Nghiên cứu trích ly polyphenol từ lá dâu tằm (morus alba l ) và ứng dụng trong thực phẩm chức năng

Ngày nay, các hoạt chất tự nhiên của thực vật luôn là đối tượng nghiên cứu, khai thác và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm do hoạt tính kháng oxy hóa của chúng có tác dụng

-

NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ LÁ DÂU TẰM

(Morus alba L.) & ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2009

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Hoàng Kim Anh

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Ngô Kế Sương

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Nguyễn Ngọc Vinh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN

THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 16 tháng 08 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 14-11-1972 Nơi sinh : Hải Phòng

Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2007

I- TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ LÁ DÂU TẰM (Morus alba L.) &

ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nghiên cứu trích ly hợp chất polyphenol từ lá dâu tằm với mục đích ứng dụng trong thực phẩm chức năng và dược phẩm Các nội dung chính như sau:

- Khảo sát nguyên liệu lá dâu tằm

- Khảo sát các điều kiện trích ly thích hợp để thu nhận polyphenol từ nguyên liệu lá dâu tằm

- Xây dựng phương pháp phân tích dược liệu từ lá dâu; nhận diện và định lượng một số thành phần hóa học trong dịch chiết

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao khô và viên nang dầu giàu polyphenol từ lá

dâu tằm; Xây dựng “ Tiêu chuẩn cơ sở” và kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 20-01-2009

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 20-12-2009

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG KIM ANH

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TS Hoàng Kim Anh PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Qua quá trình thực hiện luận văn này, em xin chân thành gửi lời cám ơn đến:

¾ TS Hoàng Kim Anh, Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tận tình hướng dẫn cho em thực hiện tốt luận văn

¾ GS TSKH Lưu Duẩn, Trường Đại học Công nghệ Sài Gòn và PGS.TS.Đống Thị Anh Đào - Trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận văn

¾ TS Nguyễn Ngọc Vinh và TS Hà Diệu Ly, Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành Phố

Hồ Chí Minh, đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt luận văn này

¾ Các thầy cô Khoa Hóa và Bộ môn Hóa thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em nhiều kiến thức khoa học

¾ Các anh chị em Khoa Thiết lập Chất chuẩn và Chất đối chiếu, các anh chị ở Công

ty Cổ phần Dược phẩm BV, Công ty Cổ phần SPM đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Nguyễn Thị Kim Phương

Leaves of mulberry (Morus alba L.) are very well known in folklore medicine

Polyphenols are major active constituents in mulberry leaves and possess various pharmacological activities

In this study, the method of designing solvents for the optimal extraction of bio-active ingredients from natural resoures in Bao Loc – Lam Dong was studied systematically using an alcohol-water binary solvent The results indicated that the maximal yield of polyphenols was achieved when mulberry leaves were ectracted under the optimized conditions of a solid-liquid ratio 1:10, a temperature of 49oC, an ethanol composition of 71% and a time about 250 min

The extracts were screened for total polyphenol contents, antioxidant and antibacterial activities The polyphenol content of the extracts was found to be in the range of 2254 -

2596 mg gallic acid equivalents (GAE)/100 g dry weight leaf Antioxidant activities of extracts tested using the reducing power and 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) radical methods - EC50= 0.0769 mg/ml or 85.5 mg/1g DPPH and the antioxidant activities correlated well with the total polyphenol contents Extracts also possessed

antibacterial activity, Staphylococcus aureus was found to be the most sensitive

By means of HPLC, the active compounds were identified as rutin and chlorogenic acid

Chromatographic fingerprint of Morus alba L was performed by HPLC-DAD method

using Gemini - NX C18 110A column (250 x 4.6 mm) The mobile phase was 0.1% formic acid (20:80) with the velocity of a fluid 0.7 mL/min; UV wavelength at 280

acetonitril-nm (0-7 min) for detection of chlorogenic acid and 370 acetonitril-nm (7-20 min) for detection of rutin Five characteristic peaks were showed in the HPLC chromatographic fingerprint The results can be used as quality control parameters for standardization of herbal

medicine as well as the functional food made from Morus alba L

1.2.3 Giới thiệu khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol

và các phương pháp khảo sát tính oxy hóa

1.5 Kỹ thuật chiết xuất polyphenol 27

1.5.1 Sử dụng dung môi để chiết xuất 28

1.5.2 Trích ly bằng phương pháp vi sóng 33

1.5.3 Chiết tách bằng pha rắn (cột sắc ký) 34

1.5.4 Trích ly bằng dung môi siêu tới hạn 35

1.5.5 Trích ly do chênh lệch áp suất 36

1.6 Các phương pháp phân tích 371.6.1 Phương pháp quang phổ hấp thu UV-Vis 371.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 381.6.3 Đầu dò dãy diod quang (đầu dò PDA) 40

CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.2.1 Quy trình trích ly polyphenol 452.2.2 Phương pháp thí nghiệm 46

2.2.4 Một số phương pháp phân tích khác 54

3.1 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu 56

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

polyphenol

60

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết 633.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 68

3.3 Tối ưu hóa quá trình trích ly 70

3.4 Định tính dịch trích và cao khô 74

3.5 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của dịch chiết 81

3.6 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 84

3.7.2 Viên nang dầu chứa cao lá dâu 91

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 98

PHỤ LỤC

CHỮ VIẾT TẮT

AAS (Atomic absorption spectrometry) : Quang phổ hấp thu nguyên tử Công ty BV pharm : Công ty cổ phần dược phẩm BV Công ty SPM : Công ty cổ phần SPM

3 D three direction : 3 chiều

FPT (Fingerprint technique) : Kỹ thuật dấu vân tay

HPLC ( High performance liquid : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography)

LC (Liquid chromatography) : Sắc ký lỏng

PDA ( Photodiode array) : Dãy diod quang

UV-Vis ( Ultraviolet and Visible) : Tử ngoại và khả kiến

3.1 Một số chỉ tiêu hóa lý của bột lá dâu nguyên liệu 513.2 Kết quả khảo sát thành phần hóa thực vật của bột lá dâu và cao

khô

54

3.3 Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học 553.4 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng polyphenol tổng 563.5 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng rutin 563.6 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng acid clorogenic 573.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng (thời

3.15 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng acid

clorogenic

64

3.20 Số liệu thực nghiệm với các thông số tối ưu hóa 693.21 Thời gian lưu của các đỉnh trong dược liệu lá dâu 733.22 Hệ số bất đối xứng (As) của các đỉnh trong dược liệu 733.23 Độ phân giải (R) của các đỉnh trong dược liệu 743.24 Số đĩa lý thuyết (N) của các đỉnh trong dược liệu 743.25 Độ chính xác về thời gian lưu của các đỉnh trong dược liệu

3.29 Thời gian lưu tương đối của 5 pic đặc trưng trong dược liệu lá

dâu (chọn pic đánh dấu là rutin)

76

3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng quét gốc tự do 773.31 Số liệu xác định EC50 của vitamin C 783.32 Số liệu xác định EC50 của polyphenol trong cao chiết 793.33 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự do 793.34 Tiêu chuẩn cơ sở cho cao khô từ lá dâu 83

3.36 Tiêu chuẩn cơ sở cho viên nang dầu chứa cao lá dâu 87

Phản ứng phân hủy chrysin

Phản ứng của quercetin với gốc tự do

Phản ứng của thuốc thử DPPH

1217181.5 Mô hình chiết xuất lỏng –lỏng trong phòng thí nghiệm 241.6 Hệ thống chiết xuất lỏng – lỏng trong công nghiệp 24

1.8 Mô hình chiết xuất có hỗ trợ vi sóng 291.9 Mô hình chiết tách bằng cột pha rắn 301.10 Mô hình sơ đồ trích ly bằng dung môi siêu tới hạn 311.11 Mô hình trích ly do chênh lệch áp suất 32

3.7 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng polyphenol tổng 563.8 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng rutin 573.9 Ảnh hưởng của nồng độ cồn tới hàm lượng acid clorogenic 573.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng 583.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng rutin 593.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid clorogenic 59

3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến hàm lượng

3.18 Sắc ký đồ dấu vân tay của cao khô lá dâu tại bước sóng 370 nm 70

3 19 Sắc ký đồ dấu vân tay của cao khô lá dâu tại bước sóng 280 nm 703.20 Phổ UV các pic trong sắc ký đồ chuẩn và dược liệu 713.21 Độ tinh khiết các pic trong sắc ký đồ chuẩn và dược liệu 723.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng quét gốc tự do 773.23 Đồ thị xác định EC50 của vitamin C 783.24 Đồ thị xác định EC50 của polyphenol trong cao chiết 793.25 Thử nghiệm kháng khuẩn trên chủng Staphylococcus aureus 803.26 Hệ thống chiết xuất và cô chân không 82

3.29 Hệ thống đóng gói viên nang dầu 863.30 Sản phẩm viên nang dầu chứa cao lá dâu 86

DANH MỤC SƠ ĐỒ

2.1 Sơ đồ nghiên cứu 392.2 Quy trình nghiên cứu trích ly polyphenol 413.1 Sơ đồ quy trình sản xuất cao khô từ lá dâu 813.2 Sơ đồ quy trình sản xuất viên nang dầu chứa cao lá dâu 85

LỜI MỞ ĐẦU

Sử dụng thực phẩm để bảo vệ sức khỏe, phòng bệnh và trị bệnh đã được khám phá

từ hàng ngàn năm trước công nguyên ở Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam Ở Phương Tây, Hippocrates đã tuyên bố từ 2500 năm trước đây: “Hãy để thực phẩm

là thuốc và thuốc là thực phẩm của bạn”

Nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ, người ta ngày càng có khả năng nghiên cứu và sản xuất nhiều loại thực phẩm chức năng phục vụ cho công việc cải thiện sức khỏe, nâng cao tuổi thọ, phòng ngừa các bệnh mãn tính, tăng cường chức năng sinh lý của các cơ quan cơ thể khi đã suy yếu… Bằng cách bổ sung thêm “các thành phần có lợi” hoặc lấy ra bớt “các thành phần bất lợi”, nhiều loại thực phẩm chức năng đã được tạo ra theo những công thức nhất định phục vụ cho mục đích của con người

Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới nên có hệ động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Từ thời xa xưa, tổ tiên chúng ta đã biết sử dụng nhiều loại thực phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ các loài động thực vật sẵn có Ngày nay, các hoạt chất tự nhiên của thực vật luôn là đối tượng nghiên cứu, khai thác và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm do hoạt tính kháng oxy hóa của chúng có tác dụng phòng chữa những thương tổn trong cấu trúc ADN với những trường hợp bị nhiễm tia xạ, nhiễm chất độc từ môi trường hoặc trong thức ăn có thuốc tăng trọng, thuốc trừ sâu, chất bảo quản chưa phân hủy hết…; đối với bệnh nhân sau điều trị bằng phẫu thuật, chạy tia xạ, truyền hóa chất… chúng giúp phục hồi sức khỏe và ngăn chặn các nguy cơ gây ung thư, nhất là ung thư gan, ung thư vú ở phụ nữ, tăng sức

đề kháng… Theo một số nghiên cứu, polyphenol từ lá dâu tằm là hợp chất thiên nhiên có giá trị sinh học cao, có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm như

là chất chống oxy hóa, phụ gia trong mỹ phẩm, có thể sử dụng để phòng và điều trị một số bệnh như ung thư, huyết áp cao, hạ đường huyết…

Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu trích ly hợp chất polyphenol từ lá dâu tằm với mục đích ứng dụng trong thực phẩm chức năng và dược phẩm Các nội dung chính cụ thể như sau:

- Khảo sát nguyên liệu lá dâu tằm

- Khảo sát các điều kiện trích ly thích hợp để thu nhận polyphenol từ nguyên liệu lá dâu tằm

- Xây dựng phương pháp phân tích dược liệu từ lá dâu; nhận diện và định lượng một số thành phần hóa học trong dịch chiết

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cao khô và viên nang dầu giàu polyphenol

từ lá dâu tằm; Xây dựng “Tiêu chuẩn cơ sở” và kiểm tra đánh giá chất lượng sản phẩm

Tên hai thành phần: Morus alba L

Phân loại khoa học:

Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Rosales Họ: Moraceae Chi: Morus

Loài: M alba

™ Mô tả thực vật

Cây dâu là một loài cây gỗ từ nhỏ đến nhỡ, lớn nhanh, có thể cao tới 15-20 m nhưng

do hái lá luôn nên chỉ cao khoảng 2 – 3 m Thông thường nó sống từ 8-12 năm, nhưng nếu đất tốt và chăm sóc tốt thì tuổi thọ có thể tới 50 năm Lá mọc so le hình bầu dục, nguyên hoặc chia làm 3 thùy, có lá kèm, đầu lá nhọn hay hơi tù, phía cuống hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt Hoa đơn tính, khác gốc, hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, 4 nhị (có khi 3), hoa cái cũng mọc thành bông hay thành khối hình cầu, có 4 lá đài Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nước thành một quả phức (quả kép) màu trắng đến đỏ, sau đen thẫm Quả có thể ăn được và làm thuốc (tang thầm)

1.1.2 Phân bổ, thu hái và chế biến

Cây Dâu được trồng phổ biến tại các khu vực có nhiệt độ thích hợp là 25-32°C, như các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Tại Việt nam, cây dâu tằm có nguồn gốc từ Trung Quốc, được di thực vào Việt Nam từ lâu, hiện nay được trồng ở khắp nơi để lấy lá nuôi tằm, một số bộ phận được khai thác dùng làm thuốc như lá dâu (tang diệp), vỏ rễ cây dâu (tang bạch bì), quả dâu (tang thầm), cây mọc ký sinh trên cây dâu (tang ký sinh), tổ bọ ngựa trên cây dâu (tang phiêu tiêu), sâu dâu

Thu hái chế biến: Lấy những lá bánh tẻ, không bị sâu, phơi nắng thật nhanh rồi phơi trong râm cho khô mà vẫn giữ được màu xanh lục

Lá dâu không mùi, vị nhạt, hơi đắng chát Loại lá dâu lá to, nguyên, không rách, không vụn nát, màu lục xám, dày khô, không bị sâu, không lẫn tạp chất là tốt Hàm lượng nước dưới 14%

Tại Việt nam dâu dược trồng rộng rãi ở đồng bằng, các vùng trung du và cao nguyên, đặc biệt tại Lâm Đồng, lúc cực thịnh (năm 1994 – 1995) diện tích dâu tại

đây đạt đến hơn 17500 ha, chiếm gần nửa diện tích trồng dâu trong cả nước và hiện nay còn khoảng 7500 ha với sản lượng đạt khoảng 52000 tấn (số liệu năm 2007)

1.1.3 Thành phần hoá học [6]

Trong lá dâu có các chất cao su, caroten, tanin, vitamin C, cholin, adenin, trigonellin, rất ít tinh dầu Ngoài ra còn có pentosan, đường, muối calcium

Thành phần hóa thực vật [29,43]

1 Các triterpene: inokosterone, ecdysterone, beta-sitosterol, lupeol

2 Bioflavonoid: rutin, moracetin, quercetin-3-triglucoside, isoquercitrin

3 Coumarin: umbelliferone, scopoletin, scopolin

4 Chất dễ bay hơi bao gồm acid acetic, acid propionic, acid butyric, acid isobutanoic, acid valeric, acid isovaleric, acid hexanoic, acid isohexanoic, methyl salicylate, guaiacol, phenol, eugenol, v.v

5 Alkaloid: trigonelline, choline, adenine

6 Amino acid: acid aspartic, acid glutamic, acid gamma-aminobutyric, acid pipecolic, acid 5-hydroxypipecolic, glutathione

7 Acid hữu cơ và các thành phần hoá thực vật khác: acid clorogenic, acid fumaric, acid folic, acid folinic, vitamin C, vitamin A, mesoinositol, glucid, pectin,

tannin, v.v

1.1.4 Công dụng [6]

Theo Đông y, lá dâu vị đắng ngọt, tính lạnh, vào 2 kinh Can, Phế có tác dụng tán phong, thanh nhiệt (trừ cảm mạo, sốt nóng) làm mát máu, sáng mắt, nhuận phổi, làm ra mồ hôi, dùng chữa các bệnh cảm sốt, nhức đầu, đau mắt đỏ, ho, sốt hâm hấp Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, người ta sử dụng lá dâu để chữa các bệnh như thiếu máu, táo bón, phù nề, đau khớp, tiểu đường, tăng huyết áp …

Các nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng kháng oxy hóa cao của lá dâu

1.2 CÁC HỢP CHẤT POLYPHENOL

1.2.1 Tổng quát [11,16,19,20]

Polyphenol là một nhóm các chất hóa học được tìm thấy trong cây trồng, đặc trưng bởi sự hiện diện của nhiều đơn vị phenol Polyphenol thường có thể chia thành tannin hòa tan (ester của acid gallic với gluco và các đường khác) và phenylpropanoid, chẳng hạn như lignin, flavonoid và tannin cô đặc

Việc chia các polyphenol thành tannin, lignin, và flavonoid bắt nguồn từ sự đa dạng của các đơn vị polyphenolic tạo ra trong quá trình chuyển hóa ở thực vật cũng như phân nhóm cổ điển dựa trên các mức độ quan trọng của mỗi thành phần cơ bản tới các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau Hóa học tannin có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thuộc da; lignin liên quan đến hóa học của đất và cấu trúc thực vật, và flavonoid liên quan đến chuyển hóa ở thực vật - chất bảo vệ trong thực vật

và màu sắc của hoa (ví dụ từ anthocyanin) Nhóm polyphenol được nghiên cứu nhiều nhất là flavonoid, bao gồm một vài nghìn hợp chất, trong đó có các flavonol, flavone, catechin, flavanone, anthocyanidin, và isoflavonoid [16] Polyphenol phong phú nhất là tannin ngưng tụ, được tìm thấy ở hầu như tất cả các loại cây, và chiếm khoảng 50% trọng lượng chất khô của lá

Bảng 1.1 Phân loại polyphenol dựa trên đơn vị cơ bản

Đơn vị cơ bản:

Acid Gallic Flavone Acid Cinnamic

Lớp/Polymer: tannin hòa tan Flavonoid, tannin ngưng tụ Lignin

Polyphenol cũng được phân loại theo vị trí và số lượng nhóm phenolic trên nhánh phụ

Bảng 1.2 Phân loại polyphenol theo vị trí và số lượng nhóm phenolic trên nhánh phụ

Phenol Pyrocatechol Pyrogallol Resorcinol

Ví dụ: gallocatechin (EGCG), tannin, myricetin, lignin dẫn xuất từ sinapyl alcohol

Ví dụ: resveratrol

Phloroglucinol Hydroquinone

Ví dụ: hầu hết các flavonoid Ví dụ: arbutin

Các đơn vị phenolic có thể được ester hóa hay methyl hóa Nó cũng có thể được tìm thấy ở dạng dimer hoặc polymer, tạo ra một phân nhóm mới của polyphenol Ví dụ, acid ellagic là một dimer của acid gallic và tạo thành nhóm ellagitannin, hoặc một catechin và một gallocatechin có thể kết hợp để tạo thành hợp chất màu đỏ theaflavin, tương tự như sự hình thành nhóm màu nâu thearubigin trong trà

Trong thực phẩm

Nguồn polyphenol thông dụng bao gồm trái berri, trà, bia, nho/rượu vang, dầu ôliu, sô-cô-la/cacao, cà phê, lạc, lựu, các loại trái cây và rau khác nhau Hàm lượng cao polyphenol thường được tìm thấy trong vỏ trái cây

Lợi ích sức khỏe: polyphenol có khả năng chống oxy hóa và khả năng kháng khuẩn Ngoài ra, polyphenol được biết đến như vitamin P; Cụ thể như ích lợi của quercetin, rutin được nghiên cứu nhiều và còn có nhiều nghiên cứu về lợi ích của các polyphenol khác Chúng có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch và ung thư [11] và được xem như là một nguồn bổ sung hữu cơ có lợi cho sức khoẻ [32]

1.2.2 Giới thiệu hợp chất flavonoid [2,7]

™ Khái niệm

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nửa rau quả thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu nguồn gốc thực vật Cho đến nay có khoảng 4000 chất đã được xác định cấu trúc Chỉ riêng hai nhóm flavon, flavonol với nhóm thế OH hoặc OCH3 thì theo

lý thuyết có thể gặp 38.627 chất Phần lớn các flavonoid có màu vàng (flavonoid xuất phát từ flavus có nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số có màu xanh, tím đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc nhóm flavon nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon, cần lưu ý để khỏi nhầm lẫn

™ Cấu trúc hóa học và phân loại

 Khung của flavon:

Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch

3 Cacbon

C C

C

Cấu trúc có thể là vòng kín hay hở Tại các vòng có đính một hay nhiều nhóm

hydroxy tự do hoặc đã thay thế một phần vì vậy các polyphenol có tính acid

3 4 5 6

5' 6'

4'

3' 2'

O O

 Phân loại flavonoid:

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl

ở vị trí C2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C3, neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C4 Người ta còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonid được cấu

tạo bởi 3 monomer flavonoid

Bảng1.3 Phân loại các flavonoid

TT Phân loại Đặc điểm Cấu tạo

1 Flavon Vòng B gắn vào vòng C (pyran)

4 Flavanol Không có nối đôi ở C2-C3, có

thêm nhóm OH ở C3

5 Chalcon Là flavonoid vòng mở, 2 nhân

thơm kết hợp nhau qua 1 dãy 3 cacbon α, β không bão hòa

O

2'

6' 5'

4' 3'

5 6

4

3 2

O

O

OH 3

TT Phân loại Đặc điểm Cấu tạo

O

O Kaempferol

4' 3'

5 6 4

3 2

R4

R4

O CH

O 4 5 6

4' 5' 6'

Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3 cacbon, không có dị vòng C như các flavonoid khác Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam Chalcon có chủ yếu trong một số hoa họ cúc, một số có trong lá, vỏ, rễ, điển hình là

trong rễ cam thảo

™ Tính chất

Các dẫn xuất flavonol có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol

do không có nối đôi liên hợp giữa vòng B với nhóm cacbonyl nên không màu

Các dẫn xuất anthocyanidin có màu thay đổi tùy theo pH của môi trường Tuy nhiên màu sắc của các flavonoid ở trong các bộ phận của cây còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác

Độ tan của các flavonoid không giống nhau, thường flavonoid glycoside và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hay ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, ít nhất là hệ cồn-nước Các aglycon flavonoid tan được trong dung môi hữu cơ và không tan trong nước Các dẫn xuất flavonoid có

nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

™ Một số phản ứng định tính

 Tác dụng với FeCl3: Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng vị trí nhóm

OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu

 Tác dụng của H2SO4 đậm đặc: khi nhỏ acid H2SO4 lên các chất flavon, flavanon thì các hợp chất này cho màu vàng đậm, chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm, đỏ tươi, flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavanon thành chalcon

 Tác dụng của NaOH đậm đặc đun nóng: Đun flavonoid với dung dịch KOH 30% sẽ có tác dụng mở vòng C rồi dẫn đến tạo các dẫn xuất acid thơm và phenol Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn xuất acid thơm và

phenol khác nhau Có thể xác định các dẫn xuất này bằng sắc ký đối chiếu với chất màu, kết quả thu được dùng để biện luận cấu trúc

Ví dụ khi phân hủy chrysin thì thu được phloroglucin, acid benzoic như hình 1.2

2 1

Hình 1.2 Sơ đồ phản ứng phân hủy chrysin

 Tác dụng của antimoin pentachlorid (Phản ứng Martini Bettolo): SbCl5 trong CCl4 cho màu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến cam với flavon Dehydrochalcon

do mất nối đôi liên hợp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc với H2SO4

 Phản ứng cyanidin: Đây là phản ứng khử hay được dùng nhất để tìm sự có mặt của các dẫn xuất nhóm flavonoid Dung dịch flavonoid trong ethanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau 1 đến 2 phút sẽ hình thành phức có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon

 Tác dụng của chì acetat trung tính hoặc kiềm: Nhiều dẫn xuất flavonoid tạo thành muối hoặc phức có màu khi tác dụng với dung dịch chì acetat trung tính hay

kiềm Màu phụ thuộc vào các dẫn xuất flavonoid Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì acetat kiềm cho kết tủa có màu với hầu hết các flavonoid phenol còn chì acetat trung tính tạo tủa với các dẫn xuất có nhóm o-dihydroxyphenol

 Phản ứng ghép đôi với muối diazo: Các dẫn xuất flavonoid có nhóm OH vị trí

7 có thể phản ứng với diazo để tạo thành chất màu azo vàng cam đến đỏ

™ Vai trò và tác dụng của flavonoid

 Các phản ứng sinh hóa: Các nhóm phenol của flavonoid có vai trò trong sự

hòa tan các chất vì di chuyển dễ dàng qua các màng sinh lý Một số flavonoid có tác dụng như một chất chống oxy hóa như acid ascobic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật Một số có tác dụng ức chế các enzym và các chất độc của cây

 Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng: Có nhiều công trình nghiên cứu về

tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoid Nhóm chức hydroxy

có vai trò quyết định về tác dụng này Ví dụ: trong cây ổi, các flavonoid có nhóm

OH ở vị trí 4’ làm tăng cường hoạt tính của enzym trong khi các flavonoid có OH ở

cả 3’ và 4’ lại có tính ức chế Flavonoid còn tham gia vào sự hô hấp quang hợp

 Vai trò tạo màu sắc: Flavonoid đóng vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp

phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả do sâu bọ có hệ thống thị giác đặc biệt nên chúng rất nhạy cảm đối với màu sắc của cây cỏ Trong việc tạo màu, các flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng trong khi các anthocyanin cho các màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm

 Vai trò một chất bảo vệ cây: Một số flavonoid không màu trong lá đóng vai trò

một chất bảo vệ cây khỏi các động vật ăn cỏ Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này

ÂTác dụng sinh học của flavonoid: Các dẫn xuất có khả năng dập tắt các gốc tự

do như OH•, ROO• Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA sẽ gây những phản ứng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa…

Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị oxy hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng như sự hủy hoại tế bào Đưa các chất chống oxy hóa vào cơ thể để bảo vệ tế bào có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu, lão hóa, tổn thương do các bức xạ, thoái hóa gan…

Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tim mạch, tĩnh mạch

bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, chảy máu do đặt vòng phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc và đã được chứng minh

có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm

Tác dụng chống độc của flavonoid có thể làm giảm tổn thương gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể súc vật thí nghiệm (CCl4, benzen, CHCl3, quinin…) Dưới tác dụng của flavonoid ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũy glycogen có tác dụng quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt

Tác dụng chống loét của flavonon và chalcon glycosid của rễ cam thảo đã được ứng dụng để chữa đau dạ dày Một số dẫn chất khác như catechin, 3-O-methyl catechin, cũng có tác dụng chống loét

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonon, flavan-3-ol, anthocyanin như rutin, quercetin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp của cơ tim, thí nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, điều hòa sự rối loạn nhịp

Trên hệ thần kinh, một số C-flavon glycosid của hạt táo có tác dụng an thần rõ rệt Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một

số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-β-D-galactopyranosid

™ Sự phân bố flavonoid trong thực vật

Flavonoid rất ít gặp trong thực vật bậc thấp Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất

ít chất Nhiều nhóm flavonoid có mặt trong dương xỉ nhưng với số lượng ít

Trong ngành hạt trần (có 700 loài, 20 họ), số lượng flavonoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm của flavonoid Nét đặc trưng của ngành hạt trần so với thực vật bậc thấp và ngành hạt kín thể hiện ở chỗ có sự hiện diện của nhiều dẫn xuất biflavonoid

Flavonoid tập trung chủ yếu ở ngành hạt kín lớp 2 lá mầm Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid

Lớp 1 lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 19 họ tìm thấy có flavonoid

Động vật không tổng hợp được flavonoid nhưng trong một vài loài bướm sự có mặt của flavonoid là do chúng lấy từ thức ăn thực vật

Hàm lượng các thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng

™ Chiết xuất flavonoid

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan trong nước và trong dung môi hữu cơ Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong dung môi phân cực, các flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực

Thông thường để chiết các flavonoid glycoside người ta phải loại các chất thân dầu bằng ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc methanol hoặc ethanol hay hỗn hợp CHCl3 và ethanol Hỗn hợp CHCl3 và ethanol hay được sử dụng để chiết các dẫn xuất methoxy flavonoid

Đôi khi để tinh chế hay tách flavonoid người ta hay dùng muối chì để kết tủa Sau khi thu được kết tủa, người ta tách chì bằng cách sục dihydrosulfid để giải phóng flavonoid

1.2.3 Giới thiệu về khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol

và các phương pháp khảo sát tính kháng oxy hóa

™ Giới thiệu về khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol [13,17,18]

Trong thời gian gần đây có nhiều nghiên cứu về tính kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol, đặc biệt là các hợp chất flavonoid Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học mạnh: kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm…Các tính chất này có được là do tính kháng oxy hóa rất mạnh của các hợp chất polyphenol Hoạt tính kháng oxy hóa của các hợp chất thường được khảo sát bằng cách cho phản ứng với các gốc tự do như: ABTS, DPPH, AAPH, O•, OOH•, OH•,…

Để một hợp chất có khả năng kháng oxy hóa thì phải thỏa mãn 2 điều cơ bản: thứ nhất, khi tồn tại ở nồng độ thấp thì chất đó phải có khả năng ức chế hay ngăn chặn quá trình tự oxy hóa của các chất dễ bị oxy hóa trong dung dịch; thứ hai, các gốc tự

do được hình thành sau khi tương tác với chất kháng oxy hóa phải bền hơn gốc tự

do ban đầu Nhiều kết quả cho thấy tính kháng oxy hóa của các hợp chất polyphenol phụ thuộc vào cấu trúc của các hợp chất, đặc biệt là vị trí nhóm - OH trên các vòng thơm và tương tác của các nhóm chức trên vòng

Ví dụ khả năng quét gốc tự do DPPH trong dung môi methanol của các chất khảo sát được sắp xếp theo trật tự giảm dần như sau: quercetin > fisetin > rutin > luteolin

> taxifolin > eriodictyol > keampferol [34,35] Như vậy, quercetin có tính kháng oxy hóa mạnh nhất

Xét về mặt cấu tạo, quercetin có 5 nhóm hydroxy ở các vị trí 5,7,3,3’,4’ liên kết đôi

ở vị trí 2,3 và nhóm 4-oxo Như vậy, quercetin có các đặc điểm sau:

+ Hợp chất có cấu trúc ortho-dihydroxy trên vòng B, điều này giúp tạo ra sự ổn định cao cho gốc tự do tạo thành và tham gia vào quá trình giải tỏa electron cục bộ

+ Cấu trúc liên hợp với sự có mặt của nối đôi tại vị trí số 2,3 và nhóm carbonyl ở vị trí số 4 (4-oxo) trên vòng C Các nối đôi này mở rộng sự liên hợp và tăng cường sự giải tỏa electron trên vòng B Khi đó gốc phenyl tạo ra sự ổn định bởi các cấu trúc cộng hưởng của nhân thơm

+ Các nhóm hydroxy ở vị trí số 3,5,7 cùng với nhóm oxo ở vị trí số 4 trên vòng A

và C làm tăng tối đa hoạt tính quét gốc tự do

Như vậy nếu trong công thức cấu tạo của các chất thiếu một trong những đặc điểm trên sẽ dẫn đến sự suy giảm về khả năng quét gốc tự do

Hình 1.3 Quá trình phản ứng của quercetin với gốc tự do

Khả năng quét gốc tự do chỉ là một trong nhiều khả năng của chất kháng oxy hóa, kết quả thu được khi nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của một hợp chất nào đó còn chịu ảnh hưởng của môi trường khảo sát, vì vậy khi tiến hành trên các hệ khác nhau có thể cho các kết quả khác nhau

™ Các phương pháp khảo sát tính kháng oxy hóa [20,21,24, 30,40,58]

ÂPhương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thực nghiệm DPPH

Gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydraz)

Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Khả năng thu gom gốc tự do

DPPHy được xác định bằng sự giảm độ hấp thu ở 515 nm do gốc DPPHy bị khử bởi chất chống oxy hóa (AH) hay do DPPHy phản ứng với các gốc tự do khác (Ry):

DPPHy + AH => DPPH-H + Ay

DPPHy + Ry => DPPH-R Phản ứng của gốc tự do DPPHy với các phenol như α-tocopherol xảy ra nhanh, nhưng phản ứng phát sinh thì chậm làm độ hấp thu chỉ giảm dần dần Do đó trạng thái cân bằng chỉ đạt được sau vài giờ Hầu hết các tài liệu dùng phương pháp DPPH đều cho rằng sự thu gom gốc tự do xảy ra sau 15 đến 30 phút phản ứng

Hình 1.4 Phản ứng của thuốc thử DPPH

ÂPhương pháp dùng cation gốc ABTSy+ (gốc tự do ở dạng cation)

Phương pháp này hiệu quả hơn phương pháp DPPH và phản ứng của cation gốc ABTS với chất chống oxy hóa xảy ra trong vòng một phút Cation gốc tự do ABTSy + được tạo thành khi cho ABTS phản ứng với kalipersulphat trong tối, để qua đêm Cation gốc này mang màu và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 734nm Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng khả năng làm nhạt màu cation gốc tự do và đánh giá thông qua giá trị TEAC (so sánh với khả năng chống oxy hóa của Trolox, hợp chất có cấu trúc giống với vitamin E)

ÂPhương pháp khử sắt (III)

Với các polyphenol, khả năng kháng oxy hóa cũng có thể được đo bằng phương pháp định lượng năng lượng khử phức Fe (III) thành phức Fe (II) Phức Fe (III) của

Chất kháng oxy hóa

2,4,6-tripyridyl-s-triazin được chuẩn bị ở pH acid và hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol được xác định ở nồng độ 10 µM bằng khả năng khử phức Fe (III) thành

Fe (II), với phức Fe (II) có độ hấp thu cực đại ở 593 nm Trolox 1µM được dùng làm chuẩn đối chiếu

 Phương pháp xác định sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid (định lượng MDA)

Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA) là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở λmax = 532nm Cường độ

màu của dung dịch tỷ lệ với hàm lượng MDA

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ LÁ CÂY DÂU

Năm 1999, Kim SY [25] đã cô lập được 9 flavonoid từ lá cây Morus alba là kaempferol-3-O-beta-D-glucopyranoside (astragalin (4)), kaempferol-3-O-(6”-O-acetyl)-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-(6”-O-acetyl)-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside, kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranosil-(1Æ6)-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-alpha-L-rhamnopyranosil-(1Æ6)-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-beta-D-glucopyranosyl -(1Æ6)-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3,7-di-O-beta-D-glucopyranoside và quercetin Hai hợp chất quercetin và quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside (1Æ 6)-beta-D-glucopyranoside có hoạt tính bắt gốc tự do trên phép thử nghiệm bằng DPPH

(4) Astragalin

Nghiên cứu năm 2000 của Kim SY [26] cho thấy 2 flavonoid từ lá dâu tằm quercetin-3-O-beta-D-glucopyranoside, quercetin-3,7-di-O-beta-D-glucopyranoside

ức chế sự phát triển của dòng tế bào HL-60 ở nồng độ 2.10-4 mmol/l Những flavonoid thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do trên phép thử bằng DPPH

Năm 2002 K.M.Park [27] phân lập được hợp chất Kuwanon G (5) trong phân đoạn

ethylacetat từ dịch chiết methanol của cây Morus alba và xác định hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất này với chủng Streptococcus mutans, kết quả cho thấy nồng độ

ức chế tối thiểu MIC là 8,0 μg/ml

(5) Kuwanon G Các nghiên cứu gần đây nhận thấy, những chất ức chế quá trình sinh tổng hợp protaglandin (thông qua ức chế enzym cyclooxygenase, COX-2) và sự tạo thành nitric oxide (thông qua ức chế enzym nitric oxide synthase, iNOS) đều có hoạt tính kháng viêm và chống ung thư Năm 2002, tác giả Chae Hee Hong [14] nhận thấy

dịch chiết methanol từ cây Morus alba có hoạt tính ức chế iNOS ở nồng độ

10μg/ml

Năm 2003, Jiang Du [23] và cộng sự phân lập được moralbnone, một prenylflavonoid, cùng 7 hợp chất khác: kuwanon S, mulberroside C, cyclomorusin, eudra-flavon B hydroperoxide, oxydihydromorusin, leachianone G và α-acetyl-amyrin từ cây dâu tằm, trong đó Leachianone G (6) có hoạt tính ức chế virus HSV-1 (IC50 = 1,6μg/ml, CC50 = 15,5μg/ml)

Năm 2003, Toshio Fukai [40] đã thử nghiệm hoạt tính bắt gốc tự do của 5

prenylflavonoid được phân lập từ cây Morus alba, Artocarpus communis,

Glycyrrhiza uralensis và G.inflata Các thử nghiệm cho thấy murusin (7) và

licorisoflavan A làm gia tăng hoạt tính bắt gốc tự do so với vitamin C khoảng 2 lần

(6) Leachianone G (7) Morusin Năm 2004, H.Y Sohn [22] và cộng sự đã phân lập được 18 hợp chất prenylflavonoid từ cây dâu tằm có hoạt tính kháng lại 4 chủng vi sinh vật và 2 loài

nấm (Candida albicans, Sacchromyces cerevisiae, E coli, Salmonella typhimurium,

Staphylococcus epidermis và S aureus) Các chất Kuwanon C, Mulberrofuran G

(8), Albanol B (9), Sophoraflavanone G (10) cho thấy hoạt tính mạnh ở nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 5 – 30 μg/ml

(10) Sophoraflavanone G

Năm 2005 Abdel Nasser B Singab [9] và cộng sự thử nghiệm hoạt tính hạ đường

huyết của phân đoạn giàu flavonoid từ dịch chiết ethanol 70% bằng mô hình in vivo

trên chuột và theo dõi trên 10 ngày, kết quả cho thấy hàm lượng gluco trong máu giảm rõ rệt Các hợp chất được phân lập từ phân đoạn này bao gồm các flavonoid: morusin, cyclomorusin, neocyclmorusin, moracin M (11), kuwanon E, 2- arylbenzofuran, và hai triteroenes, acid betulinic và methyl ursolate Các flavonoid này có khả năng ức chế peroxide hóa lipid

Từ rễ dâu tằm, năm 2006 Hesham A El-Beshbishy đã phân lập 4 hợp chất có hoạt tính chống mỡ trong máu và chống oxy hóa là Albanol A (12), Albanol B (9), Mulberroside A (13) và Streppogenin-4’-O-β-glucoside

(11) Moracin M (12) Albanol A (13) Mulberroside A Thực nghiệm năm 2006 và năm 2008 của Takuya K [39] cho thấy các hợp chất flavonol glycoside gồm quercetin 3-(6-malonylglucoside), rutin (quercetin 3-rutinoside) (3), isoquercitrin (quercetin 3-glucoside) (14) và kaempferol 3-(6-malonylglucoside) trong dịch cồn 60o từ lá dâu có khả năng kháng oxy hóa LDL

(14) isoquercitrin

Năm 2007, Jong MK [28] đã nghiên cứu hai hợp chất quercetine và mulberroside F

từ dịch chiết lá dâu có hoạt tính kháng oxi hóa và kháng tyrosin

Năm 2008, Masood SB [29] đã chứng minh các hoạt chất flavonoid từ lá dâu có tác dụng kháng oxy hóa mạnh, có tác dụng lên phổi, thần kinh và chống ung thư; hợp chất 1-deoxynojirimycin (15) có công dụng giảm đường huyết

(15) 1-deoxynojirimycin Năm 2009 Mi Zhang [31] và cộng sự đã phân lập 3 phenolic có tác dụng hạ mỡ trong máu: moracin M, steppogenin-4’-O-β-D-glucoside và mullberroside A.; và 1 flavavon glycoside từ rễ dâu tằm là 5,2’-dihydroxyflavanone-7,4’-di-O-β-D-glucoside có hoạt tính chống sự tăng sinh tế bào HO-8910 với giá trị IC50 tương ứng sau 48 giờ và 72 giờ là 3,68 và 1,87 μmol/ml

1.4 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT POLYPHENOL

Có nhiều phương pháp chiết xuất các chất từ tế bào thực vật như: nghiền, ép, dùng dung môi, vi sóng, tạo chênh lệch áp suất … Phần sau đây giới thiệu một số kỹ thuật chiết xuất polyphenol

1.4.1 Sử dụng dung môi để chiết xuất [46]

Đây là quá trình chiết xuất polyphenol hòa tan bằng cách khuếch tán các chất từ mô thực vật vào dung môi Quá trình này chia thành hai giai đoạn:

- Giai đoạn đầu: có sự trương nở của mẫu do sự thấm hút dung môi vào pha rắn Sự thấm hút là do lực thẩm thấu, lực mao quản và do sự solvat hóa các ion trong tế bào Trong giai đoạn này, một lượng polyphenol trong tế bào bị phân hủy do các bước nghiền, cắt mẫu trước đó

- Giai đoạn khuếch tán: các chất khuếch tán từ pha rắn vào pha lỏng Trong giai đoạn này ta có thể nhận biết được do sự hòa tan của các chất màu vào dung môi

Hình 1.5 Mô hình chiết xuất lỏng -lỏng Hình 1.6 Hệ thống chiết xuất lỏng-lỏng

trong phòng thí nghiệm trong công nghiệp

™ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất bằng dung môi

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất này bao gồm: loại dung môi, nhiệt

độ, thể tích dung môi, kích thước các phần tử

- Loại dung môi : Dung môi dùng để chiết xuất các hợp chất ra khỏi nguyên liệu

thực vật rất đa dạng và thay đổi tùy theo đặc điểm của nguyên liệu và bản chất của chất cần nghiên cứu Cơ sở để lựa chọn dung môi chiết xuất là tính phân cực của hợp chất chứa trong thực vật và của dung môi, nhiệt độ bay hơi và tính độc đối với thực phẩm, dược phẩm

Về các chất chứa trong nguyên liệu, các chất tan trong nước đều là chất phân cực và các chất tan trong dầu và tinh dầu là chất không phân cực Tính phân cực của mỗi chất khác nhau tùy thuộc vào trọng lượng phân tử (mạch cacbon) và vào các nhóm chức Thông thường mạch cacbon càng dài thì tính phân cực càng giảm Về nhóm chức: các nhóm chức có nguyên tử mang điện âm có thể liên kết với một nguyên tử hydro của H-O-H để hình thành liên kết hydro thì gọi là nhóm phân cực Như vậy, các nhóm như: -OH, -NO2, -NH2, -COOH, -SO2 và các nhóm halogen đều là những nhóm phân cực

Trong công nghiệp, tiêu chuẩn để chọn dung môi chiết xuất là:

• Dung môi rẻ tiền

• Dễ kiếm

• Không gây độc đối với người thao tác

• Không tạo hỗn hợp nổ với không khí,

• Có tính hòa tan chọn lọc,

• Không tác dụng hóa học với cấu tử của dịch chiết, không tác dụng hóa học hay phá hủy thiết bị chiết xuất

• Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản,

• Dung môi phải dễ tách ra khỏi sản phẩm sau khi chiết mà không để lại mùi vị lạ và không gây độc cho sản phẩm

Trong phòng thí nghiệm dung môi sử dụng để trích ly polyphenol sử dụng nhiều nhất là methanol, và hỗn hợp methanol – nước Ngoài ra có thể sử dụng aceton, ethylacetat, ethanol nhưng thường trích ly được ít polyphenol hơn Tuy nhiên trong công nghiệp, thường ethanol hay hệ ethanol – nước được sử dụng rộng rãi hơn do tính an toàn của chúng

- Nhiệt độ: nhiệt độ cao làm tăng khả năng hòa tan của các chất vào dung môi do

làm giảm độ nhớt, tăng hệ số khuếch tán Tuy nhiên, nhiệt độ cao lại gây phân hủy polyphenol

- Thể tích dung môi và số lần chiết xuất: Có nhiều cách chiết, để có được lựa chọn

thích hợp cần dựa trên bản chất, thành phần của các chất cần chiết Phương pháp chiết xuất cổ điển để nghiên cứu thăm dò là dùng một dãy dung môi bắt đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh Phương pháp chiết được tiến hành theo 2 cách:

• Chiết xuất một lần: với toàn bộ lượng dung môi cho vào

• Chiết xuất phân đoạn: là quá trình ngâm nhiều lần, mỗi lần dùng một phần của toàn lượng dung môi Tổng thể tích các phân đoạn dịch chiết sẽ cho lượng chất tan chiết được lớn hơn nhiều so với quá trình chiết một lần bằng toàn bộ lượng dung môi

Sau đây là một số cách chiết xuất:

• Chiết ở nhiệt độ thường: chiết xuất nguyên liệu trong dung môi ở nhiệt độ

phòng, thường dùng dung môi ethanol-nước ở các tỉ lệ thích hợp Trong quá trình chiết có thể khuấy trộn để tăng hiệu suất chiết, dụng cụ cần đậy kín để tránh bay hơi dung môi

• Chiết ở nhiệt độ cao: Chiết nguyên liệu đã nghiền nhỏ với dung môi trong 1 bình kín ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng và giữ ở nhiệt độ đó trong 1 thời gian quy định, thỉnh thoảng có khuấy trộn Nhiệt độ chiết thường từ 40 oC - 60 oC và thời gian kéo dài hàng giờ Phương pháp chiết này thường được dùng với các nguyên liệu có hoạt chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao, dung môi có độ nhớt cao

• Chiết trong nước sôi thời gian ngắn: Cho dung môi vào dươc liệu đã nghiền nhỏ trong 1 bình chịu nhiệt, để trong 1 thời gian xác định thường 15-30 phút, có khuấy trộn hoặc lắc sau đó gạn ép lấy dịch chiết Phương pháp được áp dụng cho nguyên liệu mỏng manh như hoa, lá…, có hoạt chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao Dụng cụ có thể được bọc cách nhiệt để tránh làm giảm nhanh nhiệt độ của dung môi trong quá trình chiết xuất Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, thời

gian tiếp xúc với nhiệt ngắn

• Sắc : Đun sôi nguyên liệu với dung môi trong 1 thời gian quy định sau đó

gạn lấy dịch chiết Thời gian sắc thường từ 30 phút đến hàng giờ Phương pháp này thường dùng dung môi nước để chiết xuất các nguyên liệu rắn chắc như vỏ, rễ,

hạt… và chứa hoạt chất không bị phân hủy ở nhiệt độ cao

Hiệu suất chiết xuất tăng khi thực hiện chiết nhiều lần và với lượng dung môi nhiều Tuy nhiên điều này sẽ làm tăng thêm chi phí cho quá trình chiết xuất cũng như tách

và thu hồi dung môi sau này

- Kích thước của các phần tử: kích thước của các phần tử nhỏ làm tăng bề mặt tiếp

xúc giữa các phần tử và dung môi nên làm tăng hiệu suất chiết