Phát hiện đột biến gen gây bệnh α Thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex-PCR

Nếu ch dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả huyết học, điện di huyết sắc tố ta cũng có thể chẩn đoán được bệnh a Thalassemia tuy nhiên, nếu như vậy sẽ không thể sàng ỉọc được những người[r]

TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1 Chadha, R., Gupta, s., and Pathak, N Artesunate­loaded chitosan/lecithin nanoparticles: Preparation, characterization, and in vivo studies Drug Development and Industrial Pharmacy, 38,1538­1546 (2012)

2 Efferth, T Willmar Schwabe Award 2006: antiplasmodial and antitumor activity of artemisinin­from bench to bedside Planta medica, 73,299­309 (2007)

3 Gabriels, M., and Plaizier­Vercammen, J Physical and chemical evaluation of liposomes, containing artesunate Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 31, 655­667 (2003)

4 Kumari, A., Yadav, s K., and Yadav, s c Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75,1­18 (2010)

5 Pradhan, R­, Poudel, B K., Ramasamy, T., Choi, H.­G., Yong, c s., and Kim, J o Docetaxel­Loaded Poiylactic Acid­Co­Glycolic Acid Nanoparticles: Formulation, Physicochemical Characterization and Cytotoxicity Studies Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 13, 5948­5956 (2013)

6 Woerdenbag, H J­, Moskal, T A., Pras, N., Malingré, T M­, Ei­Feraiy? F s., Kampinga, H H., and Konings, A

w Cytotoxicity of artemisinin­related endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells Journal of natural products, 56, 849­856 (1993)

7 Xiao, X.­C­, and Hong, Z.­G Firstborn microcrystallization method to prepare nanocapsules containing artesunate Internationa journal of nanomedicine, 5,483 (2010)

8 Xu, Q., Li, Z.­X., Peng, H.­Q., Sun, Z.­W­, Cheng, R.­L., Ye, Z.­M., and Li, W.“X Artesunate inhibits growth and induces apoptosis in human osteosarcoma HOS cell line in vitro and in vivo Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 12,247­255 (2011)

PHÁT HIỆN ĐỘT BIỂN GEN GÂY BỆNH

a THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR

ThS B ài Thị M inh Phượng*

Hướng dẫn: GS.TS Tạ Thành Vãn**

TÓM T T

a Thalassmia là bệnh di truyền gen lặn nằm trên NST 16, bệnh nhân mắc bệnh nạy là một gánh nặng cho bản thân, gia đinh, và xã hội Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh tương đối cao và chi phí cho điều trị bệnh này khá ỉớn Xuất phái từ vấn đề

đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm phát hiện các gen gây đột biến bệnh để có biện pháp tư vấn di truyền trước hôn nhân nhằm giảm tỷ lệ mắc bệnh

Đối tu­ợng và phương pháp nghiên cửu: Nghiên cứu 33 bệnh nhân đã chẩn 'đoán bị a Thalassmia

Mục tiêu: Phát hiện được các gen đột biến gây bệnh a Thalassmia

Kết quả: Đột biến SEA chiếm tỷ lệ cao nhất 54,7% Điều này cho thấy ở Việt Nam đột biến SEA chiếm chu yếu Đột biến a 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2 Đột biến a 3.7 chiếm tỷ ỉệ 16,7% Không t m thấy đột biến THAI, đột biến FIL Kết luận: Đây là kỹ thuật hữu ích cho việc phát hiện sớm các gen gây đột biến có hướng tư vấn di truyền trước hôn nhân

* Từ khóa: Đột biến gen; a Thalassmia

D t ction o f dis as -causing g n m utatons in a thalass m ia b y m ultipl x p r t chniqu Summary

a Thalassmia recessive genetic disease is located on chromosome 16, patients suffering from such a disease are a burden to themselves, their families, and society The morbidity is now relatively high and the expense for this tteatment is quite much Originating from that problem, we conducted this study aimed to detect disease­causing gene mutations to propose genetic counseling measures before marriage, therefore, the incidence of disease can be reduced

* Đại học Y Được Thai Bình

* * Đại học Y Hà Nội

Subjects and methods: 33 patients diagnosed with a Thalassmia.

Objective: To detect the disease­causing gene mutation a Thalassmia

Results: Mutation SEA accounts for highest percentage (54.7%) This shows that in Vietnam mutations SEA dominated Mutations a 4.2 2 comes the second, a 3.7 occupies 16.7% No mutation THAI and FEL was found

Conclusion: This is a useful technique in early detection ofgene mutations towards genetic counseling before marriage

* Key words: Gene mutation; a thalassmia

▼ 7nnIT f It n>ir*

í IIA T VANtJO j

a Thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường đo đột biến gen a­globin nằm trên cánh ngắn NST số 16 (16pl3.3) quy định, gây giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi a­globin Đây ỉà một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất trên toàn thế giới và là một trong những nguyên nhân hàng đầu (chiếm tới 60­90% các nguyên nhân) gây phù thai ở các nước Đông Nam Á Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố trong cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc Trong đó, tỷ lệ người mang gen đột biến mất đoạn lớn dạng SEA (Đông Nam Á) là cao nhất (tỷ lệ 90 ­ 95%), Bắc Thái Lan

là 14%, Nam Trung Quốc là 5,0 ­ 8.8%, Hồng Kông Ịà 4,5%, Trung tâm Thái Lah ỉà 3,7% và dạng Bắc Đài Loan là 3,5%

Hầu hết trẻ bị bệnh đều có biểu hiện: thiếu máu nhược sắc, đa xanh, lách to, mệt mỏi chậm chạp, xương

ph đại dễ gãy, hay mắc các bệnh nhiễm trùng, suy tim khó thở, bất thường ở gan, mật Trẻ mắc bệnh thường chết sớm v suy tim và nhiễm trùng nặng

Sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát hiện các đột biến và hiểu biết rõ sinh lý bệnh a Thalassemia phục vụ tư vấn di truyền trước sinh

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm:

­ Xác định đột biển g n a ­ globin ở bệnh nhân a Thalass mia

­ Nhận xét đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân a Thalass mia

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N c ứ u

2.1 Đối tượng nghiền cứu

Chọn 33 bệnh nhân đã được chẩn đoán a Thalassemia

2.2 Thòi gian và địa điểm nghiên cứu

" Thòi gian nghiên cứu: Từ tháng 12 ­ 2012 đến 8 ­ 2013

­ Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein ­ Trường Đại học Y Hà Nội

2.3 Phutmg pháp nghiên cứu

­ Sử dụng kỹ thuật m ultiplex PCR vào quá tr nh phát hiện 5 đột biến gen phổ biến gây bệnh a Thalassem ia tại Việt Nam (SEA, THAI, FIL, 0,3.7, a4.2)

- Phương pháp phân tích bệnh chứng

2.4 Kỹ thuật nghiên cứu

2.4.1 Tách chietADN

ADN được tách chiết từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp phenol/chlorofor

2.4.2 Thiết kể mồl cho multiplex PCR

Mồi được thiết kế nhằm phát hiện một số đột biển thường gặp tại Việt Nam với các mồi đặc hiệu bổ sung với đột biến Các đột biến là: a3.7, <x4.2 , SEA, THAI & FIL mồi gen nội chuẩn LIS và mồi a2 xác định thê bệnh của bệnh nhân

THAI­F FIL­F SEA­F 4.2­F a2/3,7­Fa2­R 4.2­R 3.7­R FÍL­R THAi­R SEA­R

j Ì gE»­

L ­ a 4­2 frj

.SEA

—FIL

THAI

3*J*VR

H nh 1 Sơ đồ tổ hợp gen a globin và vị trí các mồi xác định đột biến [70]

Cặp mồi để xác định đột biến phải dài hơn đoạn gen bị đột biến và nằm ngoài vị trí đoạn gen đột bién: Đột biến a3.7 mất cả 2 gen<Xjvà a2th cặp mồi Ct3.7 phải nằm ngoài vị trí gen cti vàct2.

2.4.3 C huẩn hóa quy tr n h m ultiplex PC R

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR

Ỉ8 Phản ứng multiplex PCR chạy với chu tr nh nhiệt như sau:

95°C: 15 phút

95°C: 40 giây

65°C: 90 giây

72°C: 2 phút 30 giấy

72°C: 5 phút

15°C: 00

X35 chu kỳ

na KẾT QƯẢ

3.1 Kễt quả bệnh nhân

H nh 1 H nh ảnh điện di của bệnh nhân

M lkb, (­) chứng âm là người b nh thường, sản phẩm của bệnh nhân từ aOl đến aio

■a i đ ồ n sh ợ p tử 0.1 dị hợp tử :H bH

iC hua phát hiện

Biểu đồ 1 Tỷ lệ các thể bệnh a Thalassemia

■SEA

oe4.2

II 3.7

l i i W

Biểu đồ 2: Tỷ lệ các đột biến bệnh nhân a Thalassemia

rv BÀNLUẶN

Các kết quả của multiplex PCR

Mau nghiên cứu của chúng tôi đều là thể HbH và thể ai Thalassemia v tất cả bệnh nhân đều trong t nh trạng thiếu máu nặng, thiếu màu vừa các chỉ số xét nghiệm đều giảm, kết quả điện di huyết sắc tố HbAị < 97%, HbA2< 3.%, có HbH ở các thể HbH đã được phát hiện gen đột biến tương ứng với đặc điểm cùa bệnh

Đột biến SEA chiếm tỷ lệ cao nhất (54,7%) tương ứng như nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà vàcs là 58,8% Tuy nhiên, két quả này khác biệt với nghiên cứu ở Malaysia (0,5%) và ở Trung Quốc (1,36%) Điều này cho thấy ở Việt Nam đột biến SEA chiếm chủ yếu

Đột biến a 4.2 chiếm tỷ lệ cao thứ 2: 28,6%, có sự khác biệt so với nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà (5,9%), ở Malaysia (0,25%), ở Trung Quốc (1,36%)

Đột biến a 3.7 chiếm tỳ lệ Ỉ6,7% cũng tương đối cao hon so với nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà 0%, Malaysia (8%), Trang Quốc (2,7%)

Chưa t m thấy đột bién THAI, FIL nào trong các bệnh nhân nghiên cứu Kết quả này cũng tương đương với kết quả của Lý Thị Thanh Hà Điều này chứng tỏ đột biến Thai và đột biến FĨL chưa phát hiện thấy ở Việt Nam Hai loại đột biến này thường có ở tộc người Thái Lan và Philipphin

Ngoài các loại đột biến trên nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà còn phát hiện được thêm 2 loại đột biến điểm là HbQs và HbCs Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi chưa t m được 2 loại đột biến này V thời gian nghiên cứu có hạn nên chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu để t m thêm các loại đột biến khác

Từ những kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau

­ ứ ng dụng ỉhành công quy tr nh phát hiện gen đột biến gây bệnh a Thalassemia ở một số bệnh nhân mắc bệnh a Thalassemia: SEA (54,7%), a4.2 (28,6%), a3.7 (16,7%)

­ Tim ra được một số yếu tố liên quan với bệnh a Thalassemia

Ở bệnh nhân a Thalassemia có những biến đổi ở máu và tủy xương như một bệnh Thalassemia nói chung: thiếu máu nhược sắc, hồng cầu nhỏ, kích thước không đều, thay đổi về h nh dáng hồng cầu

­về những biến đổi thành phần Hb ở bệnh nhân a Thalassemia nói chung và ở những bệnh nhân thể HbH nói riêng mang tính chất đặc hiệu Tất cả những bệnh nhân có điện di huyết sắc tố có tỷ lệ HbH khi ỉàm PCR cho kết quả chính xác là các bệnh nhân HbH

Nếu ch dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả huyết học, điện di huyết sắc tố ta cũng có thể chẩn đoán được bệnh a Thalassemia tuy nhiên, nếu như vậy sẽ không thể sàng ỉọc được những người lành mang gen bệnh để có tư vấn di truyền giúp cho thế hệ sau không sinh ra những đứa con bị bệnh, c ần có nghiên cửu sâu

để phát hiện thêm các đột biến khác và pháthiệnnhững người lành mang gen bệnh trong cộng đồng

VI KIẾN NGHỊ

Do giới hạn về khuôn khổ của luận văn, thời gian và kinh phí còn hạn chế, chúng tôi thấy cần phải nghiên cứu sâu thêm một số khía cạnh như:

­ Tiếp tục đánh giá khả năng phát hiện gen đột bién gầy bệnh a Thalassemia ở những người lành mang gen bệnh trong cộng đồng để tư vấn di truyền trước hôn nhân là giải pháp quan trọng nhấ£ trong việc phòng bệnh từ đó, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh a Thalassemia

­ Ở nghiên cứu này, chúng tôi mới phát hiện được các đột biến mất đoạn lớn chưa phát hiện được các đột biến điểm, cần tiếp tục nghiên cứu để phát hiện các đột biến điểm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ỉ Hoàng văn Ngọc Nghiên cứa thực trạng bệnh thalassemia và một số yếu tố liên quan ở trẻ em dân tộc Tày và Dao tại huyện Định Hóa tỉnh Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Y học 2007

2 Nguyễn Công Khanh Một số đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh p Thalassemia ở người Việt Nam Luận án Phó Tiến sỹ khoa học Y dược, Đại học Y Hà Nội 1985

3 Lý Thị Thanh Hà, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phư ng Mai, Nguyễn Tân Sinh, Dư ng Bá Trực, Bùi Văn Viện, Nguyễn Thanh Liêm, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh alpha Thalassemia tại Bệnh viên Nhi TW.Tạp chí Nhi khoa, tập 3, số 3,4 tháng 10/2010, tr.337­342

4 Chui DH, Way JS Hydrops fetal is caused by aỉpha­thalassemia: an emerging health care problem Blood.1998, 91, pp.2213­2222

5 Di ss roth A t al Hemoglobin synthesis in somatic cell hybrid: independent segregation of the human alpha and beta globin gene Science 191,1976, p.1262

6 Potrakul s t al Incidence of a Thalassemia in Bangkok J.Med Assoc, Thailan 1970,53, pp.250

8 Told D.Lai MCS, Braga C.A, ISoo N.H Alpha thalassemia in Chinese cord blood studies Br J.Haematoi 1969, 16, pp.551­556

9 Embury S.H t a t Organization of the a globin gen in the chines a thalassemia syndromes J.Clin.Inv sX 1979,63.

NGHIÊN c ứ u ỨNG D NG KỸ THUẬT NESTED RT-PCR TRONG CHÂN ĐOÁN NHIỄM RUBELLA TRƯỚC SINH

BS Đặng Tiến Trường*; s v Lê Hòa Yên*

s v Nguyễn V ìấ Hiếu* BS Nguyễn Thị Hà*

Ht âng dẫn; PGS TS Nguyễn Duy Bắc*

T Ó M T Ẳ T

Sốtphátban RubellađovirutRubellagâynên, bệnh thường nhẹ, ít biến chứng

Tại Việt Nam, chưa có chương tr nh tiêm chủng quốc gia phòng nhiễm Rubella; nhiều thai phụ nhiễm Rubella phài đ nh chỉ thai nghén mà không rõ thai nhi có nhiễm Rubella không? Việt Nam chưa có phương pháp chẩn đoán trước sinh CRĨ đạt được các tiêu chí chính xác, sớm, rè, đòi hỏi phương tiện đơn giản V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu:

­ Hoàn thiện quy trìnhphát hiện nhiễm virutRub llabằng kỹ thuậtnestedRT-PCR

- Áp dạng kỹ thuật n st d RT-PCR trong chẩn đoán nhiễm virut Rub lla trước sình ở nh m đối tượng cổ nguy

c cao

Đổi tượng và phương pháp nghiên cún:

60 mẫu bệnh phẩm nhiễm virut Rubella 60 mẫu tác nhân khác gây các triệu chứng phát ban 41 thai phụ được chẩn đoán nhiễm virut Rubella bằng kỹ thuật huyết thanh học

Phương pháp nghiên cứu:

­ Tách chiết ARN và ADN

­ Tối ưu hóa phản ứng Nested RT­PCR: tối ưu hóa thành phần và chu tr nh nhiệt của phản ứng Sau khi nhân ADN đích, điện đi sản phầm ADN trên agarose gel 2% và phân tích kểt quả

­ Đánh giá độ chính xác của kỹ thuật: xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật, chẩn đoán trên 60 mẫu ARN của virutRubella và 60 mẫu không nhiễm phải virut Rubella, tính độ nhạyvà độ đặc hiệu

+ Xác định ngưỡng phát hiện của kỹ thuật: tiến hành chẩn đoán ưên các mẫu ARN pha loăng

+ Giải tr nh tự sản phẩn phản ứng nested RT­PCR để xác định sản phẩm gen virutRubella

­ Áp dụng kỹ thuật nested RT­PCR trong chẩn đoán trước sinh

*Học viện Quân y