Khảo sát quá trình lên men rượu sake và ứng dụng trong điều kiện việt nam

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Khảo sát chất lượng của Koji được làm từ gạo Việt Nam so với gạo Nhật Khảo sát chất lượng của rượu Sake lên men từ nguyên liệu gạo Việt Nam so với gạo Nhật Đánh gi

NGUYỄN THỦY HÀ

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

RƯỢU SAKE VÀ ỨNG DỤNG

TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 604862

LUẬN VĂN THẠC SỸ

TP.HỒ CHÍ MINH, 08/2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thủy Hà MSHV: 09310565

Ngày, tháng, năm sinh: 27/11/1986 Nơi sinh: BH - ĐN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 604862

I TÊN ĐỀ TÀI:

Khảo sát quá trình lên men rượu Sake và ứng dụng trong điều kiện Việt Nam

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Khảo sát chất lượng của Koji được làm từ gạo Việt Nam so với gạo Nhật

Khảo sát chất lượng của rượu Sake lên men từ nguyên liệu gạo Việt Nam so với gạo Nhật

Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ Việt Nam tới quá trình lên men và chất lượng của rượu Sake

So sánh chất lượng của rượu Sake lên men từ gạo Việt Nam có bổ sung chủng vi khuẩn lactic so với sản phẩm không bổ sung chủng vi khuẩn lactic

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS – TS Nguyễn Thúy Hương

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU SAKE VÀ ỨNG DỤNG

TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM

GVHD: PGS-TS Nguyễn Thúy Hương

Nhằm khảo sát quá trình lên men rượu Sake trong điều kiện Việt Nam, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát từ khâu chế biến koji đến quá trình lên men rượu Sake với ba loại gạo Japonica(Nhật Bản), gạo nở (Việt Nam) và gạo nếp (Việt Nam) trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau Kết quả cho thấy, koji làm từ gạo nở có chất lượng không kém gì so với koji làm từ gạo Japonica, mặt khác chất lượng và hương vị rượu Sake lên men từ gạo Japonica là tốt nhất, nhưng kết quả này tương đương với kết quả thu được từ rượu Sake lên men từ gạo nở, trong khi đó rượu Sake lên men từ gạo nếp lại có chất lượng kém xa Kết quả phân tích cũng cho thấy quá trình lên men ở nhiệt độ lạnh và quá trình lên men hai giai đoạn thu được rượu Sake có chất lượng tương đương nhau khi sử dụng cùng nguồn nguyên liệu Tuy nhiên, với khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam khi đưa rượu Sake vào sản xuất chúng tôi đề nghị nên sử dụng gạo nở làm nguyên liệu để lên men cũng như sử dụng phương pháp lên men hai giai đoạn để sản xuất sẽ đem lại hiệu quả tốt hơn Ngoài ra khi bổ sung chủng vi khuẩn

Lactobacillus sp vào quá trình lên men rượu Sake từ gạo nở, thu được rượu Sake có

hương vị được giới nữ ở Việt Nam khá ưa chuộng

STUDIED THE FERMENTATION OF SAKE WINE AND APPLY

IN THE CONTEXT OF VIETNAM

Nguyễn Thúy Hương

Nguyễn Thủy Hà

To study the fermentation of Sake in the context of Vietnam, we conducted experiments examined from the processing of koji to the fermentation of Sake with three kinds of rice: Japonica rice (from Japan), blossom rice (from Viet Nam) and glutinous rice (from Viet Nam) in different temperature conditions The results show that, koji, made from rice blossom, had quality no less than Japonica rice koji, on the other hand the quality and taste of Japonica Sake is best, but this result is equivalent to obtained from fermented of blossom rice, while the Sake wine fermented from glutinous rice has less quality Analysis results also show that fermentation at 10-15 C and two stages

o

fermentation (25-28 C and 10-15 C) obtainedo o Sake quality were similar when using the same materials However, with a tropical climate in Vietnam, when put into the production of sake we recommend using blossom rice as raw material for fermentation as well as using two stages fermentation as a fermentation methods to produce will bring better efficiency Beside that, when additional strains of

Lactobacillus sp in the fermentation of blossom rice Sake, obtained Sake wine tasting

more prefered, especially Vietnamese women

Xin được cám ơn Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương, một người đáng kính trong công việc cũng như trong cuộc sống, cô đã động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đồng thời cũng xin được gởi lời cám ơn chân thành đến thầy Nguyễn Đức Lượng, cô Lê Thị Thủy Tiên, cô Võ Thị Ly Tao và các thầy cô khác trong bộ môn CNSH đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, cho tôi những lời khuyên chân tình quý giá trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới bố mẹ, người thân, bạn bè, các anh chị em trong lớp cao học CNSH khóa 2009 và người chồng yêu quý đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành luận văn

Mục lục

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU VÀ HÌNH VẼ

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Nội dung nghiên cứu 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nguyên liệu sản xuất 5

2.1.1 Gạo 5

2.1.1.1 Các loại gạo chuyên biệt dùng trong sản xuất rượu Sake 5

2.1.1.2 Sơ chế gạo 6

2.1.2 Nước 8

2.1.2.1 Vai trò của nước trong sản xuất rượu Sake

2.1.2.2 Các thành phần chính trong nước gây bất lợi đến quá trình làm rượu Sake 8

2.1.2.3 Các thành phần chính trong nước có lợi đến quá trình làm rượu Sake 9

2.1.3 Nấm men 9

2.1.4 Koji 10

2.1.4.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji 10

2.1.4.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae 11

2.1.4.3 Hệ enzyme 12

2.1.5 Chủng vi khuẩn lactic 14

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men rượu 14

2.2.1 Quá trình hồ hóa 14

2.2.2 Quá trình đường hóa 16

2.2.2.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đường hóa 17

2.2.2.2 Các giai đoạn của quá trình đường hóa 19

2.2.3 Quá trình rượu hóa 20

2.2.4 Biến đổi sinh hóa trong quá trình lên men 26

2.2.5.1 Khả năng tạo hương của vi sinh vật trong quá trình lên men 27

2.2.5.2 Chất lượng hương thơm của rượu trên nguyên liệu gạo đã chà và chưa chà 32

2.2.5.3 Nhiệt độ 33

2.2.5.4 Một số yếu tố khác ảnh hưởng đến hương vị của rượu Sake 34

2.3 Công nghệ sản xuất rượu Sake 35

2.3.1 Qúa trình sản xuất Koji 35

2.3.1.1 Quy trình công nghệ 35

2.3.1.2 Giải thích quy trình 35

2.3.1.3 Phương pháp nuôi cấy 36

2.3.1.4 Sấy 38

2.3.2 Qúa trình chuẩn bị nấm men 42

2.3.3 Chuẩn bị dịch lên men chính 42

2.3.4 Các quy trình xử lý khi thu sản phẩm rượu Sake 43

2.3.4.1 Ép 43

2.3.4.2 Lọc 43

2.3.4.3 Thanh trùng 44

2.3.4.4 Ủ 44

2.4 Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước 44

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 48

3.1 Phương tiện nghiên cứu 49

3.1.1 Thời gian và địa điểm 49

3.1.2 Nguyên vật liệu 49

3.1.3 Thiết bị - Dụng cụ 52

3.2 Phương pháp nghiên cứu 53

3.2.1 Quy trình công nghệ 53

3.2.2 Phần 1: Khảo sát ảnh hưởng các loại gạo lên quá trình sản xuất Koji 54

3.2.2.1 Bố trí thí nghiệm 54

3.2.2.2 Phương pháp phân tích 54

3.2.3 Phần 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại gạo lên quá trình lên men rượu Sake

3.2.3.2 Phương pháp phân tích 57

3.2.4 Phần 3: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lactic đến quá trình lên men rượu Sake 3.2.4.1 Bố trí thí nghiêm 63

3.2.4.2 Phương pháp phân tích 64

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 67

4.1 Phần1: Khảo sát ảnh hưởng của các loại gạo Việt nam đến quá trình sản xuất koji so với gạo Nhật 68

4.1.1 Nguyên liệu gạo 68

4.1.2 Vi sinh vật trong koji 69

4.1.2.1 Khảo sát trên môi trường Czapek dox 69

4.1.2.2 Khảo sát trên ba nguồn nguyên liệu khác nhau (gạo Japonica, gạo nở, gạo nếp) 71

4.2 Phần 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại gạo lên quá trình lên men rượu Sake 78

4.2.1 Đường cong sinh trưởng của S.cerevisae 78

4.2.2 Động học của quá trình lên men 81

4.2.3 So sánh độ cồn giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo khác nhau 91

4.2.4 So sánh hàm lượng đường khử giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 92

4.2.5 So sánh hàm lượng đường tổng giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 94

4.2.6 So sánh hàm lượng đạm tổng giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 95

4.2.7 So sánh pH của dịch rượu Sake giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 97

4.2.8 So sánh hàm lượng ester giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 99

4.2.9 So sánh giá trị cảm quan giữa các mẫu rượu làm từ ba loại gạo 100

4.3 Phần 3: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lactic đến quá trình lên men rượu Sake

4.3.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus sp 104

4.3.2 So sánh hàm lượng đường khử - Độ rượu – pH – Lượng ester trong sản phẩm sau lên men 107

4.3.3 Sự thay đổi hàm lượng ester theo thời gian trong quá trình lên men có bổ sung vi khuẩn lactic 108

4.3.4 Đánh giá cảm quan 109

4.3.4.1 Đánh giá cảm quan dựa trên TCVN 3217-1979 109

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112

5.1 Kết luận 112

5.2 Đề nghị 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1 Đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử trong dịch rượu Sake

2 Đường chuẩn xác định hàm lượng đường tổng trong rượu Sake

3 Đánh giá chất lượng rượu bằng phương pháp cho điểm dựa vào TCVN 3217 – 1979

4 Đánh giá mức độ ưa thích của người tiêu dùng theo phương pháp cho điểm thị hiếu

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU VÀ HÌNH VẼ

Bảng 2.1 Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc

Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme amylase

Bảng 2 3 Tính chất tạo hương và đường hóa của vi sinh vật khi nuôi cấy riêng và hỗn hợp

Bảng 2 4 Hợp chất thơm được tạo ra từ bánh men Ragi

Bảng 2.5 Thành phần các hợp chất bay hơi trong rượu khi có và không có glucoamylase

Bảng 2.6 Bổ sung nguyên liệu trong quá trình làm Sake

Bảng 4.1 Hàm lượng amylose của gạo nở, gạo Japonica, gạo nếp

Bảng 4.2 Bảng theo dõi tỷ lệ bào tử của Aspergillus oryzae trên môi trường Czapek–

dox

Bảng 4.3 Bảng theo dõi hoạt tính amylase của Aspergillus oryzae

Bảng 4.4 Độ ẩm giảm theo thời gian nuôi cấy

Bảng 4.5 Theo dõi tỉ lệ bào tử trên 3 loại gạo theo thời gian

Bảng 4.6 Tỉ lệ bào tử trong khối koji sau khi sấy và bảo quản

Bảng 4.7 Hoạt lực của koji theo thời gian nuôi cấy

Bảng 4 8 Hoạt lực của koji sau khi sấy ở t<40oC sau 72 giờ nuôi cấy

Bảng 4.9 Số lượng tế bào nấm men và cơ chất thay đổi theo thời gian nuôi cấy trên môi trường Hansen

Bảng 4.10 Sự thay đổi về độ cồn – Đường khử - pH – Hàm lượng ester trong quá trình lên men ở nhiệt độ phòng

Bảng 4.11 Sự thay đổi về độ cồn - Đường khử - pH - Hàm lượng ester trong quá trình lên men ở nhiệt độ lạnh

Bảng 4.12 Sự thay đổi về độ cồn – Đường khử - pH – Hàm lượng ester trong quá trình lên men hai giai đoạn

Bảng 4.13 Sự thay đổi hàm lượng ester theo thời gian

Bảng 4.14 Độ cồn của các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo khác nhau

Bảng 4.15 Hàm lượng đường khử trong các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo khác nhau

khác nhau

Bảng 4.17 Hàm lượng đạm tổng trong các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo khác nhau

Bảng 4.18 pH của dịch rượu Sake lên men từ ba loại gạo khác nhau

Bảng 4.19 Hàm lượng ester trong các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo khác nhau

Bảng 4.20 Điểm về các chỉ tiêu cảm quan của mẫu rượu lên men từ gạo Japonica Bảng 4 21 Điểm về các chỉ tiêu cảm quan của mẫu rượu lên men từ gạo Nở

Bảng 4.22 Điểm về các chỉ tiêu cảm quan của mẫu rượu lên men từ gạo Nếp

Bảng 4.23 Qúa trình sinh trưởng của Lactobacillus sp

Bảng 4.24 So sánh hàm lượng đường khử - Độ rượu – pH – Lượng ester trong sản phẩm sau lên men giữa hai mẫu rượu có và không có bổ sung vi khuẩn lactic

Bảng 4.25 So sánh hàm lượng ester giữa hai mẫu rượu có và không có bổ sung vi khuẩn lactic

Bảng 4.26 Điểm cảm quan cho mẫu rượu lên men từ gạo nở có bổ sung vi khuẩn lactic

Hình 2 1 Bông lúa Japonica

Hình 2.2 Hạt gạo Japonica

Hình 2.3 Độ chà bóng của hạt gạo

Hình 2.4 Hạt gạo đã chà chỉ còn 50% nhân phôi

Hình 2.5 Bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae

Hình 4.1 Hạt gạo nở

Hình 4.2 Hạt gạo Japonica

Hình 4.3 Hạt gạo nếp

Hình 4.4 Khuẩn lạc Aspergillus oryzae

Hình 4.5 Bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae quan sát dưới kính hiển vi

Hình 4.6 Koji

Hình 4.7 Khuẩn lạc S.cerevisae trên môi trưởng Hasen

Hình 4.8 S.cerevisae chụp dưới kính hiển vi

Hình 4.9 Khuẩn lạc Lactobacillus sp nuôi cấy trên môi trường MRS

Sơ đồ 2.2 Mối quan hệ giữa các hợp chất mùi trong quá trình chuyển hóa của nấm men

Sơ đồ 2.3 Quy trình sản xuất koji

Sơ đồ 3.1 Quy trình công nghệ sản xuất rượu Sake

Sơ đồ 3.2 Quy trình lên men khảo sát ảnh hưởng của Lactobacillus sp

Biểu đồ 4.1 So sánh tỉ lệ bào tử nấm mốc trong Koji làm từ các nguyên liệu khác nhau Biểu đồ 4.2 So sánh hoạt tính amylase trong các nguồn nguyên liệu khác nhau sau khi sấy

Biểu đồ 4 4 So sánh độ rượu trong các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Biểu đồ 4.5 So sánh hàm lượng đường khử trong các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Biểu đồ 4.6 So sánh hàm lượng đường tổng giữa các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Biểu đồ 4.7 So sánh hàm lượng đạm tổng giữa các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Biểu đồ 4.8 So sánh pH giữa các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Biểu đồ 4.9 So sánh hàm lượng ester giữa các mẫu rượu Sake lên men từ ba loại gạo

Đồ thị 4.1 Biểu thị độ giảm độ ẩm theo thời gian trong quá trình nuôi cấy koji

Đồ thị 4.2 Hoạt tính amylase theo thời gian nuôi cấy

Đồ thị 4.3 Đường cong tăng trưởng và độ giảm cơ chất theo thời gian

Đồ thị 4.4 Động học quá trình lên men ở nhiệt độ phòng

Đồ thị 4.5 Động học quá trình lên men ở nhiệt độ lạnh

Đồ thị 4.6 Động học quá trình lên men hai giai đoạn

Đồ thị 4.7 Biểu thị sự thay đổi hàm lượng ester theo thời gian

Đồ thị 4.8 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus sp

Đồ thị 4.9 So sánh hàm lượng ester theo thời gian giữa hai mẫu rượu có và không có

bổ sung vi khuẩn lactic

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây khi nền công nghiệp phát triển mạnh thì ngành vi sinh ứng dụng đã trở thành công nghệ khá mạnh, đạt được những thành tựu đáng kể đặc biệt là trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm Đó là những quy trình sản xuất thực phẩm lên men truyền thống với những dây chuyền thiết bị hiện đại của công nghệ sản xuất rượu vang, rượu sâm banh, cồn thực phẩm, các loại rượu cao cấp như uytki, votka, Sake…

Một trong những thành tựu nổi trội của công nghệ vi sinh là rượu Sake, một loại rượu gạo truyền thống nổi tiếng của Nhật Bản, với cách thức lên men độc đáo gồm hai quá trình diễn ra song song, đó là quy trình đường hóa của nấm mốc và quá trình rượu hóa của nấm men Rượu Sake xuất hiện ở Nhật khoảng 2000 năm trước công nguyên là loại rượu chuyên giành cho các nghi lễ thần giáo của Nhật Khi đã trở thành một đặc sản và biểu tượng đặc trưng của một nền văn hóa dân tộc, rượu Sake được thế giới chấp nhận như một nét ẩm thực tiêu biểu của người Nhật

Khi khoa học ngày càng phát triển thì hiểu biết của con người về các quá trình xảy ra trong quá trình lên men rượu Sake cũng được cải thiện và tăng lên đáng kể Hai yếu tố quan trọng nhất của quá trình sản xuất rượu Sake là gạo và nước Mặt khác ở Việt Nam tài nguyên thiên nhiên dồi dào, đất đai phì nhiêu cung cấp lượng lúa gạo xuất khẩu hàng năm lớn nhất thế giới, nguồn tài nguyên nước phong phú với nhiều suối khoáng, suối nước nóng, là những điều kiện ban đầu thuận lợi nếu chúng ta khai thác nhằm vào mục đích sản xuất rượu Sake

Mặc dù rượu Sake đã xuất hiện trên thị trường Việt Nam từ rất lâu, tuy nhiên những nghiên cứu về sản xuất rượu Sake trong điều kiện Việt Nam (với nguồn nguyên liệu phong phú) hầu như rất ít và không có, trong khi tiềm năng thị trường của rượu

Sake rất rộng lớn Với những lý do như trên, chúng tôi quyết định chọn “Khảo sát quá

trình lên men rượu Sake ứng dụng trong điều kiện Việt Nam” làm đề tài nghiên

cứu của mình

1.2 Nội dung nghiên cứu

− Khảo sát chất lượng của Koji được làm từ gạo Việt Nam so với gạo Nhật

− Khảo sát chất lượng của rượu Sake lên men từ nguyên liệu gạo Việt Nam so với gạo Nhật

− Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ Việt Nam tới quá trình lên men và chất lượng của rượu Sake

− So sánh chất lượng của rượu Sake lên men từ gạo Việt Nam có bổ sung chủng

vi khuẩn lactic so với sản phẩm không bổ sung chủng vi khuẩn lactic

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguyên liệu sản xuất

2.1.1 Gạo

2.1.1 Các loại gạo chuyên biệt dùng trong sản xuất rượu Sake

Hình 2 1 Bông lúa Japonica [52] Hình 2.2 Hạt gạo Japonica [52]

Rượu Sake được lên men từ rất nhiều loại gạo khác nhau, mỗi loại gạo này làm cho rượu Sake có mùi vị đặc thù riêng Trong quá trình chuẩn bị nguyên liệu, quá trình xay xát và chà bóng gạo đóng vai trò quan trọng đến chất lượng rượu

Hiện nay ở Nhật Bản hầu hết các cơ sở chủ yếu dùng chín loại gạo sau đây để sản xuất rượu Sake

Loại gạo Yamada Nishiki: có xuất xứ từ Hyogo, Okayama và Fukuoka, còn được gọi là Vua của các loại gạo Sake, là loại gạo thơm ngon, cơm mềm, dùng cho bất

kỳ thương hiệu Sake Daiginjo nào sản xuất trong nước Thật khó để có thể nhận xét hoàn hảo hơn nữa về loại gạo này Nadagiku, Tatsuriki, Okuharima (thuộc Hyogo) và Ginban (thuộc Toyama) được coi là những nơi sản xuất gạo có chất lượng tốt

Loại gạo Omachi: có xuất xứ từ Okayama Thường ít thơm, nhiều yếu tố hương

vị được xác định hơn Loại gạo thuần chủng này hiện nay chỉ có ở Nhật Bản Thương

hiệu Sake tiêu biểu được sản xuất từ loại gạo này là sản phẩm Bizen Sake no Hitosuji (Okayama) Gạo Omachi sử dụng để sản xuất hầu hết các loại rượu Sake

Loại gạo Miyama Nishiki: có xuất xứ từ Iwate, Akita, Yamagata, Miyagi, Fukushima, và Nagano Ít mùi Sake, nặng mùi gạo, tạo vị và hương tốt Thương hiệu Sake tiêu biểu sản xuất từ loại gạo này là Sharaku (Fukushima), Hamachidori (Iwate)

Loại gạo Gohyakumangoku: có xuất xứ từ Niigata, Fukushima, Toyama, và Ishikawa Trơn, bóng, khô và có mùi thơm nhẹ Thương hiệu Sake tiêu biểu sản xuất từ loại gạo này là Shimeharitsuru và Kubota, hoặc những loại rượu khác từ Niigata

Loại gạo Oseto: có xuất xứ từ Kagawa, có màu đất và rất giàu hương vị Thương hiệu Sake tiêu biểu sản xuất từ loại gạo này là Ayakiku (Kagawa)

Loại gạo Hatta Nishiki: có xuất xứ từ Hiroshima, có màu đất nhạt, giàu hương

vị Thương hiệu Sake tiêu biểu: Kamoizumi và Fukucho từ Hiroshima

Loại gạo Tamazakae: có xuất xứ từ Tottori và Shiga Mềm và có mùi sâu hơn khi tiến hành ủ rượu Thương hiệu Sake tiêu biểu: Kimitsukasa (Tottori), loại gạo này rất hiếm, có thể tìm thấy ở Akaoni

Loại gạo Kame no Niigata: có xuất xứ từ Niigata và Yamagata, giàu hương vị hơn, khô hơn và tính acid cao hơn các loại gạo khác Thương hiệu Sake tiêu biểu: Niigata và Tohoku, hay Kame no O (Niigata, Kusumi Shuzo)

Loại gạo Dewa San San: có xuất xứ từ Yamagata và Niigata Không quá khô, có

hương thơm nhẹ Thương hiệu Sake tiêu biểu: Fumitoi (Yamagata) Loại rượu được sản xuất từ loại gạo ngày được chứa trong chai đánh dấu rõ ràng với nhãn dán màu xanh, do đó chúng được gọi là Sake Dewa san san [45, 51, 52]

2.1.1.2 Sơ chế gạo

Xay gạo

Sau khi chọn được gạo làm rượu Sake có chất lượng như mong muốn, người ta tiến hành xay xát gạo để tách vỏ trấu và chà bóng để chuẩn bị cho quá trình sản xuất rượu Quá trình này đòi hỏi phải được tiến hành một cách khéo léo để quá trình chà xát

gạo không làm vỡ hạt gạo hoặc không tạo ra quá nhiều nhiệt (lượng nhiệt sẽ bất lợi cho quá trình hấp thu nước sau này)

Hình 2.3 Độ chà bóng của hạt gạo [52]

(Trên góc trái: hạt gao chưa chà, trên góc phải hạt gạo đã chà còn 75% nhân phôi, ở giữa hạt gạo đã chà còn 35% nhân phôi)

Hình 2.4 Hạt gạo đã chà chỉ còn 50% nhân phôi [52]

Tỷ lệ nhân phôi còn lại sau quá trình xay xát và chà bóng sẽ ảnh hưởng đến hương vị của rượu Sake Thông thường gạo được chà bóng càng nhiều thì chất lượng rượu càng cao, vì lượng tinh bột tập trung chủ yếu bên trong hạt gạo, còn lớp bên ngoài

có nhiều tạp chất như protein, lipide, đôi khi tạo ra mùi vị không mong muốn cho rượu Sake Gạo được chà bóng càng nhiều thì những phần không mong muốn nằm bên ngoài hạt gạo sẽ giảm bớt [43, 52]

Ngâm:

Sau khi được chà xát và đánh bóng, hạt gạo trắng (nuka) sẽ được đem đi vo, quá trình vo gạo cũng ảnh hưởng đến chất lượng cuối cùng của quá trình hấp gạo, vì nếu gạo được vo quá kỹ chất lượng gạo và mùi vị gạo sẽ giảm Cũng như quá trình sản xuất

rượu Việt Nam, quá trình vo sẽ giúp gạo hấp thu một lượng nước đáng kể giúp tiết kiệm được lượng hơi hấp gạo Lúc này quá trình chà bóng gạo cũng ảnh hưởng đến sự hấp thu nước, gạo được chà bóng càng nhiều thời gian hấp thu nước càng nhanh Trong một vài trường hợp quá trình vo gạo được thay thế bằng quá trình ngâm gạo qua đêm [51]

Hấp:

Trong quá trình sản xuất rượu Sake truyền thống người ta dùng nồi hấp bằng gỗ, hơi từ dưới được cung cấp cho nồi hấp (còn được gọi là “koshiki”) chứa gạo bên trên Hơi sẽ tạo nên một lớp màng mỏng và cố định bao quanh hạt gạo Thường thì các nồi hấp được chia làm nhiều tầng và đôi khi koji cũng được rắc lên trong quá trình này [50]

Kết thúc quá trình sơ chế, ta thu được gạo đã hấp chín, gạo này được dùng để làm koji, moto và lên men rượu

2.1.2 Nước

2.1.2.1 Vai trò của nước trong quá trình sản xuất rượu Sake

Trong sản phẩm rượu Sake có đến 80% là nước do đó nước đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sản xuất rượu Sake

Nước tinh khiết chiếm 80% trong thành phần của rượu Sake Nước tham gia vào từng bước của quá trình pha chế; gạo được rửa và ngâm nước trước khi đem hấp Nước tham gia vào quá trình lên men Cuối cùng một lượng nhỏ được thêm vào khâu pha chế

Sự hiện diện của một số thành phần trong nước là rất cần thiết trong quá trình chế biến rượu Sake, một số khác cản trở quá trình hoặc gây ra những tác dụng có hại trong rượu Sake

2.1.2.2 Các thành phần chính trong nước gây bất lợi đến quá trình làm Sake

Yếu tố gây hại nhất là sắt Sắt sẽ làm cho rượu chuyển màu sẫm và làm ảnh hưởng

xấu đến hương và vị Điều này xảy ra do sắt tấn công vào phần lõi của các liên kết không màu thông thường gắn trong acid amino được sản sinh ra trong quá trình lên men koji Thêm nữa, khi lưu trữ Sake, lượng đường dư phản ứng với acid amino và làm thay đổi hương vị và sự có mặt của sắt sẽ tạo điều kiện thúc đẩy nhanh phản ứng này

Mangan cũng là một thành phần không tốt Khi Sake được để ngoài ánh sáng, đặc biệt là ánh sáng có tia cực tím, mangan sẽ thúc đẩy phản ứng hoá học làm mất màu

và mất sự trong suốt của Sake Với ánh sáng trực tiếp, thay đổi này có thể xảy ra trong vòng 3 tiếng đồng hồ Đây là hai thành phần có hại nhất có trong nước làm ảnh hưởng đến chất lượng rượu Sake

2.1.2.2 Các thành phần chính trong nước có lợi đến quá trình làm Sake

Những thành phần đặc biệt có lợi và không thể thiếu trong quá trình sản xuất rượu Sake là kali, magiê, acid phosphoric Các thành phần này tham gia vào quá trình phát triển của men cái trong giai đoạn lên men (shubo) cũng như sự sinh sôi của koji Nếu không có đủ lượng các thành phần này, các tế bào men sẽ không phát triển nhanh, giới hạn thời gian của toàn bộ quá trình lên men sẽ không điều khiển được [50, 43]

2.1.3 Nấm men

Giống nấm men dùng trong sản xuất rượu Sake là giống Saccharomyces

cerevisiae Loài nấm men này là loài vi sinh vật kỵ khí tùy ý

Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại đường như:

glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose Đồng thời, chúng có thể lên men ở nhiệt độ cao (36 – 40oC) và có khả năng chịu được độ acid Ngoài ra, chúng còn

có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 – 0,025% Đặc điểm này rất thuận lợi trong trường hợp lên men có sử dụng thuốc sát trùng

Điều quan trọng hơn là có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch 12 – 14%, có khi 16 – 18% Nồng độ rượu cao nhất trong dịch lên men có thể chịu được là 10 – 12% Nhiệt độ lên men thích hợp

nhất là 28 – 32oC [27, 28,37]

2.1.4 Koji

2.1.4.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji

Thuật ngữ “koji” có nghĩa là hạt ngũ cốc lên mốc, nó còn có tên khác như:

“shui” ở Trung Quốc, “ku” ở Hàn Quốc và “koji” ở Nhật Chế phẩm koji được xem như là một bước tiến quan trọng trong quá trình lên men từ các nguồn thực phẩm

đa dạng ở Đông Á Cơ bản đó là quá trình nuôi cấy mốc trên môi trường dinh dưỡng rắn để tạo ra những enzyme thủy phân từ hạt đậu nành hay những hạt ngũ cốc khác Vì vậy koji được xem là một nguồn đa dạng các enzyme xúc tác sự thủy phân nguyên liệu thô rắn để hoà tan các chất có trong nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn phát triển ở giai đoạn lên men tiếp theo Ngoài những enzyme chính có trong nguyên liệu thì còn nhiều chất quan trọng khác, cần thiết cho giai đoạn lên men thứ hai hoặc tạo mùi thơm cho sản phẩm

Phương pháp làm koji được truyền đến Nhật vào thế kỷ XIV bởi những tăng ni đạo Phật Mặc dù nó bắt nguồn từ Trung Quốc nhưng việc nghiên cứu và phát triển hướng tới cải tiến phương pháp này lại được thực hiện ở Nhật Kết quả là hiện nay việc làm koji ở Nhật có sự khác biệt so với cách trước đây và dây chuyền này trở nên nổi tiếng khắp thế giới bởi người Nhật với thuật ngữ “koji”

Khi việc nuôi cấy mốc trên hạt ngũ cốc được quan tâm thì hàng loạt các sản phẩm lên men được sản xuất ở các nước trong đó có sản phẩm rượu gạo Trung Quốc được coi là cái nôi của chế phẩm này nhưng ở các nước khác lại cho đó là phương pháp cổ truyền của cha ông họ, được truyền qua nhiều thế hệ Trong các sản phẩm lên men thì rượu Sake (rượu gạo) của Nhật là bằng chứng tốt ở cả hai khía cạnh lịch sử và kỹ thuật

Do đặc tính có ích, dễ làm của koji đồng thời dây chuyền sản xuất koji ngày càng hiện đại đã thúc đẩy quá trình sản xuất tạo nhiều loại sản phẩm phi thực phẩm (enzyme công nghiệp, chất độc, thuốc chống vi sinh vật) [46]

Tóm lại koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cần thiết cho quá trình lên men tiếp theo

2.1.4.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae

Hình 2.5 Bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae [53]

Aspergillus spp hiện diện rất nhiều trong thiên nhiên, không phải loài nào

cũng được sử dụng trong thực phẩm Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus spp

được tiến hành thử nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α - amylase và maltase với lượng đáng kể Một số loài có khả năng sinh độc tố gây ung thư

Loài nấm mốc được dùng trong đề tài là Aspergillus oryzae Nấm sợi này có

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào Khi được tổng hợp, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của nó Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: sinh khối vi sinh vật, nước trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào, và cả khối lượng môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô

Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc, mới phát triển có màu trắng, khi

già thì khuẩn ty chuyển sang màu vàng nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng [1, 3]

Bảng 2.1 Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc

Yếu tố Điều kiện

Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường gạo nên các enzyme được

tổng hợp chủ yếu là: amylase và protease

Enzyme amylase

Enzyme amylase bao gồm nhiều loại: α-amylase, β-amylase, γ-amylase, glucose isomease, pullulanose và isoamylase Trong đó hoạt lực α-amylase, β-amylase, γ-amylase tiêu biểu cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose

• Enzyme α - amylase (1,4 - α -glucan 4-glucanhydrolase)

Có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào (endoenzyme) α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị phân hủy tiếp tục để tạo ra maltose và glucose Sau thời gian tác dụng lâu dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose

là 13% glucose và 87% maltose Còn sản phẩm thủy phân amylopectin là 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin

Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao do đó người ta còn gọi α-amylase

là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

• Enzyme β -amylase (1,4- α -glucan-maltohydrolase):

β -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, phân cắt từng tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch Khác với α-amylase,

nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylosepectin thành maltose Quá trình thủy phân amylosepectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Mỗi nhánh ngoài có từ 10-26 gốcglucose nên tạo thành 10-12 phân tử maltose Khi gặp liên kết α -1,4- glucoside đứng kế liên kết α-1,6- glucoside thì nó ngừng tác dụng Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn chứa rất nhiều liên kết α -1,6- glucoside cho màu tím đỏ với iod Độ nhớt của dung dịch giảm chậm Tác dụng của β -amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:

β -amylase

Tinh bột 54-58% maltose + 42-46% dextrin

Nếu cho cả α -amylase và β -amylase cùng tác dụng đồng thời lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%

• Enzyme γ -amylase (glucoamylase, α -1,4-glucan glucohydrolase)

Glucoamylase là enzyme ngoại phân, thủy phân liên kết α -1,4 - glucoside trong tinh bột, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase xúc tác thủy phân cả liên kết α -1,6- glucoside thành glucose Tóm lại nó có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột tới glucose

Enzyme protease

Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptide (-CO-NH-) trong phân tử protein hoặc các polypeptid Ngoài ra còn có peptidase Protease phân hủy phân tử protein thành polyleptid và pepton, chúng có đặc tính đặc hiệu tương đối

rộng Tiếp theo đó la sự phân hủy các peptid phân tử nhỏ này thành các acid amin tự

do dưới tác dụng của peptidase

Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật

và vi khuẩn Protease của vi khuẩn hoạt động ở pH = 7 – 8 Còn protease của A

oryzae hoạt động trong khoảng pH = 3.5 – 9, tối thích ở pH = 7 – 8 Dựa vào

khoảng pH hoạt động người ta chia protease thành ba loại: loại acid hoạt động ở vùng pH = 2.5 – 3, loại trung tính hoạt động ở pH = 6 – 6.5 và loại kiềm hoạt độngtrong khoảng pH = 8 – 11 [30, 36]

2.1.5 Chủng vi khuẩn lactic

Hương vị của rượu Sake cũng chịu ảnh hưởng bổ sung vi khuẩn lactic vào trong quá trình lên men thay cho việc bổ sung acid lactic…

Bổ sung Lactobacillus sp cùng lúc hoặc sau S Cerevisiae, không có sự khác

nhau rõ về sự thay đổi của các cấu tử tạo hương Điều này chứng tỏ trong giai đoạn đầu, chủ yếu xảy ra quá trình đường hóa do nấm mốc, còn vi khuẩn lactic hoạt động ở giai đoạn sau Sử dụng đường để tạo acid lactic cùng lúc có thể tạo thành các sản phẩm khác nhau như acetone tham gia trong sự tạo hương thơm [45, 51]

2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men rượu

2.2.1 Quá trình hồ hoá tinh bột:

Quá trình hồ hoá tinh bột là quá trình nấu để phá vỡ màng tế bào tinh bột, biến tính tinh bột từ trạng thái không hòa tan thành trạng thái hòa tan, giúp cho quá trình tiếp xúc giữa enzyme amylase và tế bào tinh bột được dễ dàng hơn

* Sự trương nở và hòa tan tinh bột

Sự trương nở của tinh bột là hiện tượng tinh bột hút nước trương lên tăng kích thước và khối lượng của hạt

Khi nấu tinh bột với nước đến nhiệt độ 40oC hạt bắt đầu trương nở Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì hạt tiếp tục trương nở và trương nở đến khi tạo thành một thể đồng nhất gọi là sự trương nở vô hạn Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể

tích của hạt tinh bột tăng 50 – 100 lần Lực liên kết giữa các phân tử yếu dần đến mức độ tinh bột tan ra gọi là sự hồ hóa tinh bột

Nhiệt độ hồ hoá của amylose thấp hơn so với amylopectin do đặc điểm cấu tạo

Do đó đối với từng loại nguyên liệu khác nhau, kích thước hạt tinh bột khác nhau, thành phần cũng khác nhau nên có nhiệt độ hồ hoá khác nhau

Ví dụ: Nhiệt độ hồ hoá của khoai tây là 56-70oC, lúa mì 50-80oC, gạo là

65-73oC…

Để quá trình nấu được tốt, khi nấu nguyên liệu hạt, người ta thường bổ sung một lượng nước cần thiết đảm bảo cho sự hòa tan tinh bột và đạt được nồng độ chất khô theo yêu cầu

Khi làm nguội dung dịch amylopectin đông đặc nhanh hơn, ở nhiệt độ 55oC chúng biến thành keo làm cho men amylase không thể tác dụng được Đối với dung dịch amylose thì không bền và nhanh chóng liên kết với nhau tạo thành những hạt nhỏ li ti kết tủa xuống và làm cho enzyme amylase không thể tấn công được Do đó làm giảm khả năng đường hóa (gọi là sự lão hoá) Vì vậy trong sản xuất rượu, người

ta thường làm nguội nhanh đến nhiệt độ 60 – 62oC và đường hóa Ngoài ra, để khắc phục hiện tượng trên người ta còn dùng enzyme amylase dịch hóa trước hay sau khi nấu nguyên liệu [25]

* Những biến đổi của tinh bột và đường

Khi nấu có một lượng nhỏ tinh bột biến thành đường và dextrin do tác dụng của enzym amylase chứa trong nguyên liệu

Đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccharose, glucose, fructose và một ít maltose được tạo thành trong thời gian nấu Ở nhiệt độ cao các đường sẽ phân hủy và mất nước để tạo thành caramen, furfurol, oxymetyl furfurol và melanoidin Mức độ tạo thành cấc chất được xếp theo thứ tự:

Melanoidin > furfurol > caramen

Sự tạo thành các chất trên chính là nguyên nhân gây nên tổn thất đường

trong thời gian nấu

Phản ứng tạo caramen là do đường saccharose nóng chảy và mất nước gây ra Tùy theo mức độ mất nước sản phẩm tạo thành có thể là caramenlan, caramenlen, caramenlin Trong điều kiện nấu của sản xuất rượu, phản ứng tạo thành caramen luôn xảy ra và phụ thuộc chế độ nấu Caramen là chất kiềm hãm đối với quá trình lên men rượu

Sự tạo thành furfurol và oxymetyl furfurol cũng do đường mất nước Quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn và cuối cùng mỗi phân tử đường sẽ mất đi ba phân tử nước

Đối với đường pentoza, sản phẩm tạo thành là furfurol

Đối với đường 6 cacbon (hexoza), sản phẩm tạo thành là oxymetyl furfurol

Do không bền nên oxymetyl furfurol dễ bị biến đổi tiếp theo để tạo thành alcol metylic và acid levulinovic

Một phần oxymetyl furfurol sẽ trùng hợp tạo thành chất màu

Sự tạo thành melanoidin là kết quả của phản ứng oxy hóa khử giữa đường và các acid amin cũng như các sản phẩm trung gian của quá trình thuỷ phân protide

Melanoidin là chất keo màu sẫm, mang điện tích âm, có tính khử và mang tính acid, nấm men không đồng hóa được Nếu dịch đường chứa nhiều melanoidin

sẽ gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và nấm men [23,24]

2.2.2 Qúa trình đường hóa

Đường hoá là một quá trình chuyển hoá tinh bột thành đường lên men phục

vụ cho quá trình lên men Sản phẩm thu được gọi là dịch đường hoá Đây là công đoạn rất quan trọng trong quá trình lên men

Đường hoá có nhiều phương pháp khác nhau tuy nhiên chúng ta có thể phân thành 2 loại cơ bản: đường hoá bằng phương pháp vi sinh vật (mold) và đường hoá bằng phương pháp enzyme (phương pháp malt) Ngoài ra còn có phương pháp thuỷ phân bằng acid

Trong quá trình đường hoá, hiện tượng hồ hoá tinh bột có ảnh hưởng khá lớn

đến tốc độ thuỷ phân tinh bột Tinh bột đã qua hồ hoá thuỷ phân dễ dàng hơn tinh bột chưa qua hồ hoá

Vùng pH tối ưu chung cho hệ enzyme amylase là 4,5 - 5,5 Nếu pH < 2,8 và

pH > 8 thì hệ enzyme amylase bị vô hoạt pH tối ưu của amylase khi đường hoá phụ thuộc nhiều yếu tố, quan trọng nhất là nhiệt độ [25, 32, 50]

Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme amylase

Vùng pH tối ưu Nhiệt độ (oC) α- amylase β- amylase Chung cho

Trong sản xuất tốc độ của sự thủy phân là một hàm số, là sự tác dụng tổng hợp của phức hệ enzyme Phức hệ enzyme nếu có sự khác nhau vê loại, lượng, hoạt tính khác nhau thì kết quả của sự thủy phân tinh bột cũng khác nhau

Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ đường hóa, hiệu suất đường hóa mà còn ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần của sản phẩm đường hóa Khi đường hóa ở nhiệt độ cao, dextrin tạo ra nhiều hơn so với đường khử Thêm vào đó trong nấm men không có hoặc có rất ít amylase và glucoamylase nên không thể thủy phân tiếp tục dextrin thành đường Do đó, hiệu suất thu hồi giảm

Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu từ tinh bột không xảy ra hoàn toàn, thường chỉ đạt 20 – 30% Không được kéo dài thời gian đường hoá quá lâu để tạo thành nhiều đường, vì như vậy thì chu kì sản xuất kéo dài hoạt tính của enzyme amylase cũng bị ảnh hưởng

Khi sản phẩm đường hình thành với lượng ít, nhiệt độ tối thích để bảo vệ hoạt tính của enzyme là 50 – 60oC Khi sản phẩm hình thành tương đối nhiều, nhiệt

độ đường hóa không nên vượt quá 57 – 58oC Nếu vượt quá nhiệt độ này thì hiệu suất thu hồi thấp

Nồng độ ion H+:

Bản chất của enzyme là protein, do vậy tính chất của nó cũng giống như protein Những nhóm hóa học cơ bản của enzyme có khả năng ion hóa Sự hiện diện của ion H+, OH- làm giảm khả năng ion hóa của các nhóm này hay nhóm khác Nếu nhóm này là trung tâm hoạt động của enzyme thì nó sẽ gây ra sự kìm hãm hoặc kích thích enzyme tùy theo nồng độ pH tối thích của enzyme amylase dao động trong khoảng 4,5 – 5,5

Ảnh hưởng của pH đối với enzyme còn phụ thuộc vào nhiệt độ, ngược lại

pH cũng làm thay đổi nhiệt độ tối ưu của các enzyme này Các nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ tăng thì pH cũng tăng theo

Ảnh hưởng của chất sát trùng:

Để ngăn chặn hiện tượng nhiễm khuẩn trong quá trình đường hóa, các nhà sản xuất rượu thường sử dụng Na2SiF6, formol với nồng độ 0,02 – 0,025% khối lượng Chất này được cho vào nồi nấu trước khi đường hoá hoặc cho vào dịch lên

men Nồng độ chất sát trùng cao có thể tiêu diệt luôn cả mốc, men nhưng nó không gây ức chế enzyme có khi lại kích thích hoạt động của enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ rượu:

Quá trình đường hóa xảy ra trong thời gian ngắn, tinh bột không hoàn toàn

bị thủy phân mà quá trình thủy phân còn tiếp tục đến khi kết thúc quá trình lên men Trong quá trình này nồng độ rượu tăng dần do đường đã lên men có tác dụng nhất định đến phức hệ enzyme amylase

Ảnh hưởng của thời gian đường hoá:

Thời gian đường hóa có ảnh hưởng đến sự hòa tan tinh bột không đường hóa Khi đường hóa ở nhiệt độ 55 – 58oC trong thời gian 15 – 150 phút thì hầu như lên men không tăng nhưng nồng độ chất tan tăng lên là do sự hòa tan của tinh bột không đường hóa Như vậy, thời gian đường hóa gia tăng làm nâng cao hàm lượng chất khô hòa tan và nâng cao tính đệm của dung dịch Tuy nhiên kéo dài thời gian đường hoá ở 55 – 58oC sẽ làm giảm hoạt tính của amylase, khả năng nhiễm khuẩn tăng, do vậy hiệu suất thu hồi giảm [21, 25, 50]

2.2.2.2 Các giai đoạn của quá trình đường hoá:

- Giai đoạn dịch hoá:

Khi cho enzyme amylase tác dụng lên dung dịch hồ tinh bột, các sản phẩm tạo thành trong giai đoạn này là dextrin phân tử cao và một lượng nhỏ đường Như vậy, có thể quan niệm sự dịch hóa là sự phá hủy các tập hợp tinh bột thành những phần tử riêng biệt, rồi lại phân ly tiếp tục thành các dextrin phức tạp

- Giai đoạn dextrin hoá:

Trong giai đoạn này các phân tử tinh bột sẽ bị thủy phân ngắn dần Như vậy, dextrin chẳng qua chỉ là một loại polysaccharide trung gian giữa tinh bột và maltose, tác nhân gây ra quá trình dextrin hóa là α – amylase và β – amylase

- Giai đoạn đường hoá:

Là giai đoạn phân ly dextrin thành maltose và glucose, gồm hai giai đoạn phản

+ Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường với sự có mặt của oxy như các

quá trình lên men acid tổng số, acid citric…

+ Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của oxy

như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic…

Trong quá trình lên men rượu, nấm men chuyển hóa đường thành rượu etylic

và CO2, có thể gọi quá trình này là quá trình rượu hóa hay cồn hóa Trong quá trình này nấm men phát triển theo 2 giai đoạn:

+ Quá trình phát triển sinh khối: với sự có mặt của oxy tế bào nấm men gia

tăng kích thước và số lượng

+ Quá trình lên men: nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các

enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất

để duy trì sự sống, đồng thời tạo thành rượu và CO2

- Cơ chế của quá trình lên men rượu:

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất

định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt > 100 triệu tế bào trong 1 ml dịch lên men Do điện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường

CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra càng nhiều và lớn dần lên thành những túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và nấm men thì tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho

CO2 bị phóng thích ra bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường Do đó, quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men

- Động học của quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi hàm lượng đường trong dịch lên men bằng cách theo dõi sự thay đỏi hàm lượng rượu và CO2 tạo thành

Quá trình lên men chia thành 3 thời kỳ chính:

+ Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi có nấm men tiếp xúc với dịch lên men

Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

+ Thời kỳ 2: đây là thời kì lên men chính Chiếm khoảng 60 – 120 giờ sau thời

kì đầu Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng lên nhanh đáng

kể và đạt đến trị số cực đại

+ Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là

thời kì ổn định tạo mùi cho sản phẩm Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được

Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men

Đặc trưng của quá trình lên men dịch đường hoá từ nguyên liệu chứa tinh bột

là giai đoạn lên men phụ Trong giai đoạn này sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự phân hủy hàm lượng dextrin không lên men còn lại Tuy nhiên, chính những loại đường không len men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm Như vậy, chu kỳ lên men dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme amylase Thời gian lên men cuối càng kéo dài thì hiệu suất của quá trình lên men càng cao [21, 25, 35]

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men

Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với

nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28 ÷ 32oC Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men cao và sẽ kéo dài hơn Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dịch lên men tới 20 ÷ 22oC sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn

Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men sẽ giảm nhanh, nhưng chủ yếu là trong điều kiện nhiệt độ này dễ bị nhiễm vi khuẩn lactic và nấm men dại Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde, quá trình tổn thất rượu theo

CO2 sẽ tăng

Ảnh hưởng của pH

Nồng độ của ion H+ trong môi trường lên men có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt tốt trong trạng thái ion nhất định - trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường lên men

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo ra rượu etylic là 4,5-5,5 Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glycerine sẽ tạo ra nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men

Ở pH ≤ 4,2 nấm men phát triển tuy chậm hơn so với ở pH = 4,5-5,0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển

Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men:

Nồng độ dịch đường lên men quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men, dẫn đến độ rượu tăng, sẽ ức chế không chỉ tạp khuẩn mà ức chế cả nấm men Mặt khác hàm lượng đường cao sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men Ngược lại nếu nồng độ dịch đường lên men thấp sẽ không kinh tế vì làm giảm năng suất của thiết bị lên men Hơn nữa sẽ tốn hơi khi chưng cất và tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải

Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường khoảng 16

÷ 18% (tùy mức độ thuần khiết), tương đương 13 ÷ 15% đường

Ảnh hưởng của nồng độ rượu:

Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kỵ khí là ethanol Ethanol kìm hãm hoạt động sống của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ kìm hãm khác nhau đối với từng chủng, nòi nấm men khác nhau

Ví dụ, đối với S.ellipsoideus có thể chịu đựng được nồng độ cồn 18% v/v

Khả năng chịu đựng của nấm mốc, vi khuẩn thì kém hơn nhiều so với nấm men

Điều này thực sự có ý nghĩa lớn trong sản xuất, bởi khi quá trình lên men kỵ khí bắt đầu xảy ra, ethanol hình thành trong môi trường lên men có tác dụng kìm hãm nấm mốc, vi khuẩn và nấm men dại tạo điều kiện cho nấm men phát triển

Ảnh hưởng của việc thông thoáng khí và đảo trộn:

Oxy là thành phần không thể thiếu trong quá trình phát triển sinh khối Tuy nhiên, nó lại là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu, bia trong các giai đoạn chế biến còn lại Với sự có mặt của oxy nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng

sẽ phát triển sinh khối Trong giai đoạn bảo quản chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyde, sản phẩm dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu, hình thành các acid hữu cơ làm chua và gây thối sản phẩm

Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ số lượng tế bào lên men, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất Tuy nhiên, lại có một số chủng nấm men phát triển nhanh và tạo ra lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy

Thông khí có nghĩa là cung cấp đủ oxy cho quá trình hô hấp của nấm men Việc thông khí kết hợp với đảo trộn có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Thiếu không khí tức là điều kiện yếm khí, nấm men sẽ thực hiện quá trình lên men rượu, nồng độ rượu trong môi trường tăng nhanh chóng, khi

đó sự phát triển của nấm men dần dần sẽ bị kìm hãm

Việc thông khí và đảo trộn còn có tác dụng làm cho môi trường luôn ở trạng thái động, tăng cường sự tiếp xúc giữa tế bào nấm men với môi trường dinh dưỡng,

do đó rút ngắn được thời gian nuôi cấy

Ngoài các yếu tố trên, các chất sát trùng dùng trong sản xuất như formol,

Na2SiF6, NaF, CaOCl2,…các muối kim loại nặng, các tia cực tím,… đều ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của nấm men Tuy nhiên, mỗi yếu tố (hay chất hóa học) có ảnh hưởng khác nhau trong từng điều kiện nuôi cấy và từng chủng nấm men khác

nhau

Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng:

Trong điều kiện sản xuất dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó bảo đảm vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn Có thể dùng nhiều hóa chất khác nhau như clorua vôi, formalin hay fluosilicat natri Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu tới hoạt động của nấm men [25,35]

2.2.4 Biến đổi sinh hoá trong quá trình lên men

[1]

Sơ đồ 2.1 Sự biến đổi sinh hóa trong quá trình lên men

2.2.5 Qúa trình tạo hương

2.2.5.1 Khả năng tạo hương của vi sinh vật trong quá trình lên men rượu

Vi sinh vật trong quá trình phát triển trên cơ chất, qua các hoạt động sinh lý đã tao ra một số sản phẩm ở các dạng rắn, lỏng, khí một trong các sản phẩm này có thể phản ứng với nhau hình thành những sản phẩm thứ cấp tạo hương thơm cho thực phẩm lên men Đó là những mùi hương hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

Trong quá trình lên men rượu Sake, quá trình tạo hương nhờ vi sinh vật chủ yếu

là do sự trao đổi chất của nấm men Saccharomyces cerevisae vì giai đoạn lên men là quá trình kị khí không thích hợp cho sự phát triển của mốc Aspergillus oryzae

Ester được xem là hợp chất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng hương vị của rượu Sake Sự hiện diện các chất này trong rượu với nồng độ thích hợp sẽ tạo nên hương vị rất đặc trưng cho sản phẩm Trong đó, có thể kể đến như: isoamyl acetate,

ethyl acetate, ethyl carproate với hương giống hương chuối, hương táo và một số

hương trái cây khác Khả năng tạo hương trong quá trình lên men rượu Sake chủ yếu phụ thuộc vào chủng nấm men, nhằm nâng cao những phần này trong lên men rượu Sake, Ashida và cộng sự đã tạo ra một chủng nấm men mới có khả năng chuyển hóa tạo thành các hợp chất isoamyl acetate và isoamyl alcohol với nồng độ rất cao Một hợp chất khác cũng khá quan trọng trong thành phần hương của rượu Sake là ethyl caproate được Ichikawa và cộng sự của ông đạt được khi lên men rượu với chủng nấm men đột biến

Cơ chế tạo thành các hợp chất ester quan trọng này vẫn chưa được giải thích đầy

đủ, tuy nhiên nhiều ý kiến cho rằng enzyme alcohol acetyltransferase là tác nhân chính tham gia vào sự tổng hợp isoamyl acetate từ hai cơ chất chính là isoamyl alcohol và acetyl- CoA Sự tạo thành ester phụ thuộc vào nồng độ hai cơ chất acetyl- CoA và rượu bậc cao dưới tác dụng của các enzyme tham gia tạo thành ester Vì thế các thông số như nhiệt độ, thành phần nguyên liệu, hàm lượng acid béo của quá trình lên men đều ảnh hưởng đến nồng độ cơ chất và các enzyme cấu thành ester [31]

Đến năm 1970, với sự phát triển của phương pháp sắc kí khí, người ta đã phát hiện được 214 hợp chất cho đến nay người ta cũng đã phát hiện được lên đến 350 hợp chất có mặt trong tổ hợp hương của các sản phẩm lên men truyền thống

Trong số các hợp chất dễ bay hơi thì các loại rượu bậc cao với số carbon từ 3 trở lên có ảnh hưởng mạnh đến tính chất cảm quan của sản phẩm, đặc biệt là hương thơm của sản phẩm Những rượu bậc cao có mùi mạnh hơn so với những rượu bậc thấp, như rượu isoamylic có mùi gần 10 vạn lần mạnh hơn so với rượu methyl Số rượu bậc cao

được nhận biết trong sản phẩm lên men rượu vào khoản 40 chất, tuy nhiên chỉ có 3 hoặc 4 chất trong số các rượu bậc cao này là có hàm lượng đáng kể và ảnh hưởng rõ rệt đến hương thơm của sản phẩm, đó là rượu n-propylic, rượu amylic, và rượu isoamylic

Lê Văn Nhương và cộng sự (1990) đã nghiên cứu quá trình lên men rượu nếp bằng bánh men thuốc bắc, kết quả phân tích cho thấy hương rượu nếp được tạo thành

từ các loại rượu bậc cao như n-propylic, amylic, và rượu isoamylic và một số cấu tử tạo hương khác như acetate ethyl chính những hợp chất bay hơi này phối hợp để tao hương đặc trưng cho rượu nếp

Suprianto và cộng sự (1989) nghiên cứu hương thơm tape khi sử dụng bánh men

Ragi (gồm Rhizopus sp , Saccharomyces sp và vi khuẩn lactic phát triển trên gạo), đồng thời nuôi cấp riêng rẽ Rhizopus sp bổ sung với Saccharomyces sp trong 20g gạo

nếp Kết quả khảo sát đặc tính khối lên men được ghi nhận trong bảng sau:

Bảng 2 3 Tính chất tạo hương và đường hóa của vi sinh vật khi nuôi cấy riêng và hỗn

hợp

Vi sinh vật

Tính chất

khối lên men

Rhizopus sp Saccharomyces sp Rhizopus sp.+

Saccharomyces sp

bánh men Ragi

hương thơm