Khảo sát đa trung tâm tình hình đề kháng kháng sinh của streptococcus pneumoniae và haemophilus influenzae là hai tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp cộng đồng

HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --- NGUYỄN THỊ THANH HÒA KHẢO SÁT ĐA TRUNG TÂM TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE LÀ HAI TÁC NHÂN GÂY

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN THỊ THANH HÒA

KHẢO SÁT ĐA TRUNG TÂM TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG

KHÁNG SINH CỦA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE LÀ HAI TÁC NHÂN

GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP CỘNG ĐỒNG

Mã số : 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2011

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI CÔNG TY NAM KHOA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS BS Phạm Hùng Vân

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 13 tháng 08 năm 2011

Tp HCM, ngày 25 tháng 07 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ THANH HÒA Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 23/08/1982 Nơi sinh : Phú Yên

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV : 10310609

I- TÊN ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT ĐA TRUNG TÂM TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE VÀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE LÀ HAI TÁC

NHÂN THƯỜNG GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP CỘNG ĐỒNG

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

− Thu thập chủng vi khuẩn từ các trung tâm tham gia

− Thực hiện định danh lại các chủng đã thu nhận được để xác định chính xác chủng

là Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae

− Thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp: khuếch tán kháng sinh trên thạch, phát hiện men beta-lactamase và xác định MIC bằng phương pháp E-test

− Tổng kết và xử lý kết quả bằng Excel.

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS PHẠM HÙNG VÂN

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

Tên đề tài: Khảo sát đa trung tâm tình hình đề kháng kháng sinh của Streptococcus

pneumoniae và Haemophilus influenzae là hai tác nhân thường gây nhiễm khuẩn hô

hấp cộng đồng

Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Hòa

Cán bộ hướng dẫn: TS BS Phạm Hùng Vân

Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2010 đến tháng 07 năm 2011

Nội dung đề tài:

− Thu thập chủng vi khuẩn từ các trung tâm tham gia

− Thực hiện định danh lại các chủng đã thu nhận được để xác định chính xác chủng vi

khuẩn là S pneumoniae và H influenzae

− Thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp: khuếch tán kháng sinh trên thạch, phát hiện men beta-lactamase và xác định MIC bằng phương pháp E-test

− Tổng kết và xử lý kết quả bằng Excel.

Kết quả đề tài:

Khảo sát đa trung tâm tình hình đề kháng kháng sinh của 08 bệnh viện trên cả

nước với số lượng là 100 chủng S pneumoniae và 100 chủng H influenzae

Kết quả cho thấy các S pneumoniae kháng Penicillin là 15%, 28% kháng

Cefuroxime, 84% kháng Cefaclor, 95% kháng Azithromycin, 94% kháng Erythromycin, 84% kháng Clindamycin, 86% kháng Tetracyline, 72% kháng Chloramphenicol, 97% kháng Sulfamethoxazole-trimethoprim 0% kháng với Ofloxacin, Amoxicillin/clavulanic acid và Vancomycin

Kết quả cho thấy có 34% các H influenzae tiết beta-lactamase và hầu như các

chủng tiết β - lactamase đều kháng cao Ampicillin (88%); và 17% kháng Cefuroxime, 4% kháng Amoxicillin/clavulanic acid, 17% kháng Cefaclor, 7% kháng Clarithromycin, 2%

Chloramphenicol 0% kháng Ceftriaxone và Vancomycin

2.1 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram dương 10

2.2 Các loại tiêu huyết 11

2.3 Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn gram âm 19

2.4 Vòng β-lactam 24

2.5 Cấu trúc hóa học của Penicillin G 25

2.6 Phương pháp E-test 36

2.7 Phương pháp đĩa kháng sinh 37

3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 44

4.1 Hình ảnh nhuộm Gram của S pneumoniae (X400) 58

4.2 Tiêu huyết α trên S pneumoniae 59

4.3 Đường kính vòng vô khuẩn của optochin trên BA 59

4.4 Hình ảnh nhuộm Gram của H influenzae (X400) 60

4.5 Vi khuẩn mọc vệ tinh quanh vạch S.aureus trên BA 61

4.6 Vi khuẩn không mọc vệ tinh quanh vạch S aureus trên CA 61

4.7 Đường kính vòng vô khuẩn các đĩa kháng sinh của S pneumoniae 62

4.8 Giá trị MIC (µg/ml) trên que VA của S pneumoniae 63

4.9 Giá trị MIC (µg/ml) trên que OF và AZ của S pneumoniae 64

4.10 Giá trị MIC (µg/ml) trên que XM và CF của S pneumoniae 64

4.11 Giá trị MIC(µg/ml) trên que PG và XL của S pneumoniae 64

4.12 Đường kính vòng vô khuẩn các đĩa kháng sinh của H influenzae 73

4.13 Giá trị MIC (µg/ml) trên que AZ của H influenzae 73

4.14 Giá trị MIC (µg/ml) trên que CF và XM của H influenzae 74

4.15 Giá trị MIC(µg/ml) trên que AM và XL của H influenzae 74

4.16 Giá trị MIC (µg/ml) trên que CH và TX của H influenzae 75

2.2 Giá trị nồng độ kháng sinh trong các giếng 35

3.1 Tiêu chuẩn biện luận đường kính vòng vô khuẩn của S pneumoniae 49

3.2 Tiêu chuẩn biện luận đường kính vòng vô khuẩn của H influenzae 50

3.3 Tiêu chuẩn biện luận MIC của S pneumoniae theo CLSI 2011 52

3.4 Tiêu chuẩn biện luận MIC của H influenzae theo CLSI 2011 53

4.1 Số lượng (và %) chủng vi khuẩn theo bệnh viện 55

4.2 Số lượng (và %) bệnh phẩm của vi khuẩn S pneumoniae .56

4.3 Số lượng (và %) bệnh phẩm của vi khuẩn H influenzae 57

4.4 Kết quả kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh của S pneumoniae 65

4.5 Kết quả kháng sinh đồ bằng phương pháp E-test của S pneumoniae 66

4.6 Tỷ lệ PRSP và PISP phân lập tại các trung tâm tham gia khác nhau, phân tích theo nguồn gốc bệnh là xâm lấn (INV) hay không xâm lấn (non-INV) 67

4.7 Kết quả kháng sinh đồ bằng phương pháp bằng phương pháp đĩa kháng sinh của H influenzae .75

4.8 Kết quả kháng sinh đồ của bằng phương pháp E-test H influenzae 76

4.9 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh của H.influenzae tiết men beta-lactamase so với không tiết men beta-lactamase 77

4.1 Tỷ lệ % vi khuẩn S pneumoniae theo bệnh phẩm 56 4.2 Tỷ lệ % vi khuẩn H influenzae theo bệnh phẩm 57

4.3 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh bằng phương pháp đĩa kháng sinh

của S pneumoniae 65

4.4 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh bằng phương pháp E-test

của S pneumoniae 66

4.5 So sánh tỷ lệ PRSP, PISP, PSSP giữa hai nhóm xâm lấn và không

xâm lấn trên 100 chủng S pneumoniae 68

4.6 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh bằng phương pháp đĩa kháng sinh

của H influenzae 76

4.7 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh bằng phương pháp E-test

của H influenzae 77

4.8 Tỷ lệ (%) đề kháng kháng sinh của H.influenzae tiết men

beta-lactamase so với không tiết men beta-lactamase 78

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Bệnh lý và tình hình gây nhiễm trùng hô hấp cộng đồng 3

2.2 Tổng quan về Streptococcus pneumoniae 5

2.2.1 Vai trò gây bệnh 5

2.2.2 Cấu trúc tế bào 7

2.2.3 Đặc tính vi sinh học 8

2.2.3.1 Hình thái 8

2.2.3.2 Nuôi cấy 9

2.2.4 Qui trình định danh 9

2.2.4.1 Khảo sát kính hiển vi: nhuộm Gram 9

2.2.4.2 Tiêu huyết α 11

2.2.4.3 Thử nghiệm xác định 11

2.2.5 Tiêu chuẩn xác định 13

2.2.6 Tình hình đề kháng kháng sinh 13

2.3 Tổng quan về Haemophilus influenzae 15

2.3.1 Vai trò gây bệnh 15

2.3.2 Cấu trúc và tính chất kháng nguyên 16

2.3.3 Đặc tính vi sinh học 16

2.3.4 Phương pháp định danh 18

2.3.4.1 Khảo sát kính hiển vi: Nhuộm Gram 18

2.3.4.2 Thử nghiệm nhu cầu X/V 20

2.3.5 Tiêu chuẩn xác định 22

2.3.6 Tình hình đề kháng kháng sinh 22

2.4 Các nhóm kháng sinh chính 24

2.4.1 Nhóm beta-lacmin 24

2.4.1.1 Nhóm β-lacmin phân nhóm Penicillin 25

2.4.1.2 Nhóm β-lacmin phân nhóm Cephalosporin 27

2.4.2 Nhóm Aminoside 30

2.4.2.1 Phân loại 30

2.4.2.2 Cơ chế tác động 30

2.4.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 30

2.4.2.4 Phổ hoạt tính 31

2.4.3 Nhóm Macrolid 31

2.4.3.1 Phân loại 31

2.4.3.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 31

2.4.3.4 Phổ hoạt động 31

2.4.4 Nhóm Chloramphenicol 31

2.4.4.1 Phân loại 32

2.4.4.2 Cơ chế tác động 32

2.4.4.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 32

2.4.4.4 Phổ hoạt động 32

2.4.5 Nhóm Tetracyclin 32

2.4.5.1 Phân loại 32

2.4.5.2 Cơ chế tác động 33

2.4.5.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 33

2.4.5.4 Phổ hoạt động 33

2.4.6 Nhóm Lincosamid 33

2.4.6.1 Phân loại 33

2.4.6.2 Cơ chế tác động 33

2.4.6.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 33

2.4.6.4 Phổ hoạt động 34

2.4.7 Nhóm Quinolon 34

2.4.7.2 Cơ chế tác động 34

2.4.7.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn 34

2.4.7.4 Phổ hoạt động 34

2.5 Các phương pháp kháng sinh đồ 35

2.5.1 Kháng sinh đồ bằng phương pháp định lượng tìm MIC 35

2.5.1.1 Xác định MIC bằng phương pháp vi pha loãng 35

2.5.1.2 Xác định MIC bằng phương pháp E-test 36

2.5.2 Kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh 37

2.5.3 Phương pháp phát hiện men phá hủy các kháng sinh 38

2.5.3.1 Đặc tính của beta-lactamase 38

2.5.3.2 Nguồn gốc của beta-lactamase 39

2.5.3.3 Thử nghiệm phát hiện beta-lactamase 39

CHƯƠNG III: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu 40

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 40

3.1.2 Tiêu chí chọn chủng 40

3.1.3 Tiêu chí loại trừ 40

3.1.4 Môi trường nghiên cứu 41

3.1.6 Thuốc nhuộm Gram 42

3.1.7 Đĩa kháng sinh sử dụng 42

3.1.8 Que E-test sử dụng 43

3.2 Phương pháp nghiên cứu 44

3.2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 44

3.2.2 Phương pháp định danh 46

3.2.2.1 Vi khuẩn S pneumoniae 46

3.2.2.2 Vi khuẩn H influenzae 47

3.2.3 Thực hiện kháng sinh đồ 48

3.2.3.1 Kháng sinh đồ bằng đĩa kháng sinh 48

3.2.3.2 Xác định MIC bằng phương pháp E-test 51

3.2.3.3 Thử nghiệm tìm men beta-lactamase 54

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 55

4.1 Kết quả thu nhận chủng vi khuẩn 55

4.1.1 Chủng vi khuẩn theo bệnh viện 55

4.1.2 Chủng vi khuẩn theo nguồn gốc bệnh phẩm 56

4.2 Kết quả về các phương pháp định danh lại 58

4.2.1 Vi khuẩn S pneumoniae 58

4.2.1 Vi khuẩn H influenzae 60

4.3 Thực hiện kháng sinh đồ 62

4.3.1 Vi khuẩn S pneumoniae 62

4.3.1.1 Một số hình ảnh sau khi làm kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh và E-test 62

4.3.1.2 Kết quả tỷ lệ đề kháng kháng sinh của S pneumoniae 65

4.3.2 Vi khuẩn H influenzae 72

4.3.2.1 Một số hình ảnh sau khi làm kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh và E-test 73

4.3.2.2 Kết quả tỷ lệ đề kháng kháng sinh của H influenzae 75

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

5.1 Kết luận 81

5.2 Đề nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

Hiện nay, tình hình gia tăng đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập

được từ các nhiễm khuẩn hô hấp cộng đồng như Streptococcus pneumoniae (S

pneumoniae) và Haemophilus influenzae (H influenzae) đang nhận rất nhiều sự

quan tâm của các nhà vi sinh lâm sàng cũng như các nghiên cứu y học trên thế giới Thông thường thì tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng rất ít được xác định ngay trong giai đoạn cấp của bệnh, do vậy các nhà điều trị thường phải cho chỉ định kháng sinh ban đầu theo kinh nghiệm điều trị Và việc lựa chọn kháng sinh nào thì phải rất phụ thuộc vào tình hình đề kháng kháng sinh tại chỗ của vi khuẩn được nghi ngờ là tác nhân gây bệnh [22]

Tại Việt Nam rất hiếm có các ghi nhận vi sinh lâm sàng về S pneumoniae

và H influenzae dù đây là hai tác nhân rất thường gặp trong một bệnh lý đó là

nhiễm khuẩn hô hấp cộng đồng Nguyên nhân chính của thực tế này là vì đa số các phòng thí nghiệm lâm sàng tại Việt Nam không phát triển mấy về các xét nghiệm vi sinh lâm sàng Rất ít khi các bác sĩ điều trị cho chỉ định xét nghiệm vi sinh lâm sàng trước các bệnh nhân bị nhiễm khuẩn hô hấp Và nếu có thì ít khi phòng thí nghiệm

phân lập được S pneumoniae và H influenzae vì không có môi trường nuôi cấy

thích hợp [13]

Để góp phần giải quyết vấn đề này, việc lựa chọn kháng sinh thích hợp trong điều trị là rất cần thiết khi đứng trước một bệnh nhân nhiễm khuẩn hô hấp cấp, cũng như các thách thức phải quan tâm hiện nay khi tình hình đề kháng kháng sinh của hai tác nhân vi khuẩn này đang ở mức báo động tại nhiều quốc gia Châu Á [42], [44], [45]

Chính vì vậy, việc thực hiện nghiên cứu đa trung tâm về đề kháng kháng

sinh của S pneumoniae và H influenzae phân lập từ các bệnh viện Việt Nam là việc

làm rất cần thiết và đó chính là lý do để chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Khảo sát

đa trung tâm tình hình đề kháng kháng sinh của Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae là hai tác nhân thường gây nhiễm khuẩn hô hấp cộng

đồng” hướng đến mục tiêu và nội dung sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

Thực hiện một nghiên cứu đa trung tâm trên nhiều bệnh viện để có một cái

nhìn toàn diện hơn về tình hình S pneumoniae và H influenzae đề kháng kháng

sinh tại Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

− Thu thập chủng vi khuẩn từ các trung tâm tham gia

− Thực hiện định danh lại các chủng đã thu nhận được để xác định chính xác

chủng là S pneumoniae và H influenzae

− Thực hiện kháng sinh đồ bằng phương pháp: khuếch tán kháng sinh trên thạch, phát hiện men beta-lactamase và xác định MIC bằng phương pháp E-test

− Tổng kết và xử lý kết quả bằng Excel

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 BỆNH LÝ VÀ TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP CỘNG ĐỒNG

Phổi là cơ quan thực hiện chức năng trao đổi khí Bên cạnh việc cung cấp oxy cần thiết cho mọi tế bào của cơ thể, phổi còn giúp thải khí cacbonic Tuy nhiên không khí đi vào cơ thể cũng đồng thời có thể mang theo nhiều mầm bệnh như vi khuẩn, virus, khói, bụi và các chất độc hại khác

Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang cấp, viêm tai giữa cấp, viêm amydale cấp là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên; và viêm phổi, viêm phế quản – phổi là các bệnh lý viêm nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới Tác nhân vi khuẩn thường gặp gây các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp là S

pneumoniae và H influenzae [14], [17], [28], [34], [35], [37], [57], [73].

Viêm phổi do tác nhân vi sinh vật được chia làm hai nhóm: viêm phổi mắc phải trong cộng đồng dân cư, tức là một người đang sống và làm việc trong cộng đồng mắc bệnh viêm phổi (gọi tắt là viêm phổi cộng đồng), và viêm phổi mắc phải trong bệnh viện (gọi tắt là viêm phổi bệnh viện) Viêm phổi bệnh viện nguy hiểm hơn viêm phổi cộng đồng vì do những tác nhân kháng thuốc kháng sinh

Các yếu tố làm tăng bệnh lý hô hấp thường gặp ở người có tuổi như: hút thuốc lá làm tổn thương nhu mô phổi đưa tới bệnh lý phổi tắc nghẽn mãn tính, làm giảm chuyển động các tế bào lông trụ, làm giảm khả năng bảo vệ, gia tăng nguy cơ nhiễm trùng cũng như nguy cơ ung thư phổi, các bệnh lý nhiễm trùng răng miệng là

ổ nhiễm trùng kề cận đưa tới viêm nhiễm đường hô hấp trên cũng như hô hấp dưới

Sự thay đổi thời tiết cũng là yếu tố thúc đẩy các bệnh lý cấp tính ở hệ hô hấp, cũng

như bùng nổ các đợt cấp phát trên nền mãn tính của hệ hô hấp, các yếu tố ô nhiễm môi trường cũng là tác nhân gia tăng nguồn bệnh Ngoài ra, các bệnh mãn tính ở người có tuổi như: đái tháo đường, tăng huyết áp, tim mạch, suy gan, suy thận… làm thay đổi khả năng bảo vệ của cơ thể, cũng như thay đổi đặc tính cấu trúc vi khuẩn thường trú trong cơ thể, biến các vi khuẩn thường trú thành tác nhân gây bệnh [3]

Nhiễm khuẩn hô hấp không chỉ là gánh nặng bệnh tật mà còn là bệnh lý có tỷ

lệ tử vong đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm trùng ở các nước có thu nhập thấp [72] Trong một công trình nghiên cứu đa trung tâm thực hiện tại thành phố Hồ Chí Minh

vào năm 1998 cho biết H influenzae chiếm 50% đến 58% các trường hợp viêm phổi và

phế quản phế viêm ở trẻ em; 18% các trường hợp viêm phổi đợt cấp của viêm xoang mãn tính và 24% các trường hợp viêm xoang cấp; 11% đến 27% các trường hợp viêm phổi đợt cấp của viêm phế quản mãn tính và phế quản phế viêm mãn tính ở người lớn [8] Một nghiên cứu khác thực hiện trên 67 bệnh nhân viêm phổi cộng đồng đến khám và

điều trị tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2001 đã ghi nhận H influenzae chiếm 22% và S pneumoniae chiếm 12% [7]. Năm 2002, trong chương trình đa quốc gia nghiên cứu viêm phổi cộng đồng của Mạng Á Châu Điều Tra Các Tác Nhân Kháng Thuốc (Asian Network For Surveillance Of Resistant Pathogen=ANSORP) kết hợp với khoa hô hấp của bệnh viện Chợ Rẫy thực hiện

trên 81 bệnh nhân ghi nhận H influenzae là 14% và S pneumoniae là 9% [1]. Cũng

trong năm 2002, một công trình nghiên cứu thực hiện trên 53 bệnh nhân bị viêm

xoang cấp với bệnh phẩm là mủ khe giữa được lấy qua nọi soi mũi họng ; H

influenzae và S pneumoniae là hai tác nhân chiếm tỷ lệ cao nhất theo thứ tự là 26%

và 32% [15]

Viêm phổi cộng đồng cho đến nay vẫn là một bệnh lý thường gặp và là nguyên nhân gây chết hàng đầu trong các bệnh nhiễm trùng Tại Việt Nam, viêm phổi cộng đồng chiếm 12% các bệnh về phổi Nguyên nhân chủ yếu là do các vi

khuẩn tồn tại trong cộng đồng gây nên như S pneumoniae (chiếm hết 2/3), tiếp đến

là H influenzae

Viêm phổi mắc phải ở cộng đồng cũng là một trong những nhiễm trùng hô hấp rất thường gặp, hàng năm tại Hoa Kỳ có từ 2-3 triệu bệnh nhân mắc viêm phổi nhập viện điều trị; tại khoa hô hấp Bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội, khoảng 12% các bệnh nhân nhập viện điều trị vì viêm phổi

Tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng làm cho bệnh hô hấp ngày càng phổ biến Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1990, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính là nguyên nhân gây tử vong xếp hàng thứ 5 với 2,2 triệu người chết Tính đến năm 1997 có khoảng 300 triệu người mắc bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính và là nguyên nhân tử vong xếp hàng thứ 4 Theo dự đoán của WHO số người mắc bệnh

sẽ tăng 3-4 lần trong thập kỷ này, gây ra 2,9 triệu người chết mỗi năm và đến năm

2020 bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính sẽ là nguyên nhân gây chết đứng hàng thứ 3

Ở nước ta, theo các nghiên cứu về bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính gần đây cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh thay đổi theo từng vùng, nhìn chung vào khoảng 2 - 5,7% Những thống kê về tỷ lệ bệnh nhân điều trị tại bệnh viện cho thấy, cứ 4 bệnh nhân nhập viện tại các khoa bệnh phổi thì có 1 bệnh nhân mắc bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [78]

2.2 TỔNG QUAN VỀ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

2.2.1 VAI TRÒ GÂY BỆNH

Phế cầu khuẩn (S pneumoniae) là một thành viên phổ biến của hệ vi khuẩn

chí vùng hầu họng Tỷ lệ người lành mang phế cầu thay đổi tuỳ theo tuổi, môi trường sống, mùa và sự có mặt của nhiễm trùng đường hô hấp trên (tỷ lệ trung bình dao động từ 25-70% dân số) Phế cầu là căn nguyên hàng đầu của “viêm phổi mắc phải ở cộng đồng” (viêm phổi thùy và tiểu thùy, xấp xỉ 500.000 trường hợp viêm phổi xảy ra hàng năm ở tất cả các lứa tuổi tại Mỹ Theo số liệu điều tra của một số

nghiên cứu tại Việt Nam thời gian 1990 – 2003 cho thấy 40-70% trẻ khoẻ mạnh mang phế cầu vùng hầu họng và 26-83% các trường hợp viêm đường hô hấp cấp tính có nguyên nhân là phế cầu)

Mặc dù S pneumoniae gây bệnh nhiễm khuẩn, viêm tai giữa và viêm màng

não ở người nhưng nó lại được biết đến là tác nhân gây viêm phổi, bệnh về đường

hô hấp trên và là nguyên nhân gây bệnh và tử vong trên toàn thế giới Các triệu chứng của viêm phổi bao gồm ho kèm theo nhầy màu xanh hoặc màu vàng, sốt, ớn lạnh, khó thở, và đau ngực Các vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp thường gặp nhất ở trẻ nhỏ và người cao tuổi

Các yếu tố độc lực của S pneumoniae bao gồm một polysaccharide nhằm

ngăn ngừa thực bào của tế bào miễn dịch, các protein bề mặt ngăn chặn sự hoạt hóa

bổ sung (một phần của hệ thống miễn dịch giúp các tác nhân gây bệnh rõ ràng từ cơ

thể), và tiêm mao cho phép S pneumoniae để gắn vào các tế bào biểu mô ở đường

hô hấp trên

Đường lây truyền:

Người lành mang vi khuẩn:

− Trẻ nhỏ < 5 tuổi: 60% trẻ khoẻ mạnh có phế cầu (từ 1 týp huyết thanh đến vài týp huyết thanh) vùng hầu họng

− Người lớn: 10-30% mang vi khuẩn phế cầu vùng họng

Ngoại sinh: Chủ yếu lây từ những người đang có bệnh hay người lành mang vi

khuẩn sang những người có sức đề kháng với phế cầu đang bị suy giảm vì nhiễm virus, dị ứng, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, suy nhược nói chung Bệnh nhân cắt lách hoặc thiếu máu hồng cầu hình liềm là những người nhạy cảm đặc biệt với các

bệnh do phế cầu

Nội sinh: Từ một người lành mang vi khuẩn vùng mũi-họng chuyển thành người

bệnh do sức đề kháng giảm bởi các yếu tố được nêu ở trên [4], [38], [53], [74]

2.2.2 CẤU TRÚC TẾ BÀO

S pneumoniae là đặc trưng của một viên nang polysaccharide hoàn toàn bao

quanh tế bào, đóng một vai trò quan trọng trong độc tính của nó Các thành tế bào

của S pneumoniae gồm có peptidoglycan với axit teichoic thuộc mọi axit

N-acetylmuramic thứ ba và có khoảng 6 lớp dày Axit lipoteichoic được gắn vào màng

tế bào thông qua phân nữa lipid, và cả hai axit teichoic và lipoteichoic chứa phosphorylcholine

S pneumoniae chứa hơn 500 protein bề mặt khác nhau Một nhóm đáng chú

ý là các protein choline-binding (CBPs) Mười hai trong số này là liên kết với các phân nữa choline của thành tế bào và giúp đỡ trong việc gắn các phần tử chức năng khác nhau lên bề mặt của tế bào Trong số các CBPs được tìm thấy yếu tố quyết định quan trọng của virulance, bao gồm PspA (bảo vệ kháng nguyên), LytA, B, và

C (autolysins), và CbpA (adhesin)

Vỏ polysaccharide là yếu tố bảo vệ vi khuẩn tránh được sự thực bào từ các đại thực bào – là yếu tố quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại và phát triển để gây bệnh

Pneumolysin là chất phá huỷ tế bào nội mô phổi, phá vỡ hàng rào nội mô ngăn cách phế nang và máu do đó phế cầu có thể tràn từ các phế nang vào máu (là nguyên nhân dẫn tới các triệu chứng nặng như khởi phát đột ngột rầm rộ, đông máu nội mạch rải rác )

Protein A trên bề mặt tế bào vi khuẩn giúp phế cầu bám dính vào tế bào biểu

mô phế quản, tạo điều kiện cho sự xâm lấn sâu hơn xuống đường hô hấp dưới

Enzyme phân huỷ IgA (siga protease) giúp phế cầu tồn tại được ở hầu họng Phản ứng viêm cấp tính mạnh gây nên do các thành phần của cấu trúc thành

tế bào vi khuẩn gây nên (peptidoglycan, axit teichoic có khả năng kích thích phản ứng viêm mạnh mẽ)

Vỏ polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực

duy nhất được biết Có 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn (pneumococci) đã được

nhận biết Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất

Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh bệnh Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân

Phức hợp polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose,

2-acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate [4], [69]

2.2.3 ĐẶC TÍNH VI SINH HỌC

2.2.3.1 Hình thái:

S pneumoniae là vi khuẩn Gram dương hình mũi giáo, hình ngọn nến; xếp

thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc thành đôi, không di động, không sinh bào tử Chúng thường được tìm thấy trong cặp (diplococci), nhưng cũng được tìm thấy đơn

độc và trong các chuỗi ngắn S pneumoniae là tán huyết alpha

Ở môi trường lỏng hay trong các tổ chức bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hạn hữu có thể đứng riêng rẽ một mình, thường ở trong điều kiện và môi trường kém dinh dưỡng hoặc có nồng độ ion Mg++ thấp

Hầu hết, S pneumoniae bắt màu Gram dương, đôi khi trong quá trình thay

đổi nuôi cấy có thể trở thành Gram âm do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium dodecylsulfat)

Trong môi trường lỏng S pneumoniae mọc có khuynh hướng khuếch tán và

lắng cặn khi môi trường đã ngả sang axit

Trên môi trường thạch (thạch máu cừu hay thỏ), vi khuẩn có khuẩn lạc tròn bóng ướt do có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của một enzyme tự ly giải, đường kính khuẩn lạc 0.5-1.5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha [4]

2.2.3.2 Nuôi cấy:

S pneumoniae vi khuẩn hiếu khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 35- 370C; cần phải ủ trong điều kiện 5% CO2 (hoặc bình nến); vi khuẩn khó mọc: môi trường phải giàu dinh dưỡng (thịt bằm, huyết thanh, hồng cầu,…); phát triển tốt trong các môi trường lỏng và trên các môi trường thạch Tryptocasein soya có bổ xung 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ huyết Không nên dùng máu người vì thường có chất kháng sinh và các chất ức chế vi khuẩn phát triển [4], [63], [71]

vào năm 1884 để phân biệt các Pneumococcus với Klebsiella pneumonia

Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể-iot Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường

có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào [5], [77]

Hình 2.1: cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram dương [77]

Qui Trình

− Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm

− Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn

− Dùng tím tinh thể nhuộm mẫu trong 1 phút

− Rửa nước tối đa 5 giây

− Thêm dung dịch Lugol trong 1 phút

− Rửa bằng cồn trong 10 giây

− Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút) Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu

− Rửa nước

− Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều,

trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin) Thời gian: 1 phút

− Rửa qua nước Để khô

− Xem ở vật kính dầu

2.2.4.2 Tiêu huyết α

Tán huyết (tan máu trong tiếng Anh) là sự phân hủy của các tế bào máu đỏ Khả năng của các thuộc địa để tạo ra vi khuẩn tán huyết khi trồng trên thạch máu được sử dụng để phân loại một số vi sinh vật Điều này đặc biệt hữu ích trong việc phân loại liên cầu loài Một chất gây tán huyết là một hemolysin . 

Tiêu huyết α: khuẩn lạc được bao quanh bằng một vòng màu xanh nhạt tương đối hẹp 1 - 2mm Đây là hiện tượng tiêu huyết không hoàn toàn, chỉ có một phần hồng cầu bị tiêu huyết [4], [74], [75], [76]

Hình 2.2: Các loại tiêu huyết [76]

2.2.4.3 Thử nghiệm xác định

™ Thử nghiệm Optochin

Nguyên tắc:

Ethylhydrocupreine hydrochloride (Optochin) là dẫn xuất của quinine có tác

dụng ức chế sự phát triển S pneumoniae ở một nồng độ rất thấp (5mg/ml)

Phương pháp thực hiện

− Dùng vòng cấy cấy trãi vi khuẩn trên môi trường Blood Agar (BA)

− Đặt đĩa kháng sinh Optochin lên trên vùng cấy vi khuẩn

− Ủ 350C/5% CO2/12-24 giờ

Biện luận kết quả:

− Không có vòng vô khuẩn: không là S pneumoniae

− Đường kính vòng vô khuẩn ≤ 14mm làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật

− Đường kính vòng vô khuẩn > 14mm là S pneumoniae [2], [4]

™ Thử nghiệm tan trên muối mật (Bile solubility):

Nguyên tắc:

Bile hoặc bile salt như sodium deoxycholate, sodium taurocholate có khả

năng ly giải vi khuẩn S pneumoniae khi thêm vào trong môi trường nuôi cấy Sự ly giải của S pneumoniae dưới tác dụng autolytic enzyme (autolysins) Bile salt với

hàm lượng thấp làm tăng sức căng bề mặt giữa màng tế bào vi khuẩn với môi trường Từ đó làm gia tăng quá trình ly giải tự nhiên của vi khuẩn

Phương pháp thực hiện

• Trên môi trường thạch:

− Dùng vòng cấy cấy trãi vi khuẩn trên thạch máu

− (+) : khúm khuẩn bị ly giải

− (-) : khúm khuẩn không bị ly giải

• Trên môi trường lỏng

− Làm huyền dịch vi khuẩn trong phosphate buffer pH =7

− Lấy 0.5ml huyền dịch vi khuẩn cho vào týp và thêm vào 0.5ml sodium deoxycholate 2%

− Ủ 350C/3 giờ

Biện luận kết quả:

− (+) : huyền dịch trong suốt

− (-) : huyền dịch giữ nguyên độ đục [2], [4]

2.2.6 TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH

Trước đây, điều trị nhiễm trùng do S pneumoniae là tương đối dễ dàng nhờ

vi khuẩn rất nhạy cảm với các kháng sinh và Penicillin luôn là kháng sinh hàng đầu Tuy nhiên trong vài thập niên trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã báo động tình hình vi

khuẩn S pneumoniae kháng Penicillin trên các châu lục, đặc biệt là ở Châu Á:

Nghiên cứu toàn cầu của chương trình Alexander năm 1996-1997 đã ghi nhận tỷ lệ

đề kháng Penicillin rất cao ở Hồng Kông (53.1%); kế đó là Pháp (30.6%), Mexico

(27.2%), Tây Ban Nha (29.2%), Tiệp Khắc (19.8%), Mỹ (17.7%), Bồ Đào Nha (16.8%), Ireland (13.8%), và Hungary (11.8%) [23], [26] Tiếp theo, chương trình Alexander năm 1998-2000 thực hiện trên 26 quốc gia cho thấy tỷ lệ PRSP

(Penicillin resistance S pneumoniae) cao nhất cũng là Hồng Kông (69.9%), kế đó

là Pháp (40.5%), Israel (29.7%), Nhật Bản (28.5%), Tây Ban Nha (26.4%), Mỹ(25%), Singapore (24.8%), Ireland (24.1%), Mexico (22.2%), Ả Rập Saudi (21.7%), Tiệp Khắc (19.5%), Nam Phi (17.9%), Bồ Đào Nha (10.9%) và Anh (10%) [37] Tổng kết chương trình nghiên cứu đa quốc gia Protek 1999-2000cũng cho kết quả phát hiện tỷ lệ PRSP rất cao ở Châu Á (53.4%) với cả 3 quốc gia tham gia đều có tỷ

lệ PRSP rất cao là Hàn Quốc (71.5%), Hồng Kông (57.1%), Nhật Bản (44.5%) [24] Rồi các nghiên cứu của ANSORP đã chỉ điểm được các quốc gia như Việt Nam, Hàn Quốc, Hồng Kông và Đài Loanchính là các điểm nóng tại Châu Á về tình hình

S pneumoniae kháng Penicillin [42], [44], [45]

Song song với các cảnh báo về tình hình đề kháng Penicillin tại Châu Á, các nghiên cứu của ANSORP, Alexander và PROTEKTcũng đã ghi nhận các tỷ lệ đề

kháng cao đáng lo ngại của S pneumoniae đối với các macrolides Trên các chủng

phân lập lâm sàng tại Việt Nam, ANSORP đã ghi nhận có từ 62.5% đến 92.1% kháng Erythromycin [23], [24], [26], [42], [43], [44], [45], [48]

Tại Việt Nam, một công trình nghiên cứu đa trung tâm trên 204 chủng vi

khuẩn S pneumoniae phân lập từ các bệnh phẩm lấy trên các bệnh nhân được lâm

sàng chẩn đoán nhiễm khuẩn hô hấp cấp Kết quả công trình nghiên cứu này đã cho

thấy có đến 80% vi khuẩn S pneumoniae là kháng Penicillin với 38% PRSP và 42% PISP (Penicillin intermediate S pneumoniae) Kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận tỷ lệ S pneumoniae đề kháng khá cao với macrolides: 89.7% kháng được một

trong 3 macrolides thử nghiệm là Erythromycin (72%), Azithromycin (76%) và Clarithromycin (86%) [10], [70]

2.3 TỔNG QUAN VỀ HAEMOPHILUS INFLUENZAE :

2.3.1 VAI TRÒ GÂY BỆNH

H influenzae là vi khuẩn thuộc tộc Haemophilus, được phát hiện lần đầu

trong bệnh phẩm đàm của một bệnh nhân viêm phổi ở dịch cúm năm 1892 bởi Robert Pfeifer Tên vi khuẩn là sự kết hợp của đặc tính phát triển cần các yếu tố có

ở máu (haemophilus: ưa máu) và có mối liên quan lịch sử với cúm (influenzae) của

vi khuẩn

Các thành viên của tộc Haemophilus là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc, tạo

nên một phần của hệ vi khuẩn bình thường ở người và nhiều loài động vật (chiếm

khoảng 10% hệ vi khuẩn vùng hầu họng) Tỷ lệ mang vi khuẩn H influenzae ở

đường hô hấp trên thay đổi theo lứa tuổi: Người lớn khoẻ mạnh: từ 20-40%; Trẻ em khoẻ mạnh: 75- 80%

H influenzae chỉ gây bệnh cho người, không gây bệnh cho động vật Yếu tố

có tính mãnh độc chủ yếu là vỏ polysaccharide của vi khuẩn (sinh ra týp huyết thanh) 90% các trường hợp nhiễm trùng nghiêm trọng (nhiễm khuẩn xâm lấn) như

viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết là do H influenzae có vỏ týp b (Hib), ngoài ra

Hib còn là tác nhân gây viêm phổi cấp, viêm nắp thanh quản cấp, viêm mô tế bào

Tỷ lệ người lành mang Hib dao động từ 1-5%, hạn hữu có nơi 10% nhưng ở những nhà giữ trẻ có trẻ bị viêm màng não do Hib, tỷ lệ người lành mang vi khuẩn này lên

tới 70% Ngược lại, các chủng H influenzae không có vỏ bọc thường chỉ gây các

bệnh nhiễm trùng khu trú như viêm tai giữa, viêm phế quản mãn tính, viêm xoang cấp hay mãn (> 90%) là nguyên nhân của các nhiễm trùng xâm lấn, và thường xảy

ra ở trẻ mới sinh, người già và trẻ em ở các nước đang phát triển

Cơ chế gây bệnh của Hib có thể được hiểu như vỏ bọc có khả năng kháng lại

sự thực bào, và có thể có ý nghĩa quyết định nhất trong tính mãnh độc của vi khuẩn

H influenzae không sản xuất ngoại độc tố nhưng sinh men protease phân huỷ IgA

tạo điều kiện thuận lợi cho việc xâm lấn của vi khuẩn

Đường lây truyền: trực tiếp từ người sang người thông qua việc hít phải các giọt dịch đường hô hấp có chứa vi khuẩn [6], [18], [54], [58]

2.3.2 CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT KHÁNG NGUYÊN

Thành tế bào H influenzae cũng có cấu trúc tương tự như thành của các vi

khuẩn Gram âm khác, có bản chất là lipopolysaccharide-protein Các protein đặc hiệu loài (species - specific proteins) và đặc hiệu chủng (strain - specific proteins) nằm trên màng ngoài của vi khuẩn, nhưng các kháng nguyên của thành tế bào vi

khuẩn H influenzae có vỏ hay không vỏ đều không liên quan đến độc tính của vi

khuẩn

H influenzae gồm loại không vỏ và có vỏ polysaccharide bọc ngoài Vỏ

polysaccharide có tính quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn Tùy theo cấu

trúc kháng nguyên của vỏ, H influenzae có vỏ được phân thành 6 týp huyết thanh,

đánh dấu theo thứ tự a, b, c, d, e, f, trong số này týp b là týp gây bệnh nguy hiểm nhất, là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và phosphate (gọi là polyribosyl-ribitol-phosphate [PRP] ) Ở týp a, glucose thay thế cho ribose

Các kháng nguyên vỏ có thể được phát hiện bằng các kỹ thuật huyết thanh học như phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn với kháng huyết thanh đặc hiệu, phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với hạt latex được phủ kháng thể đặc hiệu, miễn dịch gắn men, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch điện di đối lưu

Các kháng thể kháng PRP đã được dùng để điều trị các nhiễm khuẩn nặng do

H influenzae týp b khi chưa có kháng sinh [6], [58]

2.3.3 ĐẶC TÍNH VI SINH HỌC

Thuộc loại đa hình thể: hình cầu, hình trực khuẩn ngắn (short rod), hình trực khuẩn dài (long rod), hình cầu trực khuẩn (coccobacilli) Hình thể vi khuẩn còn thay đổi theo môi trường sống (ví dụ trong dịch não tuỷ, vi khuẩn có thể kéo dài gấp 4, 5 lần kích thước bình thường và nối với nhau tạo hình sợi) Nhìn chung vi khuẩn có

kích thước mảnh nhỏ: 1-1,5 x 0,3µm, bắt màu Gram âm (màu hồng nhạt hơn các vi khuẩn Gram âm khác do bản chất mỏng mảnh của vi khuẩn) Trên môi trường thạch, khuẩn lạc của chúng có vỏ ướt bóng, óng ánh khi chiếu sáng, sau 24 đến 48 giờ trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi Hiện tượng thay đổi này liên quan đến sự thay đổi hoạt tính của các enzyme nội sinh Trong môi trường lỏng, tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn Vì vậy nếu muốn xác định vỏ cần chọn một thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ)

Khuẩn lạc của các chủng H influenzae không có vỏ không phát quang, có sự

thay đổi từ khuẩn lạc dạng S sang dạng R (thường gặp ở các chủng vi khuẩn phân lập từ đường hô hấp trên) Tình trạng này cũng có thể xảy ra khi môi trường nuôi

cấy không đủ yếu tố phát triển cần thiết cho vi khuẩn H influenzae có vỏ

Vi khuẩn không nhuộm màu axit, không di động và không hình thành bào tử Đặc điểm nuôi cấy:

Muốn phân lập được H influenzae, môi trường nuôi cấy giàu chất dinh

dưỡng thông thường cần phải có thêm các yếu tố sau:

− Yếu tố X (Heamin): yếu tố này có trong máu (trong huyết tương) và cả trong hồng cầu

− Yếu tố V (NAD = Nicotinamide-Adenine-Dinucleotide): yếu tố này thường chỉ có trong hồng cầu (cũng có thể có trong huyết tương một số động vật nhưng không tồn tại lâu do bị các enzyme ly giải) Muốn có V phải ly giải hồng cầu bằng tăng nhiệt độ (800C) Ngoài ra một số vi sinh vật như tụ cầu vàng cũng có khả năng sản sinh yếu tố V và giải phóng ra môi trường trong quá trình phát triển

Nhiệt độ phát triển thích hợp: 35 -370C

Khí trường thích hợp: 5-10% CO2 Nếu không có tủ ấm CO2 cần phải sử dụng bình kín đốt nến (sau khi nến tắt, khí trường trong bình có thể có 3% CO2)

H influenzae có tính đề kháng với Bacitracin, do vậy với mục đích chỉ phân

lập H influenzae, trong môi trường nuôi cấy có thể bổ xung Bacitracin 300μg/ml để

loại bỏ vi khuẩn khác

Sau 16 -18 giờ nuôi cấy, H influenzae phát triển thành các khuẩn lạc bóng

mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1-2mm và không gây tan huyết Các chủng có vỏ có thể tạo các khuẩn lạc sáng bóng, nhày ướt và có đường kính lớn hơn Vi khuẩn thuần nhất có mùi tanh đặc biệt (mùi chuột chù) [2], [6], [71]

2.3.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH

Nhuộm Gram Thử nghiệm nhu cầu X/V

2.3.4.1 Khảo sát kính hiển vi: Nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi

khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của

thành tế bào Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938)

Nhuộm Gram được thực hiện trên dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn Nó cho kết quả nhanh hơn cấy, và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp phân biệt bệnh do nhiễm khuẩn với các trường hợp không do nhiễm khuẩn vì điều trị và tiên lượng sẽ khác nhau

Vi khuẩn vách tế bào Gram âm: có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp Trong cùng

là một lớp peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide

Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là lipopolysaccharide dày khoảng 8-10nm gồm

3 thành phần: Lipid A; Polysaccharide lõi; Kháng nguyên O

Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định vì khả năng bắt màu Gram dương không phải là

"tất cả hoặc không."

Theo kinh nghiệm (và có ngoại lệ), bệnh do vi khuẩn Gram âm thường nguy hiểm hơn vì màng ngoài của chúng được bọc bởi một nang, và nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện tác nhân xâm lấn khó khăn hơn Ngoài ra, màng ngoài vi khuẩn Gram âm có chứa lipopolysaccharide, đóng vai trò là nội độc tố và làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây sốc nhiễm khuẩn Nhiễm vi khuẩn Gram dương thường ít nguy hiểm hơn vì cơ thể người không có peptidoglycan, và

có khả năng sản xuất lysozyme tấn công lớp peptidoglycan nằm ở bên ngoài của vi khuẩn [5], [77]

Hình 2.3: Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm [77]

2.3.4.2 Thử nghiệm nhu cầu X/V

™ Nhu cầu X/V bằng que giấy X/V/XV:

Nguyên tắc:

Yếu tố X và V được tẩm trên các que giấy X (chỉ có yếu tố X), V (chỉ có yếu

tố V) và XV (đồng thời yếu tố X và V) Đặt các que giấy X, V, XV trên môi trường (Columbia Agar, Mueller Hinton Agar…) đã được trãi vi khuẩn Yếu tố X và V từ que cấy khuếch tán ra môi trường và vi khuẩn mọc thành vệ tinh xung quanh các que giấy X, V và XV

quanh que XV: H influenzae

− X(-)/V(+) : vi khuẩn vệ tinh quanh

™ Nhu cầu X/V bằng vệ tinh quanh vạch Staphylococcus aureus:

Nguyên tắc:

H influenzae chỉ mọc trên môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung X và V;

vì vậy ta sẽ tạo một môi trường có X từ hồng cầu và V được tiết ra từ

Staphylococcus aureus

Yếu tố X (Hemin) và V (NAD: Nicotin Adenine Dinucleotide ) có trong hồng cầu cừu, người, ngựa, thỏ Tuy nhiên, trong hồng cầu cừu và người lưu hành yếu tố kháng V (NADase) có tác dụng phân hủy yếu tố kháng V khi lấy máu ra khỏi

cơ thể Hồng cầu ngựa và thỏ không có yếu tố kháng V Do đó thạch máu chỉ có

yếu tố X Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S aureus) khi phát triển trên môi

trường nuôi cấy có khả năng tiết ra yếu tố V

Phương pháp thực hiện:

− Dùng vòng cấy vô trùng cấy zic zac vi khuẩn thử nghiệm trên đồng thời môi trường thạch máu (BA) và môi trường Colombia Agar (CA)

− Dùng vòng cấy vô trùng cấy một vạch S aureus thẳng góc với đường cấy zic

zac vi khuẩn thử nghiệm

− Ủ 370C/5% CO2/12-24giờ

Biện luận kết quả:

− X(+)/V(+) : vi khuẩn mọc vệ tinh quanh

vạch S aureus trên BA, không

mọc trên CA

− X(-)/V(+) : vi khuẩn mọc vệ tinh quanh vạch S aureus trên đồng thời BA và

CA

− X(+)/V(-) : vi khuẩn mọc theo đường cấy trên BA mà không mọc trên CA

− X(-)/V(-) : vi khuẩn mọc theo đường cấy zic zac trên BA và CA [2], [6], [54], [58]

2.3.5 TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH

− Là cầu trực khuẩn nhỏ mảnh đa dạng, bắt màu Gram âm, khuẩn lạc trong xám nhẹ, óng ánh khi chiếu sáng, không gây tan huyết

− Phát triển thuần nhất trên môi trường chọn lọc (thạch sôcôla có Bacitracin)

− Phát triển được cần có đủ yếu tố X và V [2], [6], [54], [71]

2.3.6 TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH

Trước đây Ampicillin vẫn được coi là kháng sinh đặc trị hữu hiệu cho các

nhiễm khuẩn H influenzae Tuy nhiên chỉ một thời gian ngắn sau đó, vào năm 1974

đã có các báo cáo về các trường hợp vi khuẩn H influenzae kháng Ampicillin [33],

[55], [66], [67] Cho đến nay tình hình đề kháng này ngày càng trầm trọng hơn, điển

hình như ở Mỹ chỉ trong một thời gian ngắn từ 1984 đến 1997, tỷ lệ vi khuẩn H

influenzae kháng Ampicillin bằng cơ chế tiết men β-lactamase gia tăng hơn gấp đôi:

từ 15% lên đến 42% và thậm chí ở vài bang lên đến trên 50% [46], [47]

Các nghiên cứu khác trên thế giới cho đến hiện nay cho thấy tỷ lệ vi khuẩn

H influenzae tiết men β-lactamase tại các nước tiên tiến dao động từ 15% đến trên 50% và có khác nhau tuỳ quốc gia, trong đó có lẽ đáng chú ý là Tây Ban Nha 26-32%, Pháp 28-32%, Hoa Kỳ 34-50%, Singapore 25-27%, Hồng Kông 29-39% và Đài Loan 56-60% [23], [30], [47], [48], [51], [60], [64], [68]

Tại Việt Nam, vi khuẩn H influenzae là một trong các vi khuẩn đang có

vấn đề về tình hình đề kháng kháng sinh, đặc biệt với Ampicillin và Sulfamethoxazol-trimethoprim; trước đây là các kháng sinh hàng đầu trong điều trị

nhiễm trùng do H influenzae gây ra Trong một chương trình nghiên cứu đa trung

tâm tại TP Hồ Chí Minh vào năm 1998, đã thực hiện được kháng sinh đồ 314

chủng H influenzae phân lập được từ các bệnh phẩm hô hấp lấy từ các bệnh nhân

người lớn và trẻ em bị nhiễm khuẩn hô hấp Kết quả cho thấy có đến 78% đề kháng Sulfamethoxazol-trimethoprim, và 52% kháng Ampicillin (tất cả bằng cơ chế tiết men β-lactamase phá huỷ kháng sinh) Tuy nhiên kết quả cũng cho thấy một điều đáng mừng là 100% các chủng hãy còn nhạy cảm với kháng sinh Cephalosporin thế

hệ 2 là Cefaclor [10]

Nghiên cứu gần đây thực hiện trên 30 chủng H influenzae phân lập được từ

đàm của bệnh nhân nhiễm trùng hô hấp dưới cấp và mủ khe giữa của bệnh nhân viêm xoang cấpcho thấy 53% kháng Ampicillin (tất cả bằng cơ chế tiết men β -lactamase phá huỷ kháng sinh), 90% kháng Sulfamethoxazol-trimethoprim Nghiên cứu cũng cho biết hãy còn 97% vi khuẩn nhạy cảm được với Cefaclor, và đây cũng

là một tín hiệu tốt trong điều trị nhiễm khuẩn hô hấp cấp gây ra do H influenzae

[9]

− Phân tử β-lactamin có cấu trúc vòng β-lactam

− Nhóm beta-lactamase bao gồm phân nhóm Penicillin và Cephalosporin

Hình 2.4: Vòng β-lactam

Cơ chế tác động

Ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn do β-lactamin gắn vào PBP (Penicillin biding protein) có hoạt tính enzyme hiện diện trên màng vi khuẩn và ức chế chức năng của enzyme này trong sự tổng hợp peptidoglycan

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn

− Tổng hợp men β-lactamin: phá vỡ vòng β-lactamin làm enzyme mất tác dụng

− Giảm tính thấm của thành vi khuẩn

− Thay đổi cấu trúc hóa học của PBP (Penicillin biding protein) Æ làm giảm ái lực của điểm đích đối với kháng sinh

2.4.1.1 Nhóm β–lacmin phân nhóm Penicillin