Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men rhodotorula sp

34 2.2.3 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm Box-Hunter ..... 10 Bảng 1.2 Các ngh

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ

KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN

BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ

KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN

BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH : 62.54.02.01

Phản biện độc lập 1 : PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Phản biện độc lập 2 : PGS.TS LƯU HỮU MÃNH

Phản biện 1 : PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Phản biện 2 : PGS TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Phản biện 3 : PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

2 TS NGUYỄN HỮU PHÚC

An, Việt Nam một chủng nấm men Rhodotorula sp.3 có khả năng sinh tổng hợp

carotenoid giàu beta-carotene trên môi trường nuôi cấy bán rắn Chủng giống này đã được giải trình tự 28S ADN Thành phần để phối trộn 100 Kg môi trường nuôi cấy

bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 gồm gạo tấm = 45%; nước = 55 đến 60% , bã đậu

nành = 3% (% Klg) Gạo sau khi hồ hóa với nước, trộn với bã đậu nành rồi lần lượt bổ sung 1% (ml/g) dầu cọ thô, các chất dinh dưỡng tối ưu gồm: saccharose = 8700; nitơ (NaNO3) = 8500; phospho (KH2PO4)= 3300; lưu huỳnh (MgSO4.7H2O) = 500 (ppm) Tiến hành lên men bán rắn ở điều kiện nhiệt độ phòng trên các khay lên men với các thông số nuôi cấy tối ưu như sau: độ ẩm môi trường = 65%; độ dày lớp môi trường = 1,5 cm; tỷ lệ giống = 9 x 107 CFU/g môi trường Vào ngày nuôi cấy thứ 7, tiến hành xử

lý vi bao tòan bộ canh trường nuôi cấy với 5% bột gạo và sấy ở nhiệt độ 50 ± 1 oC đến

độ ẩm 11-12% để thu nhận chế phẩm sinh học từ Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là βCR)

Chế phẩm βCR đã được thử nghiệm dùng làm nguyên liệu thức ăn nuôi gà đẻ trứng

công nghiệp IsaBrown Kết quả nghiên cứu cho thấy khi khẩu phần thức ăn có đáp

ứng nhu cầu năng lượng trao đổi ME ở mức (2893 ± 10) Kcal/Kg, hàm lượng protein thô đạt (18,27 ± 0,35) %Klg và hàm lượng carotenoid tổng ở mức (131,57 ± 17,46) ppm gà mái sẽ cho năng suất trứng đạt trên 94% Các chỉ tiêu chất lượng trứng như màu của lòng đỏ, kết cấu albumin của lòng trắng trứng đặc, độ dày vỏ cùng với hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể, đặc biệt hàm lượng vitamin A (µg %) trong lòng đỏ trứng đạt (895,26 ± 66,96) so với trứng gà

ở lô đối chứng là (468,24 ± 52,48)

Nghiên cứu sinh

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các

kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành nghiên cứu này

Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Kỹ thuật Hóa học, quý Thầy Cô trong Hội đồng bảo vệ các chuyên đề NCS và đặc biệt là Thầy PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã có những đóng góp, những nhận xét chân thành cho kết quả đạt được của luận án

Đồng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng giảng viên, nhân viên Viện Công nghệ Thực phẩm – Sinh học, Trường Đại học Công Nghiệp TP HCM; Bộ môn chăn nuôi chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi – Thú y trường Đại học Nông Lâm TP HCM; Khoa Hóa học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu

Cảm ơn anh Trần Văn Nam, chủ cơ sở Mai Thủy, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà

Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện cho tôi làm thực nghiệm trên đàn gà đẻ trứng IsaBrown của

cơ sở

Xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Thị Tú Minh, Tạ Đăng Khoa, Nguyễn Đình Thịnh và cử nhân Nguyễn Minh Nhựt đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm

Xin cảm ơn Ba, Mẹ và các Anh Chị trong đại gia đình Đức Hải đã giúp con có được sự thành đạt ngày hôm nay

Lời cuối cùng tôi xin cảm ơn anh Phan Trung Viên đã luôn cận kề, động viên, chia sẻ, tạo mọi điều kiện về vật chất lẫn tinh thần cho tôi học tập và nghiên cứu Cảm ơn hai con Phan Trung Thành Nhân và Phan Nguyễn Minh Tâm đã ngoan, khỏe mạnh và học giỏi trong những năm mẹ học tập

Lời cảm ơn

MỤC LỤC

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các sơ đồ và hình

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM MEN RHODOTORULA 3

1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái 5

1.1.3 Đặc điểm sinh hóa 6

1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula 6

1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula 13

1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 14

1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn 14

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn 15

1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn 17

1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula 19

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 19

1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GÀ ĐẺ TRỨNG 23

1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin 24

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA 29

2.1.1 Vật liệu phân lập 29

2.1.2 Môi trường phân lập 29

2.1.3 Các thí nghiệm định danh nấm men 30

2.2 THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA THEO KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 30

2.2.1 Khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 30

2.2.2 Thành phần môi trường cơ bản cho quá trình LBR Rhodotorula 34

2.2.3 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm Box-Hunter 36

2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula 38

2.2.5 Phương pháp khảo sát động học sinh tổng hợp sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất khác 39

2.2.6 Khảo sát quá trình sấy và thu nhận chế phẩm 40

2.2.7 Các phương pháp phân tích hóa lý 41

2.3 THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 42

2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 42

2.3.2 Thành phần thức ăn đối chứng 43

2.3.3 Bố trí thí nghiệm trên chuột 43

2.3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp khảo sát 44

2.4.2 Thành phần thức ăn đối chứng 46

2.4.3 Các nguyên liệu phối trộn thức ăn thí nghiệm 47

2.4.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn gà 47

2.4.5 Các chỉ tiêu khảo sát năng suất và phẩm chất trứng 49

2.4.6 Quan sát sự tiêu huỷ của tế bào nấm men Rhodotorula 52

2.4.7 Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn với năng suất cho trứng của gà 52

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 53

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 54

3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid 54

3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij 54

3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ sởkhả năng sinh tổng hợp beta-carotene 57

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN 59

3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 59

3.2.2 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula 63

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula 71

3.2.5 Khảo sát quá trình sấy và hoàn thiện chế phẩm 81

3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm 82

3.2.7 Phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm 83

3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 87

3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG 90

3.4.1 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng sử dụng trong thí nghiệm 90

3.4.2 Năng suất trứng 92

3.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng và năng suất trứng gà

93

3.4.4 Tỷ lệ gà sống 94

3.4.5 Các chỉ tiêu phẩm chất trứng 94

3.4.6 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng 97

Chương 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 99

4.2 ĐỀ NGHỊ 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp 10

Bảng 1.2 Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm 12

Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau 120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau 22

Bảng 2.1 Các nguồn phân lập nấm men sinh sắc tố carotenoid 29

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào 32

Bảng 2.3 Thành phần nguyên liệu sử dụng 35

Bảng 2.4 Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm 36

Bảng 2.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2 37

Bảng 2.6 Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh (ppm) 37

Bảng 2.7 Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để tìm thí nghiệm tại tâm 38

Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn phần 38

Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi 39

Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột 43

Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed 47

Bảng 2.12 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng đối chứng 48

Bảng 3.1 Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân lập được 55

Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men

Rhodotorula trên môi trường cơ bản ……… 58

Bảng 3.4 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng saccharose khác nhau 64

Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng nitơ khác nhau 65

Bảng 3.6 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng phospho khác nhau 66

Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng lưu huỳnh khác nhau 67

Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực

nghiệm tối ưu dinh dưỡng 68 Bảng 3.9 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng 69 Bảng 3.10 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh

dưỡng … 69 Bảng 3.11 Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh

dưỡng bổ sung 70 Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các mức độ ẩm ban đầu

khác nhau 72

Bảng 3.13 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các lớp môi trường có độ

dày khác nhau 72 Bảng 3.14 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các tỷ lệ giống khác nhau 73

Bảng 3.15 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực

nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy 74 Bảng 3.16 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện

nuôi cấy ……… 75

Bảng 3.18 Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy 75 Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng beta-carotene, carotenoid tổng theo thời gian LBR 79 Bảng 3.20 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm CR 84 Bảng 3.21 Thành phần acid amin trong chế phẩm βCR… 85 Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR biểu hiện lên chuột 87 Bảng 3.23 Công thức thức ăn gà đẻ sử dụng trong thí nghiệm 91 Bảng 3.24 Kết quả trung bình khảo sát các chỉ tiêu chất lượng trứng qua các tuần thí nghiệm 95 Bảng 3.25 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ở các lô thí nghiệm 97

Sơ đồ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát và thu nhận chế phẩm sinh học CR từ Rhodotorula 33

Sơ đồ 3.1 Tóm tắt quy trình thu nhận chế phẩm βCR 83

Hình (hình, biểu đồ, đồ thị) Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi Rhodotorula glutinis 5

Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt, ánh sáng và bức xạ 7

Hình 1.3 Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid 8

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid 9

Hình 1.5 Quá trình sinh tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin của Rhodoturula 11

Hình 1.6 Sự sắp xếp của cơ chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống lên men bán rắn đối với nấm sợi và vi sinh vật đơn bào 14

Hình 1.7 Thành phần thể tích của dòng khí đi vào và đi ra trong lên men bán rắn 16

Hình 2.1 Gạo tấm và bã đậu nành dùng trong nghiên cứu 34

Hình 2.2 Chuột nhắt trắng dùng trong nghiên cứu 42

Hình 2.3 Gà IsaBrown tại trại thực nghiệm 46

Hình 2.4 Trứng gà đập trên mặt phẳng kính 50

Hình 2.5 Quạt so màu lòng đỏ trứng 51

Hình 3.1 Các nấm men giả định sinh sắc tố carotennoid phân lập được 54

Hình 3.2 Giống nấm men Rhodotorula phân lập được 55

Hình 3.3 Trình tự nucleotid đoạn 28S ADN 59

Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các

phương pháp phá vỡ tế bào 61

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula

theo thời gian 77 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian 78

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và

carotenoid tổng theo thời gian 80 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng

beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung chitinase 81

Hình 3.11 Khay lên men bán rắn Rhodotorula và chế phẩm βCR thu được 82

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng

canxi, phospho trong xương và phospho trong phân của chuột thí nghiệm 88 Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng

hemoglobin, beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột 88 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn năng suất cho trứng (%) của gà qua các tuần khảo

sát 92

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với

năng suất cho trứng 93 Hình 3.16 Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà của lô thí nghiệm và lô đối

chứng 96

MỞ ĐẦU

Nhu cầu phải có thức ăn sạch, an toàn, đảm bảo dinh dưỡng và sức khỏe cộng đồng để cải thiện và phát triển thể lực, trí lực của các thế hệ người Việt trong tương lai là một đòi hỏi cấp thiết cho ngành công nghệ thực phẩm Trong khẩu phần thức ăn của người, ngoài nền tảng tinh bột như cơm, ngô, khoai , lượng đạm cơ bản được cung cấp chủ yếu từ các sản phẩm vật nuôi và cây trồng như thịt, trứng, sữa, rau, đậu, … đặc biệt trong đó là các sản phẩm từ chăn nuôi Theo số liệu thống kê, trong những năm đầu của thế kỷ 21, ước tính tổng giá trị gia cầm đã đóng góp khoảng 5% GDP của Việt Nam [139] Tiềm năng và kỳ vọng đóng góp của ngành chăn nuôi này vào việc cung cấp đủ nhu cầu thức ăn đáp ứng tiêu chuẩn và cho sự phát triển của nền kinh tế đất nước trong tương lai là rất lớn Tuy nhiên, tại Việt Nam, gà đẻ trứng chủ yếu được nuôi bằng nguồn thức ăn tự nhiên sẵn có thiếu hoặc không cân đối về dinh dưỡng hay bằng nguồn thức ăn nhập từ nước ngoài với giá cao [6]

Thức ăn là vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi, nó quyết định trực tiếp đến năng suất, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt, trứng, sữa, Đặc biệt, sắc tố carotenoid là yếu tố cần phải có trong thức ăn Ngoài tác dụng cung cấp chất tiền vitamin A, sắc tố carotenoid còn là chất chống oxi hóa sinh học để bảo vệ tế bào, buồng trứng, làm tăng năng suất và sản lượng trứng [9, 84, 97] Tuy nhiên nguồn thức

ăn thực vật dồi dào tại Việt Nam như tấm, khoai mì, cám, v.v… dùng trong chăn nuôi gia cầm nói chung hay gà đẻ hầu như không có sắc tố carotenoid Do đó, gia cầm bị thiếu sắc tố vàng nên sức đề kháng yếu, dễ sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ và chất lượng trứng kém [9]

Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp carotenoid thì giống nấm men

Rhodotorula có khả năng sản xuất carotenoid [14, 37-39, 55-59] trong đó có

beta-carotene [91, 116] đang được nghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp để làm chất

màu thực phẩm [51] và đã được dùng làm thức ăn chăn nuôi [80, 110]

Luận án: “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp

beta-carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng” được thực

hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy bán rắn dòng vi sinh vật

để sản xuất nguồn thức ăn giàu beta-carotene và sản phẩm này sử dụng có hiệu quả cho chăn nuôi gia cầm đẻ trứng

CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

- Phân lập và chọn từ tự nhiên các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc giống

Rhodotorula có khả năng tổng hợp sinh khối giàu beta-carotene trên môi trường bán

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Tuyển chọn được một chủng nấm men Rhodotorula có khả năng tổng hợp carotenoid

giàu beta-carotene, sinh khối và phytase trên môi trường bán rắn

- Tối ưu thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula

trên cơ chất chính là gạo tấm và bã đậu nành với hàm mục tiêu là hàm lượng carotene, đồng thời đã đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm sinh học có giá trị dinh

beta-dưỡng cao từ nấm men Rhodotorula theo phương pháp bán rắn

- Thử nghiệm dùng chế phẩm làm nguyên liệu bổ sung nuôi gà đẻ trứng cho kết quả tăng năng suất và chất lượng trứng

- Tìm ra phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng trong

thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng IsaBrown

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NẤM MEN RHODOTORULA

1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại

Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật Cách thứ nhất dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá; cách thứ hai dựa vào cơ sở cấu trúc phân tử của tế bào Nấm men thuộc giới

( Regnum) nấm (Fungi) Giới này bao gồm nấm và nấm lớn (hay nấm quả thể) Ước tính

có khoảng 1,5 triệu loài nấm [74] và giới này cho đến nay vẫn còn là điều bí ẩn [106]

Đại diện tiêu biểu của giới nấm là nấm mốc (Mold), nấm men (Yeast) và nấm lớn (Mushroom) Nấm men được chia thành 2 ngành là nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm (Basidiomycota) [15] Trong mỗi ngành (Phylum) có các lớp (Classis), trong mỗi lớp chia thành các bộ (Ordo), trong mỗi bộ chia thành nhiều họ (Familia), trong mỗi họ chia thành nhiều giống (Genus), trong mỗi giống có nhiều loài (Species) và loài là đơn

vị cơ bản của hệ thống phân loại

Năm 1928, Harrison F.C phân lập và định danh được loài Rhodotorula mucilaginosa

và một số loài khác thuộc giống này Sau đó giống nấm men trên được đặt tên là nấm

men Rhodotorula Harrison [54] Theo Harrison, nấm men Rhodotorula có vị trí trong

hệ thống phân loại như sau [129]:

loại của Barnett và cs (1990) hay Kurtzman và Fell (1998) Trong nghiên cứu này, khóa phân loại của Kreger-van Rij (1984) được sử dụng để định danh nấm men Theo khóa phân loại này, nấm men gồm 60 giống, trong đó có 25 giống xếp vào nhóm có

khả năng tạo và không tạo bào tử, và giống Rhodotorula thuộc nhóm này Đặc điểm phân loại của Rhodotorula theo mô tả của Kreger-van Rij như sau [95]:

- Không hình thành bào tử và không sinh sản hữu tính;

- Nẩy chồi theo nhiều hướng;

- Tạo sắc tố đỏ, hồng, cam hay vàng;

- Khuẩn lạc nhầy;

- Không lên men các loại đường;

- Có hay không đồng hóa nitrat NO3- ;

- Không đồng hoá nguồn carbon inositol, đây là nét đặc trưng khác nhau cơ bản

nhất giữa giống Rhodotorula và giống Cryptococcus

Theo Lodder và Kreger-van Rij, cơ sở để xếp Rhodotorula vào một giống riêng là do

sự hiện diện của sắc tố carotenoid có các màu từ vàng đến đỏ bên trong tế bào và không có khả năng đồng hóa nguồn carbon inositol

Thực tế, khóa phân loại của Lodder và Kreger-van Rij được sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam Tuy nhiên, hiện tại phương pháp phân loại nấm men chính xác là phương pháp dựa trên cơ sở vật chất di truyền [75] Theo Swarajit và cs (2001) việc định danh

các loài nấm men thuộc giống Rhodotorula phải trên cơ sở cấu trúc của rARN [143] Guinet F (2007) cho rằng khi định danh giống Rhodotorula nếu chỉ dựa vào kết quả

phản ứng từ bộ test- KIT thì chỉ chính xác khoảng 72% Nếu kết hợp với các quan sát đại thể, vi thể về đặc trưng hình thái, các phản ứng sinh hóa trên thạch đĩa sẽ nâng độ

chính xác lên 87,8% [69] Thực tế hiện nay, một số loài thuộc giống Rhodotorula và

Rhodosporidium tuy có tên gọi khác nhau nhưng có cấu trúc ADN giống nhau [16,

134] Nghiên cứu của Belloch C và cs (2007) cũng kết luận rằng giống Rhodotorula đã

xuất hiện nhiều loài mới và nhiều chủng mới ngay trong cùng một loài do đó khi định

danh nấm men cần phải có sự hỗ trợ của sinh học phân tử để xác định cấu trúc của nhân tế bào [21]

1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Tế bào nấm men Rhodotorula là tế bào sinh dưỡng ở thể đơn bào, quan sát dưới kính

hiển vi có dạng hình tròn, hình oval, tế bào có thể bị kéo dài và bị uốn cong Kích thước tế bào nấm men trung bình khoảng 5µm x 8m [4, 10]

Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi của Rhodotorula glutinis [95]

Thành tế bào nấm men Rhodotorula bao gồm nhiều lớp, thành phần chủ yếu là các

polysaccharid như: 1,3-alpha-glucan; mannan; 1,3-beta-1,6-beta-glucan và chitine

(n-acetyl glucosamine) Các cấu tử tham gia vào cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula

thường khác nhau ở các loài, đa số các loài có thành phần cấu tạo gồm glucose,

mannose, galactose và fucose [18, 95]

Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi gồ ghề, mịn và nhớt Bờ khuẩn lạc Rhodotorula không có răng cưa, có màu từ

kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có khi có màu vàng và đỏ cam thuộc nhóm sắc tố carotenoid [10, 89, 129] Kích thước khuẩn lạc tuỳ thuộc vào thành phần môi trường

dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy Đường kính khuẩn lạc Rhodotorula có thể từ 1 đến

10 mm [109] Trên bề mặt dịch chúng tạo thành các vòng có màu từ vàng đến đỏ [10]

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý

Đa số các loài thuộc giống Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi đa cực, một số loài sinh sản theo kiểu nẩy chồi có cực Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu

phân đôi nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản theo kiểu hữu tính [3, 18] Nấm men Rhodotorula không hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả

nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4, 10]

Theo Phaff và cs (1969), khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý

quan trọng dùng trong phân loại của các giống Rhodotorula và Cryptococcus [117]

1.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Ngoài các đặc điểm sinh hoá dùng để phân loại giống nấm men Rhodotorula theo

Kreger-van Rij (mục 1.1.1.), nấm men này còn có một số đặc điểm sinh hóa sau:

- Không tạo ra acid acetic [91];

- Sinh enzyme urease [91];

- Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau [121];

- Đồng hóa tốt các hydrocarbon dầu mỏ [10, 91, 122]

- Không sinh enzyme amyloglucosidase và cellulase [93, 121];

- Không hình thành hợp chất loại tinh bột [18, 95];

- Sinh tổng hợp enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [16, 60, 96, 153, 155];

- Có chứa enzyme khử bão hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid oleic (C18:1) thành acid linolenic (C18:3) [154]

1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

1.1.4.1 Sơ lược về carotenoid

Các carotenoid chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật nhưng có chức năng sinh lý đặc hiệu đối với cơ thể người và động vật Số lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 loại với các màu sắc khác nhau Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20) Sau đó, chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40 Do đó các carotenoid còn được gọi là tetraterpenoid [35]

Các carotenoid được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dưới dạng các chất màu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cá hồi [34], gia cầm [84] Trong số hàng trăm loại carotenoid được biết thì beta-carotene được xem là tiền chất cao nhất của vitamin A [20] Phân tử beta-carotene có cấu tạo cân đối, được hình thành do một chuỗi prolene

và 2 vòng beta-ionone ở hai đầu, khi thủy phân cho hai phân tử vitamin A Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, ánh sáng và bức xạ, beta-carotene bị mất màu do xảy ra quá trình chuyển hóa như hình 1.2

Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và bức xạ [35]

1.1.4.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men

Nấm men sinh tổng hợp sắc tố carotenoid qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu sinh tổng hợp các isoprenoid gồm dimethyallyl-pyrophosphat (DMAPP) và isopentenyl-5-pyrophosphat (IPP) từ acetyl-CoA Giai đoạn tiếp theo, DMAPP và IPP sẽ tham gia vào quá trình sinh tổng hợp carotenoid [137, 144]

- Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp isoprenoid (DMAPP và IPP)

Sau phát minh ra con đường mevalonate về quá trình sinh tổng hợp isopenoid ở sinh vật [20], các tác giả Boll M và cs (1975) [32], Trocha và cs (1976) [146], Ratledge (1982) [119], Servouse M và cs (1986) [132] khẳng định quá trình sinh tổng hợp isoprenoid IPP của nấm men cũng theo hướng mevalonate Nghiên cứu của Chappell (1995), McGarvey và Croteau (1995) về quá trình đồng phân hóa isoprene (C5)chuyển IPP thành DMAPP do enzyme isomerase xúc tác cho thấy tất cả các sinh vật từ vi khuẩn đến người đều tổng hợp các isoprenoid theo con đường mevalonate [20, 36, 41,

82] Theo Ratledge C (2002) [119], giống Rhodotorula và Rhodosporidium sinh tổng

hợp carotenoid theo hướng mevalonate Như vậy, con đường sinh tổng hợp tiền chất

isoprenoid ở Rhodotorula diễn ra như hình 1.3

Hình 1.3 Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid [20]

Nghiên cứu của Rohmer và cs (1993) [127], tiếp đến là của Broers (1994) [36], Schwarz (1994) cho rằng vi khuẩn, thực vật tổng hợp diệp lục tố và sinh vật quang

dưỡng còn có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo hướng mevalonate

(non-mevalonate pathway) Các nghiên cứu tiếp theo của Lichtenthaler và cs (1997, 1999),

Eisenreich và cs (1998, 2001), Rohmer (1999) đã khẳng định thực vật và vi sinh vật trong nhiều trường hợp có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo hướng

mevalonate Do đó, con đường non-mevalonate còn có tên gọi là Rohmer pathway – tên của chính tác giả tìm ra và sau này đổi tên thành methylerythritol 4-phosphat

pathway (MEP pathway) [127] Hiện tại chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên

cứu nào cho khẳng định rằng quá trình sinh tổng hợp isoprenoid ở nấm men xảy ra theo hướng non-mevalonate

- Giai đoạn 2: Sinh tổng hợp carotenoid từ DMAPP và IPP

Ở giai đoạn này (như hình 1.4), các isoprenoid DMAPP và IPP (còn gọi là hemiterpenes – C5) tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp GGPP Hai phân tử GGPP kết hợp tạo ra carotenoid (tetraterpenes – C40) có tên là phytoene, phân tử này không màu Quá trình khử phytoene sẽ hình thành lycopene, là một chuỗi các nối đôi

liên hợp có màu đỏ Lycopene bị đóng vòng để hình thành beta-carotene có màu vàng

[41, 83]

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [83]

Chú thích: IPP- isopentenyl diphosphat, acetyl-CoA - acetyl coenzym A, HMG-CoA-

3-hydroxi-3-methylglutaryl coenzym A, DMAPP- dimethylallyl diphosphat; FPP- farnesyl diphosphat, GPP- geranyl diphosphat, GGPP- geranylgeranyl diphosphat

Sự hình thành các carotenoid của nấm men xảy ra theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất bão hòa giống các sinh vật tổng hợp carotenoid khác Theo Daisuke Umeno và cs (2003) [43], các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp carotenoid không được phân loại cụ thể bằng cách dựa vào cơ chất Theo Simpson và cs (1964) [137], Kocková (1990) [89], Visser H và cs (2003) [152] từ phytoene sẽ xảy ra các quá trình khử, tạo vòng và oxi hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt và các quá trình này ở nấm men có thể xảy ra theo nhiều hướng khác nhau

1.1.4.3 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để

phân loại giống Rhodotorula [18, 19, 91, 95] Carotenoid hình thành được kết hợp với màng tế bào và chỉ tồn tại bên trong tế bào Các sắc tố carotenoid ở Rhodotorula có

khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng rộng từ 450 đến 550 nm [39] Theo Kocková

và cs [89], các carotenoid có tác dụng bảo vệ tế bào nấm men chống lại ảnh hưởng có hại của tia cực tím Cường độ màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với các giống men trắng khi chúng sống ở các vùng địa lý có tia cực tím mạnh Tuy nhiên, khi cường độ bức xạ quá cao, các carotenoid không còn khả năng che chở cho tế bào

Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp [116]

Chủng nghiên cứu Các carotenoid thu được

I II III IV V VI VII VIII IX X

Chú thích: I- beta-carotene, II- beta-zeacarotene, III- torulene, IV- torularhodin, V-

plectaniaxanthin, VI- hydroxyplectaniaxanthin, VII và VIII- dẫn xuất của torulene, IX- chưa xác định, X- beta-carotenone

Các carotenoid do Rhodotorula tổng hợp nên chủ yếu là -carotene, -carotene,

torulene và torularhodin [59], trong đó torulene thường chiếm tỷ lệ cao hơn [91] Tuy

nhiên, Buzzini và cs (2000) [38] khi nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid

của Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ

khác nhau lại thu được các carotenoid chính là -carotene, torulene và torularhodin, trong đó torularhodin luôn chiếm tỷ lệ cao hơn Theo Sakaki H và cs (2000) [130],

khi hàm lượng torularhodin tăng khả năng chịu đựng của tế bào nấm men Rhodotorula

với các quá trình oxi hóa sẽ tăng lên

Perrier V và cs (1995) [116] khi khảo sát thành phần các sắc tố có trong 13 chủng

Rhodotorula đã tìm thấy từ 1 đến 10 sắc tố thuộc nhóm carotenoid (như trình bày ở

bảng 1.1) Kết quả của nghiên cứu này cho thấy sắc tố beta-carotene luôn hiện diện

trong các chủng Rhodotorula khảo sát và tác giả đã đưa ra kết luận rằng beta-carotene

diễn ra theo 3 giai đoạn như hình 1.5 Như vậy, 2 giai đoạn đầu của quá trình sinh tổng

hợp carotenoid của Rhodotorula diễn ra như 2 giai đoạn đã trình bày ở trên Riêng giai

Hình 1.5 Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin của Rhodoturula [59]

đoạn 3 là giai đoạn tổng hợp các carotenoid từ phytoene, phytoene được chuyển thành lycopene Lycopene được xem là tiền chất để tổng hợp nên -carotene và torulene, sau

đó torulene sẽ tham gia quá trình khử và oxi hoá nhờ sự xúc tác của enzyme oxidase để hình thành nên torularhodin

Bảng 1.2 Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm

TT Tên nấm men Carotenoid tổng Beta-carotene Nguồn tài liệu tham khảo

6 Rh rubra NRRL Y 15596 1,91 0,13 - Shih và Hang, 1996 [135]

7 Rh gracilis ATCC 90950 - 0,54 Govindaswamy và cs, 1999 [65]

8

Rh glutinis

DBVPG 3853 4,99 0,83 16

Buzzini và cs, 2000 (trên môi trường CGM ở 25oC) [38]

9 Rh glutinis DBVPG 3853 6,9 - 12 Buzzini và cs, 2001 (nuôi gián đoạn) [39]

10 Rh glutinis DBVPG 3853 8,2 - 14 Buzzini và cs, 2001 (nuôi bán liên tục) [37]

11 Rh rubra GED2 12,1 - 46,6 Frengova và cs, 2003 [56]

12 Rh rubra GED5 19,2 - 31,67 Frengova và cs, 2004 [57]

13 Rh glutinis K 50T - - 35 Bong[33] K Kim và cs, 2004

14 Rh rubra GED 8 13,37 0,498 51,1 Frengova và cs, 2006 [58]Hiện tại đã có rất nhiều công bố khoa học về khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của

nấm men Rhodotorula Các công trình đã công bố được thu thập, tóm tắt và trình bày

ở bảng 1.2 Mục tiêu của các nghiên cứu trên nhằm nâng cao hàm lượng beta-carotene

trong sinh khối tế bào bằng các biện pháp như phân lập, tuyển chọn [20, 58] cải tạo giống, gây đột biến [25-27], tối ưu thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm

men [36, 56, 114, 145] Các nghiên cứu nuôi kết hợp Rhodotorula với một vi sinh vật

khác có khả năng lên men, thủy phân tinh bột hay có hệ enzyme có khả năng thủy phân thành tế bào trên các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế phụ phẩm của ngành công

nghệ thực phẩm [37, 133] Một số dự án nghiên cứu dùng nấm men Rhodotorula để

sản xuất sắc tố đỏ cam [51], sắc tố beta-carotene [91] hay chất béo [115] đã thành công

và đang ở giai đoạn phát triển dự án để từng bước đưa quy trình sản xuất vào quy mô công nghiệp

1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula

1.1.5.1 Sinh tổng hợp phytase

Theo Bindu S và cs (1998) [30], nấm men Rhodotorula gracilis có khả năng sinh tổng

hợp phytase Enzyme này rất cần thiết cho dinh dưỡng của gà [101, 156]

1.1.5.2 Sinh tổng hợp chất béo

Ngoài các đặc điểm sinh hóa như trình bày ở mục 1.1.3, Rhodotorula còn được ghi

nhận là giống nấm men có khả năng sinh tổng hợp acid béo cao Chúng được xếp vào

nhóm nấm men tổng hợp chất béo cùng với Saccharomyces và Lypomyces (Hunter và Rose, 1971; Rattray và cs, 1975) [70] Theo Khaled M và cs (1990) [87] Rhodotorula

glutinis là nấm men tổng hợp chất béo cao nhất trong các giống nấm men Nguồn dầu

do các giống nấm men dầu (oleaginous yeast) trong đó có Rhodotorula tổng hợp ra được gọi là single-cell oils Chất béo và các acid béo do Rhodotorula tổng hợp có

thành phần khác nhau tùy nhiệt độ và môi trường nuôi cấy Theo Ratledge C (2002)

[119], Rhodotorula gracilis có khả năng tích luỹ tới 65% chất béo và các nấm men

Rhodotorula spp có khả năng tổng hợp chất béo rất cao, có thể đạt 40 đến 70% trọng

lượng tế bào khô Nguồn cơ chất thường dùng trong sinh tổng hợp chất béo của

Rhodotorula là glycerol [99], dịch chiết than bùn [100], hay các hydrocarbon dầu mỏ

[9, 91, 120] nên nấm men này đã được sử dụng trong xử lý dầu loang [7, 14, 122]

Theo Somashekar D (2000) [140] thành phần chất béo và carotenoid do nấm men

Rhodotorula tổng hợp có mối tương quan với nhau và tuỳ thuộc vào tỷ lệ C/N trong

môi trường nuôi cấy Chất béo có trong Rhodotorula thường là các triacylglycerol

[119], trong đó các acid béo có mạch carbon từ C7 đến C18, các acid béo không no như acid oleic (C18:1), acid linoleic (C18:2, n-6) và acid linolenic (C18:3, n-3) chiếm tỷ lệ

cao [147] Đặc biệt, Rhodotorula có chứa các enzyme khử bão hoà (desaturase) có khả

năng chuyển hóa acid oleic thành acid linoleic và acid linolenic [154]

1.1.5.3 Sinh tổng hợp protein đơn bào (SCP: Single Cell Protein)

Nấm men Rhodotorula có khả năng sử dụng nguyên liệu dầu mỏ làm nguồn cơ chất để tổng hợp protein [10, 122] Sinh khối nấm men Rhodotorula sau khi đã trích ly sắc tố

là một nguồn nguyên liệu giàu protein an toàn được dùng trong thức ăn chăn nuôi

(Jacob, 1991) [80], Naidu và cs (1988) [110]

1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN

1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn (LBR)

Lên men trên môi trường bán rắn hay trên cơ chất rắn là một quá trình trong đó sự sinh trưởng và sự hình thành sản phẩm do vi sinh vật sinh tổng hợp trên bề mặt của nguyên liệu Môi trường nuôi cấy hầu như không có mặt nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ trong các hạt hay trong mạng cơ chất rắn.Quá trình LBR thực chất là sự phát triển của vi sinh vật xảy ra trong các phần tử rắn nhỏ và ẩm của lớp cơ chất Cơ chất rắn sử dụng trong LBR thường là những nguyên liệu hữu cơ hỗn hợp không đồng

Hình 1.6 Sự sắp xếp của cơ chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống LBR đối với

(a) nấm sợi; (b) vi sinh vật đơn bào (theo Moo-Young và cs, 1983) [107]

nhất Moo-Young và cs (1983) [107] đã mô tả khái quát sự phân bố của nấm sợi và các sinh vật đơn bào trong các hạt cơ chất rắn ẩm của LBR như hình 1.6 LBR thường tiến hành trên các khay, các túi nhựa hay các ống hình trụ và không nhất thiết phải thanh trùng môi trường Quá trình LBR cho đến nay vẫn chưa được hiểu thấu đáo về các quy luật của kỹ thuật sinh học, hóa sinh, vi sinh và sinh học phân tử [151].

Raimbault và cs (1979) [118] cho rằng LBR dựa vào các cơ chất hữu cơ tự nhiên, các

cơ chất rẻ tiền chủ yếu là nguồn thực vật giàu carbohydrat nhưng nghèo protein và thường là các phế phụ phẩm của ngành công nghệ thực phẩm Nguyên liệu sử dụng nhiều nhất là bã sắn, kế đến bã khoai tây, bã chuối, bã mía, bã củ cải đường, Do đó,

kỹ thuật LBR đã góp phần làm giảm đáng kể lượng các chất thải ra môi trường đồng thời cũng mang lại lợi nhuận đáng kể về mặt kinh tế

Sự không đồng nhất của cơ chất rắn được xem là nhược điểm của LBR Khi thu hồi sản phẩm từ công nghiệp sản xuất các acid hữu cơ, enzyme, các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bằng kỹ thuật LBR thường sót lại phần chất cơ rắn dư không lên men Phần vật liệu này có hoạt tính probiotic có thể dùng trực tiếp làm thức ăn chăn nuôi hay là nguyên liệu phối trộn trong công nghệ sản xuất thức ăn hỗn hợp [77]

Sự khác biệt chính giữa LBR và lên men chìm có liên quan đến các tính năng lý- hoá khác nhau như là: a) sự đảo trộn và khuếch tán của cơ chất và sản phẩm trong sinh khối

ở LBR ít hơn nhiều; b) khả năng hoà tan và khuếch tán của oxi cùng các khí không phân cực khác trong LBR mạnh hơn; c) nhiệt lượng tiêu tốn cho LBR ít hơn; d) lượng nước thải ra trong LBR ít hơn so với lên men chìm Những điểm khác biệt này được xem như là các mặt thuận lợi và hạn chế của LBR so với lên men chìm Kết quả của nhiều nghiên cứu đã cho thấy được chất lượng khác nhau giữa LBR và lên men chìm

Sự khác nhau này là do đặc điểm sinh lý của vi sinh vật không tuân theo một quy luật chung mà phụ thuộc vào từng quá trình nuôi cấy, đặc biệt là trong một số các trường hợp liên quan đến việc sản xuất các bào tử nấm, enzyme và các sản phẩm trao đổi chất bậc hai [151]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn

Vấn đề khó khăn thường gặp trong LBR là quá trình khuấy trộn môi trường, trao đổi nhiệt, thông khí và quá trình kiểm soát độ ẩm, độ pH Đây chính là các yếu tố làm cho LBR có phần nào hạn chế khi đưa ra ứng dụng theo quy mô công nghiệp [107]

1.2.2.1 Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước

Lượng nước sử dụng trong LBR rất thấp Điều này có ý nghĩa thực tiễn cao trong công nghiệp do giảm được lượng nước thải rất nhiều so với lên men chìm [118] Trong LBR,

có thể xem sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trên cơ chất rắn không có sự hiện diện của nước tự do Nước trong hệ thống tồn tại ở dạng liên kết với cơ chất hoặc

ở dạng liên kết hấp phụ hay liên kết mao quản trong cơ chất Độ ẩm trong LBR ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của vi sinh vật Không có mức độ ẩm tối ưu cho tất cả các loại cơ chất và vi sinh vật Thông thường độ ẩm thay đổi từ 30 đến 85% [151] Trong LBR, hàm lượng nước tối ưu của môi trường cơ chất mà vi sinh vật phát triển

được thể hiện bằng thông số hoạt độ (water activity- a W) Việc giảm aW sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha lag kéo dài, giảm tỷ lệ tăng trưởng và cuối cùng là hàm lượng sinh khối thu được sẽ thấp (Oriol và cs, 1988) [113]

1.2.2.2 Nhu cầu oxi

Trong LBR, việc đảm bảo sự thoáng khí nhằm duy trì điều kiện hiếu khí, đẩy khí CO2

ra khỏi môi trường, duy trì nhiệt độ cho môi trường cơ chất và điều hòa độ ẩm Điều kiện này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp sinh khối, enzyme và đặc biệt

là sắc tố đối với các vi sinh vật sinh tổng hợp sắc tố

Hình 1.7 Thành phần thể tích của dòng khí đi vào và đi ra trong LBR [107]

Do cơ chất ở trạng thái rắn nên oxi được lưu chuyển và khuếch tán đến bề mặt của chúng một cách dễ dàng Việc sục khí trong LBR sẽ làm tăng khả năng khuếch tán của không khí vào môi trường cơ chất nhằm đảm bảo việc cung cấp oxi Khi cung cấp không khí vào hệ thống LBR thì thành phần khí khi đi vào và đi ra khỏi hệ thống được

mô tả như hình 1.7 [107]

1.2.2.3 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt

Nhiêt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến quá trình LBR Do đó việc làm giảm nhiệt độ của cơ chất trong quá trình LBR ở quy mô công nghiệp là nhiệm vụ rất cần thiết Do cơ chất rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo

ra một gradient về nhiệt Khi cơ chất rắn tích tụ nhiệt sẽ làm tăng hàm lượng ẩm và gây khó khăn cho quá trình truyền nhiệt Vấn đề duy trì nhiệt và hàm lượng ẩm ổn định trong LBR ở quy mô công nghiệp đang là bài toán nan giải trong kỹ thuật Tuy nhiên, người ta cũng có thể thực hiện được với các thiết bị chuyên dùng đặc biệt [107, 151]

1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn

Việc nghiên cứu động học của hệ thống LBR là vấn đề rất phức tạp Trong LBR tồn tại hỗn hợp gồm 3 pha: pha rắn (chất hữu cơ, khoáng chất hay các chất tổng hợp), pha chìm và pha khí Vi sinh vật hiện diện trong cả 3 pha này (Durand và Chereau, 1988) [52] Do đó, khác với lên men chìm, việc xác định trực tiếp sinh khối trong LBR sẽ rất khó khăn do gặp trở ngại trong việc tách vi sinh vật ra khỏi môi trường không đồng nhất Dưới đây là một số phương pháp xác định sinh khối của quá trình LBR

1.2.3.1 Phương pháp xác định sinh khối trực tiếp

Trong LBR các vi sinh vật thuộc nhóm đơn bào, người ta có thể dùng phương pháp xác định sinh khối trực tiếp Do tế bào không bám sâu vào cơ chất rắn nên ta dễ dàng tách chúng ra khỏi cơ chất rắn bằng cách trộn vào nước, sau đó dùng các phương pháp cổ điển (phương pháp xác định tổng số tế bào, khuẩn lạc, …) để xác định sinh khối (Sato

và cs, 1985) Tuy nhiên đối với quá trình LBR, không có phương pháp xác định sinh khối trực tiếp dựa vào đường chuẩn [52]

1.2.3.2 Phương pháp xác định sinh khối gián tiếp

Hiện nay, các nhà khoa học đã công bố nhiều phương pháp gián tiếp khác nhau để xác định sinh khối bằng cách phân tích các yếu tố trung gian như:

- Glucosamine (glucosamine từ chitin, Narahara và cs, 1982) [112];

cơ chất, … cũng có thể được sử dụng như yếu tố trung gian để xác định khả năng hình thành sinh khối, trong đó:

- Phương pháp xác định hàm lượng ATP trong canh trường LBR [22]

- Phương pháp xác định hàm lượng ADN dựa trên cơ sở là sự không đổi của hàm lượng ADN có trong tế bào Tuy nhiên có nhược điểm là khó đảm bảo tính đại diện của mẫu và sự tích luỹ hàm lượng ADN của tế bào Nhược điểm khác là tốn nhiều thời gian tách chiết, tinh sạch và thực hiện các thủ thuật trong xác định hàm lượng ADN [107] Ngoài ra, còn có phương pháp xác định hệ số hô hấp, phương pháp đo sự giảm áp, phương pháp dựa vào các cơ quan phát triển tại các đỉnh phân nhánh của hệ sợi nấm, phương pháp cân bằng khối lượng, cân bằng nước và cân bằng nhiệt

Tóm lại, trong LBR không có phương pháp phổ biến chung để xác định sinh khối Theo Graciele và cs [67, 68], không có phương pháp nào được xem là thích hợp cho mọi trường hợp Vấn đề quan trọng là xác định đúng mục đích nghiên cứu để chọn tiêu chuẩn đánh giá phù hợp Trong nhiều nghiên cứu và ứng dụng, không cần thiết phải

xác định tổng hàm lượng sinh khối nhưng khi tính toán hiệu suất, tối ưu một sản phẩm trao đổi chất nào đó, đặc biệt là sản phẩm trao đổi chất bậc hai thì việc xác định sinh khối là rất cần thiết [52]

1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula

Carr và cs (1979-1980) khi khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như độ thoáng khí, độ

pH, nồng độ ethanol và nồng độ cơ chất thích hợp cho quá trình lên men cacao cho rằng trong tự nhiên có nhiều nấm men có khả năng lên men cacao, trong số đó có

Rhodotorula spp Từ kết quả nghiên cứu này, Carr đưa ra kết luận là nấm men Rhodotorula spp có khả năng LBR [121]

Nghiên cứu của Jacob (1991) [80] khi LBR nấm men Rhodotorula gracilis trên môi

trường cơ chất là cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có thể tóm lược như sau: Hàm lượng lipid trong môi trường cơ bản ban đầu (gồm cám mì, mật rỉ có bổ sung khoáng chất) là 3,5% Sau lên men hàm lượng lipid tăng lên đến 69,8% Sản phẩm sau LBR chứa sắc tố carotenoid, tiền vitamin B12, giàu chất béo và nhiều acid béo không bão hòa đã được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Kaur B và cs (2009) [86] đã tiến hành LBR để xác định hàm lượng carotenoid do

Rhodotorula rubra MTCC 1446 tổng hợp khi nuôi cấy bề mặt trên môi trường thạch

MYEBCW chứa 1,5% (w/v) agar, với MYEB (malt extract: 3 g/l, peptone: 5 g/l, yeast

extract: 3 g/l, glucose: 10 g/l) được bổ sung 10% v/v nước dừa (CW: coconut water) Qua các tài liệu tổng kết được cho thấy nghiên cứu về LBR nấm men Rhodotorula trên

thế giới rất ít và chủ yếu là các nghiên cứu về lên men chìm Dưới đây là tóm tắt sơ

lược qua các yếu tố chính có ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula

1.2.5.1 Ảnh hưởng của nguồn giống

Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật là vấn đề rất quan trọng Đặc biệt, với nấm

men Rhodotorula là giống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid không giống nhau

giữa các chủng giống (xem bảng 1.2) Khả năng này phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính

di truyền của chủng giống dùng trong nghiên cứu [116]

Ngoài đặc tính di truyền của chủng giống, quá trình nuôi cấy vi sinh vật còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy Từ trước đến nay nấm men

Rhodotorula chủ yếu được nghiên cứu nhiều theo kỹ thuật lên men chìm, rất ít nghiên

cứu đã công bố về khả năng phát triển trên môi trường rắn của nấm men này Do đó,

trên cơ sở tài liệu hiếm hoi thu được từ các quá trình LBR, trong luận án này chỉ tổng

kết sơ lược các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm của Rhodotorula

1.2.5.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

- Ảnh hưởng của nguồn carbon

Theo Martin (1993) [100], thành phần môi trường để vi sinh vật sinh tổng hợp sắc tố không phụ thuộc vào việc nuôi cấy nhằm mục đích trích ly sắc tố hay thu sinh khối cực đại Tuy nhiên cũng có nhiều công bố cho rằng nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển, tổng hợp sắc tố, thành phần sắc tố và thành phần các acid béo của

Rhodotorula [14, 48, 66] Theo Müncnerová D và Augustín J.nhiều loài thuộc giống

Rhodotorula có thể sử dụng được nguồn carbon là benzoate [109] hay glycerol [99] Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydrocarbon mạch dài [91, 122], cũng

như dễ dàng đồng hóa nguồn glucid từ các phế phụ phẩm của ngành công, nông nghiệp thực phẩm [14] như: bột mì, bột bắp, dịch chiết bột đậu nành, dịch chiết bột ngô [37-

39, 144], nước sữa tách ra từ công nghệ sản xuất pho mát [55-57, 136], nước muối dưa cải [135], nước chiết than bùn [100], rỉ đường mía [27], rỉ đường củ cải [87], nước ép nho [38]

Như vậy, nấm men Rhodotorula có khả năng sử dụng nhiều nguồn glucid khác nhau

Đặc biệt là khả năng sử dụng nguồn carbon mạch dài và thực tế Jacob (1991) đã dùng

cám mì để LBR nấm men Rhodotorula gracilis [80] Đây chính là cơ sở để gạo tấm đã

qua hồ hoá (có bổ sung dưỡng chất) được chọn làm cơ chất chính cho quá trình LBR chủng nấm men nghiên cứu

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula và

sự ảnh hưởng này còn tùy thuộc vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ của từng chủng giống [89] Theo Khaled M và cs (1990) [87] hai nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng lớn

đến khả năng tổng hợp carotenoid tổng của Rhodotorula là NH4NO3 và (NH4)2SO4

Khi Rhodotorula sử dụng nitơ ở dạng NH4+ sẽ kích thích quá trình tích lũy sinh khối cực đại Trong khi đó nitơ ở dạng NO3- sẽ cho hiệu suất thu hồi sinh khối chỉ ở mức trung bình nhưng hàm lượng carotenoid tổng tăng lên rất lớn Ngược lại, nguồn nitơ hữu cơ như: glycine, valine, asparagine và leucine không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp carotenoid [129] Tỷ lệ C/N thích hợp từ 30 đến 50 [66, 129, 147]

- Ảnh hưởng của khoáng chất

Giống Rhodotorula thích hợp với môi trường nước biển [24] và môi trường muối kim loại kiềm [88] Một số loài thuộc giống Rhodotorula bị ức chế ở nồng độ muối trên

5%, trong trường hợp này khả năng lên men của các nấm men càng thấp khi ở nồng độ muối càng cao [122] Theo Bhosale P và Grade R.V [29], khi nuôi cấy chủng đột biến

Rhodotorula glutinis mutant 32 cần được cung cấp thêm K2HPO4, KH2PO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường Tuy nhiên, thực tế nguồn khoáng cần bổ sung vào môi trường dinh dưỡng phụ thuộc nhiều vào nguồn cơ chất [87]

- Ảnh hưởng của các chất khác

Ngoài các nguồn dinh dưỡng chính như carbon, nitơ và khoáng chất các nấm men dầu cần bổ sung thêm các nguyên liệu chứa chất béo (gồm các loại dầu và các acid béo) để tích luỹ chất béo [89] Khaled M và cs cho rằng các loại dầu thực vật như dầu hạt bông, dầu ôliu, dầu bắp và dầu thầu dầu đều làm tăng đáng kể khả năng tổng hợp chất béo, trong đó dầu hạt bông được xem là có tác dụng cao nhất [87] Bên cạnh đó, một số chất được ghi nhận có tác dụng làm tăng hàm lượng carotenoid như:

- Phenol với nồng độ 500 ppm làm tăng hàm lượng beta-carotene lên đến 35%, giảm lượng torularhodin trong khi hàm lượng torulene hầu như không đổi [33]

- 2-(4-chlorophenyl)- triethylamine (CPTA) có tác dụng kích thích quá trình chuyển hóa vòng của các carotenoid như quá trình tạo vòng trực tiếp từ lycopene thành -carotene dẫn đến tăng hàm lượng beta-carotene [73]

1.2.5.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nấm men Rhodotorula thường phát triển ở nhiệt độ từ 25 đến 30oC và khoảng nhiệt độ thích hợp là 27 đến 28oC [19] Ở nhiệt độ 30oC, nếu có chiếu sáng vào cuối giai đoạn tăng trưởng logarith sẽ làm tăng lượng beta-carotene đồng thời giảm lượng torulene và torularhodin Khi hạ nhiệt độ từ 30oC xuống 25oC hàm lượng beta-carotene thu được tăng cao như ở bảng 1.3 Ở nhiệt độ 40oC, nấm men Rhodotorula hầu như không phát

triển [89, 91, 129] Sau đây là một kết quả minh hoạ:

Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau

120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau [38]

Carotenoid tổng(g/g tế bào khô)

Các sắc tố carotenoid (% carotenoid tổng)

-carotene Torulene Torularhodin

25 4,99 831,7 16,0 18,0 60,1

- Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của nấm men Rhodotorula khác nhau tùy từng

loài, chủng và thông thường ở khoảng pH hơi acid từ pH 5 đến 6 Tuy nhiên, giá trị pH

này còn phụ thuộc vào thành phần môi trường và nhiệt độ nuôi cấy [109]

- Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng hình thành carotenoid cũng như thành phần carotenoid của nấm men [89] Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn: giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ), giai đoạn tổng hợp các enzyme (giai đoạn này xảy ra trong tối) và giai đoạn tổng

hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng [129] Tuy nhiên, theo Tada Mikiro (1982) [144] mức độ hình thành carotenoid phụ thuộc vào cường độ chiếu sáng và qua hai giai đoạn Giai đoạn đầu xảy ra phản ứng quang hóa không phụ thuộc vào nhiệt độ nhưng rất cần ánh sáng và giai đoạn thứ hai xảy ra các phản ứng hóa sinh không phụ thuộc vào ánh sáng Thực tế, cường độ chiếu sáng có liên quan đến nhiệt độ nuôi cấy Khi

nuôi nấm men Rhodotorula ở nhiệt độ 30oC, hàm lượng beta-carotene giảm đáng kể nhưng nếu nấm men được chiếu sáng vào cuối giai đoạn phát triển logarith kết quả lượng beta-carotene sẽ tăng 58% so với khi không chiếu sáng Ngược lại, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp (khoảng 20oC), hàm lựơng beta-carotene thu được khi nấm men được và không được chiếu sáng tăng (chênh lệch) không đáng kể [129]

- Ảnh hưởng của oxi

Quá trình tổng hợp carotenoid rất cần đến sự tạo thành của các hợp chất có tính oxi hóa cao do đó rất cần oxi [20] Không khí đóng vai trò rất quan trọng, có liên quan đến sự hình thành sắc tố ở nấm men và các vi sinh vật khác [35, 152] Không khí còn có vai trò trong việc phân chia thành từng vùng của sắc tố trong quá trình sinh tổng hợp

carotenoid của tế bào sinh vật [63] Như vậy, quá trình sinh trưởng của Rhodotorula rất

cần đến không khí, vì ngoài việc cung cấp oxi giúp tế bào hô hấp nó còn giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men

1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GÀ ĐẺ TRỨNG

Chất dinh dưỡng là các chất có trong thức ăn mà cơ thể sử dụng để duy trì các hoạt động của cơ thể, giúp gia cầm khỏe mạnh và tăng trưởng Nhu cầu dinh dưỡng cho gia cầm rất phức tạp, phụ thuộc vào giống, loài, tuổi, giới tính Trong từng giống, loài tùy theo giai đọan phát triển khác nhau mà nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Cân đối nhu cầu và thành phần các chất dinh dưỡng cần thiết trong khẩu phần của gia súc, gia cầm

là biện pháp quan trọng nhằm tăng năng suất và hiệu quả trong chăn nuôi [8, 79]

Có hơn 40 hợp chất và nguyên tố là các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sống, tăng trưởng và sinh sản của gia cầm Dựa vào thành phần hóa học và chức năng, các chất dinh dưỡng cần thiết cho gia cầm được chia thành 6 nhóm hợp chất khác nhau là nước,

protein, glucid, lipid, vitamin và khoáng chất Để duy trì tốt sức khỏe và các hoạt động của cơ thể, trong thức ăn gia cầm phải có đủ 6 nhóm trên với tỷ lệ thích hợp Nếu thiếu hụt một trong các nhóm trên thì sự tăng trưởng, sinh sản, chất lượng vỏ trứng, sản lượng trứng, sản lượng thịt, … có thể giảm đáng kể [44-47]

Hiện có rất nhiều tài liệu tổng quan về vai trò, thành phần, nhu cầu dinh dưỡng cũng như nguồn nguyên liệu dùng trong dinh dưỡng gia cầm [8, 9, 12, 93-94] Trong luận án này chỉ trình bày về vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin, vai trò của sắc tố carotenoid và vai trò của phytase đối với gia cầm đẻ trứng

1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin

1.3.1.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin

Protein thuộc nhóm chất dinh dưỡng sinh năng lượng chiếm tỷ lệ thứ hai sau các chất glucid (đường, bột) Protein là nguồn nguyên liệu chính để gia cầm sản xuất ra các sản phẩm thịt, trứng cung cấp nguồn thực phẩm giàu protein cho con người Đối với gà, giai đoạn đẻ trứng khẩu phần phải có 18 đến 19% (theo Klg) protein thô và gà phải ăn được 100 đến 110 g/mỗi ngày [8, 79, 101]

Thực chất gia cầm cần acid amin trong thức ăn dưới dạng protein chứ không cần protein Nhu cầu acid amin và nhu cầu protein thô trong thức ăn có mối quan hệ mật thiết với nhau [105] Có 11 loại acid amin thiết yếu ở gia cầm gồm methionin, lysin, threonin, tryptophan, phenylalanin, leucin, isoleucin, valin, histidin, arginin và glycin Trong đó, 4 loại thường có giới hạn trong thức ăn theo thứ tự (có giới hạn nhiều đến ít)

là methionin, lysin, theonin và tryptophan Trong thực tiễn khi cân bằng các acid amin thiết yếu ở gia cầm, các acid amin giới hạn này có vai trò quan trọng, quyết định sự tổng hợp protein trong cơ thể Cơ thể chỉ tổng hợp protein từ một mẫu acid amin cân đối Bổ sung acid amin giới hạn để tạo sự cân đối, nếu bổ sung acid amin không giới hạn thì làm mất sự cân đối [93] Khi các acid amin thiết yếu được cân đối giữa chúng với nhau và giữa chúng với mức năng lượng được cung cấp thì nhu cầu protein thô trong thức ăn gia cầm sẽ giảm nhất là khi thời tiết nóng [123] Đồng thời khi khẩu phần thức ăn được bổ sung các acid amin giới hạn trên sẽ cải thiện được sức đẻ trứng của gà

[9] Người ta thường bổ sung acid amin cho gà từ nhiều nguồn protein khác nhau như bột cá, bột thịt xương, bột máu, đậu tương, khô dầu và sinh khối vi sinh vật, … [12] Dựa vào nhu cầu dinh dưỡng, người ta đã xây dựng một khẩu phần ăn cho gà đẻ trứng [79] (Xem các dạng năng lượng ở phụ lục 5.1.5 và khuyến cáo về tỷ lệ tối đa của một

số nguyên liệu trong thức ăn hỗn hợp cho gia cầm ở phụ lục 5.1.6 [12])

1.3.1.2 Sự đáp ứng nhu cầu protein của nấm men

Trong thế giới vi sinh vật, giữa các loài tảo, nấm men và vi khuẩn không gây bệnh có nhiều chủng là những nguồn protein hoàn thiện Protein từ nấm men có giá trị dinh dưỡng cao Sinh khối của chúng sau khi lên men và tách khỏi môi trường nuôi cấy chứa nhiều chất có giá trị dinh dưỡng, trong đó hàm lượng protein chiếm 40 đến 70% Klg khô Trong protein nấm men có đủ các thành phần acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế và các vitamin (nhất là vitamin B12), do đó chúng có vai trò quan trọng trong lĩnh vực thực phẩm và chăn nuôi [10] Thực tế hiện nay trên thế giới nguồn protein từ vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng đã trở thành một thương phẩm quan trọng Chúng góp phần khắc phục nạn thiếu protein cho gia súc, gia cầm tạo điều

kiện tăng thêm lượng thịt, sữa, trứng trong khẩu phần của con người [12]

1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ

Đặc điểm sinh lý của gà ở giai đoạn đẻ trứng rất cần sắc tố carotenoid do chúng có vai trò sinh học rất quan trọng [64, 79] Cụ thể như sau:

1.3.2.1 Carotenoid là các chất chống oxi hoá (antioxidants) bảo vệ buồng trứng

Sắc tố carotenoid dù không có tác dụng chuyển hóa thành vitamin A nhưng là các chất chống oxi hóa rất tốt giúp bảo vệ buồng trứng Nếu thiếu carotenoid trong khẩu phần

gà sẽ giảm tỷ lệ đẻ và trứng giảm tỷ lệ ấp nở [9, 106], chất lượng vỏ trứng kém [138]

1.3.2.2 Carotenoid là nguồn cung cấp beta-carotene và vitamin A cho gia cầm

Qua nhiều thập kỷ thí nghiệm về vitamin A và carotene trên gia cầm, người ta đã xác định rằng carotene ngoài việc tạo ra vitamin A, còn có vai trò sinh học riêng của nó [97, 104] Lotthammer và cs (1979) [97] đã phát hiện rằng nếu chỉ cung cấp đủ nhu cầu