Chiết xuất, phân lập epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (camellia sinensis l ) làm chất đối chiếu

Thiết lập các chất cô lập được thành chất đối chiếu theo hướng dẫn ASEAN –WHO và theo ISO13528 Khảo sát nhóm hợp chất catechin trong một số sản phẩm trên thị trường có thành phần chiết x

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA



HÙYNH THỊ NGỌC DUNG

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP EPIGALLOCATECHIN GALLATE

TỪ TRÀ XANH (Camellia sinensis L.)

Công trình được hoàn thành tại: Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS DS Hà Diệu Ly………

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thành Quân………

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS Nguyễn Thị Lan Phi………

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Bạch Long Giang………

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 20 tháng 08 năm 2014 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 PGS TS Phạm Thành Quân 2 TS Nguyễn Thị Lan Phi 3 TS Bạch Long Giang 4 TS Lê Thành Dũng 5 TS Lê Xuân Tiến Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

TS Lê Thành Dũng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

Tp.HCM, ngày tháng 08 năm 2014

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: HÙYNH THỊ NGỌC DUNG

Ngày tháng năm sinh: 17/11/1986

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ HỮU CƠ MSHV : 12050144

1 TÊN ĐỀ TÀI

Chiết xuất, phân lập Epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (Camellia sinensis

L.) làm chất đối chiếu

2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

Lựa chọn phương pháp chiết xuất epigallocatechin gallat có độ tinh khiết cao phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm

Phân lập EGCG và (+/-) catechin bằng sắc ký cột silica gel và Sephadex LH-20 kết hợp với sắc ký lỏng điều chế

Thiết lập các chất cô lập được thành chất đối chiếu theo hướng dẫn ASEAN –WHO và theo ISO13528

Khảo sát nhóm hợp chất catechin trong một số sản phẩm trên thị trường có thành phần chiết xuất từ trà xanh

3 NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/2013

4 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2014

5 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS.DS.Hà Diệu Ly, PGS.TS Phạm Thành

Quân

Tp.HCM, ngày tháng năm 2014 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Hà Diệu Ly, cô hướng dẫn đã cho tôi ý tưởng, động lực và giúp đỡ tận tình trong nghiên cứu, xin cảm ơn PGS.TS Phạm Thành Quân, thầy đã giúp tôi giải đáp các vấn đề phát sinh trong nghiên cứu, các thầy cô trong hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các kết quả

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị trong khoa Thiết Lập Chất Chuẩn

& Chất Đối Chiếu – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM đã tạo điều kiện, hết lòng ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn

TÓM TẮT

Trong luận văn này, lá trà thuộc giống LD 97 được dùng làm nguyên liệu cho quá trình chiết xuất, phân lập acid gallic, EGCG, catechin Quá trình chiết xuất, phân lập được thực hiện theo phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm Kết quả đạt được như sau:

Phân lập acid gallic, EGCG, (+/-) catechin từ trà xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm

Xác định cấu trúc EGCG, acid gallic và (+/-) catechin bằng phổ hồng ngoại, phổ

tử ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C

Độ tinh khiết của 3 chất được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả sau khi phân tích phần trăm độ tinh khiết > 95 %

Thiết lập, đánh giá các chất EGCG, (+/-) catechin thành chất đối chiếu theo ISO

13528

Khảo sát một số sản phẩm có chiết xuất từ trà xanh dùng trong thực phẩm và các thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường

ABSTRACT

In the thesis, the leaves of LD 97 tea collected from Lam Dong Provin wre extractd isolated EGCG, catechins, gallic acid Experiments were carried out procedure of ultrasonic-assisted extraction method for extracting polyphenols from fresh tea leaves The results were shown: Isolated EGCG, catechins, gallic acid from green tea extraction method by supports ultrasonic Define the structure of EGCG, gallic acid, catechins by infrared, ultraviolet and nuclear magnetic resonance spectroscopic The purity of three substances were determined more than 95 % by high performance liquid chromatography The EGCG, catechins were evaluated their purity foe establishment reference standard according ISO 13528 guide Identification and quantification EGCG, catechins from the finish product containing green tea extracts in market diertary supplements

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Huỳnh Thị Ngọc Dung

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

EC: (-) – epicatechin

EGC: (-) – epicatechin gallt

EGCG: (-) – epigallocatechin gallt

GC: (+) – gallocatechin

HPLC: High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu năng cao ODS: Octadecylsilan – cột C18

TPCN: Thực phẩm chức năng

NMR: Nuclear Magnetic Resonance – cộng hưởng từ hạt nhân

IR: Infrared – hồng ngoại

WHO: World Health Organization

ISO/IEC:International Organization for Standardization/ International

Electrotechnical Commission

DĐVN: Dược Điển Việt Nam

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo của acid gallic

Hình 1.2: Cấu tạo khung cơ bản của hợp chất catechin Hình 1.3: Cấu tạo các chất trong catechin

Hình 3.1: Phổ UV của (X2.1) - EGCG

Hình 3.2: Công thức cấu tạo của EGCG

Hình 3.3: Phổ UV của (X1.1) – catechin

Hình 3.4: Công thức cấu tạo của catechin

Hình 3.5: Phổ UV của (X1.2) – acid gallic

Hình 3.6: Công thức cấu tạo của acid gallic

Hình 3.14: Sắc ký đồ của mẫu thử (a)

Hình 3.15: Sắc ký đồ của mẫu thử (b)

Hình 3.16: Sắc ký đồ của mẫu thử (c)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần hóa học có trong lá trà

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá chất đối chiếu EGCG và (+/-)

catechin

Bảng 3.1: Hiệu quả trích ly của các phương pháp

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H – NMR (500 MHz) và 13C – NMR (125 MHz) của EGCG trong aceton d-6 (trị số trong ngoặc là J tính bằng Hz)

Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H(500 MHz) và 13C – NMR (125 MHz) của catechin trong

aceton –d6

Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H(500 MHz) và 13C – NMR (125 MHz) của acid gallic trong aceton –d6

Bảng 3.5: Độ tinh khiết của các chất được phân lập

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống của EGCG (n =6)

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống của catechin (n =6)

Bảng 3.8: Kết quả kiểm tra tính tương thích hệ thống của acid gallic (n =6)

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tuyến tính của EGCG và (+/-) catechin

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của EGCG

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng của catechin

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ thô

Bảng 3.13: Kết quả đánh giá các chế phẩm

Bảng 3.14: Kết quả xác định % độ tinh khiết liên phòng

Bảng 3.16: Kết quả xác định % độ tinh khiết liên phòng của (+/-) catechin

Bảng 3.17: Kết quả đánh giá liên phòng thí nghiệm của (+/-) catechin theo Anova Bảng 3.18: Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng EGCG

Bảng 3.19: Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng (+/-) catechin

Bảng 3.20: Kết quả tính tương thích hệ thống của (+/- ) catechin

Bảng 3.21: Kết quả tính tương thích hệ thống của EGCG

Bảng 3.22: Kết quả tỷ lệ phục hồi của (+/-) catechin và EGCG

Bảng 3.23: Kết quả hàm lượng EGCG và (+/-) catechin có trong mẫu thử

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về trà 3

1.2 Phân bố 3

1.3 Thành phần hóa học có trong lá trà – các tính chất dược lý 4

1.3.1 Acid gallic 5

1.3.2 Nhóm hợp chất catechin 6

1.3.3 Epigallocatechin gallat 9

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

1.5 Tổng quan chung về chất chuẩn 10

1.5.1 Khái niệm 10

1.5.2 Phân loại 11

1.5.2.1 Chất chuẩn dược điển 11

1.5.2.2 Các loại chuẩn khác 11

1.5.2.3 Mục đích sử dụng chất chuẩn 12

1.5.3 Sơ lược về bộ tiêu chuẩn ISO Guide 12

1.5.4 Một số chất chuẩn phân lập từ dược liệu 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Chiết xuất 15

2.2.2 Phân lập, tinh chế 16

2.2.3 Xác định cấu trúc 16

2.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn, thẩm định phương pháp đánh giá chất đối chiếu 16

2.2.5 Thiết lập chất đối chiếu 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Chiết xuất 20

3.2 Phân lập 21

3.3 Xác định cấu trúc 21

3.4 Khảo sát độ tinh khiết của chế phẩm 29

3.5 Thẩm định phương pháp 31

3.5.1 Tính tương thích hệ thống 31

3.5.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 32

3.5.3 Độ tuyến tính, hệ số tương quan r, phương trình hồi quy 32

3.5.4 Độ đúng phương pháp 35

3.5.5 Độ thô 37

3.6 Đánh giá chất đối chiếu 38

3.7 Thiết lập chất đối chiếu 39

3.7.1 Đóng lọ 39

3.7.2 Xác định giá trị ấn định - Đánh giá chất chuẩn 39

3.8 Ứng dụng phương pháp phân tích và chất đối chiếu để khảo sát một số sản phẩm có chứa chiết xuất trà xanh trên thị trường 43

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trà là thức uống có truyền thống từ lâu đời trong nhiều nền văn hóa trên thế giới (Trung Quốc, Nhật Bản,…) Ngày nay, các nhà nghiên cứu khoa học đã chứng minh trong trà có nhiều thành phần có lợi cho sức khỏe như các hợp chất polyphenol đặc biệt là nhóm catechins (epicatechin, epigallocatechin, epigallogatechin gallat,…) là những chất chống oxy hóa cao (gấp 100 lần so với acid ascorbic) Ngoài ra, epigallocatechin gallat được nhiều công trình nghiên cứu công bố về khả năng kìm hãm sự phát triển của các tế bào ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi [12],[15],[16],[17],[18]

Acid gallic là một acid hữu cơ thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá trà

và nhiều lọai thực vật khác, nó có thể ở dạng tự do hay ở dạng một phần của tannin Acid gallic có tính kháng khuẩn, kháng nấm, nó cũng là chất chống oxy hóa và có khả năng kháng tế bào ung thư mà không làm tổn hại đến các tế bào lành Đặc điểm chiết xuất thiên nhiên và an tòan vì vậy ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của nhóm hợp chất này là khả năng chống oxy hóa nên được sử dụng nhiều trong lãnh vực thực phẩm và mỹ phẩm [9]

Các đề tài nghiên cứu trước đây [3],[4],[5],[6] đều khảo sát các phương pháp tối

ưu để trích ly epigallocatechin gallat từ trà xanh và khảo sát họat tính của cao thô nhưng chưa tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao để phù hợp làm chuẩn đối chiếu chiết từ dược liệu Hiện nay, phần lớn chất chuẩn đang sử dụng trong nước chủ yếu phải nhập từ nước ngoài (chuẩn USP, Chromadex, Wako Pure Chemicals…) với giá thành cao và thồi gian đặt hàng kéo dài vài tuần đến vài tháng Trong khi đó ở Việt Nam, bên cạnh hệ thống chất chuẩn do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương và Viện Kiểm Ngiệm Thuốc TP.HCM thiết lập, một số cơ sở khoa học cũng được phân lập được chất chuẩn từ dược liệu nhưng việc sử dụng còn hạn chế trong phạm vi cơ sở

và chưa được thẩm định đủ Vì vậy cần phải xây dựng hệ thống chất chuẩn với chất lượng cao hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phạm vi cả nước, giúp tiết kiệm chi

phí, thời gian mua chuẩn từ nước ngoài nhưng vẫn đảm bảo kết quả kiểm nghiệm đáng tin cậy và hiệu quả để làm cơ sở kiểm tra chất lượng chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng

Xuất phát từ thực tế đó, trên cơ sở tham khảo tài liệu kết hợp các điều kiện thực nghiệm, trong luận văn này chúng tôi chiết xuất cô lập, tinh chế và thiết lập chất đối chiếu epigallocatechin gallat, catechin, gallic acid nhằm cung cấp chất đối chiếu đạt yêu cầu phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm có trà xanh lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về trà [1],[6],[7]

Tên khoa học: Camellia sinensis (L.) O.Kuntze

Trà thuộc lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, bộ Trà Theales, họ Trà Theaceae, chi Trà Camellia (Thea.) Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ

có một thân chính, chia làm 3 loại: thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ) Cành trà do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều

từ 1 – 10cm Đốt trà càng dài là biểu hiện của giống trà có năng suất cao Lá trà mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy giống Lá trà

có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa Búp trà là giai đoạn non của một cành trà, được hình thành từ các mầm dinh dưỡng, gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non

Trà là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất lâu 60 – 100 năm, tuổi thọ kinh tế tối đa là

50 – 60 năm tùy vào điều kiện môi trường và phương pháp trồng, cho năng suất cao vào mùa mưa từ tháng 5 – 11, sau 10 – 15 ngày thì thu hoạch một lần Trà nguyên liệu

sử dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm và 2 – 3 lá non

1.2 Phân bố

Trà được trồng nhiều tại các vành đai á nhiệt đới, khu vực có khí hậu ôn hòa, ẩm ướt Hiện nay, trà được trồng ở hơn 30 nước, các nước sàn xuất và xuất khẩu nhiều trà nhất là: Trung Quốc, Ấn Độ, Sirlanca, Nhật Bản,…Ở Việt Nam trà được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc ( Lai Châu, Hoàng Liên Sơn, ), các vùng trung du (Vĩnh Phúc, Yên Bái, ) vùng Tây Nguyên (Lâm Đồng, Gia Lai, Kom Tum)

1.3 Thành phần hóa học có trong lá trà – các tính chất dược lý [3],[6]

Acid gallic là một acid hữu cơ thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá trà

và nhiều lọai thực vật khác đặc biệt trong củ tỏi, giúp làm giảm cholesterol trong máu Ngòai ra, acid gallic làm gia tăng phóng thích insulin tự do trong máu, tăng cường chuyển hóa glucose trong gan, làm giảm lượng đường trong máu và trong nước tiểu Acid gallic có khả năng ức chế 70 lọai vi khuẩn gram (-) và gram (+), kháng virus như cúm, cảm lạnh Nó có họat tính kháng viêm mạnh, dùng chữa đau thần kinh, phong thấp, đau hệ cơ và phần lưng dưới

Hình 1.1: Cấu tạo của acid galic

1.3.2 Nhóm hợp chất catechin[11]

Catechin của trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 carbon bao gồm hai vòng 6 carbon A và B được nối bởi 3 đơn vị carbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai carbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2,3 và nhóm 4-oxo

Hình 1.2: Cấu tạo khung cơ bản của catechin

Các catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm GC, EC, EGC (vị trí carbon số 3 có chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị ester hóa hay nhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí carbon số 3 được thay bằng một nhóm gallat)

Các hợp chất catechin trong lá trà tác dụng với FeCl3 cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, aceton, ethyl acetat tạo dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzene hoặc chloroform

Các hợp chất trong nhóm catechin:

(+)- Catechin C 15 H 14 O 6 (-)-Epicatechin C 15 H 14 O 6

(-)-Epigallocatechin C 15 H 14 O 7 (+)-Gallocatechin C 15 H 14 O 7

(-)-Epigcatechin gallat C 22 H 14 O 10 (-)-Epigallocatechin gallat C 22 H 18 O 11

Hình 1.3: Cấu tạo các hợp chất trong (+/-) catechin

Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất khỏang 30 % khối lượng khô Trong các hợp chất catechin được tìm thấy trong trà, thành phần gallat là chiếm đa số (trên

80 % tổng catechin), ngòai ra các hợp chất catechin còn được tìm thấy trong cacao,

nho, táo, hành, Hàm lượng các catechin trong là trà luôn thay đổi, phụ thuộc vào

giống trà, thời kỳ sinh trưởng, vị trí các lá trên búp trà và các yếu tố khác về thổ nhưỡng Trong quá trình phát triển của lá trà, dưới tác dụng của enzyme các catechin

bị chuyển hóa dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành

Công thức cấu tạo catechin với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6 nhóm ở các gallocatechin, 8 nhóm ở các catechin gallat và 9 nhóm ở các gallocatechin gallat) đảm bảo khả kháng oxy hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin

Nhóm hợp chất catechin có khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nhóm chất này còn được quan tâm sử dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm Do đặc điểm xuất phát từ thiên nhiên, an toàn, trà và

các chất từ trà đang được sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hóa nhằm thay thế các phụ gia tổng hợp thường dùng khác như BHT, BHA…

1.3.3 Epigallocatechin gallat [6],[7],[10],[11]

EGCG là viết tắt của hợp chất Epigallocatechin–3 – gallat là một trong bốn loại polyphenol được tìm thấy nhiều trong trà xanh, bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin –3 – gallat (ECG) và epigallocatechin–3 – gallat (EGCG) EGCG là ester của epigallocatechin và acit gallic, là hoạt chất chống ôxy hóa có nhiều trong trà xanh nhưng không có trong trà đen vì khi lên men EGCG chuyển thành thearubigin Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu, khả năng chống oxy hóa của hoạt chất EGCG trong trà xanh cao gấp 100 lần so với vitamin C, gấp 25 lần

so với vitamin E

Với sự tiến bộ của khoa học, ngày nay các nhà nghiên cứu còn tìm thấy những tác dụng tích cực của EGCG đối với sức khỏe con người, như khả năng diệt trừ các virus, vi khuẩn, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư; ngăn ngừa các bệnh tim mạch như: đau tim, đột qụy, tai biến mạch máu não Ở những bệnh nhân đái tháo đường, EGCG còn có tác dụng lên tuyến tụy để điều chỉnh khả năng tiết insulin – cải thiện tình trạng bệnh tiểu đường type I

Vì những tính chất dược lý trên, ngày càng có nhiều sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh trên thị trường dược phẩm, nhiều nhất là dạng TPCN…

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước[3],[4],[5]

Nguyễn Hải Hà (2006): nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà, dựa vào phương

pháp Folin-ciocalteu đánh giá hàm lượng polyphenol tổng thu được Xác định các thông số cho quá trình trích ly bằng vi sóng, thăm dò, tinh chế sơ bộ dịch trích, tạo sản phẩm dạng bột có hàm lượng EGCG 35%, catechin tổng 70%, polyphenol tổng 95% Khảo sát một số tính chất kháng oxy hóa, kháng khuẩn của sản phẩm

Dương Hoàng Long (2009): nghiên cứu chiết xuất EGCG từ trà xanh dùng

phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi ethanol/nước Khảo sát các yếu tố (nồng độ dung môi, tốc độ dung môi, lượng dung môi, tính chất nhựa) đối với sự phân tách catechins Xây dựng quy trình chiết xuất tinh chế EGCG có hàm lượng ≥50% (khối lượng chất khô)[5]

Võ Ngọc Trâm (2012): sử dụng các phương pháp làm giàu EGCG từ trà xanh

như trích ly trong S-CO2, dùng sắc ký cột (silicagel, nhựa trao đổi ion, lingo cellulose,…), kết quả cho thấy nếu cho qua sắc ký cột trao đổi ion nhiều lần làm tăng hàm lượng EGCG >52%

1.5 Tổng quan chung về chất chuẩn [29]

1.5.1 Khái niệm

Chất đối chiếu là chất cần thiết để đảm bảo kết quả phân tích đạt độ chính xác, chúng được làm chuẩn để đánh giá các nguyên liệu, chế phẩm theo quy trình Dược điển Việc thiết lập chuẩn đối chiếu dựa vào các báo cáo kết quả thí nghiệm đánh giá của các phòng thí nghiệm với các phương tiện phân tích hiện đại chứng tỏ chúng đáp ứng được mục đích sử dụng Theo DĐVN IV, chất đối chiếu được định nghĩa như sau: "Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử "

Theo định nghĩa của FDA hướng dẫn soạn tài liệu để đăng ký sản xuất chất chuẩn: "Chuẩn đối chiếu (reference standard) là một lô hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu sản xuất và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác nhận nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa có thể đạt được một cách hợp lý Nó thường được dùng cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn (benchmark) cho các chuẩn làm việc"

1.5.2 Phân loại

1.5.2.1 Chất chuẩn dược điển

Đặc trưng của chất chuẩn Dược điển được đề cập trong phần giới thiệu của ISO Guide 34: Chuẩn Dược điển được thiết lập và phân phối bởi Hội đồng Dược điển theo các nguyên tắc chung của ISO này Tuy nhiên, Hội đồng Dược điển cũng có thể cung cấp các thông tin thiết yếu được ghi trong giấy chứng nhận phân tích và ngày hết hạn đến người dùng Bao gồm một số chuẩn như:

 Chuẩn Dược điển Quốc tế

 Chuẩn Dược điển châu Âu

 Chuẩn Dược điển Anh

 Chuẩn Dược điển Mỹ

 Chuẩn Dược điển Nhật

1.5.2.2 Các loại chuẩn khác

Chuẩn gốc hay chuẩn sơ cấp

Là các chất được thừa nhận rộng rãi, có chất lượng phù hợp trong điều kiện quy định và có giá trị được chấp nhận mà không phải so sánh với chất khác

Chuẩn làm việc hay chuẩn thứ cấp

Bao gồm các chất chuẩn sinh học và các chất đối chiếu hóa học được thiết lập trên các nguyên liệu được chuẩn hóa so với các chất chuẩn gốc hay bằng phương pháp phân tích có độ chính xác cao để cung cấp rộng rãi cho các phòng kiểm nghiệm thuốc; được dùng để định tính, định lượng, đánh giá hoạt lực, xác định độ tinh khiết của thuốc, nguyên liệu và thành phẩm

Chuẩn cơ sở hay chuẩn của nhà sản xuất

Là các chất được sản xuất, tinh khiết hóa, mô tả đầy đủ và xác định rõ cấu trúc (IR, UV, MNR, MS) thường được sử dụng trong các trường hợp chất mới (New Chemical Entity - NCE) chưa có chuyên luận tóm tắt

Chất đối chiếu chiết từ dược liệu có hàm lượng phải lớn hơn 95,0 %, thường

dùng trong xác định cấu trúc, chất đánh dấu trong sắc ký đồ vân tay

1.5.2.3 Mục đích sử dụng chất chuẩn

Các chất đối chiếu được sử dụng theo yêu cầu của chuyên luận Dược điển hay yêu cầu kiểm nghiệm Định tính: phổ hồng ngoại, quang phổ, SKLM Thử tạp chất liên quan: SKLM, HPLC, quang phổ, sắc ký khí (GC) Định lượng: HPLC, quang phổ, vi sinh, hay chuẩn độ

1.5.3 Sơ lược về bộ tiêu chuẩn ISO Guide

ISO là tên viết tắt của Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa, được thành lập vào năm

1946 và chính thức hoạt động vào ngày 23/02/1947 ISO có trụ sở tại Geneva (Thụy Sĩ)

và là một tổ chức Quốc tế chuyên ngành có các thành viên là các cơ quan tiêu chuẩn Quốc gia Tùy theo từng nước, mức độ tham gia xây dựng các tiêu chuẩn ISO có khác nhau Ở một số nước, tổ chức tiêu chuẩn hóa là các cơ quan chính thức hay bán chính thức của Chính phủ Việt Nam chính thức gia nhập từ năm 1977 và là thành viên thứ

71 của ISO

Để xây dựng quy trình thiết lập và chứng nhận chất chuẩn, chủ yếu dựa vào ba

bộ ISO Guide 31, 34 và 35 làm cơ sở ISO Guide 31 cung cấp các chỉ dẫn cần thiết giúp nhà sản xuất chất chuẩn soạn thảo giấy chứng nhận phân tích một cách rõ ràng, ngắn gọn phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế ISO Guide 34 đưa ra các yêu cầu nhằm đánh giá năng lực của nhà sản xuất chất chuẩn đồng thời hướng dẫn giúp đáp ứng các yêu cầu này; nhìn chung, ISO này đưa ra các mô hình thử nghiệm tính đồng nhất, độ

ổn định và xác định hàm lượng của nguyên liệu ISO Guide 35 cung cấp các nguyên

lý thống kê hỗ trợ trong việc phát triển các phương pháp hợp lý nhằm đánh giá độ đồng nhất lô, độ ổn định, ấn định giá trị chất chuẩn và xác định độ không đảm bảo đo ISO 13528:2005 bổ sung cho ISO Guide 43 bằng cách mô tả chi tiết các phương pháp thống kê cho các tổ chức sử dụng để phân tích các dữ liệu thu được từ chương trình thử nghiệm thành thạo và đưa ra các khuyến cáo thực tiễn cho đối tượng tham gia trong chương trình ISO này chỉ dẫn cách xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo chuẩn của giá trị này

1.5.4 Một số chất chuẩn phân lập từ dược liệu

Huỳnh Thị Mai Trang (2012): Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp đã phân lập và tinh chế 2 hợp chất labdan diterpen lacton (hispanon và leoheteromin) có trong cao hexan của cây ích mẫu Cấu trúc hoá học được xác định bằng phương pháp phổ nghiệm và so sánh với tài liệu đã công bố Sản phẩm thu được có độ tinh khiết >95 %, đạt yêu cầu cho chất đối chiếu chiết từ dược liệu Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn các hoạt chất vừa phân lập để làm chất đối chiếu nhằm hướng tới thiết lập chất đối chiếu chiết từ dược liệu phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng các sản phẩm có chứa ích mẫu lưu hành trên thị trường [30] Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014): Thiết lập được 6 hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu trinh nữ hoàng cung đạt yêu cầu chất đối chiếu hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu chuẩn gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR và tiêu chuẩn cơ sở để đánh giá chất lượng [31]

Hà Minh Hiển (2014): Thiết lập được calophylloid và 4 – hydroxyxanthon làm chuẩn đối chiếu từ nhựa và vỏ quả mù u theo ISO 13528 [32]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

Lá của giống trà LD 97, thu mua tại Trung Tâm Nghiên cứu Thực Nghiệm Lâm Đồng vào thời gian cây trà cho năng suất cao (tháng 9 đến tháng 11)

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

Thiết bị và dụng cụ đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP

Máy sắc ký lỏng Shimadzu với detector PDA

Máy quang phổ hồng ngoại Nicolet

Máy Mettle Toledo TGA/DSC 1SF/1240

Máy đo nhiệt độ nóng chảy Buchi

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer ( Trường KHTN TP.HCM)

Máy cô quay Heidolph, bể siêu âm Branson 3510, các dụng cụ thủy tinh cần thiết

Máy HPLC điều chế Knauer – Merck, cột Phenomenex (250 mm x 210 mm, 5µm)

Máy quang phổ Shimadzu UV- Vis 1700

Bảng mỏng Silica gel (Merck), silica gel 60 (Merck) cỡ hạt 0,040 – 0,060 mm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất[2],[4],[5]

Lá trà sau khi hái về phải xử lý, diệt men Giai đọan này đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bào thành phần catechin của trà Nguyên liệu sau khi được diệt men bằng hơi nước, sấy khô ở 400C, xay nhỏ, trích ly bằng một số phương pháp, tỉ lệ dược liệu -dung môi (1:6 g/ml)

Phương pháp 1: Trích ly có hỗ trợ vi sóng, thời gian vi sóng 6 phút, dung môi là

ethanol 60 o, công suất lò vi sóng 800W

Phương pháp 2: Trích ly thường bằng cách đun hồi lưu có khuấy trộn, thời gian

chiết 60 phút, nhiệt độ chiết 70oC, dung môi chiết ethanol 60o

Phương pháp 3: Trích ly có hỗ trợ của siêu âm, thời gian chiết 30 phút, dung

môi chiết ethanol 60 o

Phương pháp 4: Trích ly bằng cách ngâm dầm dược liệu trong dung môi ethanol

60 o trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng

Phương pháp phân tích so màu được lựa chọn nhằm để định lượng hàm lượng polyphenol tổng và so sánh nhanh hiệu quả trích ly trong quá trình khảo sát phương pháp trích ly Phương pháp Folin - ciocalteu sử dụng để đo hàm lượng polyphenol tổng

Thuốc thử Folin–ciocalteu (hỗn hợp muối phức polyphosphotungstat - molydat) rất nhạy đối với chất khử, nếu có mặt hợp chất polyphenol trong môi trường kiềm nhẹ

sẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium-tungsten có màu xanh

Hóa chất: Thuốc thử Folin-ciocalteu, dung dịch Na2CO3 bão hoà, nước cất

Chất chuẩn : Dung dịch (+/-) catechin

Phương pháp thực hiện: Lấy 0,5 ml dung dịch (chuẩn hoặc dung dịch cần đo đã pha loãng- mẫu trắng dùng nước cất) cho vào bình định mức 10ml, cho tiếp 4,5ml nước cất, lắc đều, cho nhanh 0,2 ml Folin và 0,5 ml Na2CO3 bão hòa, lắc đều dung dịch, sau đó địch mức bằng nước cất đến 10 ml, lắc đều Để yên trong 1giờ, sau đó tiến hành đo độ hấp thu A tại bước sóng λ = 725 nm

2.2.2 Phân lập, tinh chế [3],[4]

Lọc thu dịch chiết ethanol, lấy phần gạn cho tiếp dung môi ethanol 60O tiếp tục siêu âm Gộp tất cả dịch lọc, chiết với cloroform loại bỏ clorophyll → dịch lọc Dung dịch gelatin 25% (tỷ lệ 1:60) cho vào dịch lọc nhằm loại các hợp chất tannin ngưng

tụ, làm lạnh 10OC, xuất hiện tủa tiến hành lọc hút chân không để loại tủa→ dịch lọc Dịch lọc thu được chiết với ethyl acetat, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao thô Sắc ký cột silica gel nhiều lần cao thô, hệ dung môi rửa giải n-hexan - ethyl acetat (9 :1) Lần lượt rửa giải bằng dung môi kém phân cực và thay đổi tỷ lệ dung môi để tăng dần độ phân cực Cô dưới áp suất giảm để loại dung môi các phân đọan Gộp các phân đoạn có EGCG, catechin, gallic acid khi so sánh vết Rf với các chất định tính Sigma, tiến hành sắc ký cột silica gel lần 2 với hệ dung môi cloroform : aceton (4,5 – 5,5) kết hợp với sắc ký lọc gel trên Sephadex LH-20 (MeOH) thu được

ba hợp chất catechin, acid gallic, EGCG thô Sản phẩm thô được tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế Kanuer – Merck, cột Phenomenex (250 mm x 210 mm, 5 μm) thu được hợp chất tinh khiết

Xây dựng chỉ tiêu chất lượng: căn cứ vào tính chất hoá lý và mục đích sử dụng

để xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất đối chiếu cần thiết lập

Xây dựng phương pháp đánh giá: tham khảo các tài liệu quốc tế và dược điển các nước để lựa chọn phương pháp phù hợp

Xác định độ tinh khiết: Khảo sát độ tinh khiết sản phẩm bằng phương pháp HPLC ở điều kiện sau [13], [23], [24]

Máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20AD, đầu dò chuỗi diod quang SPD-M20A Cột: Gemini ODS (250 x 4,6mm 5 μm)

Tốc độ dòng: 1,0ml/phút

Thể tích tiêm: 10 μl

Bước sóng phát hiện: 280 nm

Pha động: A: dung dịch H3PO4 0,1%; B: Acetonitril

Theo chương trình gradient:

Bảng 2.1: Các tiêu chuẩn và phương pháp đánh giá chất đối chiếu EGCG, (+/-)

6 Độ tinh khiết

HPLC ( % diện tích)

> 95 % tính trên chế phẩm nguyên trạng

2.2.5 Thiết lập chất đối chiếu

Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ

Lấy mẫu ngẫu nhiên theo N+ 1 trong đó N là tồng số lọ Tiến hành xác định chỉ tiêu tinh khiết từng lọ theo phương pháp đã xây dựng Đánh giá theo kỹ thuật thống

kê phân tích ANOVA-one way so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc Nếu Ftn < Ftc: kết quả giữa các mẫu là đồng nhất

Xác định giá trị ấn định: Đánh giá chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025 Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo quy trình phân tích và các tài liệu liên quan

Mỗi phòng thí nghiệm sẽ trả lời kết quả độc lập của phòng trên sáu lọ mẫu gởi Tập hợp các kết quả của ba phòng thí nghiệm tham gia ( n = 18), đánh giá kết quả theo ANOVA, so sánh 2 giá trị Ftn và Ftc

Trường hợp 1: Ftn ≤ Ftc  kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa, quy trình phân tích có độ lặp lại cao, hàm lượng chất phân tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá

Trường hợp 2: Ftn ≥ Ftc  kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khác nhau

có nghĩa, quy trình phân tích có độ lặp lại thấp, hàm lượng chất phân tích thay đổi tùy vào mỗi phòng thí nghiệm tham gia đánh giá

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Chiết xuất

10 kg lá trà tươi sau khi được diệt men bằng hơi nước trong khỏang 3 – 5 phút, sấy ở 400C trong 60 phút Xay lá trà đến kích thước ≤ 2 – 3 mm, thu được 2,5 kg nguyên liệu, bảo quản nơi thóang mát Khảo sát bốn điều kiện chiết xuất như trên Kết quả tổng hàm lượng polyphenol được kiểm tra bằng phương pháp so màu

Bảng 3.1: Hiệu quả trích ly của các phương pháp

Gộp tất cả dịch lọc, chiết với clorofrom để lọai bỏ clorophyll, thu dịch lọc Tiếp tục lọai các hợp chất tannin bằng dung dịch gelatin 25 % (tỷ lệ 1 : 60), làm lạnh 100C, lọc bỏ tủa Dịch lọc chiết với ethyl acetat, cô quay lọai dung môi có được cao thô ethyl acetat (35 g)

3.2 Phân lập [2],[23]

Sắc ký cột cao ethyl acetat trên cột silica gel (8 x 50 cm) với hệ dung môi giải ly

n-hexan: ethyl acetat (1-100) thu được 10 phân đọan (A1 -A10) Kiểm tra các phân

đoạn bằng SKLM, kết quả Rf cho thấy phân đoạn A4 có chất cần phân lập

Phân đoạn A4 (5,4 g), tiếp tục sắc ký cột trên cột silica gel (5 x 50 cm) với hệ dung môi giải ly cloroform : aceton (4,5 : 5,5) thu được 9 phân đọan (A4.1 – A4.9),

kiểm tra 9 phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi chloroform : aceton : acid formic

(4 : 6 : 0,1) dựa vào kết quả Rf chọn phân đoạn A4.2, A4.3 và A4.9

Gộp hai phân đoạn A4.2 và A4.3 (1,5g) sắc ký cột trên cột silica gel với hệ dung môi giải ly clorofrom: methanol (7:3) thu được X1 thô Tinh chế X1 bằng sắc ký lỏng

điều chế Merck – Knauer với cột Phenomenex RP-18 (250 x 210 cm, 5 μm), pha động

methanol- acid acetic 0,2 % (70:30) thu được catechin (X1.1) tinh khiết (200 mg), acid gallic (X1.2) tinh khiết (401 mg)

Phân đọan A4.9 (0,9g) tiếp tục cho qua cột Sephadex với hệ dung môi clorofrom: methanol (4,5 ; 5,5) thu được X2 thô Tinh chế X2 bằng sắc ký lỏng điều

chế Merck – Knauer với cột Phenomenex (250 x 210 cm, 5 μm) với hệ dung môi

methanol: acid acetic 0,2% (6 ; 4) thu được EGCG (X2.1) tinh khiết ( 305 mg)

3.3 Xác định cấu trúc [21],[22],[27]

EGCG (X2.1): dạng vô định hình màu trắng ngà, kết tinh trong ethanol tuyệt đối

Phổ UV cho mũi hấp thu cực đại ở 273 nm (Phụ lục 2)

Hình 3.1: Phổ UV của (X2.1) - EGCG

Phổ IR cho các mũi hấp thu đặc trưng ứng với dao động của nhóm O –H (3356

cm-1), C = O (1616 cm-1), C-O (1292cm-1), vòng thơm carbon (741 cm-1) (Phụ lục 2 –

Hình 2.1)

Phổ 1H –NMR cho các nũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của một vòng benzen thế vị trí 1,2,3,5 [δH 6,03 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6] và 6,06 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8], một vòng benzene thế vị trí 1, 3, 4, 5 có các proton hương phương đối xứng [δH

6,62 (2H, d, J =2,5 Hz, H-2’, H-6’, 2 nhóm CH sp3 mang oxigen [δH 5,56 (1H, m, 3), (δC 69,3, C-3)], [δH 5,06 (1H, s, H-2), (δC 78,1, C-2)], một nhóm metylen benzil [δH 2,93 (1H, dd, J=17,0 và 2,0 Hz, Ha-4) và 3,02 (1H, dd, J=17,0 và 4,5 Hz, Hb-4), (δC 26,7, C-4)] (Phụ lục 2 – Hình 3.1, 3.2, 3.3)

H-Phổ 13C – NMR cho các mũi cộng hưởng với 22 carbon bao gồm một carbon carbonyl [δC 166,2, C-7”], 18 carbon vòng thơm, hai nhóm metin gắn vào carbon mang oxygen [δC 69,3, C-3; δC 78,1, C-2], một nhóm metylen [δC 26,6, C-4], mười nhóm metylen [δC 157,1, C-5; δC 95,87, C-6; δC 157,7, C-7; δC 96,55, C-8; δC 157,4, C-9; δC 99,0, C-10; δC 130,77, C-1’; δC 133,1, C-4’; δC 21,9, C-1”; δC 138,8, C-4”], tám nhóm metylen [δC 106,8 (2C, dd, C-2’, C-6’); δC 146,2 (2C, dd, C-3’, C-5’); δC

110,0 (2C, dd, C-2”, C-6”); δC 145,9 (2C, dd, C-3”, C-5”)] (Phụ lục 2 – Hình 3.4)

So sánh phổ 1H – NMR và 13C- NMR của (X2.1) với phổ của EGCG [23], [27]cho thấy (X2.1) là epigallocatechin galltat C22H18O11 cô lập từ trà xanh trước đây

Hình 3.2: Công thức cấu tạo của (X2.1) - EGCG Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H – NMR (500 MHz) và 13C – NMR (125 MHz) trong aceton d-6 (trị số trong ngoặc là J tính bằng Hz)

Catechin (X1.1) [21], [25], [27]: dạng bột màu trắng ngà dễ chuyển sang màu

hồng nhạt do bị oxi hóa Phổ UV cho cực đại hấp thu ở bước sóng 278 nm

dd, J = 8 Hz, H-6’); δH 6,19 (1H, d, J = 8,2 và 2 Hz, H-5’)], một proton gắn vào carbon mang oxygen [δH 4,56 (1H, d, J = 8Hz, H-2)], một proton metin gắn vào carbon mang nhóm thế [δH 3,99 (1H, m, H-3)], hai proton metilen [δH 2,93 (1H, dd, J

= 16,5 và 4,6 Hz, H-4a); δH 2,54 (1H, dd, J = 16,8 và 2,9 Hz, H-4b)] (Phụ lục 5 –

Hình 5.1, 5.2, 5.3)

Phổ 13C – NMR cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 15 carbon Trong đó gồm bốn carbon olefin mang nhóm thế [δC 156,9, C-7; δC 157,2, C-5; δC 145,7, C-4’ và δC 145,6, C -3’], hai carbon có gắn oxygen [δC 82,1, C-2; δC 68,4, C- 3], một nhóm metilen [δC 28,8, C-4], bảy carbon olefin [δC 95,5, C-6; δC 96,2, C-8;

δC 132,2, C-1’; δC 115,3, C-2’, δC 115,7, C-5’, δC 120,1, C-6’, δC 100,6, C-10], một

proton gắn oxygen [ δC 157,7, C-9] (Phụ lục 5 – Hình 5.4)

So sánh với tài liệu tham khảo cho thấy X1.1 là (+/-) catechin C15H15O6

Hình 3.5: Phổ UV của (X1.2) – acid gallic

Phổ 1H – NMR có mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của hai proton vòng thơm [δH 7,15 (2H, s, H-3, H-7)] (Phụ lục 4- Hình 4.1)

Phổ 13C-NMR có tín hiệu cộng hưởng với bảy carbon gồm một carbon carbonyl của acid carboxylic [δC 167,8 (1C, s, C-1)] và ba carbon mong nhóm thế [δC 146,0