Thu nhận sinh khối saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên men liên tục và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm cao nấm men

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu - Thu nhận sinh khối nấm men bằng phương pháp lên men liên tục - Tạo sản phẩm cao nấm men dạng bột ứng dụng trong nuôi cấy vi si

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

LÊ NGUYÊN TUYẾT MINH

THU NHẬN SINH KHỐI SACCHAROMYCES

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN

THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 13 tháng 08 năm 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: LÊ NGUYÊN TUYẾT MINH MSHV: 09310970

Ngày, tháng, năm sinh: 05/11/1986 Nơi sinh: Ninh Thuận Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 604280

I TÊN ĐỀ TÀI: Thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên

men liên tục và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm cao nấm men

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu

- Thu nhận sinh khối nấm men bằng phương pháp lên men liên tục

- Tạo sản phẩm cao nấm men dạng bột ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS.Nguyễn Thúy Hương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Khoa Kỹ Thuật Hóa Học - Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

Đặc biệt, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thúy Hương là giáo viên trực tiếp hướng dẫn, đã tận tình giúp đỡ và dìu dắt em trong suốt thời gian thực hiện

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài luận văn: “ Thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp lên

men liên tục và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm cao nấm men”

Học viên thực hiện: Lê Nguyên Tuyết Minh

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Thời gian thực hiện: 07/2010 - 06/2011

Mục tiêu của đề tài

- Thu nhận sinh khối nấm men bằng phương pháp lên men liên tục

- Tạo sản phẩm cao nấm men dạng bột, ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật

Nội dung đề tài:

1 Khảo sát các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để thu nhận sinh khối

Saccharomyces cerevisiae trong lên men theo mẻ Tối ưu hóa bằng phương pháp quy

4 Khảo sát quá trình sấy phun tạo sản phẩm dạng bột

5 Bước đầu ứng dụng sản phẩm cao nấm men vừa sản xuất trong nuôi cấy vi sinh vật

Kết quả đề tài:

1 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm: Môi trường Hansen, thời gian lên men 24 giờ, tỉ lệ giống 4.3%, tốc độ khuấy 190 vòng/phút, khi đó mật độ tế bào cao nhất là 2.83×108 tế bào/ml

2 Lên men liên tục theo các yếu tố đã tối ưu hóa, với tốc độ pha loãng 0.042 (1/h), mật

độ tế bào đạt khoảng 2,12×108 tế bào/ml và ổn định trong thời gian theo dõi

3 Quá trình tự phân nấm men được tối ưu hóa với các thông số như sau: tỉ lệ khối lượng giữa nấm men/nước: 1/3, nồng độ enzyme protease sử dụng là 2%, nhiệt độ tự phân:

55oC, pH ban đầu: 4,5 và thời gian tự phân: 8 giờ Khi đó hiệu suất tự phân nấm men

là 79,2%

4 Các thông số kỹ thuật thích hợp cho quá trình sấy phun dịch chiết nấm men

- Nhiệt độ đầu vào: 140 – 160oC

- Lưu lượng dịch phun: 2cm3/giây

- Áp suất phun: 2kg/cm2

Khi đó quá trình sấy đạt hiệu quả tốt nhất với các kết quả như sau:

- Độ ẩm của sản phẩm: 5.7%

- Hiệu suất thu hồi sản phẩm: 81.25%

- Hiệu suất thu hồi Nitơ amin 80%

5 Bước đầu ứng dụng sản phẩm cao nấm men sản xuất được trong nuôi cấy vi sinh vật

Kết quả cho thấy sản phẩm cao nấm men giúp cho vi khuẩn Bacillus subtilis sinh

trưởng tốt hơn so với mẫu kiểm chứng, và cho kết quả tăng sinh tương tự như cao nấm men do Merck sản xuất

Một phần kết quả trên được thể hiện qua bài báo “Continuous fermentation of Saccharomyces cerevisiae biomass and application in yeast extract production” - Tác giả:

Nguyễn Thúy Hương, Lê Nguyên Tuyết Minh - Hội nghị RSCE 2011 (18th Regional Symposium on Chemical Engineering)

MỤC LỤC

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Thu nhận sinh khối nấm men 3

2.1.1 Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men 3

2.1.2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men 3

2.1.3 Môi trường nuôi cấy nấm men 4

2.2 Lên men liên tục 4

2.3 Cao nấm men và ứng dụng 9

2.3.1 Giới thiệu về cao nấm men 9

2.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất cao nấm men 11

2.3.2.1 Quá trình tự phân nấm men 11

2.3.2.2 Quá trình sấy 14

2.3.2.3 Một số quá trình khác 16

2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng nghiên cứu của đề tài 17

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 Vật liệu nghiên cứu 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Nội dung nghiên cứu 24

3.2.2 Phương pháp thực hiện 25

3.2.2.1 Khảo sát quá trình lên men theo mẻ 25

3.2.2.2 Khảo sát quá trình lên men liên tục 29

3.2.2.3 Khảo sát quá trình tự phân nấm men 29

3.2.2.4 Khảo sát quá trình sấy phun 31

3.2.2.5 Sản xuất chế phẩm cao nấm men và ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật 33

3.2.3 Các phương pháp phân tích dùng trong thí nghiệm 34

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Khảo sát quá trình lên men theo mẻ 44

4.1.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 44

4.1.2 Tối ưu hóa lên men theo mẻ bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 48

4.2 Khảo sát quá trình lên men liên tục 51

4.3 Khảo sát quá trình tự phân nấm men 53

4.4 Khảo sát quá trình sấy phun 60

4.5 Ứng dụng cao nấm men làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật 66

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70

PHỤ LỤC 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PTHQ Phương trình hồi quy

QHTN Quy hoạch thực nghiệm

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của cao nấm men 10

Bảng 3.1 Các mức và khoảng biến thiên 26

Bảng 3.3 Thống kê các hệ số bi và i 28

Bảng 3.4 Bố trí quy hoạch thí nghiệm theo gradient của mật độ tế bào 29

Bảng 4.1 Tương quan giữa giá trị OD và log mật độ tế bào 46

Bảng 4.2 Mật độ tế bào nấm men theo thời gian nuôi cấy 46

Bảng 4.3 Mật độ tế bào nấm men ở các chế độ lắc và tỉ lệ giống khác nhau 47

Bảng 4.5 Giá trị thực hiện tại tâm phương án 48

Bảng 4.6 Giá trị phương sai và phân bố theo Student 49

Bảng 4.8 Quy hoạch thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ tế bào 50

Bảng 4.9 Các thông số của quá trình lên men liên tục 51

Bảng 4.10 OD và mật độ tế bào theo thời gian theo dõi 53

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến hiệu suất tự phân 54

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của protease đến hiệu suất tự phân 55

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tự phân 56

Bảng 4.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tự phân 57

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất tự phân tế bào nấm men 58

Bảng 4.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến quá trình sấy phun 60

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của vận tốc nhập liệu đến quá trình sấy phun 62

Bảng 4.18 Ảnh hưởng của áp suất phun đến quá trình sấy phun 64

Bảng 4.20 Đánh giá chất lượng cao nấm men 67

Bảng 4.21 Giá trị OD theo thời gian nuôi cấy khi sử dụng các chế phẩm khác

nhau

68

Bảng 6.1 Lượng nitơ tổng số theo các độ pha loãng khác nhau 75

Bảng 6.2 Hiệu suất tự phân tế bào nấm men ở các độ pha loãng khác nhau 76

Bảng 6.3 Hiệu suất tự phân tế bào nấm men ở các nồng độ enzyme khác

nhau

76

Bảng 6.4 Hiệu suất tự phân tế bào nấm men ở các khoảng pH khác nhau 77

Bảng 6.5 Hiệu suất tự phân tế bào nấm men ở nhiệt độ khác nhau 77

Bảng 6.6 Hiệu suất tự phân tế bào nấm men theo thời gian 78

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Đường chuẩn giá trị OD và log mật độ tế bào nấm men 46

Đồ thị 4.2 Đường cong sinh trưởng của nấm men S cerevisiae 46

Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng đến hiệu suất tự phân 54

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của protease đến hiệu suất tự phân 55

Đồ thị 4.5 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tự phân 56

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất tự phân 57

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất tự phân tế bào nấm men 58

Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến độ ẩm bột chiết nấm men 61

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hiệu suất thu hồi 61

Đồ thị 4.10 Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun đến độ ẩm 63

Đồ thị 4.11 Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun đến hiệu suất thu hồi 63

Đồ thị 4.12 Ảnh hưởng của áp suất phun đến độ ẩm bột chiết nấm men 65

Đồ thị 4.13 Ảnh hưởng của áp suất phun đến hiệu suất thu hồi 65

Đồ thị 4.14 Giá trị OD theo thời gian nuôi cấy khi sử dụng các chế phẩm

Hình 2.2 Các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 11

Hình 2.3 Sơ lược các nghiên cứu về nấm men S cerevisiae 22

Hình 3.3 Quy trình sản xuất cao nấm men 33

Hình 4.1 S cerevisiae dưới kính hiển vi 44

Hình 4.3 Cấy chuyền nấm men S cerevisiae 45

Hình 5.1 Quy trình hoàn chỉnh sản xuất cao nấm men 72

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, ngành công nghệ vi sinh vật đang phát triển rất mạnh và đem lại những hiệu quả kinh tế to lớn Các sản phẩm của công nghệ vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm, công nghệ chế biến dầu khí, trong bảo vệ môi trường… Việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật sinh sản và phát triển là rất quan trọng Nó sẽ quyết định đến sự tăng hay giảm sinh khối vi sinh vật để từ đó tạo ra những sản phẩm mong muốn

Một trong những thành phần của môi trường cần thiết cho sự sinh sản và phát triển của vi sinh vật là nitơ ở dạng amin Lượng nitơ amin này có thể được cung cấp từ nước thịt, pepton hoặc từ thực vật (các cây họ đậu giàu nitơ như đậu nành, đậu phộng) Như vậy, môi trường dinh dưỡng sẽ đắt tiền và sản phẩm do vi sinh vật tổng hợp nên sẽ có giá thành cao Mặt khác, sử dụng các môi trường dinh dưỡng như trên sẽ không có ý nghĩa kinh tế vì nguồn nguyên liệu dùng làm môi trường liên quan đến vấn đề lương thực thực phẩm của loài người

Ở Việt Nam, chế phẩm cao nấm men dùng trong pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật vẫn còn phải nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao, trong khi kỹ thuật sản xuất chế phẩm cao nấm men ta hoàn toàn nắm bắt được Nhu cầu này mở ra một hướng mới trong nghiên cứu tạo sản phẩm cao nấm men nhằm cung cấp cho các phòng thí nghiệm, chế phẩm này đòi hỏi sự tinh khiết nên cần một lượng sinh khối nấm men có chất lượng tốt để tiến hành sản xuất

Xuất phát từ nhu cầu thực tế nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Lên men liên tục

thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae và ứng dụng trong sản xuất chế phẩm

cao nấm men” với mục đích thu nhận nguồn nitơ amin cung cấp cho ngành công nghệ vi

sinh vật Sản phẩm có thể ở dạng lỏng, paste, hay dạng bột Chúng tôi chọn sản phẩm dạng bột vì sản phẩm dạng này có khả năng bảo quản và vận chuyển dễ dàng hơn các dạng khác

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Thu nhận sinh khối nấm men bằng phương pháp lên men liên tục

- Tạo sản phẩm cao nấm men dạng bột, ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy để thu nhận sinh khối

Saccharomyces cerevisiae trong lên men theo mẻ Tối ưu hóa bằng phương pháp

quy hoạch thực nghiệm

- Áp dụng các yếu tố tối ưu này vào lên men liên tục đồng thời khảo sát tốc độ pha loãng thích hợp, kiểm tra sự ổn định của hệ thống

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân nấm men có bổ sung chế phẩm enzyme

- Khảo sát quá trình sấy phun tạo sản phẩm dạng bột

- Bước đầu ứng dụng sản phẩm cao nấm men sản xuất được trong nuôi cấy vi sinh vật

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Tạo sản phẩm cao nấm men tinh khiết, có chất lượng cao

- Sản phẩm giàu nitơ amin, ứng dụng trong pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy

vi sinh vật

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thu nhận sinh khối nấm men

2.1.1 Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men

- Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota và

thuộc giới nấm

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước

nhỏ, từ 5-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử

- Nấm men Saccharomyces gồm những thành phần chủ yếu sau:

có thể có hại cho tế bào Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin dị truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy ra trong ty thể cũng nằm trong tế bào chất Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào [2, 5]

2.1.2 Thành phần hóa học của tế bào nấm men

Thành phần hoá học của tế bào nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môi trường nuôi cấy và tình trạng sinh lý của tế bào Men ép chứa trung bình khoảng 75% nước và 25% chất khô Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần sau:

Protein: chiếm khoảng 40 – 60% chất khô trong nấm men Protein nấm men gần giống như protein nguồn gốc động vật, chứa khoảng 20 acid amin và có đầy đủ các acid amin

2.1.3 Môi trường nuôi cấy nấm men

Sử dụng môi trường Hansen để nuôi cấy nấm men, gồm glucose, peptone, K2HPO4, MgSO4.7H2O, agar và nước cất, pH = 5.4 – 6.4 là thích hợp theo tỉ lệ như sau:

Peptone : 10g/L

K2HPO4 : 3g/L MgSO4.7H2O : 3g/L Nước cất : đủ 1L

2.2 Lên men liên tục

2.2.1 Hệ thống lên men

Tùy vào loại sản phẩm, loại vi sinh vật, loại cơ chất, động học của quá trình lên men

mà cấu tạo, phương thức hoạt động của các fermenter sẽ khác nhau

Phân loại fermenter theo cách thức nhập liệu và tháo liệu ta có:

- Fermenter làm việc gián đoạn: Đây là dạng fermenter có cơ chất được đưa vào một lần từ đầu quá trình lên men Quá trình lên men diễn ra trong một hệ kín, không có nhập liệu cũng như tháo liệu Sản phẩm chỉ được lấy ra khi kết thúc thời gian lên men

- Fermenter làm việc liên tục: Cơ chất được đưa vào và sản phẩm tháo ra liên tục

- Fermenter làm việc bán liên tục: đây là dạng fermenter có cơ chất được nhập liệu theo chu kì, ngoài lượng cơ chất được nhập liệu ban đầu thì sẽ có một lượng cơ chất bổ sung trong khi đang tiến hành lên men Sản phẩm được tháo ra vào cuối giai đoạn lên

men Thời gian giữa các lần bổ sung cơ chất sẽ được tính toán để thu được hiệu quả cao nhất

Hình 2.1 Fermenter làm việc liên tục [20]

2.2.2 Động học của quá trình nuôi cấy trong fermenter

2.2.2.1 Sơ lược về nuôi cấy gián đoạn

Khi vi sinh vật được nuôi cấy gián đoạn, quá trình sinh trưởng và phát triển sẽ theo các pha:

- Pha lag: pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy cho đến khi vi sinh vật đạt được tốc

độ sinh trưởng cực đại Trong pha lag vi sinh vật chưa phân chia mạnh, nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt

- Pha log: trong pha này vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, sinh khối vi sinh vật tăng theo hàm mũ:

No: mật độ vi sinh ban đầu, T: thời gian thế hệ, a: hệ số (1 < a ≤ 2), t: thời gian nuôi cấy

- Pha ổn định: quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi, tế bào cũng giữ được sự ổn định về kích thước và khối lượng Kết quả là sinh khối được giữ ở mức ổn định

2.2.2.2 Nuôi cấy liên tục

Giả sử ta có thiết bị lên men làm việc liên tục với thể tích là V (lít) và lưu lượng của dòng môi trường chảy vào bình lên men và dòng tháo sản phẩm là F (lít/giờ)

Trong quá trình lên men sẽ có hai quá trình ảnh hưởng đến lượng sinh khối vi sinh vật có trong thiết bị lên men Đó là quá trình tháo liệu sản phẩm liên tục và quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Ta sẽ xét cân bằng vật chất của thiết bị lên men khi hai trạng thái này độc lập với nhau

Nếu chỉ có quá trình tháo liệu xảy ra (xem như vi sinh vật không có bất cứ họat động sinh lý nào: sinh trưởng, phát triển hay chết đi) Vi sinh vật bị lấy ra khỏi bình nuôi cấy với vận tốc v-

Ở đây X là mật độ tế bào (g/l hay tế bào/ml) D là tốc độ pha loãng (1/h), là tốc độ cấp môi trường trên thể tích bình nuôi

D = F/V Nếu chỉ xét quá trình phát triển của vi sinh vật, không xét đến quá trình tháo liệu thì vi sinh vật sẽ phát triển và tăng sinh khối theo phương trình Monod:

v+, v-: g/l.h hay tế bào/ml.h

Với µ (1/h) là tốc độ gia tăng sinh khối, µ xác định bằng phương trình Monod

Tuy nhiên cả hai quá trình diễn ra đồng thời nên ta có sự biến thiên sinh khối của

vi sinh khối vật là:

Vận tốc biến thiên sinh khối

Nếu µ > D, giá trị v = dX/dt có giá trị dương, nghĩa là nồng độ vi sinh vật trong bình tăng Ngược lại, nếu µ < D, v sẽ có giá trị âm và nồng độ vi sinh vật trong bình giảm.Trong trường hợp µ = D ta có v = 0, nghĩa là nồng độ vi sinh vật không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học [9]

Nếu duy trì sao cho µ luôn luôn bằng D trong thiết bị, ta sẽ thu được quần thể vi sinh vật sinh trưởng và phát triển ở một mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian Trong trường hợp như vậy, không những kích thước trung bình của tế bào, trạng thái sinh lý của chúng mà thành phần môi trường nuôi cấy cũng không phụ thuộc vào thời gian Điều này, một mặt tạo điều kiện cho nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của

tế bào vi sinh vật, mặt khác cải thiện quá trình sản xuất vi sinh vật ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên điều này đòi hỏi phải có hệ thống cảm biến theo dõi và hệ thống điều khiển tự động Vì vậy trong nuôi cấy, có hai dạng thiết bị là chemostass và turbidostass

- Chemostass là thiết bị lên men có tốc độ nhập liệu được thiết lập sẵn, tốc độ này tương thích với tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong thiết bị lên men nên bảo đảm cho quá trình nuôi cấy đạt một mức độ ổn định tương đối Các thông số của quá trình lên men có thay đổi nhưng chỉ dao động ở một mức độ nhỏ so với giá trị ổn định Nếu xem các biến đổi này là không đáng kể thì quá trình làm việc không phụ thuộc vào thời gian

- Turbidostass hoạt động dựa trên nguyên lý duy trì một hay vài thông số nào đó của canh trường nuôi cấy ở giá trị không đổi Tốc độ nhập liệu sẽ được hệ thống điều khiển tự động thay đổi sao cho thông số đó luôn được duy trì ở giá trị đặt sẵn Thông số của canh trường thường được cài đặt là:

hệ phụ thuộc chặt chẽ với nhau thì cả hệ thống hoạt động độc lập với thời gian

Tóm lại, ở thiết bị lên men liên tục, khi quá trình nuôi cấy đạt trạng thái ổn định thì các thông số như nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ vi sinh vật… là các đại lượng không phụ thuộc thời gian (hoàn toàn hay gần đúng)

Vì tiến hành nhập liệu và tháo sản phẩm liên tục nên thời gian lên men trong thiết

bị làm việc liên tục là một đại lượng không thể xác định được một cách chính xác Chúng

ta chỉ có thể xác định được thời gian lưu trung bình của một phần tử trong thiết bị

Trong suốt thời gian lưu, một phần tử của canh trường có thể tham gia hoạt động lên men, hay không tham gia hoạt động này Mặt khác thời gian lưu của các phần tử trong thiết bị cũng không như nhau, đặc biệt là các thiết bị có vùng chết hay có dòng chảy tắt

Vì vậy đại lượng thời gian lưu kể trên là giá trị trung bình cho tất cả các phần tử Thời gian lưu này được xác định bằng thực nghiệm với tiêu chuẩn là độ chuyển hóa mong muốn Khi đó lưu lượng dòng nhập liệu (hay tháo sản phẩm) được tính toán để phù hợp với công thức sau:

T = V/F

Với V: thể tích dung dịch chứa trong thiết bị

F: lưu lượng nhập liệu, tháo sản phẩm

T: thời gian lưu [11]

2.2.2.3 So sánh fermenter liên tục và gián đoạn

Ứng với cùng một độ chuyển hóa mong muốn thì thời gian lưu cần thiết trong thiết

bị liên tục ngắn hơn so với thời gian lên men trong thiết bị gián đoạn Hay nói cách khác nếu ta cho thời gian lưu bằng thời gian lên men thì độ chuyển hóa trong thiết bị liên tục sẽ cao hơn và năng suất sản phẩm tương ứng cũng cao hơn Ngoài ra có một số sản phẩm

của quá trình lên men có khả năng ức chế ngược phản ứng tạo ra chúng, là chất độc đối với vi sinh vật Nếu quá trình lên men thu nhận enzyme thì enzyme tồn tại trong canh trường sẽ tham gia xúc tác phản ứng sinh hóa và giảm hoạt tính rất nhanh Vì vậy nếu sản phẩm lên men được lấy ra liên tục thì sẽ làm giảm các ảnh hưởng trên và cải thiện năng suất

Ngoài ra thiết bị lên men liên tục còn có ưu điểm sau: quá trình lên men liên tục cho sản phẩm đồng đều về chất lượng và năng suất, trong khi quá trình lên men gián đoạn thì không đạt được như vậy Cho dù hiện nay, các hệ thống điều khiển kiểm soát đã co nhiều thành tựu nhưng vấn đề này vẫn còn tồn tại Người ta thường giải quyết bằng cách trộn các mẻ lên men với nhau

Tuy nhiên, thiết bị làm việc gián đoạn cũng có những ưu điểm so với thiết bị liên tục:

- Thích hợp với sản xuất có năng suất thấp, đặc biệt trong sản xuất dược phẩm, các nhóm sản phẩm quý, sản phẩm đắt tiền như enzyme giới hạn (RE)

- Các quá trình lên men có thời gian lên men dài thì bắt buộc phải lên men gián đoạn vì giới hạn của kích thước thiết bị, không thể tiến hành lên men liên tục Giả sử quá trình lên men bia liên tục với năng suất 1000 l/h thì đòi hỏi thiết bị lên men có thể tích

700 m3

- Thiết bị lên men gián đoạn khá linh động, có thể sử dụng để lên men nhiều nhóm sản phẩm khác nhau Trong khi đó thiết bị lên men liên tục là hệ thống có tính linh động thấp vì nó là một tập hợp hoàn chỉnh các cơ cấu lên men, nhập liệu, tháo liệu ăn khớp và tương thích với nhau cũng như tương thích với một hay một nhóm sản phẩm cụ thể [11]

2.3 Cao nấm men và ứng dụng

2.3.1 Giới thiệu về cao nấm men

Cao nấm men là tập hợp những chất có thể hòa tan trong nước được thu nhận từ quá trình phân hủy tế bào nấm men, sau đó được làm khô bằng phương pháp sấy phun hoặc sấy chân không, sản phẩm của quá trình là cao nấm men tồn tại ở dạng bột hoặc dạng hạt Cao nấm men có thể được sản xuất từ bã thải nấm men bia hoặc từ sinh khối nấm men bánh mì Việc lựa chọn nguồn nguyên liệu nấm men phụ thuộc vào giá thành, thành phần hóa học của nấm men cũng như các yêu cầu về chất lượng sản phẩm Chẳng hạn như bã

thải nấm men bia có giá thành thấp hơn sinh khối nấm men bánh mì nhưng phải tốn chi

phí cho việc xử lý bã trước khi tự phân và sản phẩm cao nấm men có hương vị kém hấp

dẫn hơn Do đó, nếu cao nấm men dùng để bổ sung vào thực phẩm thì nên dùng nguyên

liệu là sinh khối nấm men bánh mì Còn cao nấm men dùng cho các mục đích khác, chẳng

hạn như bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật thì có thể dùng nguyên liệu là bất kỳ

các sinh khối nấm men nào

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của cao nấm men

Thành phần (% khối lượng) Giá trị

Ngoài ra trong cao nấm men còn có chứa các acid amin, các vitamin và acid nucleic

Cao nấm men được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực:

- Y học: được sản xuất dưới dạng viên nang, viên bọc đường nhằm bổ sung acid

amin cho người già và trẻ em

- Sinh học: là nguồn dinh dưỡng bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật ở quy

mô phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất Ở nước ta, lượng cao nấm men sử dụng

trong lĩnh vực này là rất lớn

- Công nghệ thực phẩm: do cao nấm men có mùi thịt và hàm lượng acid amin cao

nên được bổ sung vào thức ăn trẻ em, bánh snack, soup, patê, xúc xích, cá đóng

hộp… nhằm tạo hương vị thịt cho sản phẩm

2.3.2 Quy trình trong công nghệ sản xuất cao nấm men

2.3.2.1 Quá trình tự phân nấm men

a Các phương pháp phá thành tế bào nấm men

Do thành tế bào nấm men có cấu tạo tương đối bền vững nhờ các mối liên kết giữa glucan, mannan và protein nên nguồn protein của nấm men khó được hấp thu Để sử dụng được nguồn protein này, người ta phải tìm cách giải phóng protein ra khỏi tế bào bằng cách phá vỡ thành tế bào nấm men Một số phương pháp dùng trong phá vỡ thành tế bào nấm men:

Hình 2.2 Các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men [13]

Phương pháp cơ học: dễ thực hiện, thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm, có

ưu điểm là không phá hủy thành phần sinh học của dịch chiết và không làm mất hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất tự phân không cao, cần nhiều máy móc thiết bị

Phương pháp nhiệt lạnh: dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, dễ kiểm soát quá trình, không

bị nhiễm các chất lạ, chi phí thấp Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thủy phân không cao và thời gian kéo dài

Phương pháp hóa học: hiệu suất tự phân tương đối cao nhưng việc lựa chọn dung môi

cần lưu ý đến mức độ độc hại đối với cơ thể, tính ăn mòn đối với thiết bị cũng như việc

nó phá hủy các thành phần dinh dưỡng của dịch chiết, vấn đề loại bỏ các chất ra khỏi sản phẩm sau quá trình tự phân

Phương pháp hóa sinh (dùng chế phẩm enzyme): quá trình phân cắt các hợp chất cao

phân tử sẽ nhanh hơn rất nhiều, do đó rút ngắn được thời gian tự phân Do tính đặc hiệu của enzyme nên việc tinh sạch sản phẩm sau quá trình tự phân sẽ dễ dàng

Phương pháp sinh học: sử dụng hệ enzyme của chính tế bào nấm men để thủy phân cơ

chất là những chất cấu tạo nên tế bào Khi tế bào nấm men chết sẽ diễn ra sự tự phân Tuy nhiên, quá trình này thường kéo dài và dịch tự phân dễ bị nhiễm các vi sinh vật lạ [13]

b Quá trình tự phân nấm men

Quá trình tự phân là quá trình phân giải vật chất tế bào dưới tác động của chính các enzyme của tế bào đó Ở nhiệt độ và pH thích hợp, các enzyme này sẽ xúc tác quá trình phân cắt các hợp chất cao phân tử như: protein, polysaccaride, lipid thành các hợp chất có phân tử lượng thấp hơn Quá trình tự phân sẽ xảy ra mạnh hơn khi thành tế bào bị phá vỡ

vì lúc đó các enzyme chứa trong không bào sẽ được giải phóng và tiếp xúc với cơ chất Trong công nghệ sản xuất cao nấm men, ta quan tâm chủ yếu đến quá trình thủy phân protein

Dịch tự phân rất giàu dinh dưỡng, là môi trường tốt cho vi sinh vật phát triển Do đó khi tiến hành tự phân cần phải kiểm soát thời gian để có hiệu quả cao nhất Nếu quá trình

tự phân không được kiểm soát về thời gian, nhiệt độ… thì sản phẩm cuối cùng ngoài acid amin, peptid mạch ngắn, còn có các sản phẩm của quá trình oxy hóa khử, quá trình deamin hóa… gây mùi khó chịu làm giảm giá trị dinh dưỡng và cảm quan của dịch tự phân

Thông thường người ta kiểm tra quá trình tự phân bằng cách theo dõi sự biến đổi hàm lượng N amin theo thời gian

c Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân

- Tỉ lệ pha loãng: quyết định khả năng khuếch tán và độ nhớt của dịch tự phân, quan

trọng hơn cả là tỉ lệ pha loãng quyết định nồng độ cơ chất của dịch tự phân, do đó quyết định tốc độ phản ứng

- pH của môi trường: enzyme rất mẫn cảm đối với sự thay đổi pH của môi trường

Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định là vùng pH tối thích của enzyme Vì vậy, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ phản ứng tự phân, quyết định đến trạng thái ion hóa của phân tử enzyme nói chung hay các nhóm hoạt động (tâm hoạt động) nói riêng, làm thay đổi cấu trúc của tâm hoạt động Đồng thời pH cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất, độ bền của protein Như vậy

pH thích hợp cho môi trường tự phân sẽ được chọn sao cho gần với pH tối thích của enzyme

- Nhiệt độ: nhiệt độ có liên quan đến áp suất thẩm thấu, khi tăng nhiệt độ thì áp suất

thẩm thấu cũng tăng, đẩy nhanh quá trình chiết rút dịch bào Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng trong giới hạn cho phép thì tốc độ phản ứng tăng, khi vượt quá giới hạn này thì tốc độ phản ứng giảm Đó là do protein bị biến tính, làm enzyme mất hoạt tính, như vậy, cần tìm nhiệt độ tối ưu cho quá trình tự phân nhằm thu được hiệu suất thủy phân protein là cao nhất

- Thời gian: Khi tăng thời gian thì hiệu suất quá trình tự phân sẽ tăng nhưng nếu thời

gian quá dài thì hệ vi sinh vật lạ bị nhiễm trong dịch tự phân sẽ phát triển gây ra mùi khó chịu, làm giảm giá trị dinh dưỡng và cảm quan của dịch tự phân Do đó, cần tìm thời gian tối ưu cho quá trình tự phân nhằm thu được hiệu suất thủy phân protein là cao nhất

- Hệ enzyme protease: Phản ứng thủy phân protein có vai trò quan trọng trong nhiều

ngành công nghiệp Sự thủy phân protein được thực hiện bởi các protease có sẵn trong nguyên liệu động thực vật, do vi sinh tiết ra hoặc do bổ sung vào môi trường phản ứng dưới dạng protease

 Peptidase (exopeptidase): thủy phân các liên kết peptid ở hai đầu mạch tạo thành các acid amin, enzyme có tính đặc hiệu hẹp hơn

Căn cứ vào acid amin ở trung tâm hoạt động của phân tử enzyme, người ta chia hệ protease ra 4 nhóm sau:

 Protease – serine: ở trung tâm hoạt động có 1 gốc serine và 1 gốc histidine, các enzyme này có pH hoạt động từ 7 – 10, gọi là protease kiềm, điển hình như: trypsin, chymotrypsin…

 Protease – cystein: có gốc cystein trong trung tâm hoạt động, trực tiếp tham gia xúc tác phản ứng thủy phân, pH hoạt động từ 4.5 – 10, điển hình như bromelin, papain…

 Protease – metalo: trung tâm hoạt động của các enzyme này có chứa các ion kim loại, trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác, điển hình như: prolinase, aminopeptidase…

 Protease – aspartic: trung tâm hoạt động của các enzyme này có chứa nhóm carboxyl tham gia xúc tác phản ứng, điển hình như: pepsin, renin…

Các chế phẩm protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau: công nghiệp chế biến thịt, sữa, công nghiệp da, sản xuất tơ tằm, chất tẩy rửa, mỹ phẩm, trong y học [4]

2.3.2.2 Quá trình sấy

Sấy là quá trình tách pha loãng (làm bốc hơi nước) ra khỏi vật liệu bằng phương pháp nhiệt Vì dịch chiết nấm men chứa nhiều các acid amin, peptid, vitamin… là những chất mẫn cảm với nhiệt nên thiết bị có thể dùng để sấy là thiết bị sấy chân không hoặc sấy

phun Hàm lượng ẩm của sản phẩm sau khi sấy khoảng 4% Trong quá trình sấy có thể xảy ra một số các biến đổi về màu sắc và mùi vị cũng như có sự thay đổi hàm lượng các chất so với ban đầu do xảy ra một số các phản ứng hóa học như phản ứng phân hủy amin, phản ứng tạo melanoidin…

a Sấy chân không

Là phương pháp sấy tiếp xúc, nhiệt lượng được truyền đến vật liệu bằng cách cho vật liệu tiếp xúc trực tiếp với bề mặt được đốt nóng Các đĩa sắp xếp chồng lên nhau được đặt trong buồng chân không Áp suất chân không được tạo ra nhờ hệ thống bơm chân không, Vật liệu dưới dạng dung dịch 40 – 50% chất khô đi vào phễu nhập liệu, nhờ bộ phận điều chỉnh lưu lượng rơi từ từ xuống đĩa sấy trên cùng Khi đĩa quay, vật liệu san bằng trên bề mặt một lớp có chiều dày nhất định Trục quay hết một vòng, vật liệu nhờ cào gạt từ đĩa trên rơi xuống đĩa dưới và cứ tiếp tục như vậy, vật liệu đi từ đĩa sấy trên cùng xuống đĩa sấy cuối cùng, sau đó vào đường ống tháo liệu để tháo ra ngoài Sau khi sấy, qua quá trình nghiền và rây, thu được sản phẩm dạng hạt Thiết bị sấy chân không có cấu tạo phức tạp, đắt tiền hơn thiết bị sấy làm việc ở áp suất thường, được sử dụng cho những nguyên liệu

dễ bị oxy hóa, chất nổ hay chất có dung môi độc [3, 10]

b Sấy phun

Nguyên lý chung: sấy phun dùng để sấy các dạng dung dịch và huyền phù trong trạng

thái phân tán Thiết bị sấy phun có kết cấu tương đối phức tạp, trong đó quá trình sấy xảy

ra rất mãnh liệt Sự trao đổi nhiệt ẩm xảy ra ngay trong lòng thể tích các giọt lỏng Dòng nhập liệu được phân tán thành những hạt nhỏ li ti nhờ cơ cấu phun sương Cơ cấu phun sương thường có dạng đĩa quay hoặc vòi áp lực Những giọt lỏng được phun ra ngay lập tức sẽ tiếp xúc với dòng khí nóng, kết quả là hơi nước được bốc đi nhanh chóng nhưng nhiệt độ của vật liệu vẫn duy trì ở mức thấp, nhờ vậy mà vật liệu được sấy khô nhưng không làm thay đổi đáng kể tính chất của sản phẩm Sản phẩm của sấy phun có dạng bột mịn Thời gian sấy khô các hạt lỏng dạng sương trong sấy phun nhanh hơn nhiều so với các quá trình sấy khác [16, 18]

Sấy phun gồm ba giai đoạn cơ bản sau:

- Quá trình phân tán dòng nhập liệu thành những hạt sương nhỏ li ti (sự phun sương)

- Sự hòa trộn giữa vật liệu và không khí nóng, đồng thời xảy ra quá trình bốc hơi nước

- Quá trình thu hồi sản phẩm từ dòng khí ra

Ưu điểm của quá trình sấy phun:

- Tính chất và chất lượng của sản phẩm đạt được tốt hơn

- Có thể sấy được những thực phẩm, chế phẩm sinh học, dược phẩm mẫn cảm với nhiệt,

do thời gian sấy rất nhanh, khí nén dùng là không khí hoặc khí trơ

- Thiết bị đơn giản, cho phép hoạt động ở năng suất cao và liên tục

- Sản phẩm tiếp xúc với bề mặt thiết bị trong điều kiện khô, vì thế việc chọn vật liệu chống ăn mòn cho thiết bị đơn giản hơn

- Sản phẩm sau khi sấy đồng nhất, chất lượng ít bị biến đổi so với nguyên liệu ban đầu

- Khoảng nhiệt độ tác nhân sấy khá rộng từ 150 – 600oC nhưng hiệu quả tương tự các loại thiết bị khác

Nhược điểm:

- Sấy phun không thuận lợi cho những sản phẩm có tỉ trọng lớn

- Không linh động, một thiết bị được thiết kế cho sản xuất sản phẩm có kích thước nhỏ thì không thể dùng để sản xuất các sản phẩm có kích thước lớn hơn

- Vốn đầu tư cao hơn các loại khác

- Việc thu hồi sản phẩm và bụi làm tăng chi phí cho quá trình sấy

b Pha loãng

Quá trình pha loãng tạo điều kiện cho quá trình tự phân diễn ra tốt nhất, tỉ lệ pha loãng càng cao thì khả năng khuếch tán của các chất càng dễ nên quá trình tự phân có hiệu suất càng cao Tuy nhiên tỉ lệ pha loãng quá cao sẽ tăng chi phí cho quá trình cô đặc tiếp theo trong quy trình công nghệ

c Ly tâm

Sau quá trình tự phân, trong dịch chiết nấm men có chứa rất nhiều thành phần như các chất hòa tan, các chất không hòa tan, tế bào nấm men chưa tự phân, thành tế bào, các mảnh vụn tế bào và các tạp chất khác Vì vậy ta phải tiến hành ly tâm để loại bỏ những chất không tan này Có thể sử dụng phương pháp ly tâm lắng hoặc ly tâm lọc Trong quá trình sản xuất cao nấm men, người ta thường sử dụng phương pháp ly tâm lắng Tốc độ ly tâm khoảng 3000 – 4000 vòng/phút

d Cô đặc

Là quá trình làm bốc hơi nước nhằm làm tăng nồng độ chất khô của dịch chiết đến nồng độ thích hợp cho quá trình sấy tiếp theo Ngoài ra, quá trình cô đặc còn hạn chế sự phát triển của vi sinh vật kéo dài thời gian bảo quản dịch chiết nấm men Dịch chiết nấm men sau khi cô đặc phải đạt được nồng độ 40oBx Để tránh sự tổn thất của các cấu tử mẫn cảm với nhiệt độ trong dịch chiết, người ta sử dụng thiết bị cô đặc chân không Nhiệt độ của quá trình cô đặc không quá 70oC Người ta có thể tiến hành sấy phun dịch chiết nấm men không cần qua giai đoạn cô đặc, tuy nhiên chi phí năng lượng cho quá trình sấy sẽ tăng lên rất nhiều

e Lọc

Quá trình lọc thường được tiến hành ngay sau quá trình cô đặc để loại bỏ những kết tủa do protein biến tính và các cặn mịn còn lại nhằm mục đích làm sạch và nâng cao chất lượng của dịch chiết nấm men, giúp cho quá trình sấy phun được thực hiện dễ dàng hơn

2.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng nghiên cứu của đề tài

Một số hướng ứng dụng của sinh khối nấm men S cerevisiae đang được quan tâm là

khả năng lên men cồn từ thực vật trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau cũng như khả năng hấp thu kim loại nặng của tế bào nấm men, theo một số nghiên cứu như sau:

Antonius J A van Maris và Derek A Abbott (2006) đã tìm hiểu quá trình lên men

cồn bởi S cerevisiae, sử dụng nguồn Carbon từ sinh khối thực vật thủy phân Sản xuất nhiên liệu etanol bằng cách thủy phân sinh khối thực vật, sử dụng S cerevisiae là một

hướng đi có ý nghĩa quan trọng về mặt kinh tế và môi trường Nghiên cứu này tóm lược tình hình sản xuất và triển vọng của quá trình lên men cồn với nguyên liệu chính là

monosaccharide có nguồn gốc từ sinh khối thực vật Chủng S cerevisiae hoang dại có

khả năng lên men glucose, mannose và fructose qua con đường thủy phân Embden – Meyerhof, trong khi galactose được lên men bằng con đường Leloir Cấu trúc của tế bào nấm men có khả năng chuyển hóa hiệu quả những nguồn cơ chất thực vật khác nhau thành etanol vẫn còn là một câu hỏi lớn trong kỹ thuật trao đổi chất Nguồn cơ chất dồi dào nhất vẫn là xylose Những nghiên cứu gần đây về kỹ thuật chuyển hóa và tiến hóa của

các chủng S cerevisiae cho thấy một loại enzyme isomerase xylose đã giúp quá trình lên

men xảy ra nhanh chóng và hiệu quả Khả năng lên men arabinose, theo con đường giống

như của prokaryote trong S cerevisiae, cũng đã được thiết lập nhưng cần tối ưu hóa các

thông số trước khi xem xét để áp dụng ở quy mô công nghiệp Ngoài ra, phương pháp

chuyển hóa acid galacturonic và lên men rhamnose bởi S cerevisiae đang được thảo

luận Thách thức lớn là cần phải đạt được sự chuyển đổi nhanh chóng từ các thí nghiệm trong điều kiện nghiên cứu (môi trường tổng hợp, cơ chất đơn hoặc hỗn hợp cơ chất đơn giản, không có chất ức chế độc hại) sang sử dụng hỗn hợp cơ chất phức tạp công nghiệp

và vi sinh vật có thể phát triển trong điều kiện có chất ức chế [14]

Karl Esser và cộng sự (2004) cũng nghiên cứu quá trình sản xuất cồn từ sinh khối các

chủng nấm men hoang dại và chủng đột biến trong điều kiện lên men hiếu khí và kỵ khí

Để kiểm tra khả năng lên men cồn trong điều kiện hiếu khí, người ta nghiên cứu trên ti

thể của 4 chủng S cerevisiae đột biến về khả năng hô hấp và kiểm tra lượng cồn cũng

như sinh khối tạo thành Các chủng hoang dại tương ứng cũng được kiểm tra trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí Người ta cho tế bào ngừng hô hấp bằng cách ức chế con đường dị hóa Các số liệu cho thấy các chủng đột biến (hô hấp thiếu khí) tạo ra lượng etanol ít hơn

so với chủng hoang dại nuôi trong điều kiện kỵ khí, nhưng nhiều hơn những chủng này khi nuôi hiếu khí Do đó, có thể nói rằng: vì lý do kỹ thuật, lên men hiếu khí là cần thiết, nhưng việc sử dụng các chủng đột biến ti thể có lợi thế nhất định về kinh tế [24]

Talebnia và Farid (2008) tìm hiểu quá trình sản xuất cồn từ cellulose bằng phương

pháp vi gói nấm men Saccharomyces cerevisiae, trong đó, cellulose là nguồn nguyên liệu

phong phú và nổi bật để sản xuất ethanol với giá rẻ Tuy nhiên, do cấu trúc khó phân hủy của loại nguyên liệu này, giai đoạn tiền xử lý là bắt buộc Tùy thuộc vào loại sinh khối, điều kiện tiền xử lý và thủy phân mà một số sản phẩm phân hủy và các thành phần độc hại có thể được tạo thành và ức chế các vi sinh vật lên men Trong nghiên cứu này, người

ta đề cập đến ứng dụng công nghệ vi gói nấm men để lên men các sản phẩm thủy phân có độc tính cao mà không cần xử lý thêm Các tế bào tự do không sống được trong môi trường có furfural ở nồng độ 5g/l trong môi trường xác định, chất ức chế ở vỏ gỗ và các sản phẩm thủy phân làm ngừng quá trình lên men Nuôi cấy liên tục sản phẩm thủy phân

từ gỗ thành công ở tốc độ pha loãng 0,1 h-1 và phần lớn các tế bào bị mất khả năng tồn tại của mình sau khoảng thời gian gấp 5 lần thời gian lưu Hệ thống tế bào vi gói có thể lên men thành công trong môi trường tổng hợp có 5 g/l furfural khi nuôi cấy mẻ với sản lượng ethanol đạt được khoảng 0,41 - 0,42g/g Tiến hành nuôi cấy trong môi trường có sản phẩm thủy phân đã khử độc, cho thấy glucose và mannose đã được chuyển đổi trong vòng 10h, giai đoạn thích nghi không đáng kể Tuy nhiên, hoạt tính tế bào giảm dần sau các mẻ lên men Nuôi cấy liên tục thu được kết quả tốt hơn, gỗ thủy phân được lên men

bởi S cerevisiae vi gói để sản xuất etanol ở tốc độ pha loãng lên đến 0,5h-1 Hơn 75% các

tế bào vi gói hoạt động tốt trong điều kiện cực đoan Etanol được sản xuất với sản lượng 0,44 g/g , năng suất cụ thể là 0,14-0,17 g /g.h ở tất cả các độ pha loãng

Kết quả theo dõi tác động của việc vi gói nấm men trong mô hình kỵ khí, sự thay đổi

hình thái học và sinh lý của S cerevisiae cho thấy tốc độ tăng trưởng, nồng độ RNA và

protein của tế bào vi gói giảm dần sau các chu kỳ nuôi cấy, trong khi nồng độ carbohydrate tích lũy tăng lên Sau 20 chu kỳ nuôi cấy, nồng độ RNA và protein của tế bào vi gói giảm tương ứng 39% và 24%, trong khi đó nồng độ glycogen và trehalose lại tăng lên [29]

Bên cạnh sản xuất cồn, còn có các nghiên cứu về ứng dụng của nấm men

Saccharomyces cerevisiae trong việc hấp thu kim loại nặng, chẳng hạn như nghiên cứu

của B Volesky, H A May-Phillips Sinh khối Saccharomyces cerevisiae sống và chết

khác nhau ở khả năng hấp thu uranium, kẽm và đồng ở pH tối ưu 4-5 Người ta tiến hành kiểm tra khả năng hấp thu kim loại nặng của nấm men từ dung dịch nước pha loãng Điều

kiện của môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ kim loại, kết quả một số thí nghiệm đạt được là: ở nấm men bia sống và chết: U> Zn> Cd> Cu; men chết: Zn> (Cd)> U> Cu; nấm men sống: Zn> Cu (Cd)> U Nấm men chết tích lũy 0,58 mmol U /g Khả năng hấp thu tốt nhất là nấm men chết, hấp thu kẽm ở mức 0,56 mmol Zn /g Nấm

men S cerevisiae chết loại bỏ nhiều hơn khoảng 40% uranium hoặc kẽm so với các tế bào sống Quá trình hấp thu uranium bởi S cerevisiae xảy ra nhanh chóng, đạt đến 60% giá trị

hấp thu cuối cùng trong 15 phút đầu tiên [15]

M.D Machado và cộng sự tìm hiểu quá trình loại bỏ kim loại nặng nhờ nấm men

Saccharomyces cerevisiae Mục tiêu của thí nghiệm là so sánh khả năng loại bỏ Cu, Ni và

Zn bởi sinh khối nấm men sống và nấm men bị xử lý nhiệt ở 45oC Nghiên cứu động học

đã cho thấy nấm men có thể tích lũy tối đa là Ni2+ và Zn2+ sau 10 phút đối với cả hai loại

tế bào, trong khi khả năng tích lũy Cu2+ tối đa đạt được sau 30 phút đối với nấm men chết

và 60 phút đối với tế bào sống Các nghiên cứu đã cho thấy sinh khối nấm men chết tích lũy Zn2+ và Ni2+ nhiều hơn so với nấm men sống Đối với Cu2+, các tế bào sống và chết có khả năng tích lũy gần như nhau Nghiên cứu bằng huỳnh quang, kính hiển vi điện tử quét

và phổ hồng ngoại đã cho thấy rằng không có sự thay đổi đáng kể nào đối với cấu trúc phân tử tế bào nấm men trong quá trình làm chết tế bào bằng nhiệt độ Sự hấp thu kim loại tăng lên ở các tế bào chết có thể được giải thích bởi khả năng mất tính toàn vẹn của màng tế bào, cho phép các liên kết kim loại tiếp tục hình thành bên trong tế bào Như vậy

có thể kết luận rằng xử lý nhiệt làm chết các tế bào nấm men làm tăng khả năng loại bỏ kim loại nặng so với các tế bào sống, phù hợp với các công trình xử lý sinh học Nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc sử dụng các cụm bông bùn chết trong những công nghệ chi phí thấp để xử lý kim loại trong các dòng nước thải, tạo điều kiện dễ dàng tách tế bào ra khỏi dòng nước [25]

Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về sản phẩm cao nấm men, như nghiên cứu quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase của (Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thẩm Minh Hoàng, Nguyễn Ngọc Tuyết Sương, Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM, 2006) Nghiên cứu này khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase Đầu tiên, sử dụng phương pháp thực nghiệm thay đổi giá trị của một yếu tố và cố định các giá trị của những yếu tố còn lại để xác định điều kiện thích hợp cho quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase Kết quả thu được như

sau: tỉ lệ khối lượng giữa nấm men/dung môi (dung dịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 50oC, pH ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ Khi đó hoạt tính invertase thu được là 94,7 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men Tiếp theo, tối ưu hóa hai yếu tố nhiệt

độ và pH ban đầu của quá trình tự phân bã nấm men bia bằng phương pháp trực giao bậc hai cấu trúc có tâm Kết quả cho thấy giá trị nhiệt độ và pH tối ưu của quá trình tự phân

bã nấm men bia để thu nhận invertase lần lượt là 45oC và 5,5 Khi đó, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme invertase thu được trong dịch tự phân là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt tính/mg protein [8]

Tatjana Vuka Inovi Mili và Marica Rakin cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại enzyme khác nhau (papain và lyticase) trong quá trình thu hồi protein và carbohydrate khi sản xuất cao nấm men từ nấm men bánh mì Tiến hành theo dõi ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến khả năng thu hồi protein và carbohydrate, so sánh với quá trình tự phân của tế bào nấm men (không sử dụng enzyme), từ đó kết luận về điều kiện tối ưu để sản xuất cao nấm men Thực nghiệm cho thấy nồng độ tối ưu của papain và lyticase lần lượt là 2.5 % và 0.025 % [30]

Như vậy, nấm men S cerevisiae có rất nhiều ứng dụng và vẫn là đối tượng được quan

tâm trong các nghiên cứu Có thể khái quát hóa vị trí của những nghiên cứu này trong sơ

đồ sau:

Hình 2.3 Sơ lược các nghiên cứu về nấm men S cerevisiae [8, 14, 15, 19, 25, 28, 29, 30]

Chủng nấm men S cerevisiae S28 sử dụng có nguồn gốc từ Trung tâm lưu giữ giống vi

sinh vật chuẩn, ĐHQG Hà Nội, được giữ giống đông khô tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

3.1.2 Chế phẩm enzyme protease

Sử dụng chế phẩm enzyme protease thương mại Viscozyme (Novozyme)

3.1.3 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường Hansen trong nuôi cấy nấm men S cerevisiae với các thành phần

như sau (môi trường lỏng):

Sucrose : 40g/L Peptone : 10g/L

K2HPO4 : 3g/L MgSO4 : 3g/L Nước cất : đủ 1L Đối với môi trường thạch, bổ sung 20g/L agar

Thành phần môi trường Morris (nuôi cấy Bacillus subtilis trong giai đoạn kiểm tra khả

năng ứng dụng của chế phẩm cao nấm men tự sản xuất):

Cao nấm men : 20g

Nước cất : đủ 1L

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung nghiên cứu:

Gồm 5 nội dung, cụ thể như sau:

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Khảo sát tốc độ pha loãng

Kiểm tra tính ổn định của hệ thống

NỘI DUNG 4:

Khảo sát quá trình

sấy phun

Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào

Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun

Hoạt hóa, kiểm tra và nhân giống

Ứng dụng trong nuôi cấy vi sinh vật Ảnh hưởng của áp suất phun

3.2.2 Phương pháp thực hiện

3.2.2.1 NỘI DUNG 1: Khảo sát quá trình lên men theo mẻ

a Khảo sát điều kiện nuôi cấy

 Thí nghiệm 1.1: Hoạt hóa, kiểm tra chất lượng giống

Tiến hành quan sát vi thể bằng phương pháp nhuộm tế bào, quan sát đại thể trên thạch nghiêng và tiến hành cấy trải để xem xét hình dạng khuẩn lạc Xem xét

kết quả quan sát hình thái có phù hợp với những đặc điểm của S cerevisiae và

có bị nhiễm khuẩn không để dùng ống giống này để nhân giống và giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo

 Thí nghiệm 1.2: Nhân giống cấp 1

Từ ống giống thạch nghiêng, tiến hành cấy chuyền sang ống thạch lỏng và thạch nghiêng để giữ giống và nhân giống cho các thí nghiệm sau Sử dụng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hoặc phương pháp đếm gián tiếp thông qua

số lượng khuẩn lạc để kiểm tra mật độ tế bào trong ống giống cấp 1

 Thí nghiệm 1.3: Xây dựng đường chuẩn để định lượng vi sinh vật

Có thể định lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu hoặc gián tiếp thông qua đếm số lượng khuẩn lạc Để thuận tiện, nên dùng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm, tương ứng với các độ đục khác nhau, từ đó xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa OD610nm

theo mật độ tế bào (tế bào/ml) Dựa vào đường chuẩn này, ta có thể theo dõi thông số mật độ tế bào qua giá trị tương ứng với giá trị độ đục của dịch nuôi cấy

 Thí nghiệm 1.4: Xây dựng đường cong sinh trưởng, từ đó xác định thời

gian nuôi cấy thích hợp

Định lượng tế bào trực tiếp bằng buồng đếm tương ứng với các độ đục khác nhau, khoảng 6 giờ lấy mẫu đo OD một lần, theo dõi trong 48 giờ Dựa vào đường chuẩn OD và mật độ tế bào đã xác định ở trên, ta thiết lập được đường cong sinh trưởng của nấm men (mật độ tế bào theo thời gian theo dõi)

 Thí nghiệm 1.5: Lên men thu sinh khối, từ đó khảo sát điều kiện nuôi cấy

thích hợp

Khảo sát các tỉ lệ giống bổ sung khác nhau: 2, 3, 4, 5%; chế độ khuấy đảo: ở chế

độ tĩnh hoặc ở các chế độ lắc lần lượt là 100, 200 vòng/phút Định lượng sinh khối bằng phương pháp đo độ đục, đếm trực tiếp hoặc cân lượng sinh khối khô

b Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Để nghiên cứu ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến quá trình lên men theo mẻ, chúng tôi tiến hành quy hoạch thực nghiệm các yếu tố toàn phần (TYT) Chọn nhiệt độ lên men là nhiệt độ phòng, thời gian lên men là 24 giờ

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men theo mẻ thu sinh khối S cerevisiae

- x1: tỉ lệ giống bổ sung, %

- x2: chế độ khuấy đảo, vòng/phút

Đáp ứng: mật độ sinh khối tế bào nấm men

Số thí nghiệm phải thực hiện: N = 2k với k là số các yếu tố  N = 22 = 4 thí nghiệm

Để xác định được phương sai tái hiện, phải thực hiện thêm 3 thí nghiệm ở tâm phương

-1

Mức cơ sở

0

Mức trên +1

Tốc độ khuấy (vòng/phút) 0 100 200 100

Ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo x0 = +1 và hệ số tương tác đôi b12được thể hiện ở bảng 3.2

1 2 1 12

m u u

N

b

11

F  với 1 '

2 2

)(

N N

y y S

N i

i i

N’: số hệ số có nghĩa trong phương trình;

yi: giá trị đo được trong thực nghiệm;

F    Nếu Fb > F, kết luận phương trình phù hợp với các

số liệu thực nghiệm

Với p: mức ý nghĩa;

f1: bậc tự do của phương sai dư, f1 = N - N' = 4 -3 =1;

f2: bậc tự do của phương sai tái hiện, f2 = m - 1 = 2

Cuối cùng, tiến hành tối ưu hoá thực nghiệm bằng phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson)

Chọn bước nhảy của yếu tố Z1 là δ1 = 0.1, dựa vào δ1 tính δ2 của Z2 theo công thức:

bi : là hệ số hồi qui của các yếu tố tương quan;

Δi : là khoảng biến thiên của từng yếu tố tương ứng

Bảng 3.3 Thống kê các hệ số bi và i

Tiến hành thí nghiệm theo hướng gradient sẽ thu được các giá trị mật độ tế bào

tương ứng, từ đó kết luận về điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận sinh khối nấm men

Bảng 3.4 Bố trí quy hoạch thí nghiệm theo hướng gradient của mật độ tế bào

3.2.2.2 NỘI DUNG 2: Khảo sát quá trình lên men liên tục

Sử dụng các thông số tối ưu đã thiết lập trong thí nghiệm trên để tiến hành nuôi cấy nấm men trong hệ thống liên tục

- Chuẩn bị hệ thống lên men liên tục

- Tiến hành lên men theo các thông số đã xác định trong quy hoạch thực nghiệm (về tỉ lệ giống và chế độ sục khí)

- Tiến hành lên men với thời gian lưu phù hợp với kết quả trong thí nghiệm khảo sát điều kiện nuôi cấy theo mẻ

- Tiến hành đo OD mỗi ngày, xác định mật độ tế bào nấm men tương ứng, từ đó kết luận về tính ổn định của hệ thống

3.2.2.3 NỘI DUNG 3: Khảo sát quá trình tự phân nấm men

 Thí nghiệm 3.1 : Khảo sát tỉ lệ pha loãng

- Sinh khối nấm men thu được sau lên men liên tục (80% ẩm), khối lượng 9g/mẫu

- Lượng chế phẩm protease: 0.4% (tính trên khối lượng nấm men)

- pH môi trường tự phân 5.0, nhiệt độ tự phân 45oC