Tách chiết acid ursolic và tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic

HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆTNAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đôc lập-Tự do- Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ I- TÊN ĐỀ TÀI: TÁCH CHIẾT ACID URSOLIC VÀ TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN NGỌC VĨ

TÁCH CHIẾT ACID URSOLIC VÀ TỔNG HỢP CÁC DẪN

XUẤT CỦA ACID URSOLIC

Chuyên nghành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Mã số: 60.52.75

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 7/2013

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa-ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS TỐNG THANH DANH

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Phạm Thành Quân

Cán bộ chấm nhận xét 2:TS Lê Thành Dũng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM

ngày 29 tháng 7 năm 2013

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Nguyễn Công Hào

2 TS Huỳnh Khánh Duy

3 PGS.TS Phạm Thành Quân

4 TS Lê Thành Dũng

5 TS Tống Thanh Danh

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lí chuyên

nghành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆTNAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Đôc lập-Tự do- Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I- TÊN ĐỀ TÀI: TÁCH CHIẾT ACID URSOLIC VÀ TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA ACID URSOLIC

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tách acid ursolic từ vỏ táo

- Tổng hợp các dẫn xuất từ acid ursolic

- Xác định các sản phẩm thu được bằng phổ HRMS, NMR

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học các dẫn xuất

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 21 tháng 01 năm 2013

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 21 tháng 06 năm 2013

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS TỐNG THANH DANH

Tp HCM, ngày tháng năm 2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy TS Tống Thanh Danh, Thầy đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các Thầy Cô và các anh chị trong bộ môn Hóa Hữu Cơ, cảm ơn chị Viên (phụ trách phòng thí nghiệm) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi gúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cảm ơn các bạn làm chung phòng thí nghiệm đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Xin gởi lời biết ơn đến những thành viên trong gia đình, đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn

Tp HCM, tháng 7 năm 2013

Học viên Trần Ngọc Vĩ

TÓM TẮT

Acid ursolic được tách ra từ vỏ táo, từ đó tổng hợp một số dẫn xuất bằng cách ester hóa tại vị trí C-3, C-28 và oxi hóa tại vị trí C-11 của acid ursolic Trong 5 sản

phẩm thu được, có 4 chất mới (3, 4, 5, 6) Các dẫn xuất được xác định sơ bộ bằng

săc kí cột và cấu trúc của nó được xác định bằng phương pháp khối phổ MS, 1H NMR và 13C NMR Hợp chất (3) có hoạt tính sinh học đối với các dòng tế bào

HeLa, Hep G2, MCF-7, NCI-H460

ABSTRACT

Ursolic acid is extracted from apple peels, resulting synthesis of a number

of derivatives by esterification at positions of C-3, C-28 and oxidation at positions

of C-11of ursolic acid Among the 5 derivatives obtained, there are 4 new

derivatives (3, 4, 5, 6) The derivatives are preliminary determined by column

chromatography and their structures were determined by mass spectrometry (HRMS), 1H NMR and 13C NMR The compound (3) hasbiologically

activities against the HeLa cell line, Hep G2, MCF-7, NCI-H460

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi, các số liệu, trích dẫn trong

luận văn là trung thực

Tp HCM 29/7/2013 Tác giả Luận văn

MỤC LỤC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Error! Bookmark not defined.

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Sơ lược về acid ursolic 2

1.1.1 Giới thiệu 2

1.1.2 Nguồn gốc thực vật [5, 6], [13, 14] 3

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.2.1 Tách acid ursolic từ vỏ táo 5

1.2.2 Hoạt tính kháng ung thư của dẫn xuất acid ursolic 5

1.2.3 Một số hoạt tính khác của các dẫn xuất của acid ursolic 9

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 12

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 12

2.2 Thực nghiệm 12

2.3 Sơ đồ phản ứng 13

2.3.1 Các tác chất trong quá trình thí nghiệm 13

2.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 14

2.4 Phương pháp sử dụng trong quá trình thí nghiệm 14

2.5 Nội dung thí nghiệm 15

2.5.1 Cô lập acid ursolic từ vỏ táo (apple) 15

2.5.2 Tổng hợp sản phẩm từ Acid Ursolic 16

2.5.2.1 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2) 16

2.5.2.2 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3) 16

2.5.2.3 Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4) 17

2.5.2.4 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5) 18

2.5.2.5 Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6) 18

PHẦN 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 20

3.1 Cô lập acid usolic 20

3.2 Tổng hợp các sản phẩm của Acid Ursolic 23

3.2.1 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2) 23

3.2.2 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3) 25

3.2.3 Phản ứng tổng hợp Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4) 27

3.2.4 Phản ứng tổng hợp 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5) 29

3.2.5 Phản ứng tổng hợp Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6) 31

3.3 Thử hoạt tính kháng ung thư ( thử nghiệm SRB) 32

3.3.1 Nguyên tắc 32

3.3.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp SRB 33

3.3.3 Thử hoạt tính 35

PHẦN 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 38

4.1 Kết luận 38

4.2.Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

CDCl3: chloroform

CH2Cl2: dichloromethane

DMAP: 4-dimethylaminopyridine

DMSO: dimethyl sulfoxide

Et3N: triethylamine EtOAc: ethyl acetate

IR: phổ hồng ngoại (infrared spectroscopy)

IUPAC: International Union of Pure Applied Chemistry

MS: khối phổ (infrared spectroscopy)

NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance spectroscopy) TCL: sắc ký bản mỏng (thin layer chromatography)

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Các loại cây thảo dược có chứa acid ursolic 4

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của sản phẩm acid ursolic (1) 22

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ sản phẩm 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2) 24

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ sản phẩm 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3) 26

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ sản phẩm 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5) 30

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ sản phẩm Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6) 32

Bảng 3.7 Kết quả Sàng lọc thô ở nồng độ 100 µg/ml 35

Bảng 3.8 Kết quả đo nồng độ IC50 36

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc một số pentacyclic triterpen acid 2

Hình 1.2 Cấu trúc acid ursolic 3

Hình 1.3 Một số dẫn xuất của acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư 6

Hình 1.4 Các dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng kháng ung thư 8

Hình 1.5 Dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng trong diệt khuẩn 9

Hình 1.6 Các dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng trên bệnh sốt rét 9

Hình 1.7 Một số dẫn xuất của acid ursolic 11

Hình 2 Táo Mỹ (pink) 15

Hình 3.1 Dịch lọc bằng dung môi hexane thể hiện trên bảng mỏng 20

Hình 3.2 Dịch lọc bằng dung môi ethyl acetate thể hiện trên bảng mỏng 21

Hình 3.3 Quá trình chạy cột thể hiện trên bảng mỏng 21

Hình 3.4 Acid ursolic sau khi chạy cột 22

Hình 3.5 Kết quả tạo sản phẩm (2) thể hiện trên bản mỏng 23

Hình 3.6 Kết quả tạo sản phẩm (3) thể hiện trên bản mỏng 25

Hình 3.7 Kết quả tạo sản phẩm (4) thể hiện trên bảng mỏng 27

Hình 3.8 Kết quả tạo sản phẩm (5) thể hiện trên bản mỏng 29

Hình 3.9 Kết quả tạo sản phẩm (6) thể hiện trên bản mỏng 31

Hình 3.10 Hợp chất có hoạt tính sinh học (3) 37

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quá trình cô lập acid ursolic và tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic 12

Sơ đồ 2.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic 13

Sơ đồ 2.3 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2) 16

Sơ đồ 2.4 Phản ứng tổng hợp β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid 16

Sơ đồ 2.5 Phản ứng tổng hợp Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4) 17

Sơ đồ 2.6 Phản ứng tổng hợp 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5) 18

Sơ đồ 2.7 Phản ứng tổng hợp Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6) 18

MỞ ĐẦU

Từ rất lâu, loài người đã biết sử dụng nhiều loại thảo mộc, rau quả để trị bệnh, làm mỹ phẩm theo phương pháp truyền thống, nhưng họ không hề biết trong những loại rau quả, thảo mộc ấy có những chất gì, và có những hoạt tính như thế nào Cho đến những năm đầu thế kỉ 20, những nhà khoa học đã phát hiện ra họ pentacylic triterpen acid có những tác dụng tích cực trong việc kháng khuẩn, kháng

vi rút, trong việc chống viêm nhiễm, dị ứng, tiểu đường…và đặc biệt là trong việc ngăn chặn sự phát triển của khối u ác tính (ung thư) Họ triterpenoid này tồn tại trong nhiều loại thảo mộc, cây, trái Trong đó, acid ursolic là một hợp chất có hoạt tính kháng ung thư nên được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu

Đó là lí do thúc đẩy tôi thực hiện đề tài “tách chiết acid ursolic và tổng hợp

các dẫn xuất của acid ursolic” với mong muốn cô lập được acid ursolic và từ đó

tổng hợp được một số dẫn xuất mới và thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng, tìm ra những chất thích hợp có thể sản xuất thành thuốc chữa bệnh cho con người

và các dẫn xuất của các acid này còn đóng vai trò trong lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm Như vai trò trong mỹ phẩm là hoạt chất ngăn ngừa ung thư da, diệt khuẩn, virut, chống lão hóa, chống rụng tóc, [3], [6-9]

Các loại cây chứa các chất dược tính quí này có mặt trên khắp thế giới Ở

nước ta phổ biến ở một số tỉnh phía nam như cây họ cúc, cà phê, ô rô, bứa [10]

Hình 1.1 Cấu trúc một số pentacyclic triterpen acid

Acid ursolic (hình 1.2.) là một pentacyclic triterpen acid [4-6], [11, 12], công thức phân tử C30H48O3, tên khoa học là 3β-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid

Acid Ursolic còn có tên gọi là urson, prunol, micromerol, và malol

Hình 1.2 Cấu trúc acid ursolic

1.1.2 Nguồn gốc thực vật [5, 6], [13, 14]

Acid ursolic chứa nhiều trong thực phẩm chay, trong thảo dược, và có nhiều trong các loại cây Nó đã được phân lập từ táo, lê, húng quế , nam việt quất, hoa elder, bạc hà, cây hương thảo, hoa oải hương, rau oregano , thyme, táo gai , mận, cây xô gai, lá cây bần và các loại trái cây khác Với sự phân bố của acid ursolic trong thảo dược như trong bảng 1

Bảng 1 Các loại cây thảo dược có chứa acid ursolic

3 Holy Basil (Tulsi) ( húng quế) Ocimum sanctum L Lamiaceae

4 Bilberry (việt quất) Vaccinum myrtillus L Vacciniaceae

6 Elder Flowers (European Variety) (cây cơm cháy) Sambucus nigra L Caprifoliaceae

7 Peppermint leaves (lá bạc hà) Mentha piperita L Lamiaceae

9 Lavender (oải hương) Lavandula augustifolia Mill Lamiaceae

12 Hawthorn ( táo gai) Crataegus laevigata (Poir) DC Rosaceae

13 Cherry laurel leaves (lá nguyệt quế) Prunus laurocerasus L Rosaceae

1.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.2.1 Tách acid ursolic từ vỏ táo

Việc tách acid ursolic từ vỏ táo đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện như là Sandol [15], Hiddeaki Yamaguchi tách từ vỏ táo khô, đạt 0.71% khối lượng acid ursolic trên vỏ táo khô [16], Chao-Mei Ma tách acid ursolic từ vỏ táo tươi, đạt

19 g acid ursolic/27 kg quả táo tươi [3]

1.2.2 Hoạt tính kháng ung thư của dẫn xuất acid ursolic

Nhóm của Yanqiu Meng [17, 18], đã tổng hợp một số dẫn xuất của acid

ursolic bằng cách ester hóa nhóm chức alcol tại vị trí C-3, vị trí C-28 hoặc amid hóa tại vị trí C-28 (hình 1.4.) Kết quả nhận thấy rằng hợp chất amid có hoạt tính sinh học cao hơn (đặc biệt trong trường hợp có chứa vòng benzen), là do có sự

phóng thích electron trên nguyên tử nitơ và của vòng benzen, đây là yếu tố quang trọng gây nên hoạt tính sinh học

1a: R’ = CH(CH2OH)

3a: R’ =CH(CH2C6H4-p-OH) 5a: R’= CH(CH(CH3)C2H5)

2a: R’=CH(CHOHCH3) 4a: R’=CH2

6a: R’=CH(CH2C6H5)

O

H H

Hình 1.3 Một số dẫn xuất của acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư

Sản phẩm acetyl hóa của chức alcol tại C-3 cùng với một liên kết giữa alcol amino hoặc benzylamine tại C-28 tạo các dẫn xuất có tác dụng ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư mạnh hơn hơn ursolic acid (phép phân tích hoạt tính IC50 cho giá trị tương ứng của các hợp chất 7a, 8a và 9a với các nồng độ 10.83 μM, 5.44

μM và 1.63 μM) Ở các hợp chất 7b, 8b cho thấy tính kháng lại sự phát triển của

7a-9a 7a: R”=(CH2)2

8a: R”=CH(CH3)CH2

9a: R”=C6H4(o-CH2)

7b-9b 7b: R”=(CH2)2

8b: R”=CH(CH3)CH29b: R”=C6H4(o-CH2)

tế bào, hoạt tính này chịu ảnh hưởng bởi quan hệ giữ cấu trúc và cấu trúc, và có cơ chế là do sự cảm nhận ở chu kỳ chết của tế bào tác động lên sự ngăn cản phát triển của chu kỳ tế bào trong giai đoạn S

Nhóm tác giả đã cho thấy ở dẫn xuất từ 1a-4a và 6a thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất tại nồng độ 10μM trên tế bào Hela- tế bào rây ung thư tử cung ở nữ

Và ở dẫn xuất 1b-4b, 6b với các OH tự do trong cấu trúc nên thể hiện hoạt tính kháng khối u yếu hơn các sản phẩm 1a-4a, 9b, tuy nhiên vẫn mạnh hơn acid ursolic

Các dẫn xuất 7a-9a cũng thể hiện hoạt tính kháng khối u yếu hơn 7b-9b trên tế bào Hela-tế bào rây ung thư tử cung ở nữ, SKOV3-tế bào buồng trứng, và BGC-823-tế bào dạ dày Nhưng có sự ngoại lệ ở 9b và 9a, hoạt tính 9a thể hiện tốt hơn 9b do nhóm anilino của 9b (N-[3b-acetoxy-urs-12-en- 28-oyl]-aniline)có sự giải phóng điện tử trên vòng benzen

Tóm lại, từ những kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm 3-O-acetal và amido có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính, đồng nghĩa hoạt tính có sự khác biệt với các dẫn xuất khác nhau từ acid ursolic

28-Các dẫn xuất khác nhau sẽ cho kết quả kháng các loại tế bào ung thư khác nhau, và hiệu quả kháng cũng khác nhau Ở (9c, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h) có khả năng kháng ung thư trên các dòng tế bào như HeLa, SKOV3, BGC-823 với hiệu quả kháng cao nhất là dẫn xuất 9h với hiệu suất kháng 92%, kế là dẫn xuất 9e với hiệu suất ngăn sự phát triển 40% theo phương pháp IC50, nồng độ 10µmol/L trong 96h

Hoạt tính độc tố tế bào còn thể hiện trên những tế bào khác nhau như trên tế bào NTUB1 (tế bào gây ung thư bàng quang người) với các dẫn xuất được nghiên cứu [11]

Nhóm tác giả Huang-Yao Tu đã nhận thấy rằng khi ester hóa tại vị trí C-28, các nhóm thế R đẩy điện tử mạnh thì tăng hoạt tính sinh học

Hình 1.4 Các dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng kháng ung thư

Các dẫn xuất trên đáng chú ý nhất là chất 13, 15-19 và 28-30 (hình 1.5.) thể hiện hoạt tính độc tố tế bào rất hiệu quả đặc biệt trên tế bào NTUB1, với hoạt tính chống sự phát triển của tế bào Tuy nhiên tương ứng từng loại dẫn xuất của acid ursolic tai C-17 là - COOH với các loại dẫn xuất alkyl halide sẽ cho hoạt tính khác nhau

1.2.3 Một số hoạt tính khác của các dẫn xuất của acid ursolic

Ngoài những hoạt tính nổi bật kháng khối u ung thư, nhóm tác giả Oxana B cũng tổng hợp dẫn xuất của acid ursolic (hình 1.6.) có tác dụng trên các loại vi rút như vi rút gây ra viêm nhiễm như: papillomavirus, H1N1,… [19]

Hình 1.5 Dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng trong diệt khuẩn

Nhóm tác giả Simone C.B đã phát hiện rằng, một số dẫn xuất acid ursolic (hình 1.7.) còn có tác dụng trị bệnh sốt rét, đặc biệt là các nhóm thế mạch dài, chứa nguyên tử nitơ Sau đây là 2 trong số những dẫn xuất có hoạt tính nổi bật nhất với nồng độ IC50 (µM) tương ứng là 0.17 ± 0.07 và 0.08 ± 0.04 [20]

Hình 1.6 Các dẫn xuất của acid ursolic có tác dụng trên bệnh sốt rét

Một số dẫn xuất khác của acid ursolic có tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh tăng huyết áp, bệnh tiểu đường, kháng vi khuẩn, kháng lão hóa…

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Acid ursolic ở nước ta được phát hiện và nghiên cứu chủ yếu trên các loại cây thuộc họ cà phê (Rubiaceae), [10], [21-23]. Gần đây, Từ Đức Dũng tại Khoa Hóa học Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM phát hiện trong cây An điền đầu nhỏ – Hedyotis Microcephala Pierre ex Pit là một trong những loài cây thuộc chi Hedyotis, chủ yếu mọc ở những vùng khí hậu nhiệt đới chứa 5%-10% acid ursolic [24]

Một số dẫn xuất của acid ursolic (hình 1.3.) đã được nhóm TS Tống Thanh Danh tổng hợp [25-27]

Hình 1.7 Một số dẫn xuất của acid ursolic

Các dẫn xuất trên đều có tính kháng ung thư thấp hơn acid ursolic

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Tách acid ursolic từ vỏ táo, từ acid ursolic thu được, tiến hành tổng hợp tạo ra các dẫn xuất mới Sau đó thử hoạt tính sinh học của acid ursolic và các dẫn xuất

2.2 Thực nghiệm

Sơ đồ 2.1 Quá trình cô lập acid ursolic và tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic

Vỏ quả táo tươi (apple)

xay nhỏ

Chiết, lọc, cô quay, chạy cột Dung môi hexane

Phân tích phổ, xác định cấu trúc

Dung môi ethyl acetate

Loại bớt chất

kém phân cực

2.3 Sơ đồ phản ứng

HO

H O OH

H

O

H O OH

H

O

H O OH

H

HO

H O OH

H O

O

HO

H O O

H O

Sơ đồ 2.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic

2.3.1 Các tác chất trong quá trình thí nghiệm

2.4 Phương pháp sử dụng trong quá trình thí nghiệm

Phương pháp sử dụng trong quá trình thực nghiệm gồm có: phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, khối phổ (HRMS, thực hiện tại trường ĐHTN tp HCM), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR, thực hiện tại trường ĐHTN tp HCM) Trong suốt quá trình thí nghiệm sắc, ký lớp mỏng và sắc ký cột được sử dụng là chủ yếu Sắc ký lớp mỏng theo dõi phản ứng xảy ra và đoán được sản phẩm tạo thành, sắc ký cột chủ yếu dùng cho quá trình tách chất

2.5 Nội dung thí nghiệm

2.5.1 Cô lập acid ursolic từ vỏ táo (apple)

Hình 2 Táo Mỹ (pink)

Gọt vỏ 5 kg táo tươi, xay nhỏ, ngâm trong dung môi hexan 24h để loại bớt những chất kém phân cực Sau đó ngâm trong dung môi ethylacetate (300 ml), sau 24h đem lọc trong máy hút chân không, cô quay dịch lọc, thử sản phẩm bằng sắc kí bảng mỏng Ngâm 4 lần bằng ethylacetate như vậy, thì dịch lọc lần thứ 4 thấy không còn vết sản phẩm acid ursolic, do đó kết thúc việc chiết Chạy cột với hệ dung

môi ethyl acetate: hexane từ 0% – 40% (V: V) ethyl acetate, thu được acid ursolic

2.5.2 Tổng hợp sản phẩm từ Acid Ursolic

2.5.2.1 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2)

Sơ đồ 2.3 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2)

Hòa tan 100mg (0,2 mmol) Acid Ursolic trong 10 ml THF, thêm 0.5 ml

pyridin, 1 mg DMAP, khuấy ở nhiệt độ phòng, thêm 40 µl anhydride acetic (0.4 mmol) Kiểm tra phản ứng bằng săc kí bảng mỏng Sau 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn, đem h ỗ n h ợ p sa u ph ả n ứn g c h i ế t trong 20 ml nước và 20 ml ethylacetate 3 lần, lấy phần ethylacetate (lớp trên) Sau khi làm khan bởi Na2SO4, đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi ethylacetate : hexane bắt đầu từ 0% -40% ethylacetate Sản phẩm thu được là

3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2).

2.5.2.2 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3)

Sơ đồ 2.4 Phản ứng tổng hợp β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid

Hòa tan 50mg (0.10 mmol) (2) trong hỗn hợp gồm 0,75 ml anhydride

acetic và 14,25 ml acid acetic với 20 mg CrO3 (0,2 mmol) , khuấy ở nhiệt độ phòng Kiểm tra phản ứng bằng săc kí bảng mỏng Sau 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn, đem h ỗ n h ợp s a u p hả n ứn g chiết trong 20 ml nước và 20 ml ethylacetate 3 lần, lấy phần ethylacetate (lớp trên) Sau khi làm khan bởi Na2SO4, đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi ethylacetate : hexane bắt đầu từ 0% đến 40% ethylacetate Sản phẩm

thu được là 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3)

2.5.2.3 Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4)

Sơ đồ 2.5 Phản ứng tổng hợp Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4)

Hòa tan 20mg (0.04 mmol) (3) trong 5 ml acetone (CH3CO)2O khuấy khoảng 5 phút thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), và thêm tiếp 10 µl benzylbromide (0,08 mmol), khuấy ở nhiệt độ phòng Sau 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn (TLC), đem hỗn hợp sau phản ứng chiết trong 20 ml nước và

20 ml ethylacetate 3 lần, lấy phần ethylacetate (lớp trên) làm khan bởi Na2SO4 Xong, đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi ethylacetate : hexane từ 0%-30% ethylacetate, thu được sản phẩm là

Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4)

2.5.2.4 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5)

Sơ đồ 2.6 Phản ứng tổng hợp 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5)

Hòa tan 20mg (0.04 mmol) (3) trong 5 ml CH2Cl2, khuấy khoảng 5 phút thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), và thêm tiếp 3ml CH3OH, vừa khuấy vừa đun sôi hỗn hợp trong hệ thống hoàn lưu K i ể m t r a p h ản ứn g b ằ n g sắc ký bản mỏng, sau 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn, acid hóa hỗn hợp sau phản ứng bằng dung dịch HCl 0.1M (đến pH : 3-4), sau đó chiết trong 20 ml nước và 20 ml ethylacetate 3 lần, lấy phần ethylacetate (lớp trên) làm khan bởi Na2SO4 Xong, đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi

ethylacetate : hexane từ 0%-40% ethylacetate Thu được sản phẩm là

3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5)

2.5.2.5 Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6)

Sơ đồ 2.7 Phản ứng tổng hợp Allyl 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6)

Hòa tan 20mg (0.043 mmol) (5) trong 50 ml acetone ((CH3CO)2O), khuấy khoảng 5 phút thêm 27 mg K2CO3 (0,2 mmol), và thêm tiếp 75µl allylbromide (CH2=CHCH2Br 0,086 mmol), khuấy ở nhiệt độ phòng Kiểm tra sắc

ký bản mỏng Sau 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn, đem hỗn hợp sau phản ứng chiết trong 20 ml nước và 20 ml ethylacetate 3 lần, lấy phần ethylacetate (lớp trên) làm khan bởi Na2SO4 Xong, đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi rồi đem chạy cột trong hệ dung môi ethylacetate : hexane từ

0%-40% etyelacetat Sản phẩm thu được là Allyl

3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oate (6)

PHẦN 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

3.1 Cô lập acid usolic

Phần dịch lọc bằng dung môi hexan chứa phần lớn những hợp chất hữu cơ kém phân cực (so với acid ursolic) và một lượng rất ít acid ursolic (vệt màu đỏ phía dưới) (hình 3.1.)

4 : 6 (V:V) (Ethyl acetate: Hexane)

Hình 3.1 Dịch lọc bằng dung môi hexane thể hiện trên bảng mỏng

Phần dịch lọc bằng dung môi ethylacetate (3 lần) có nhiều acid ursolic (vệt màu đỏ bên trái là acid ursolic chuẩn được mua của hãng Sigma-aldrich, vệt màu đỏ bên phải là acid ursolic trong dịch lọc) Trong dịch lọc lần thứ 4 bằng ethylacetate

không còn vệt màu đỏ của acid ursolic (hình 3.2.)

4: 6 (V:V) (Ethyl acetate: Hexane)

Hình 3.2 Dịch lọc bằng dung môi ethyl acetate thể hiện trên bảng mỏng

2 : 8 (V:V) (Ethyl acetate: Hexane)

Hình 3.3 Quá trình chạy cột thể hiện trên bảng mỏng

Kết quả thu được 1.2 g sản phẩm( tinh thể màu trắng) /5 kg quả táo tươi kết quả phân tích phổ được trình bày ở bảng 3.1

Acid Ursolic chuẩn Acid Ursolic

chuẩn

3: 7 (V: V) (Ethyl acetate: Hexane)

Hình 3.4 Acid ursolic sau khi chạy cột Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của sản phẩm acid ursolic (1)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3 + DMSO-D6), δ (ppm): 5.12 (t, 1H, 3J = 3.2 Hz,

CH-12), 3.0 (dd, 1H, 3J = 10.3, 5.6 Hz, CH-3), 2.11 (d, 1H, 3J = 11.3 Hz, CH-18),

1.90 ( td, 1H, 3J = 13.3, 3.8 Hz, CH2(β)-15), 1.83 (m, 3H, CH2-22, CH2(α)-16), 1.60 (m, 4H, CH2(α)-6, CH2(β)-1, CH2(β)-16, CH2(β)-21), 1.38-1.48 (m, 5H, CH2(α)-15,

1.51-CH2(β)-6, CH2(α)-7, CH2(α)-9, CH2(α)-21), 1.23-1.32 (m, 4H, CH2-2, CH-19, CH2(α)-7), 1.03 (s, 3H, CH3-27), 0.98 (d, 1H, 3J = 13.4 Hz, CH-20), 0.89-0.94 ( m, 8H, CH3-29,

CH3-23, CH2-11), 0.86 (s, 3H, CH3-26), 0.81 (d, 3H, 3J = 6.4 Hz, CH3-29), 0.75 (s, 3H, CH3-24), 0.67 (s, 3H, CH3-25), 0.65 (d, 1H, 3J = 11.9 Hz, CH-5) Phụ lục 1a

13

C NMR (125 MHz, CDCl3 + DMSO-D6), δ (ppm): 183.5 28), 143.3 13), 129.8 (C-12), 82.1 (C-3), 60.0 ( C-5), 57.6 ( C-18), 52.1 (C-17), 46.9 (C-9), 43.7 (C-1, C-4), 43.6 (C-8), 43.5 (C-22), 41.7 (C-10), 41.5 (C-7), 37.9 (C-21), 35.5 (C-23)33.4 (C-2), 32.7 (C-15), 32.1 (C-16), 29.0 (C-27), 28.4 (C-11), 28.0 (C-30), 26.3 (C-6), 23.2 (C-29), 22.1 (C-24), 21.2 (C-26), 20.4 (C-25) 3 mũi C-19, C- 20, C-14 nằm lẫn trong vùng dung môi CDCl3 Phụ lục 1b

(C-Trong phổ 1H NMR không phát hiện mũi của H (COOH) và H (OH) tại những

vị trí nhất định, vì đây là những nguyên tử H tương đối linh động Tại vị trí CH-12

có liên kết đôi nên nguyên tử H có độ dịch chuyển hóa học xa hơn so với các mũi

còn lại và tiếp đến là mũi của H (OH) vì gần nguyên tử Oxi có độ âm điện mạnh

Trong phổ có đủ 5 mũi đơn tương ứng với 5 nhóm CH3 (CH3-23 đến CH3-27) và 2

mũi đôi ứng với 2 nhóm CH3 (CH3-29, CH3-30) Trong phổ 13C NMR cũng có đầy

đủ các mũi của các nguyên tử C tương ứng Kết quả phân tích phổ phù hợp với kết

quả trong tạp chí đã đăng [8]

3.2 Tổng hợp các sản phẩm của Acid Ursolic

3.2.1 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2)

3: 7 (V: V) Sản phẩm (2) sau khi chạy cột

(Ethyl acetate: Hexane) 3: 7 (V: V)

Sau24h phản ứng (Ethylacetate: Hexane)

Hình 3.5 Kết quả tạo sản phẩm (2) thể hiện trên bản mỏng

Vì H của OH (C-3) đã được thay bằng nhóm CH3CO- làm cho phân tử kém

Sản phẩm (2),

Rf = 0.55 Acid ursolic

(1), Rf = 0.32

phân cực hơn nên Rf (2) > Rf (1)

Kết quả thu được 97 mg (0.195 mmol), hiệu suất 89% Kết quả phân tích phổ

của sản phẩm (2) 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ sản phẩm 3β-acetoxy-urs-12-en-28-oic acid (2)

13

C NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 183.2 28), 170.9 1’), 137.9 13), 125.7 (C-12), 80.9 (C-3), 55.3 (C-5), 52.5 (C-18), 47.9 (C-17), 47.5 (C-9), 41.9 (C-14), 39.5 (C-8), 39.04 (C-20), 38.8 (C-19), 38.3 (C-1), 37.7 (C-4), 36.9 (C-22), 36.7 (C-10), 32.8 (C-7), 30.6 (C-21), 28.08 (C-15), 28.01 ( C-23), 24.1 (C-16), 23.6 (C-27, C-11), 23.3 (C-2), 21.2 (C-30), 21.1 (C-2’), 18.2 ( C-24), 17.1 (C-6), 16.98

(C-(C-29), 16.8 (C-26), 15.5 (C-25) Phụ lục 2b

Trong phổ 1H NMR xuất hiện mũi đơn tại vị trí 2.04 (s, 3H, CH3-2’), trong phổ 13C NMR xuất hiện mũi tại vị trí 170.9 (C-1’) và tại vị trí 21.1 (C-2’) chứng tỏ nguyên tử H của HO-C-3 đã được thay bởi nhóm CH3-COO Phổ NMR phù hợp với tạp chí đã đăng [8].Trong phép đo khối phổ ta cũng nhận được kết quả nằm trong

dự đoán, HRMS (ESI-MS, m/z), (M+Na)+, C32H50O4Na, lý thuyết: 521.3607, kết quả

đo: 521.3604 Phụ lục 2c

3.2.2 Phản ứng tổng hợp 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3)

3:7(v:v) (Ethyl acetate:Hexane) Sau 24h phản ứng

Hình 3.6 Kết quả tạo sản phẩm (3) thể hiện trên bản mỏng

Hai nguyên tử H tại C-11 được thay bằng nguyên tử Oxi làm cho phân tử trở nên phân cực hơn, do đó Rf(3) < Rf (2)

Kết quả thu được 43 mg (0.084 mmol), hiệu suất 84% Kết quả phân tích phổ NMR của sản phẩm (3) 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid được trình bày

ở bảng 3.3

Trước phản ứng

(2),

Sản phẩm (3),

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ sản phẩm 3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oic acid (3)

1

H NMR (500MHz, CDCl3), δ (ppm): 5.59 (s, 1H, CH-12), 4.50 ( dd, 1H, 3J

= 11.7, 4.8 Hz, CH-3), 2.8 (tt, 1H, 3J = 13.7, 3.4 Hz, CH2(α)-1), 2.38 ( d, 1H, 3J =

11.2 Hz, CH-18), 2.3 (s, 1H, CH-9), 2.08 (dd, 1H, 3J = 13.8, 4.6 Hz, CH2(β)-15), 2.04 (s, 3H, CH3COO), 1.87 (dd, 1H, 3J = 13.8, 4.6 Hz, CH2(α)-16), 1.52-1.71 (m, 7H, CH2(α)-6, CH2(β)-21, CH2(β)-22, CH2(α)-21, CH2(β)-1, CH2(α)-15, CH2(α)-16), 1.37 (m, 3H, CH2(β)-6, CH2-2), 1.29 (s, 3H, CH3-27), 1.26 (m, 2H, CH2(β)-7, CH-19), 1.15 ( s, 3H, CH3-26), 1.08 (m, 2H, CH2(α)-7, CH-20), 0.97 (d, 3H, 3J = 6.4 Hz, CH-

3-29), 0.89 (s, 3H, CH3-23), 0.88 (d, 3H, 3J = 6.7 Hz, CH3-30), 0.86 ( s, 3H, CH324), 0.85 (s, 3H, CH3-25), 0.79 (d, 1H, 3J = 11.0 Hz, CH-5) Phụ lục 3a

-13

C NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 199.8 (C-11), 182.1 (C-28), 170.9 (C-1’), 162.5 (C-13), 130.8 (C-12), 80.6 (C-3), 61.4 (C-9), 55.1 (C-5), 52.5 ( C-18), 47.5 ( C-17), 44.7 (C-14),43.7 ( C-8), 38.8 (C-20), 38.6 (C-19), 38.5 (C-1), 38.0 ( C-4), 37.1 (C-22), 36.05( C-10), 32.9 (C-7), 30.25 ( C-21), 28.4 (C-15), 28.1 (C-23), 23.6 (C-16), 23.58 ( C-27), 21.2 (C-2), 21.06 (C-30), 20.9 ( C-2’), 19.2 (C-24),

3.2.3 Phản ứng tổng hợp Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4)

2:8 (v:v) (Ethyl acetate:Hexane) Sau 24h phản ứng

Hình 3.7 Kết quả tạo sản phẩm (4) thể hiện trên bảng mỏng

Nguyên tử H của nhóm COOH đã được thay bằng nhóm benzyl làm cho phân tử ít phân cực hơn nên Rf(4) > Rf(3)

Kết quả thu được 21mg (0.035mmol), hiệu suất 90% Kết quả phân tích phổ

NMR của sản phẩm (4) Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate ở bảng 3.4

Trước phản ứng (3), Rf = 0.4

Sản phẩm (4),

Rf = 0.75

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ sản phẩm Benzyl-3β-acetoxy-urs-11-oxo-12-en-28-oate (4)

1

H NMR ( 500 MHz, CDCl3), δ (ppm): 7.32-7.38 (m, 5H, C6H5-), 5,62 (s,1H, CH-12), 5.07 (s, 2H, CH2-1’’), 4.53 (dd, 1H, 3J = 11.8, 4.7 Hz, CH-3), 2.80 ( dt, 1H,

-13

C NMR (125 MHz, CDCl3), δ (ppm): 199.4 (C-11), 176.4 (C-28), 170.98 (C-1’), 162.5 (C-13), 135.8 (C-2’’), 130.8 (C-12), 128.2-128.6 (C-3’’, C-4’’, C-5’’, C-6’’, C-7’’), 80.6 (C-13), 64.4 (C-1’’), 61.3 (C-9), 55.07 ( C-5), 52.8 ( C-18), 47.7 (C-17), 44.6 (C-14), 43.75 (C-18), 38.8 (C-20), 38.6 (C-19), 38.6 (C-1), 38.02 (C-4), 37.01 (C-22), 35.98 (C-10), 33.03 (C-7), 30.3 (C-21), 28.3 (C-15), 28.1 (C-23), 23.9 (C-16), 23.6 (C-27), 21.3 (C-2), 20.96 (C-2’), 18.9 (C-24), 17.4 (C-6), 17.1 (C-

25), 16.7 (C-26), 16.3 (C-29) Phụ lục 4b

Trong phổ 1H NMR có sự xuất hiện các mũi của các nguyên tử H của nhóm

C6H5- tại vị trí 7.32-7.38, và một mũi đơn của 2 nguyên tử H tại vị trí 5.07 (s, 2H,

CH2-1’’) Hơn nữa, trong phổ 13C NMR, cũng xuất hiện các mũi tại 128.2-128.6 3’’, C-4’’, C-5’’, C-6’’, C-7’’) và 64.4 (C-1’’) điều đó cho thấy tại vị trí C-28 đã bị ester hóa bởi nhóm benzyl Trong phép đo khối phổ ta cũng nhận được kết quả phù hợp với dự đoán, HRMS (ESI-MS, m/z), (M+H)+, C39H55O5, lý thuyết: 603.3405,

(C-kết quả đo: 603.4047 Phụ lục 4c

3.2.4 Phản ứng tổng hợp 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid (5)

5: 5(v:v) (Ethyl acetate:Hexane) Sau 24h phản ứng

Hình 3.8 Kết quả tạo sản phẩm (5) thể hiện trên bản mỏng

Nhóm chức este đã bị thủy phân trả lại nhóm OH nên phân tử phân cực hơn, do đó

Rf(5) < Rf(3)

Kết quả thu được 16 mg (0.034 mmol), hiệu suất 88% Kết quả phân tích phổ

của sản phẩm (5) 3β-hydroxyurs-11-oxo-12-en-28-oic acid ở bảng 3.5

Trước phản ứng

f = 0.4