ẢNH HƯỞNG của KHÁNG SINH đến HOẠT lực TINH TRÙNG cá mè TRẮNG (hypophthalmichthys harmandi) bảo QUẢN TRONG tủ LẠNH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH ĐẾN HOẠT LỰC TINH TRÙNG CÁ MÈ TRẮNG Hypophthalmichthys harmandi BẢO QUẢN TRONG TỦ L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH ĐẾN HOẠT LỰC TINH

TRÙNG CÁ MÈ TRẮNG (Hypophthalmichthys harmandi) BẢO

QUẢN TRONG TỦ LẠNH

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Hứa Thị Ngọc Dung

Sinh viên thực hiện : Võ Thị Minh Thúy

Mã số sinh viên : 56132479

Khánh Hòa - 2018

VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

BỘ MÔN QUẢN LÝ SỨC KHỎE ĐỘNG VẬT THỦY SẢN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA KHÁNG SINH ĐẾN HOẠT LỰC TINH TRÙNG

CÁ MÈ TRẮNG (Hypophthalmichthys harmandi) BẢO QUẢN

TRONG TỦ LẠNH

GVHD: Th.S Hứa Thị Ngọc Dung SVTH: Võ Thị Minh Thúy

MSSV: 56132479

Khánh Hòa, tháng 7/2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi Các số liệu sử dụng phân tích trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong luận văn do tôi tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách quan và phù hợp với thực tiễn của Việt Nam Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Minh Thúy

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý phòng ban trường Đại học Nha Trang nói chung và Viện Nuôi trồng Thủy sản nói riêng, đặc biệt là sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của Th.S Hứa Thị Ngọc Dung, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Lê Minh Hoàng người đã chỉ bảo trực tiếp và tận tình đồng thời tạo điều kiện mọi mặt về trang thiết bị thí nghiệm trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả các thầy, cô giáo trong Viện Nuôi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức

cơ bản nhất để làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày tháng năm 2018

Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là nhằm tạo tiền đề cho sản xuất giống nhân tạo cá

mè trắng (Hypophthamichthys harmandi) Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là tìm ra được

hiệu quả của việc bổ sung thêm kháng sinh, chất bảo quản tốt nhất và tỷ lệ pha loãng tối

ưu nhất trong bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh Thí nghiệm được sử dụng các chất bảo quản lần lượt là: HBSS (Hanks’ balanced salt solution), Modified HBSS, CCSE-2 (Comon carp sperm extender), Kurokura-1 và Kurokura-2 Thí nghiệm về tỷ lệ pha loãng trong nghiên cứu này là 1:1, 1:3 và 1:5 (tinh trùng: chất bảo quản) Kháng sinh được bổ sung là Cephalexin và Amoxceline ở nồng độ là 50ppm Hai loại kháng sinh này được dùng dưới dạng đơn lẽ và dạng kết hợp Tất cả các thí nghiệm trên được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC Kết quả cho thấy: điều kiện tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh là chất bảo quản HBSS ở tỷ lệ 1:3, tinh trùng

có thể duy trì hoạt lực đến ngày thứ 9 Trong điều kiện bổ sung thêm kháng sinh kết hợp 25ppm Cephalexin+ 25ppm Amoxceline thì hoạt lực tinh trùng có thể duy trì đến ngày

thứ 13

Từ khóa: Cá Mè trắng, Hypophthamichthys harmandi, tinh trùng, bảo quản lạnh, chất

bảo quản, kháng sinh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá mè trắng: 3

1.1.1Hệ thống phân loại: 3

1.1.2Phân bố 3

1.1.3Đặc điểm hình thái 4

1.1.4Đặc điểm sinh thái 4

1.1.5Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.6Tuổi và kích thước thành thục 5

1.1.7Tập tính sinh sản 5

1.1.8Mùa vụ sinh sản 6

1.1.9Sức sinh sản 6

1.1.10 Một số đặc điểm về tinh trùng cá 7

1.2 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh 15

1.2.1Trên thế giới 15

1.2.2Ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Thời gian nghiên cứu 21

2.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1Chọn cá đực và vuốt tinh: 22

2.4.2Một số đặc điểm tinh dịch cá mè trắng khi đưa vào thí nghiệm: 22

2.4.3Thí nghiệm ảnh hưởng của chất bảo quản, tỉ lệ pha loãng và việc bổ sung kháng sinh đến thời gian bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh 24

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Ảnh hưởng của các chất bảo quản khác nhau lên thời gian bảo quản tinh trùng 27

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến thời gian bảo quản tinh trùng 30

3.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung kháng sinh lên thời gian bảo quản tinh trùng:

33

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 37

4.1 Kết luận: 37

4.2 Đề xuất ý kiến: 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá mè trắng - Hypophthalmichthys harmandi 3

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh 21 Hình 2.2 Vuốt tinh cá 22 Hình 3.1 Hoạt lực của tinh trùng (%) trong 5 chất bảo quản khác HBSS, Ku1, Ku2, CCSE-2 và Modified được bảo quản ở 40C 27 Hình 3.2 Thời gian hoạt lực (s) của tinh trùng trong 5 chất bảo quản khác HBSS, Ku1, Ku2, CCSE-2 và Modified được bảo quản ở 40C 29 Hình 3.3 Hoạt lực của tinh trùng (%) với các tỷ lệ pha loãng khác nhau trong HBSS bảo quản trong tủ lạnh 40C 30 Hình 3.4 Thời gian hoạt lực (s) của tinh trùng với các tỷ lệ pha loãng khác nhau trong HBSS bảo quản trong tủ lạnh 40C 31

kháng sinh 33

sung thêm kháng sinh 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sức sinh sản của cá mè trắng Việt Nam 6

Bảng 2 1 Mật độ tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm 24

Bảng 2.2 Hoạt lực cá mè trắng đưa vào thí nghiệm 24

Bảng 2 3 Thành phần của các chất bảo quản trong 50ml nước cất 25

ASTT: Áp suất thẩm thấu

ppm: Parts per million

MỞ ĐẦU

Cá mè trắng (Hypophthalmichthys harmandi Sauvage, 1884) là một chi thuộc họ

cá chép (Cyprinidae) [68] Cá mè trắng là một trong số các loài cá nuôi phổ biến ở miền Bắc nước ta Cá sinh trưởng nhanh, có chuỗi thức ăn ngắn, dễ nuôi và có thể nuôi được với mật độ dày hơn các loài cá khác Trong nhiều năm nay cá mè trắng chiếm sản lượng quan trọng, nếu như không muốn nói đến là sản lượng chủ yếu, trong sản lượng cá thịt nuôi trong ao hồ, đầm nước ngọt Với hàm lượng chất khô là 22,36% và hàm lượng đạm tổng số là 2,36% tính theo trọng lượng tươi của cá, cá mè trắng đã cung cấp một lượng đạm đáng kể cho nhân dân ta [24]

Trước đây, cá mè trắng Việt Nam phân bố rộng rãi ở hệ thống sông Hồng, sông Thái Bình, sông Mã, sông Lam và còn là đối tượng nuôi quan trọng ở các ao hồ, sông cụt, đập nước…Năm 1958 chúng ta nhập cá mè trắng Trung Quốc vào, đây là loài đặc trưng cho khu hệ cá đồng Trung Quốc Đến năm 1963, chúng ta đã cho cá mè trắng Trung Quốc đẻ nhân tạo thành công và việc nhập loài cá này từ Trung Quốc lại tiếp tục vào năm 1964 Mặc dù cá có cỡ nhỏ hơn cá mè trắng Việt Nam nhưng cá mè trắng Trung Quốc đẻ nhiều, đẻ sớm và dễ cho đẻ hơn nên các trại cá giống của ta đã giành sự chú ý đến cá mè trắng Trung Quốc nhiều hơn Sự ưu ái này đã dẫn đến tình trạng lãng quên cá

mè trắng Việt Nam Đồng thời tình trạng phối giống tạp giao giữa hai loài cá mè trắng này dẫn đến tình trạng thoái hóa nghiêm trọng về giống [24] Việc tìm được các đàn cá

mè trắng Việt Nam thuần nhất không phải là việc dễ Do vậy việc lưu giữ dòng thuần cá

mè trắng tại Việt Nam làm nguyên liệu cho chọn giống, lai tạo các thế hệ con lai kinh tế

là hết sức cần thiết và mang lại ý nghĩa thực tiễn to lớn [22]

Một trong những phương pháp giúp lưu giữ dòng thuần cá nói riêng và các loài động vật thủy sản nói chung đó là bảo quản lạnh tinh trùng Trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, việc bảo quản lạnh tinh giúp cho quá trình thụ tinh được chủ động hơn, đơn giản trong việc vận chuyển cá bố mẹ từ nơi này đến nơi khác, phục vụ lai tạo giống mới, khắc phục khó khăn trong sản xuất nhân tạo một số loài cá do sự lệch pha giữa cá đực và cá cái đồng thời bảo vệ được nguồn gen Ngoài ra, bảo quản lạnh tinh trùng còn

có vai trò quan trọng trong việc hạn chế tối đa lưu giữ cá đực, bảo tồn dòng thuần, hạn chế suy giảm do cận huyết trong quần đàn [73]

Bảo quản lạnh làm giảm hoạt động trao đổi chất của các tế bào tinh trùng và kéo dài thời gian sống của chúng [59] Bảo quản lạnh tinh trùng của cá là một trong những

kỹ thuật đơn giản cho phép tinh trùng luôn có sẵn tại các thời điểm khác nhau để tiến hành thụ tinh với trứng bằng cách tiêm hoocmon cho con cái từ đó làm tăng năng suất sinh sản [65]

Trước tình hình này, cần có nhiều nghiên cứu hơn về thành phần tinh dịch của cá

mè trắng nhằm đưa ra những chất bảo quản, chất kháng sinh, tỷ lệ pha loãng tốt nhất giúp cho quá trình bảo quản lạnh tinh trùng đạt hiệu quả cao nhất Có rất nhiều công trình bảo quản lạnh tinh trùng các loài cá được công bố như cá hồi [81], cá tra [71], cá tầm [43], cá đù vàng [59]… Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đề cần được nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng cá mè trắng nhằm gia tăng thời gian bảo quản Vì vậy, đề tài:

“ Ảnh hưởng của kháng sinh đến hoạt lực tinh trùng cá mè trắng

(Hypophthalmichthys harmandi) trong quá trình bảo quản trong tủ lạnh.” được thực

hiện

Đề tài này được thực hiện với những nội dung sau:

Do thời gian ngắn, cơ sở vật chất chưa hiện đại cũng như kiến thức về lĩnh vực này còn nhiều hạn chế nên đồ án tốt nghiệp không tránh khỏi được thiếu sót Qua đó, rất mong quý thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện hơn Trân trọng cảm ơn!

Loài: H harmandi (Sauvage, 1884)

Tên tiếng Anh: Silver carp

Tên tiếng Việt: Cá Mè, Cá Mè trắng, Cá Mè trắng Việt Nam

Tên tiếng Thái: Pa Mè

1.1.2 Phân bố

Trên thế giới: Phân bố tự nhiên ở Trung Quốc, tập trung nhiều ở sông Nam Độ thuộc đảo Hải Nam Di nhập và nuôi ở nhiều nước trên thế giới [5]

Ở Việt Nam: Cá mè trắng Việt Nam là loài cá phổ biến ở sông ngòi miền Bắc nước

ta, có nhiều ở lưu vực sông Hồng, sông Thái Bình và còn thấy có ở sông Mã, sông Lam Đây là loài cá điển hình ở đồng bằng miền Bắc nước ta [24]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Thân cá dẹp bên, có màu trắng, phần lưng có màu sẫm hơn, bụng màu trắng bạc Chiều dài thân bằng 2,8-3,15 chiều cao, 3,2-3,7 lần chiều dài đầu Đầu lớn, mắt thấp; mõm tù, ngắn; miệng hướng trên, khoảng cách hai ổ mắt rộng Mắt tự do, không màng

da che Màng mang rộng, lược mang rất dài, xếp thành mang mỏng, phần gốc có nhiều

lỗ nhỏ Thân có 38-40 đốt sống Bóng hơi khá to, có hai ngăn Ruột dài, cuộn khúc nhiều lần [24]

Vây lưng 2-3,7 Vây ngực 3,12-16 Vây bụng 1,8 Vây hậu môn 1,17-19 Răng hầu một hàng 4-4, hình hơi bầu dục, mặt răng hơi cong hình thuyền, có nhiều rãnh cưa nhỏ Khởi điểm vây lưng sau khởi điểm vây bụng Vây bụng dài chưa đạt tới vây hậu môn Vây ngực quá khởi điểm vây bụng một ít Khi cá trưởng thành, trên mặt tia vây ngực của cá đực có nhiều khía răng cưa rất rõ, sờ tay vào thấy ráp sắc; còn ở cá cái trơn láng Vây đuôi có thùy dưới lớn hơn thùy trên Các vây đều không có gai cứng Lỗ hậu môn

ở ngay trước vây hậu môn Sống bụng hoàn toàn, từ vây ngực đến vây hậu môn [24]

1.1.4 Đặc điểm sinh thái

Cá mè trắng thức ăn chính là thực vật phù du (phytoplankton) do đó chúng thường sống ở tầng nước mặt và tầng giữa, nơi mà thực vật phù du tập trung nhiều [5] Cá thường đi ăn theo đàn, khi ăn cá đớp nước để lại phía trên mặt nước đám bọt nhỏ và không liên tục như cá mè hoa [24] Cá Mè trắng khi hoảng sợ cá nhảy lung tung và nhảy rất cao Cá sinh sống nhiều ở các đầm hồ, ruộng trũng, các sông nhánh để tăng trưởng Khi trưởng thành, vào mùa phát dục cá ngược lên vùng trung và thượng lưu các sông tìm nơi có điều kiện thích hợp để đẻ trứng Trứng trên đường trôi về xuôi sẽ nở dần thành cá bột và cá bố mẹ cũng xuôi về đồng bằng để sinh sống và vỗ béo [24]

Mặc dù cá Mè trắng có thể chịu đựng được sự thay đổi rất lớn của pH, nhưng cũng

có một giới hạn nhất định, cá sẽ bị chết nhanh chóng khi pH < 4 hoặc pH >10,2 Nhu cầu Oxy hòa tan và khả năng trao đổi chất suy giảm rất nhanh khi pH giảm xuống nhỏ hơn 6, trong trường hợp này cá chậm lớn Thực tế chỉ ra rằng pH tối ưu cho cá mè trắng

giảm xuống dưới 1500C cường độ bắt mồi của cá giảm mạnh và chúng sẽ ngừng bắt mồi

lượng khí Oxy hòa tan Khi hàm lượng oxy hòa tan (DO) lớn hơn 2,2mg/l thì cá Mè trắng sinh trưởng và phát triển bình thường Khi DO< 2mg/l nhu cầu sử dụng thức ăn giảm xuống rõ rệt Tại DO<1,1mg/l cá bắt đầu nổi đầu và bỏ ăn Sự nổi đầu nghiêm trọng tại thời điểm DO= 0,5mg/l Cá sẽ ngạt thở và chết khi DO< 0,35mg/l [5]

1.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Cá mè trắng có kích thước lớn, trong điều kiện thiên nhiên cá lớn nhất đạt 15 kg (Phú Yên - Sông Đà) Cá khai thác có khối lượng trung bình 0,5-1,5 kg Cá mè trắng lớn rất nhanh: 1 tuổi dài 35,4 kg-38 cm, nặng 785-885 kg, 2 tuổi: 41,3-43,5 cm, nặng 1400- 1530g, 3 tuổi: 47,0-50,5 cm, nặng 1940-2030g, 4 tuổi: 53,7-54,1 cm, nặng 2600-3010g,

5 tuổi: 56,1-59,6 cm, nặng 3240-4465g và 6 tuổi dài 62-67 cm, nặng 4500-6000g [5] Trong ao nuôi tốc độ tăng trưởng cá phụ thuộc vào nguồn thức ăn cung cấp Những

ao nuôi thức ăn phong phú cá lớn nhanh: 1 năm nặng 0,5-1kg, 2 năm 1,5-2,5 kg và 3 năm 2-4 kg Lượng mỡ bám ở nội tạng cá khá cao từ 3-8% khối lượng thân Vào các mùa thu, đông và xuân hàm lượng mỡ tập trung nhiều nhất, còn mùa hạ lượng mỡ thấp nhất [5]

1.1.6 Tuổi và kích thước thành thục

Cá Mè trắng Việt Nam ở sông Hồng thường thành thục khi cá được 3 tuổi, (chỉ một số ít 2 tuổi) Kích thước nhỏ nhất của cá đực khi phát dục dài 32,5cm, nặng 0,75kg; còn kích thước nhỏ nhất của cá cái khi phát dục dài 37,3cm, nặng 1,05kg [24]

Khi nuôi trong ao, cá Mè trắng thành thục ở 3 tuổi dài 47kg, nặng 2,3kg; cá đực 2 tuổi dài 40cm, nặng 2kg Những theo dõi về cá Mè trắng ở sông cụt Cà Lồ (Mê Linh, Vĩnh Phúc) cho thấy cá đực thành thục dài 52cm, nặng 2,5kg; cá cái dài 53cm, nặng 2,8kg [24]

1.1.8 Mùa vụ sinh sản

Ngoài tự nhiên: Mùa vụ sinh sản của cá Mè trắng trong tự nhiên từ cuối tháng 4 và kết thúc vào cuối tháng 6; lác đác đầu tháng 7 cá còn đẻ Cá đẻ rộ nhất từ 15 tháng 5 đến

15 tháng 6 ở ngoài tự nhiên

Trong sinh sản nhân tạo: khoảng giữa tháng 4 đã có thể cho cá đẻ Mùa vụ cho cá

Mè trắng đẻ nhân tạo tốt nhất là từ cuối tháng 4 đến giữa tháng 5 Ngoài vụ đẻ chính còn có thể cho cá đẻ tái phát lần thứ hai, thứ ba trên một cá cái trong cùng một năm đạt kết quả tốt (thời gian nuôi vỡ tái phát mỗi lần cách nhau 40-50 ngày) Thời gian cho cá

đẻ tái phát dục tốt nhất từ tháng 6 đến tháng 7 Lượng trứng thu được của cá Mè trắng

đẻ lần thứ hai thường chỉ bằng 70% lượng trứng của lần đẻ thứ nhất [24]

1.1.9 Sức sinh sản

Sức sinh sản của cá mè trắng Việt Nam được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Sức sinh sản của cá mè trắng Việt Nam [24]

Khối lượng cá (kg) Sức sinh sản tuyệt đối

(*) trung bình

Sức sinh sản tương đối (**) trung bình

1,5-2,0 2,0-2,5 2,5-3,0 3,0-3,5 3,5-4,0 4,0-4,5

263,057 289,900 429,707 537,988 562,255 446,675

197,1 129,4 141,9 159,7 146,5 93,0

(*) Sức sinh sản tuyệt đối là sô' lượng trứng tổng cộng của 1 cá thể

(**) Sức sinh sản tương đối là sô' lượng trứng tính theo 1g cơ thể cá

Nếu như trong tự nhiên lượng trứng mà cá mè trắng đẻ được bằng 88,6% - 97,5% sức sinh sản tuyệt đối, nghĩa là tính trung bình 1g cơ thể cá chỉ cho 154 trứng thì trong sinh sản nhân tạo cá có thể đẻ 59,98-95,39% lượng chứa trứng, nghĩa là 1g cơ thể cá cho 74 trứng [24]

1.1.10 Một số đặc điểm về tinh trùng cá

1.1.10.1 Quá trình tạo tinh trùng:

Sự phát triển tinh trùng của cá diễn ra trong tinh sào (buồng tinh) [10] , được chia làm 3 giai đoạn:

 Giai đoạn tăng sinh:

Tinh sào còn non chứa tinh nguyên bào gốc, chúng phân chia nguyên phân nhiều lần để tạo thành các tinh nguyên bào Trong giai đoạn này, tinh nguyên bào có một nhân

to, chất nguyên sinh phân bố đều, đường kính dao động của tinh nguyên bào từ 9-16 µm [1, 8]

 Giai đoạn sinh trưởng:

Tế bào sinh trưởng mãnh liệt, thể tích được tăng lên và hình thành tinh bào sơ cấp (tinh bào cấp 1) vì trong giai đoạn này chất dinh dưỡng do tinh nguyên bào hấp thụ được đồng hóa và chuyển thành nguyên sinh chất của tế bào Nguyên sinh chất từ dạng hạt biến thành nhiễm sắc thể sợi mảnh hoặc thô chuẩn bị bước vào giai đoạn phân chia tiếp theo [21]

1.1.10.2 Cấu tạo tinh trùng:

Ở các lớp động vật khác nhau, tinh trùng của chúng cũng khác nhau khá nhiều Tuy nhiên, tất cả đều có nét chung về hình thái và liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả năng sống và thụ tinh [1] Tinh trùng có kích thước vô cùng nhỏ từ 50-60µm Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: Phần đầu, phần cổ và phần đuôi

 Phần đầu:

Đầu tinh trùng là phần cố khả năng kích thích trứng và chuyển vật chất di truyền vào trong trứng Hình thái đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình đa giác, hình trụ (cá tầm, cá phổi), hình xoắn (cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương có cấu tạo đơn giản gần như hình tròn [1]

Bên cạnh đó, đầu tinh trùng thường rất to so với phần cổ và phần đuôi Trên cùng của đầu, nằm ngang dưới màng là thể đỉnh Thể đỉnh có hình như chiếc mũ trùm xuống phía dưới, bên trong có chứa enzyme Hialuronidaza tác dụng hòa tan màng tế bào trứng

để mở đường cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh Thể đỉnh do bộ máy Golgi tạo thành Nhân tinh trùng nằm dưới thể đỉnh, rất to và đông đặc, có chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất mỏng [2]

 Phần cổ:

Phần cổ tương đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng Trong cổ có chứa trung

tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng đã được thụ tinh [1]

 Phần đuôi:

Đuôi tinh trùng là cơ quan vận động dài, mảnh tùy theo loài Phần đầu của đuôi là vòng xoắn ty thể Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa và enzyme oxyphosphorine hóa, vì vậy nó có liên quan đến quá trình hoạt động chuyển hóa năng lượng của tinh trùng Phần cuối đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở giữa và 9 đôi

ở ngoại vi Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động Để gặp được trứng, tinh trùng phải chuyển động một khoảng cách nhất định Sự di chuyển được thực hiện bằng cách chuyển động co duỗi lượn sóng và chuyển động đập của đuôi [1]

1.1.10.3 Đặc điểm sinh học của tinh trùng:

 Kích thước và số lượng:

Kích thước của tinh trùng thường rất bé so với tế bào trứng trong cùng 1 loài

Ví dụ: cá rô 20µm, hầu 75µm, người 50-70µm, cá rô 20 µm, tôm he 10 µm [1]

Ngược lại với kích thước, tinh trùng có số lượng vô cùng lớn Mật độ tinh trùng trung bình ở 1 số loài cá nước ngọt: cá trắm cỏ 36,5109 tế bào/ml, cá trắm đen

(Hippoglossus hippoglossus) 2-6109 tế bào/ml [53], cá chẽm mõm nhọn

Cũng như 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen có 16,2±0,9 triệu tinh trùng [1]

 Đặc điểm vận động:

Khi tinh trùng sống trong buồng tinh (tinh sào) thì không vận động nhưng khi ra ngoài môi trường nước thì nó bắt đầu vận động Chính vì vậy làm cho tinh trùng tiêu hao năng lượng và chóng chết [1] [17]

Năng lượng cung cấp cho tinh trùng hoạt động chủ yếu dựa vào sự phân giải gluxit (năng lượng dự trữ của tinh trùng) [15]

Tinh trùng của cá giống như ở các động vật khác, có khả năng vận động nhờ sự co rút của đuôi Quá trình vận động khi ra môi trường nước chia làm 2 giai đoạn: Giai đoạn đầu là chuyển động xoáy theo hướng tiến thẳng về phía trước, giai đoạn sau là chuyển động lắc lực vận động giảm dần cho đến khi chết Chỉ có các tinh trùng ở giai đoạn vận động mạnh mới có khả năng thụ tinh [16] Thời gian vận động tinh trùng cá khác nhau thì khác nhau và thông thường thì rất ngắn

Ở cá nước ngọt, tinh trùng lao đầu về phía trước sau 1-2 phút thì chúng chuyển động chậm dần và chuyển sang chuyển động dao động Từ 2-3 phút thì lượng tinh trùng chuyển động còn ít và cuối cùng ngừng hoạt động [1]

Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục cũng như điều kiện môi trường mà nó đang sống Sự chuyển động và thời gian vận động của tinh trùng giúp đánh giá chất lượng tinh trùng Persov [72] đã đề nghị 1 bảng đánh giá mức độ chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào dung dịch kích hoạt Cụ thể: Mức 5: Tất cả tinh trùng đều chuyển động tiến thẳng về phía trước, mức 4: Đa số chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy chỉ có 1 số ít tinh trùng dao động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động ít hơn số tinh trùng dao động, có 1 số tinh trùng bất hoạt, mức 2: Rất

ít tinh trùng chuyển động tiến, 1 số chuyển động dao động, ¾ số tinh trùng không chuyển động được, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động

1.1.10.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng:

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực cũng như khả năng thụ tinh của tinh trùng cũng

đã được nghiên cứu, mặc dù còn chưa được thể hiện rõ Yếu tố chính được xác định là:

 Chất lượng cá bố mẹ:

Việc duy trì nuôi dưỡng cá bố mẹ trong điều kiện môi trường phù hợp với mỗi loài

là 1 trong những yêu cầu quan trọng trong sản xuất tinh trùng có chất lượng tốt Trong

cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) chất lượng của tinh trùng khi sử dụng để bảo quản

lạnh được cải thiện nhờ quản lý tốt nhiệt độ nuôi cá bố mẹ Độ mặn là một yếu tố môi trường khác ảnh hưởng đến thành phần lipid của màng tế bào, đặc biệt là các cơ quan điều hòa áp suất thẩm thấu [39]

Chất lượng tinh trùng có tốt hay không phụ thuộc vào mức độ thành thục của cá đực, điều kiện nuôi cũng như là môi trường chúng đang sống Tinh trùng chưa thành thục hay quá thành thục vận động yếu hơn tinh vận động vừa đạt độ thành thục Việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng [6] Tuổi của cá bố mẹ cũng

ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng tinh trùng cũng như có thể ảnh hưởng đến việc lưu giữ

chiều dài) theo Gjerde [52]

Ngoài ra, khi nuôi cá bố mẹ thành phần dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng tinh trùng Cho ăn bằng thức ăn viên được làm giàu với dầu cá sẽ làm tăng đáng kể thể tích tinh dịch, mật độ tinh trùng, tỷ lệ sống của phôi và ấu trùng cá Chẽm

Châu Âu (Dicentrarchus labrax) Trong một nghiên cứu khác, thức ăn được làm giàu

chứa acid béo không bão hòa (PUFA) có thể tăng cường hiệu quả sinh sản của cá Chẽm đực Đồng thời nghiên cứu này cho thấy được thức ăn có bổ sung vitamin C bảo vệ tế bào tinh trùng khỏi các tác dụng phụ của chất chống oxy hóa lipid màng tế bào bằng việc làm giảm tác động xấu từ quá trình peroxy hóa lipid [52] Tuy nhiên có một số chất trong thức ăn có ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng của tinh trùng như gossypol sử dụng trong thức ăn viên làm giảm hoạt lực của tinh trùng và hoạt động của enzyme

dehydrogenase ở cá Rô vàng (Perca flavescens) [38] và cá miệng tròn [74], cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) [62]

Kết quả tỷ lệ thụ tinh sẽ giảm ở một số loài cá khi tinh dịch bị nhiễm bẩn bởi nước tiểu trong quá trình vuốt tinh (có thể do ống dẫn tinh và niệu quản quá gần nhau hoặc chỉ có 1 lỗ niệu sinh dục duy nhất thông qua đó cả tinh dịch và nước tiểu được đưa ra ngoài Ở cá Hồi Đại Tây Dương, ô nhiễm nước tiểu sẽ làm tăng sự thay đổi của các

tinh ở cá chép (Cyprinus carpio) do nước tiểu làm giảm năng lượng và khả năng vận

động của tinh trùng [52]

 Mùa vụ sinh sản:

Mùa vụ sinh sản của cá bố mẹ cũng ảnh hưởng lớn đến hoạt lực của tinh trùng Càng về cuối mùa sinh sản mật độ của tinh trùng càng giảm và khả năng hoạt lực cũng kém hơn Vào cuối mùa sinh sản tinh trùng sẽ bị lão hóa như thay đổi hình thái học, giảm khả năng hoạt lực [2] [26] [29] [64] Thông qua các thông số ảnh hưởng đến chất lượng cũng như khả năng hoạt lực của tinh trùng thì trong nghiên cứu này chỉ quan tâm đến một vài yếu tố đưa vào nghiên cứu Đó là các thông số như: tỉ lệ pha loãng, chất bảo quản, việc bổ sung kháng sinh đến khả năng hoạt lực và thời gian hoạt lực của tinh trùng

1.1.10.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến bảo quản lạnh tinh trùng:

 Nhiệt độ

Nhiệt độ bảo quản tinh trùng trong tủ lạnh từ 00C đến 40C là khoảng nhiệt độ được

sử dụng nhiều nhất vì khoảng nhiệt độ này dễ đạt được và dễ điều chỉnh [7] Nếu nhiệt

độ vượt quá giới hạn cho phép của phạm vi thích hợp thì tinh trùng nhanh chóng mất khả năng hoạt lực và chết [23] Ở nhiệt độ dưới 60C được cho là tốt hơn so với nhiệt độ cao vì nhiệt độ thấp sẽ làm giảm đáng kể sự phát triển của vi khuẩn [7] Trên thế giới cũng như Việt Nam, có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trùng của

sống được 8 ngày, tinh trùng cá tầm ở 0 - 40C thì sống lâu nhất nếu bảo quản tốt có thể

trì thời gian sống lên đến 34 ngày [81], tinh trùng cá tra có thể duy trì hoạt lực lên đến

nhiệt đới như cá rô phi sông Nile hay cá da trơn (Ictalarus punctatus) cũng sẽ cho hiệu

quả bảo quản ở 0 - 40C [43] [73]

Tinh trùng có thể duy trì khả năng thụ tinh của mình khá lâu nếu được giữ ở nhiệt

tinh trùng ở nhiệt độ thấp để kéo dài tuổi thọ của tinh trùng [12] [54]

 Chất bảo quản

Chất bảo quản là môi trường đệm giúp pha loãng tinh dịch và để có được lượng tinh trùng pha loãng lớn trong sinh sản nhân tạo [67] Do đó, việc sử dụng chất bảo quản trong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng là rất cần thiết

Chất bảo quản còn là một trong những yếu tố quyết định đến hoạt lực của tinh trùng Với mỗi loài cá khác nhau cần một dung dịch pha loãng có thành phần khác nhau Chất bảo quản là một chìa khóa quyết định đến các yếu tố như ion, áp suất thẩm thấu hay pH Muốn tinh trùng tồn tại được lâu và hoạt lực tốt cần tìm ra chất bảo quản phù hợp nhất Để tăng hiệu quả của thụ tinh nhân tạo, các thành phần của dung dịch pha loãng có vai trò rất quan trọng và nó phải được điều chỉnh cho phù hợp với từng loài cụ thể [33]

Hầu như các nghiên cứu đã được công bố về bảo quản lạnh tinh trùng trong tủ lạnh đều trình bày một thành phần khác nhau của chất pha loãng, kể cả trong cùng một loài Muốn xác định thành phần chất bảo quản thì cần phải dựa vào thành phần của tinh dịch Việc làm này cho phép các thành phần ion có mặt sẽ giúp kiềm chế khả năng vận động của tinh trùng và đồng thời làm giảm tiêu hao năng lượng dự trữ của tế bào Ngoài ra, nồng độ ion thích hợp sẽ duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào [7]

Đối với tinh trùng cá hồi, khả năng vận động được kích hoạt bởi sự pha loãng ion kali và kali có mặt trong tinh dịch với nồng độ cao (37,3 mM) [66] Hầu hết các loài cá nước ngọt và nước mặn chỉ yêu cầu áp suất thẩm thấu của chất pha loãng có nồng độ hơi nhỏ hơn 300 mOsm/kg đối với cá nước ngọt (290 ở cá hồi, 295 ở cá da trơn –

Ictalurus punctatus [43] [44] và hơi lớn hơn 300 mOsm/kg đối với cá biển (cá vược sọc – Morone saxatilis [55], cá tuyết – Gadus morhua và cá tuyết chấm đen – Melanogtammus aeglefinus [45])

Hiện nay đã có một số nghiên cứu được công bố về bảo quản lạnh tinh trùng trong

tủ lạnh với chất bảo quản mang lại hiệu quả cao trong quá trình bảo quản như: tinh trùng

cá chép bảo quản ở tỷ lệ pha loãng 1:3 trong chất bảo quản CCSE-2 (Comon carp sperm extender) có bổ sung kháng sinh kéo dài thời gian bảo quản lên đến 29 ngày [8], tinh

trùng cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) bảo quản trong chất bảo quản Ku2 (Kurokura-2) kéo dài thời gian bảo quản đến ngày thứ 9 [4]

 Tỷ lệ pha loãng

Pha loãng cho phép tất cả các tinh trùng được kích hoạt cùng một lúc và tránh sai sót trong trường hợp quan sát với mật độ cao Điều này đặc biệt quan trọng trong các loài có mật độ tinh trùng cao và tinh trùng chuyển động nhanh Pha loãng tinh trùng sẽ làm giảm mật độ tinh trùng, nếu mật độ quá dày sẽ ảnh hưởng đến khả năng bơi của tinh

trùng do nó phải cạnh tranh cao trong một không gian hẹp, điều này sẽ khiến cho tinh trùng tiêu hao năng lượng lớn và nhanh chết hơn Tuy nhiên, nếu mật độ quá thưa cũng làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng do quãng đường chúng phải bơi để gặp trứng

xa hơn Do đó tỉ lệ pha loãng tối ưu là một yếu tố quan trọng để tinh trùng hoạt lực tốt [19] [27] [28] [46] [54] [56]

Việc bảo quản lạnh tinh trùng trong tủ lạnh ngắn hạn ở cá mè (Tinca tinca) chỉ có

thể thực hiện khi pha loãng tinh trùng [75], việc pha loãng cũng giúp cải thiện được thời

gian lưu giữ đối với cá vược sọc (Morone saxatilis), cá tuyết (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) và cá mướp (Osmerus mordax) [46] [45] Đối

với tinh trùng của cá tuyết, cá tuyết chấm đen và cá mướp vân thì tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt

hơn so với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:5 và 1:10 [45] [46] Ở cá hồi nâu (Salmo trutta fario) và

cá hồi Chinook (Oncorhynchus tschawytscha), pha loãng lớn hơn tỷ lệ 1:3 làm giảm

chất lượng tinh trùng sau 48h bảo quản so với tỷ lệ 1:1, 1:2 và 1:3 [47] Ở cá da trơn

châu Phi (Clarias gariepinus), tỷ lệ 1:5 tốt hơn tỷ lệ 1:3 hay 1:10 [48] Ở cá chép Việt

thì tỷ lệ 1:3 tốt hơn tỷ lệ 1:5 và 1:1 [69] Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên cá đù

vàng (Larimichtys polyactis) thì tỷ lệ 1:3 tốt hơn so với tỷ lệ 1:5, 1:1, 1:10 [59] Đối với

cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis) ở tỷ lệ 1:3 cho kết quả cao hơn so với

các tỷ lệ còn lại [9], nghiên cứu công bố gần đây nhất đối với cá trắm cỏ

(Ctenopharyngodon idella) trên tỷ lệ 1:3 cũng cho kết quả tương tự [4]

 Kháng sinh

Việc bổ sung kháng sinh đối với tinh trùng không pha loãng hoặc pha loãng đều cải thiện được thời gian lưu trữ lạnh tinh trùng, việc bổ sung này cho thấy đây là thông

số quan trọng trong lưu trữ lạnh tinh trùng [8]

Khi Paniagua-Chavez và cộng sự, đã kiểm tra các điều kiện lưu giữ tinh trùng hầu như chúng được dự đoán là mất mát chất lượng do lượng vi khuẩn trong mẫu Việc kết hợp penicilline và streptomycin là phổ biến nhất Bổ sung 50 IU/ml penicilline + 50 IU/ml streptomycin cho tinh trùng cá chép không pha loãng cho phép khả năng vận động

thì khả năng thụ tinh ít hơn 6 ngày Cùng nồng độ đó sử dụng cho cá tuyết Đại Tây

Dương (Gadus morhua) [45] và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) Một kết quả gần đây nhất được báo cáo trên cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) thì bổ

sung 25ppm Cephalexin+ 25ppm Amoxceline có thể kéo dài thời gian bảo quản [4]

Ngoài ra, theo một nghiên cứu khác được công bố khi bảo quản tinh trùng hầu Thái Bình

bảo quản lên đến 25 ngày [11]

Đối với từng loài cá sẽ thích ứng với một loại và liều lượng kháng sinh khác nhau

Sự khác biệt này có thể là do sự hiện diện nhóm loài vi khuẩn trong suốt thời gian bảo quản lạnh tinh trùng Vì thế, để tìm ra được loại kháng sinh cũng như liều lượng thích hợp cho từng loài cá thì cần có nghiên cứu sâu hơn về phân tích chủng loại vi khuẩn [8]

 Thời gian bảo quản

Thời gian bảo quản lạnh tinh trùng phụ thuộc rất lớn vào điều kiện bảo quản Tuy nhiên, thời gian thu thập tinh trùng trong mùa sinh sản có ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng ở một số loài động vật thủy sản và chất lượng tinh trùng ban đầu đem đi bảo quản

sẽ ảnh hưởng đến khả năng bảo quản lạnh tinh trùng [36, 49] [49]

Kết quả là khi tiến hành thử nghiệm bảo quản lạnh tinh trùng cá mùi đỏ (Pagrus pagrus) thì việc duy trì thời gian sống của tinh trùng không pha loãng kéo dài 4 ngày

khi bắt đầu mùa sinh sản và 12 ngày nếu thu thập tinh trùng tại thời điểm 3 tháng sau mùa sinh sản Đối với động vật thủy sản, thời gian bảo quản lạnh tinh trùng lâu nhất là

ở cá bơn (Scophtalmus maximus) và cá vược sọc (Morone saxatilis) từ 6-7 ngày [42],

trong khi đó khả năng hoạt động vẫn có thể xảy ra sau 38 ngày bảo quản lạnh đối với cá

tuyết (Gadus morhua) và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) [56] Nổi bật nhất là đối với tinh trùng cá thìa (Polyodon spathula) vẫn có thể vận động sau 56 ngày

Các nghiên cứu về hoạt lực tinh trùng được phát triển xuất phát từ nghiên cứu trên

mô hình của tinh trùng cầu gai (Authoeidaris erassispina) do Gibbons thực hiện [51]

Sau đó, nhiều công trình nghiên cứu đánh giá chất lượng cũng như ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến chất lượng tinh trùng đã được thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau

Đối với cá nước ngọt những đối tượng chính được quan tâm đó là: họ cá Hồi

Salmonidae [31] [33], họ cá Chép Cyprinidae [26], họ cá tầm Acipenseridae [25]

Đối với các loài cá biển các nghiên cứu tập trung vào một số đối tượng như: Cá

tráp biển (Sparus auratus), cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus labrax) [29], cá bơn Đại Tây Dương (Hippoglossushippoglossus) [53], cá tuyết (Gadus morhua macrocephalus) [84], cá đối (Mugil cephalus), cá Trachurus mediterraneus, cá Mullus barbutus, cá Boops boops, cá Diplodus sargus [58] , cá bống (Gillichthys mirabilis) [83],…

Tỷ lệ hoạt lực của tinh trùng ảnh hưởng quan trọng đến hoạt lực và thụ tinh của tinh trùng Tinh trùng cá nước ngọt và nước mặn đều bất động trong tinh dịch tuy nhiên khi pha loãng tinh dịch với nước hoặc với các tỷ lệ khác thì ở tỷ lệ 1:0,4 tinh trùng đã bắt đầu có hoạt lực [41] Alavi và ctv [25] đã kết luận tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho cá tầm

Ba Tư (Acipenser persicus) là 1:50, tương tự đối với cá Perca fluviatilis thì tỷ lệ pha loãng tối ưu là 1:50, nhưng đối với cá Larimichthys polyactis thì tỷ lệ pha loãng tối ưu

là 1:100 [61] Đồng thời, có nhiều công trình nghiên cứu đã công bố các dung dịch tối

ưu cho tình trùng các loài cá khác nhau Theo Lahnsteiner và ctv (1997) [57], đã nghiên

cứu cấu trúc và khả năng hoạt lực của tinh trùng cá bống đầu bò (Cottus gobio) cho thấy

khi pha loãng tinh trùng với dung dịch NaCl 50mM thì chúng hoạt động mạnh và sống lâu hơn khi dùng nước cất (ở nước cất vận tốc giảm xuống <20µm/s trong vòng 1 phút) Còn trong NaCl 50mM vận tốc không đổi ở 60 phút đầu tiên và giảm xuống, 20µm/s sau 120 phút.Với mỗi loài cá khác nhau thì dung dịch pha loãng là khác nhau [57] Việc xác định các yếu tố môi trường tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng cá có vai trò quan trọng trong việc bảo quản tinh trùng cá để đạt được hiệu quả cao hơn thông qua đó chúng

ta sẽ lưu giữ được giống cá thuần để phục vụ cho việc chọn giống cũng như bảo vệ nguồn gen

Từ trước những năm 50 của thế kỷ XX, việc lưu giữ tinh trùng ở điều kiện nhiệt

độ thấp như bảo quản trong tủ lạnh hoặc trong đá khô đã được thực hiện, tuy nhiên thời gian gần đây mới có nhiều kết quả được công bố rộng rãi: Tinh trùng cá hồi vân

lưu giữ ở 0 - 50C thì khả năng thụ tinh lên đến 8 ngày [78] Đối với tinh trùng cá hồi,

thời gian lưu giữ biến đổi giữa các loài khác nhau: ở loài Oncorhynchus masou thời gian lưu giữ 4 ngày [78], Salmo trutta fario 14 ngày [32] và đáng chú ý hơn là đối với tinh trùng cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) thời gian lưu giữ lên đến 34 ngày [79] Đối với tinh trùng của các loài cá nước ấm như cá rô phi song Nile hay cá da trơn (Ictalurus punctatus) khi lưu giữ ở 0 - 40C cũng cho kết quả tương tự [43] [73] Theo các báo cáo

về việc lưu giữ tinh trùng cá biển, thời gian lưu giữ lâu nhất là ở cá bơn (Scophtalmus maximus) và cá chẽm (Morone saxatilis) 6-7 ngày [42] [56] và vẫn có thể hoạt hóa sự vận động của tinh trùng cá tuyết (Gadus morhua) và cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus) sau 38 ngày lưu giữ [41] Đặc biệt đối với tinh trùng cá thìa (Polydon spathula) vẫn có thể hoạt động sau 56 ngày lưu giữ [35]

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu đã tiến hành lưu giữ tinh trùng trong các chất bảo quản để kéo dài thời gian bảo quản Đối với việc bảo quản tinh trùng cá chép kính

(Ctenopharyngodon idella), Yusuf Bozkurt và ctv [34] đã tiến hành bảo quản chúng

trong 3 chất bảo quản lần lượt là 0,3M Glucose, 1% NaCl và hỗn hợp MIS (Modified

1:3 Kết quả đạt được là tinh trùng bảo quản trong 0,3M Glucose có tỷ lệ thụ tinh tốt nhất và thấp nhất là MIS Trong khi tinh trùng của cá hồi Abant bảo quản trong 0,3M

thì khả năng tinh trùng vận động trong 0,3M Glucose là tốt hơn trong Ringer solution [54]

Tỷ lệ pha loãng của tinh trùng cũng ảnh hưởng lớn đến hoạt lực và khả năng thụ tinh của tinh trùng từ đó ảnh hưởng tới thời quan bảo quản tinh trùng vì khi pha loãng

sẽ làm giảm đi mật độ của tinh trùng so với lượng tinh trùng ban đầu cũng như giảm thiểu các vấn đề về ô nhiễm từ các tạp chất (nước tiểu,…) lẫn trong tinh trùng Vì vậy cần có những nghiên cứu về chất pha loãng sao cho phù hợp với tinh trùng của từng loài

cá Gần như khi nào kiểm tra, việc pha loãng tinh trùng cũng giúp cải thiện thời gian lưu giữ tinh trùng từ vài giờ khi không pha loãng lên 21-28 ngày sau khi pha loãng ở cá tầm

(Acipencer oxyrinchus) [71] và từ 1 ngày khi không pha loãng lên 6 ngày khi pha loãng đối với cá bơn (Scophtalmus maximus) [42] Việc lưu giữ tinh trùng trong thời gian ngắn (vài giờ) ở cá mè (Tinca tinca) chỉ có thể thực hiện khi pha loãng tinh trùng [75] và việc

pha loãng cũng cải thiện được thời gian lưu giữ đối với cá chẽm (Morone saxatilis) [56],

cá tuyết (Gadus morhua), cá tuyết chấm đen (Melanogrammus aeglefinus), cá mướp (Osmerus mordax) [45] Đối với tinh trùng cá tuyết Đại Tây Dương, cá tuyết chấm đen

và cá mướp vân thì tỷ lệ pha loãng 1:3 tốt hơn nhiều so với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:5 và 1:10

[45] [46] Ở tinh trùng cá da trơn châu Phi (Clarias gariepinus) tỷ lệ 1:5 thì tốt hơn so

với 1:3 hay 1:10 [48]

Trong quá trình bảo quản tinh, Stoss và ctv [78] đã bổ sung thêm chất kháng sinh khi bảo quản tinh cá hồi, tinh trùng được lưu giữ 23 ngày ở -20C Theo Saad và ctv [76], khi bổ sung thêm chất kháng sinh 50 IU/ml penicillin+50µg/ml streptomycin cho tinh trùng cá chép không pha loãng có thể duy trùy khả năng vận động và thụ tinh hơn 18

Đối với cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) thì nồng độ kháng sinh cao hơn (125 IU/ml penicillin+125µg/ml streptomycin) [80] Việc lưu giữ tinh trùng cá thìa (Polyodon spathula) cũng được cải thiện khi được bổ sung kết hợp 2 kháng sinh penicillin và streptomycin [35] Đối với cá da trơn Châu Phi (Clarias gariepinus) khi bổ sung 25-50

IU/ml penicillin+25-50 µg/ml streptomycin không cải thiện được chất lượng tinh trong quá trình lưu giữ ngắn hạn (4 ngày) và với 100 IU/ml penicillin+100µg/ml streptomycin gây độc cho các tế bào trong khí đó bổ sung 1mg/ml gentamycin sulfate có thể cải thiện khả năng vận động của tinh trùng Trong cùng 1 loài, Christensen và Tiersch (1996) cải thiện thời gian lưu giữ từ 3 - 8 ngày với việc kết hợp 2 kháng sinh trên với lượng 100

IU penicillin+100µg/ml streptomycin và 0,25µg/ml antimycotic amphotericin [43] Ở các đối tượng khác nhau sẽ có quy trình bảo quản tinh khác nhau Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh được tiến hành hơn 200 loài cá, trong đó có trên 30 loài cá biển [82] Bên cạnh đó, cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu bảo quản tinh trùng đã được nghiên cứu thành công và đã công bố như cá trích [33], cá hồi [28],

cá mú đen [50], cá trê châu Âu [63], cá Chình Nhật [70], cá chép , cá đù vàng [59] Với những kết quả đã đạt được như trên cho thấy kỹ thuật bảo quản tinh ngày càng phát triển đã đóng góp một phần không nhỏ vào việc bảo tồn đa dạng sinh học và lĩnh vực chọn giống cá nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, nghiên cứu bảo quản tinh trùng

cá mè trắng trong tủ lạnh vẫn còn ít thông tin Vì thế, nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá

mè trắng trong tủ lạnh rất cần thiết

Đối với cá tra (Pangasianodon hypohthalmus) tỷ lệ thụ tinh của tinh bảo quản 7

ngày và 3 tháng lần lượt là 54-66% (67,5-82,5% đối chứng) và 36,3-37,6% (338,6-40% đối chứng) Tỷ lệ nở đạt 80-83% (94,1-97,6% đối chứng) cho tinh bảo quản 7 ngày và 61,8% (73,1% đối chứng) cho tinh bảo quản 3 tháng Nếu máy đông tinh đạt tốc độ hạ nhiệt cao và ổn định có thể nâng cao chất lượng bảo quản hơn [18] Còn đối với cá mè

trắng (Hypophthalmichthys molitrix) sau bảo quản 1 tuần, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở ở

nghiệm thức dùng tinh bảo quản trong Kuro Kura’s 2, tỷ lệ pha loãng 1:3 là 46,15%± 16,81% và 13,45%±21,92% Trong khi pha loãng ở tỷ lệ 1:5 đạt được kết quả tương ứng 48,41%± 27,74% và 40,74%± 4,69% không khác biệt so với mẫu đối chứng và cao hơn,

có ý nghĩa so với tinh bảo quản trong Durbin A và Durbin B (p<0,05) Ở tỷ lệ pha loãng 1:9, nghiệm thức dùng Kuro kura’s 2 đạt được tỷ lệ thụ tinh cao nhất 69,85%± 1,58%

Tỷ lệ nở cao nhất ở tinh bảo quản trong Durbin B Tỷ lệ dị hình cao do môi trường điều kiện ấp chưa phù hợp, nhiệt độ nước cao [12] Các nghiên cứu này đã tìm ra được chất bảo quản và nồng độ chất chống đông thích hợp cho bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng

Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio) trong tủ lạnh đã được

tiến hành bằng cách pha loãng tinh dịch trong các chất bảo quản (CCSE-1,2,3; glucose 0,3M và sucrose 0,6M) ở các tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5 (tinh trùng: chất bảo quản) và được bổ

tinh trùng được bảo quản trong CCSE-2 ở tỷ lệ 1:3 cho hoạt lực và thời gian bảo quản cao nhất lên đến 17 ngày và sai khác có ý nghĩa đối với các chất còn lại, thấp nhất ở chất bảo quản sucrose 0,6M với thời gian lưu giữ là 7 ngày Việc bổ sung kháng sinh với liều

lượng thích hợp (25ppm pencillin+25ppm streptomycin) giúp gia tăng thời gian bảo quản tinh trùng lên đến 29 ngày [69]

Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) trong tủ

lạnh đã được tiến hành bằng cách pha loãng tinh dịch trong các chất bảo quản HBSS (Hanks’ balanced salt solution), Modified HBSS, CCSE-2 (Comon carp sperm extender), Kurokura-1 và Kurokura-2 ở các tỷ lệ 1:1, 1:3, 1:5 (tinh trùng: chất bảo quản)

và được bổ sung kháng sinh là 25ppm Cephalexin+ 25ppm Amoxceline Tất cả các thí nghiệm trên được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC Kết quả cho thấy: điều kiện tốt nhất cho bảo quản lạnh tinh trùng cá trắm cỏ trong tủ lạnh là chất bảo quản Kurokura-2

ở tỷ lệ 1:3, tinh trùng có thể duy trì hoạt lực đến ngày thứ 9 Trong điều kiện bổ sung thêm kháng sinh kết hợp 25ppm Cephalexin+ 25ppm Amoxceline thì hoạt lực tinh trùng

có thể duy trì đến ngày thứ 13 [4]

Nghiên cứu bảo quản tinh trùng hầu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) trong

tủ lạnh đã được thực hiện bằng cách pha loãng tinh dịch trong các chất bảo quản: HBSS (Hanks’ balanced salt solution), CFHBSS1000 (Calcium-free Hanks’ balance salt solution, nồng độ thẩm thấu1000 mOsm/kg), CFHBSS600 (nồng độ thẩm thấu 600 mOsm/kg) và Kurokura ở 3 tỉ lệ pha loãng 1:1, 1:3, 1:5 Kháng sinh được dùng để bổ sung trong thí nghiệm là cephalexin và amoxiciline ở nồng độ 100ppm Hai loại kháng sinh này được dùng dưới dạng đơn lẽ và dạng kết hợp Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng chất bảo quản CFHBSS1000 có bổ sung Cephalexin ở tỉ lệ pha loãng 1:3 (tinh trùng: chất bảo quản) cho ra kết quả về phần trăm tinh trùng hoạt lực (22,22%) và thời gian tinh trùng hoạt lực (25 ngày) cao hơn so với các nghiệm thức còn lại (P<0,05) Kết

quả thụ tinh sau 7 ngày bảo quản là 53,85 ± 2,65% [11]

Ngoài các đối tượng trên đã được tiến hành nghiên cứu thì hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh Để góp phần cung cấp thông tin về lĩnh vực này cũng như nghiên cứu chuyên sâu về bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh là một việc làm hết sức cần thiết

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm NORAD - Trường Đại học Nha Trang

2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 13/02/2018 đến ngày 25/06/2018

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Cá mè trắng (Hypophthalmichthys harmandi)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh được trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá mè trắng trong tủ lạnh

Ảnh hưởng của kháng sinh đến hoạt lực tinh trùng cá mè

trắng (Hypophthalmichthys harmandi) trong quá trình

bảo quản trong tủ lạnh

Kuro Kura’s 1

Kuro Kura’s 2

HBSS Modified CCSE-2

1:1 1:3 1:5

Không có kháng sinh 50ppm Cephalexin 50ppm Amoxcelin 25ppm Cephalexin+ 25ppm Amoxcelin

Hoạt lực tinh trùng và thời gian hoạt lực

Kết luận và đề xuất ý kiến

Mẫu tinh thu xong được giữ lạnh trên đá lạnh và tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

2.4.2 Một số đặc điểm tinh dịch cá mè trắng khi đưa vào thí nghiệm:

2.4.2.1 Màu sắc tinh dịch:

Màu sắc tinh dịch cũng là một trong các yếu tố để đánh giá chất lượng tinh Tinh

có chất lượng tốt thường có màu trắng sữa hoặc trắng ngà Trong quá trình thu mẫu để nghiên cứu, tinh dịch được quan sát chủ yếu có màu trắng sữa Trong quá trình lấy tinh

để bảo quản, những mẫu tinh dịch có lẫn máu, tạp chất hay tinh dịch bị loãng thì được

loại bỏ

2.4.2.2 Thể tích tinh dịch:

Do cá được thu mua từ nhiều nơi khác nhau, có chiều dài, khối lượng, độ tuổi, mức

độ thành thục khác nhau nên thể tích tinh dịch thu được không đồng đều ở mỗi cá thể Lượng tinh thu được dao động lớn từ 0,5-2,2 ml/cá thể

80 Trong đó: M: Mật độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch (TB/ml)

Mật độ tinh trùng trong nghiên cứu được thể hiện thông qua Bảng 2.1

Bảng 2 1 Mật độ tinh trùng qua 3 đợt thí nghiệm

Bảng 2.2 Hoạt lực cá mè trắng đưa vào thí nghiệm

Mẫu thí nghiệm

Hoạt lực ban đầu của tinh trùng