Phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion Arms

Từ kết quả thu được, một quy tr nh xét nghiệm đột biến gen trong điều trị BN UTPKTBN được thiết lập như sau: Trước tiên, xác định đột biến gen ở tế bào mô ung thu bằng kỹ thuật giải tr n[r]

PHÁT HIỆN ĐỘT BIÉN GEN EGFR BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH Tự GEN

VÀ SCORPION ARMS

Clf Phạm Lê A nh Tuấn*

H ướng dẫn: TS Trần Văn Khánh* TÓM T T

Liệu pháp điều trị đích hứa hẹn là một liệu pháp điều trị mởi mang lại hiệu quả cao cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi không tể bào nhỏ (ƯTPKTBN), tuy nhiên không phải tất cà BN ung thư đều đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích Nhiều nghiên cứu đã chứng minh mối tương quan chặt chẽ giữa đột biến gen EGFR và hiệu quả đáp ứng ỉhuốc điều trị đích của khối u Nghiên cứu này được tiến hành vởi mục tiêu: Xác định đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ƯTPKTBN và bằng kỹ thuật giải ír nh tự gen và kỹ thuật Scorpion ARMS 42 BN UTPKTBN được ỉựa chọn để tiển hành nghiên cứu;

kỹ thuật giãi tr nh tự gen và kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions­Amplification Refractory Mutation System) được ứng dụng để xác định đột biến gen EGFR trên mẫu mô ung thư Kêt quả cho thấy 16/42 BNƯTPKTBN xác định có đột biến tại exon 18, 19,21 của gen EGFR

* Từ khóa: ưng thư phổi không tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR

Detection o f egfr mutation in non small cell lung cancer

Summary

Targeted therapy is a potential therapy for non small cell lung cancer However, not all of patients have good response with targeted drugs Previous studies demonstrated the dose relationship between EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) mutation and the response of targeted drugs with tumor The aim of this study is to identify of EGFR mutations in non small lung cancer patients by sequencing and Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification R fractory Mutation Syst m) and compare sequencing and Scorpions ARMS techniques in identifying EGFR mutations of non small cell lung cancer 42 non small cell lung cancer patients were selected for this study; sequencing and Scorpions ARMS were applied to identify mutations Results showed that 16/42 non small cell lung cancer patients have EGFR mutations in exon 18, 19, 21

* Key words: Non small cell lung cancer; EGFR mutation

I; Đ Ặ TV Á N Đ Ẻ

Ưng thư phổi là bệnh lý ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất và có tỷ lệ tử vong hàng đầu írên thế giới và Việt Nam [1] Ưng thư phổi được chia làm 2 thể: thể không tể bào nhỏ (non­small cell ỉung cancer) chiếm khoảng 85% và thể tế bào nhỏ (small cell lung cancer) chiếm khoảng 15% Thuốc lá ỉà nguyên nhân chính gây ra 90% trường hợp ung thư phổi ờ nam và 78% ở nữ [2, 3, 4] Chẩn đoán sớm bệnh ung thư và điều trí đúng phác đồ đóng vai trò quan trọng nhằm gia tăng thời gian sống cho bệnh nhân (BN) Bên cạnh những phương pháp điều trị truyền thống như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị.,., các nhà khoa học đã nghiên cứu một íhế hệ thuốc mới tác động trực tiếp ỉên các thụ thể tế bào nhằm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Thế hệ thuôc mới này được gọi là liệu pháp điều trị trúng đích (targeted therapy­LPĐTTĐ) [5] LPĐTTĐ hứa hẹn là một liệu pháp điều trị mới, có hiệu quả cho BN ung thư phổi không tế bào nhỏ (ƯTPKTBN), Tuy nhiên, không phải tất cả BN ung thư đều đáp ứng tốt với íhuổc điều trị đích, hiệu quả của thuốc phụ thuộc vào t nh trạng các gen nằm trong con đường tín hiệu EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) của tế bào Nhiều nghiên cứu

đã chứng minh moi liên quan chặt chẽ giữa đột biến gen EGFR với mức độ đáp ứng thuốc của khối u trong LPĐJ 1Đ' Khoảng ỉ 0 " 40% BN ƯTPKTBN có đột bien ở exon 18, 19, 20 và 2 1 của gen EGFR Đột biển gen EGFR mã hóa protein EGFR có ái lực mạnh với thuốc điều trị đích, do đó, BN UTPKTBN có đột biến gen EGFR

* Đại học Y Hà Nội

thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [6] Việc xác định đột biến gen EGFR trên BN UTPKTBN giúp cung cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ lâm sàng để chỉ định LPĐTTĐ Có nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến gen EGFR Tuy nhiên, độ nhạy của mỗi kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tể bào ung thư trong mẫu mô phân tích Hai kỹ thuật hiện nay đang được sử dụng phổ biển để xác định đột biến gen EGFR là giải tr nh

tự gen và Scorpions ARMS Kỹ thuật giải tr nh tự gen có giá thành rẻ, nhưng trong trường hợp mẫu mô xét nghiệm có ít tế bào ung thư th đột biến gen không phát hiện được bằng kỹ thuật này Scorpions ARMS

là kỹ thuật có độ nhạy cao, có thể phát hiện đột biến gen EGFR khỉ aỉen đột biển chiếm tỷ lệ nhỏ; nhưng giá thành rất cao, nên kỹ thuật này khó áp dụng với qui mô lớn trên BN ung thư Với mục đích xây dựng quy tr nh xác định đột biến gen chính xác, giá thành phù hợp vói điều kiện BN Việt Nam, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biển g n EG FR ở B N U TPK TBN bằng kỹ thuật giải trình tự

g n và Scorpions ARM S

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đối tượng nghiên cứu

42 mẫu mô của BN UTPKTBN đúc trong block parafin thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội, Bệnh viện Hữu Nghị, Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Những BN này được chẩn đoán xác định dựa vào kết quả mô bệnh học, BN không mắc bất kỳ một loại h nh bệnh tật hay ung thư nào khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu

­ Kỹ thuật tách chiết A D N

Tách chiết ADN từ mẫu mô đúc parrafin của BN theo qui tr nh phenoỉ/chỉoroform sau khi đã lựa chọn chính xác vùng tế bào ung thư Trước khi tách chiết bằng phenol/chloroform, loại bỏ parafin trong mô đúc bằng xyỉen Xác định nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết trên máy Nano­Drop, những mẫu ADN đạt giá trị OD 280/OD2ỔO > 1,8 được sử dụng để phân tích

­ Kỹ thuật giải trình tự g n

Sau khi khuyéch đại vùng exon 18, 19, 20, 21 của gen EGFR bằng kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR tinh sạch từ gel agarose, sử dụng Promega Wizard s v gel clean­up system (Prom ga, USA), au đồ đưa vào giải tr nh tự bằng phương pháp BigDye terminator sequencing (Appli d Biosyst ms, Fost r city, USA) Đối chiếu và so sánh tr nh tự gen với tr nh tự của gen EGFR hoang dại (wild type) trên GeneBank (National

c nt rfo r biot chnology information, NCBỈ)

- Kỹ thuật Scorpions-Amplification R fractory Mutation Syst m (Scorpions AR M S)

Scorpions ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng real time PCR để phát hiện đột biến Nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu aỉen đột biến dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chi khuếch đại hoàn chỉnh 1 phân tử ADN khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau Nếu đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phản ứng PCR bị ức ché hoàn toàn Bởi vậy, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu tr nh tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó chiểm tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn ADN Scorpions là phân tử có cấu tạo một đầu mang tr nh tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu tr nh tự này được nối với một đầu dò, fluorophore phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò gắn với Quencher có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của ỉluorophore Trong phản ứng PCR, khi đầu dò bám với đoạn tr nh tự khuếch đại fluorophore được giải phóng khỏi Quencher, phát tín hiệu đến cảm biến của máy Rea time­PCR Quy tr nh

kỹ thuật theo Kit đo Hãng QIAGEN cung cấp

ra KẾT QUA

E18

*— 281 bp

H nh 1 H nh ảnh điện đi sản phẩm nested PCR khuểch đại cệc exon 1 8,19,20,2 1 của gen EGFR EJ8, EĨ9, E20, E2 ỉ: Kết quả PCR của các xon ĩ 8, ĩ 9, 20, 2Ĩ; (+): Mau đổi chứng dư ng;

(-): Mau đối chúng âm; MK: Mark r 6174

H nh ảnh điện di cho thấy sản phẩm khuếch đại các exon gen EGFR đều là 1 băng đặc hiệu có kích thước tương ứng: Exon 18 ~ 400bp; Exon 19 ­ 349bp; Exon 20 ~ 410bp; Exon 21~ 374bp Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch từ gel agarose được giải tr nh tự và so sánh với mẫu người b nh thường để xác định đột biến

< 3 :< Q iG C ir «3#43'CS J tk A

CTG > CGG L858R _ ĩ

o css­ <B <zr <3­ <3­ <3T<ZÍ<r 5PV.

B nh thường

; c T G G C C T

Binh thường

Bệnh nhân L1 GGOAGC G719S

c X o m a 1

Bệnh nhân L41

H nh 2 Kết quả giải tr nh tự gen EGFR (A) Hình ảnh đột biến L858R; (B) Hình ảnh đột biển x a đoạn

15 nucl otỉt (LREA d l tion), mũi tên chi vị trí bắt đầu c đột biển x a đoạn; (C) Hình ảnh đột biển G7Ỉ9S

BN LI mang đột biến CTG>CGG tại vị trí 2573 thuộc exon 21 gen EGFR (đột biến L858R); BN L14 bị đột biến xóa 15 nucỉeot t tại vị trí 2235 thuộc exon 19 gen EGFR (đột bién LREA deletion); BN L41 bị đột biến GGC>AGC tại vị trí 2155 của exon 18 gen EGFR (đột biến G719S)

Kết quả giải tr nh tự cũng phát hiện thấy đột biến EGFR ở 13 BN UTPKTBN khác; trong đó, BN L28 nghi ngờ mang đột biến L858R (tín hiệu đột biến quá thấp) BN L28 được kiểm tra ại với kỹ thuật Scorpions ARMS, kết quả cho thấy BNmang đột biến L858R (h nh 3)

i í*

c HMhxbl unỉ

mđ­­­

H nh 3 Kết qua Scorpion ARMS cua BN mã số L28 Kết qua Scorpions ARMS khẳng định bệnh nhân L28 mang đột biến L858R 26 BN ƯTPKTBN không thây đột biến bằng kỹ thuật giải tr nh tự gen đã kiểm ứa lại bằng kỹ thuật Scorpions ARMS, kết quả cho thấy những BN này không có đột biến gen EGFR ở mẫu mô ung thư

Tổng họp kết quả của 2 kỹ thuật cho phép xác định 16/42 BN ƯTPKTBN mang đột biến gen EGFR (bảng 1) Bảng 1 Đột biến gen EGFR ở BN ƯTPKTBN

IV BÀN LUẬN

Trong nghiên cứu này, việc xác định đột bién gen EGFR ở exon 18, 19, 20, 21 tiến hành trên 42 BN UTPKTBN Kết quả cho thấy 16/42 BN ƯTPKTBN có đột biến gen EGFR V có giá thành thấp hơn nên kỹ thuật giải tr nh tự gen được tiến hành trước tiên để xác định đột biến, tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi

số lượng tế bào ung thư ít hoặc được lấy không chính xác ở vùng ung thư, những đột biến cùa gen không phát hiện được bằng kỹ thuật này Scorpions ARMS là kỹ thuật nhanh và nhạy để phát hiện đột biến gen EGFR, cho dù alen đột biến đó chiểm một tỉ lệ rất nhỏ trong tổng số sợi khuôn ADN [7] Trường hợp nghi r> TÒ' ĨT’ " Ĩ 'Í ? Ị h t í r ' M A i ’ Í=ỊA* V ­* á ~ f ụ é r » \ lÝ ỉr­ị­ l í ­ i x r A ti a U T k iC

iigư íĩicuig UỤi L 7ỈC ĨÌ gCu Liui iv i u i n i i iiii lỉỉCU UỌi ulCii Inajj/ uuyC Kiittug U U I 1 1 iẹũ vơi Ky Inũặí õCuĩlỡiiS rtiuvio.

26 BN UTPKTBN không thấy đột biến bằng kỹ thuật giải tr nh tự gen được kiểm tra lại bằng kỹ thuật Scorpions ARMS và có kết quả tương tự như giải tr nh tự gen

Đây là lần đầu tiên kỹ thuật Scorpion ARMS được thực hiện tại Việt Nam Kỹ thuật này cho phép phát hiện đột biến gen một cách chính xác trong mô phân tích có tỷ lệ tế bào ung thư thấp Điều này có ý nghĩa đặc biệt đối với BNung thư, tạo điều kiện cho BN nhanh chóng được áp dụng một phác đồ điều trị hiệu quả [8] Từ kết quả thu được, một quy tr nh xét nghiệm đột biến gen trong điều trị BN UTPKTBN được thiết lập như sau: Trước tiên, xác định đột biến gen ở tế bào mô ung thu bằng kỹ thuật giải tr nh tự, sau đó những trường hợp có kết quả nghi ngờ hoặc âm tính được xác định lại bằng kỹ thuật Scorpions ARMS

Theo thống kêt tỷ lệ đột biến gen EGFR là 10 ­ 40% đối với BN UTPKXBN [7, 9] s ố lượng mẫu trong nghiên cứu này còn hạn chế, nhưng kết quả thu được tương tự như các công bố trước đây Việc xét nghiệm đột biến gen EGFR trong ƯTPKTBN có ý nghĩa hết sức quan trọng, giúp đua ra những bằng chứng chính xác về t nh trạng gen, từ đó bác sĩ lâm sàng có thể chỉ định phác đồ điều trị có hiệu quả đối với BN

V KẾ T LUẬN

­ Bằng kỹ thuật giải tr nh tự gen và Scorpions ARMS đã phát hiện đựợc 11/42 BN UTPKTBN có đột biến gen EGER

­ Kỹ thuật Scorpion ARMS giúp khẳng đinh những trường hợp h nh ảnh đột biến gen không rõ ràng với

kỹ thuật giải trinh tự gen

TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1 Jemal A, Siegel 1 R, Ward E (2008), Cancer statistics, CA Canc r J Clin, 58,71­96

2 Sato M, Shames DS, Gazdar AF, Minna JD (2007), A translational view of the molecular pathogenesis of lung cancer J Thorac Oncol 2, 327­343

3 Wistuba n, Mao L, Gazdar AF (2002), Smoking molecular damage in bronchial epithelium Oncog n , 21, 7298­7306

4 Lê Trần Ngoan (2010), T nh h nh tử vong do ung thư tại Hà Nội và Thái Nguyên, 2005­2008 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học

5 Lievre A, Blons H (2010); Oncogenic mutation as predictive factor in colorectal cancer, Oncog n 29, 3033­3043

6 Amado RG, Wolf M (2008), Wild­type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer, J Clin Oncol 2 6 ,1626­34

7 Hisayuki s., Li L., Takao T, et al (2005), Clinical and Biological Features Associated With Epidermal Growth Factor Receptor Gene Mutations in Lung Cancers, Journal ofth National Canc r In stitut 97(5), pp 339­346

8 Mok T.S., Wu Y.L., Thongprasert s et al (2009), Gefitinib or Carboplatin­Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma, NEngJM d., 361(10), 947­958

9 Pao w and Ladanyi M (2007), Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Testing in Lung Cancer: Searching for the Ideal Method, Clin Canc r R s., 13, pp 4954­4955