Nghiên cứu điều chế Acid Glycyrrhizic và Acid Glycyrrhetic từ cam thảo để làm chất chuẩn

Xuất phát từ iihững lý do ưên, chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm thiết lập được hai chất chuẩn axít glycyrrhizic và axít glycyrrhetic có chất lượng cao dùng trong công tác kiểm tra ch[r]

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ ACID GLYCYRRHIZIC VÀ ACID GLYCYRRHETIC TỪ CAM THẢO ĐẺ LÀM CHÁT CHUẢN

DS Phạm Quỳnh Khoa*; DS Bùi Thị Châu P hư n g*

Hướng dẫn: GS.TS Nguyễn M inh Bức*

TÓM TẲT

Cam thảo và hoạt chất chính axít glycyrrhizic (GA) đirợc sử dụng phổ biến hiện nay, có mặt trong hầu hết các bài thuốc, toa thuốc Hiện nay Irên thị trường, Cam thảo hầu hét được nhập lừ Trung Quốc với nguồn gốc, xuất xứ và chất lượng còn nhiều bất cập V vậy, để Iránh việc sử dụng sàn phẩm kém chất lượng, đòi hỏi phải có phương pháp kiêm nghiệm dược ỉiệu Cam thảo và chê phâm Ngày nay, có nhiêu phương pháp kiểm nghiệm đáng tin cậy như phương pháp sắc ký, đặc biệt là sãc ký lỏng hiệu năng cao Những phương pháp này đòi hỏi phải có chât chuân đê đảm bào kết quà phân tích chính xác và tin cậy Xuât phát từ những lý do írên, chúng tôi thực hiện đê tài này nhăm phục vụ cho công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu Cam ihảo và chế phẩm với mục tiêu: Xây dựng quy

trìnhchiếtxuẩt,phânlậpvàtinhkhiếthaaxítglycyrrhizic(GA)vàaxítgỉycyrrhtic(GH)từCamthảođểlàmchuẩn, đồngthờitiếnhànhđánhgiáhaichattrênvớiđầyđùcấcchỉtiêuhalývàđịnhhcợng.

Đối tượng và phương pháp nghiên cún: Dược liệu Cam Ihảo được chiết với elhanoỉ 30% Irong b nh hồi lưu Phân lập axít glycyrrhizic từ cao cồn Cam thào bằng phương pháp HPLC điều chế Thu được axít glycyrrhetic lừ thủy phân axít glycyrrhizic thô, phân ỉập qua sắc ký cột và kết linh nhiều lần trong MeOH

Kết quả: Đã xây đựng và hoàn thiện quy tr nh chiết xuất, phân lập và tinh khiết hóa axít glycyrrhizic và axít glycyrrhelic íừ Cam Ihảo Kiểm tra và đánh giá hai chất chuẩn đã điều chế theo các tiêu chí đánh giá chất chuẩn như: SKLM, điểm chảy, phổ UV­Vis, phổ TR, phổ MS và phổ NMR và định lượng

Kết luận: Các chất chuẩn điều chế có độ l nh khiết cao, đù điều kiện để ỉàm chất chuẩn đối chiểu

* Từ khóa: Chất chuẩn; Cam thảo; Axít glycyrrhizic; Axít glycyrrhetic

P r pa ra tion o f r f r n c S ta n d ard o f g lyc yr rh izic a c id a n d g ly cy rrh tic a c id fr o m licoric

Sum m ary

Licorice as well as its active substance such as GA have been used widely in traditional medicine and in pharmaceutical At the moment, licorice used in Vietnam is mostly imported from China wilh unidentified origin and quality Therefore, to avoid the use of poorly qualified products, it is necessary to build up quality control methods for licorice and its products Nowadays, there are many reliable quality control methods such as chromatographic methods, especially high performance liquid chromatography (HPLC) These methods often require reference standards lo ensure accurate and reliable analytical results The aim of this study is to prepare the reference standards of GA and

GH to serve research works, quality control and standardization of licorice and its products with the following objectives: Establishing method for extraction, isolation and purification of glycyrrhizic acid (GA) and glycyrrhetic acid (GH) from licorice to be used as reference standards, along with checking the isolated substances with physicochemical criteria for reference standards and quantitative test

Materials and method: This powder of licorice was extracted with ethanol 30% in a percolator GA was isolated with preparative HPLC Crude GA was hydrolized by acid to obtain crude GH then il was separated by column chromatography and crystallized many times in methanol

Results: This study established a stable and repeatable method for extraction, isolation and purification of glycyrrhizic acid (GA) and glycyrrhetic acid (GH) from licorice to be used as reference standards The reference standards were evaluated based on criteria including determination of chemical and physical criteria such as thin layer chromatography, melting point, UV­Vis, IR, MS and NMR spectrum, quantitative test

Conclusion: The isolated reference standards including GA and GH are of high quality and meet the requirement for a primary standard

* Key words: Reference standard; Licorice; Glycyrrhizic acid; Glycyrrhetic acid

* Đại học YDược TP HCM

653

Cam thảo là một trong những dược liệu được sử đụng phổ biến nhất hiện nay, có mặt trong hầu hết các bài thuốc, toa thuốc Nguồn Cam thảo trên thị trường hầu hết được nhập từ Trung Quốc với nguồn gốc, xuất

xứ và chất lượng còn nhiều bất cập

V vậy, để tránh việc sử dụng các sản phẩm giả, kém chất lượng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng, việc xây dựng các phương pháp kiểm nghiệm được liệu Cam thảo và các chế phẩm vô cùng quan trọng Hiện nay, những phương pháp phân tích hiện đại như quang phổ tử ngoại khả kiến, quang phổ hồng

pháp kiểm nghiệm đáng tin cậy Tất cả những phương pháp trên đều cần có chất chuẩn để đảm bảo kết quà phân tích đạt độ chính xầc Tuy nhiên, các chất chuẩn axít glycyrrhizic và axít glycyrrhetic hiện nay chủ yếu được nhập từ nước ngoài với giá thành cao, đặc biệt là chuẩn gốc và thời gian đặt hàng kéo dài vài tuần, thậm chí vài tháng, gây ra rất nhiều khó khăn cho công tác kiểm nghiệm Cụ thể, giá của chất chuẩn axít acid glycyrrhizic và axít acid glycyrrhet c của Công ty Chromadex trên thị trường Ịần ỉượt là 47,03 USD (100 mg) và 85,50 USD (10 mg)

Xuất phát từ iihững lý do ưên, chúng tôi nghiên cứu đề tài này nhằm thiết lập được hai chất chuẩn axít glycyrrhizic và axít glycyrrhetic có chất lượng cao dùng trong công tác kiểm tra chất lượng dược liệu Cam thảo và các chế phẩm chứa Cam thảo nói chung, cũng như hai chất trên nói riêng

n ĐỐI y ị P ỉ iĩ f Ơ N G PHÁP n g h i ê n c ứ u

2.1 Đốỉ tưọiìg nghiên cứu

­ Rễ Cam thảo được mua từ Bệnh viện Y học c ổ truyền TP Hồ Chí Minh Thời gian thu mua

25 ­ 03 ­ 2013

­ Chất đối chiếu, tran g thiết bị, hóa chất, đung môi:

+ Chuẩn GA: Chuẩn thứ cấp (SH) của Công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00007374­M3D, hàm lượng 75,1%

4­ Chuẩn axít 18p­glycyrrhetic: Chuẩn sơ cấp (p) của Công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00007370­910, hàm lượng 97,3%

­ Trang thiết bị:

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC­20A (Nhật), detector PDA

+ Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR­8201PC (Nhật)

+ Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhãn Broker 500 MHz NMR (Mỹ)

­f Máy đo khối phổ Bruker |iQ­TOF MS (Mỹ)

­ Hóa chất, dung môi phù hợp với mục đích sử đụng

2.2 Phương pháp nghiên cứ u

Kiểm nghiệm nguyên liệu: Dược l ệũ Cam thảo được kiểm nghiệm theò Dược điển Việt Nam (DĐVN) IV (2009) [3]

Điều ché GA: Làm ẩm ỉ kg dược liệu với 300 ml EtOH 30% trong 4 giờ Đun hồi lưu trong 60 phút X3 lần rút địch chiết, lọc qua giấy lọc và cô cách thủy dịch lọc còn lại 1/3 thể tích, để nguội Axít hóá bằng H C Í10% đến

pH ỉ ­ 2, tạo tủaGA, làm lạnh trong 30 phút, gạn bỏ nước, thu tủa và rửa tủa bằng nước đển khi địch rửa không còn axít Hòa tủa với EtOH 96%, lọc qua phễu Buchner, rửa lọc bằng EtOH 96% đển khi hết màu vàng eô cách thủy dịch lọc để ỉoại bớt EtOH, sấy chân không ờ nhiệt độ 60°c đến cắn, thu được cao khô GA (100 g) Cân 100

g cao khô GA cho vào b nh nón nút mài, chiết bằng aceton X3 ỉần, mỗi lần chiết trong 2 giờ ở nhiệt độ 56 ­ 57°c

I ĐẶT VẤN Đ

654

thu dịch chiết, lọc qua phễu Buchner Kiềm hóa dịch ỉọc bằng đung dịch KOH 10% trong MeOH đển pH ~ 9, thu tủa GA 3K, lọc lấy tủa và rửa tủa ỉần ỉưọt với aceíon (300 ml), methanol (300 mỉ), sau đó sẩy chân không ờ nhiệt

độ60°c.Hòa tan hoàn toàn muối GA 3K trong axít acetic băng ở nhiệt độ 95­100°c, để nguội, kết tinh Lọc lấy tinh thể muối GA 1K, rửa lần ỉượt bằng axít acetic băng, methanol, ether ethyỉic, để khô tự nhiên (*), thu được muối GA 1K Két tinh muối GA 1K trong ethanol ­ nước (tỷ lệ 5:1) (**) Lặp lại quy tr nh lọc (*) và kết tinh (**) như trên thêm 2 lần nữa Axít hóa muối GA 1K bằng dung dịch H2SO41% ở 100°c trong 20 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc lấy tủa, rửa tủa với nước đến khi dịch rửa hết axíÈ, sấy chân không trong 3 giờ ở60°c.GA thu được khuấy trộn với cloroform, lọc lấy tủa, sấy chân không trong 1 giờ ở Ố0°c, thu được GA [2], GA thu được sau quá tr nh loại tạp được tinh chế bằng sắc kỹ ỉòng hiệu năng cao, điều chế thu được 0,820 g

Điều chế GH: Muối GA 1K thu được sau quá tr nh loại tạp được thủy phân bằng HC1 7%, rửa cắn bằng nước đến khi hết axít, ỉắc vói cloroform, lọc lẩy dịch đoroíorm, cô thu hồi dung môi thu được cao GH Cao

GH được phân lập bằng sắc ký cột với hệ điciorometan ­ methanoỉ vói độ phân cực tãng đần, thu lấy phân đoạn chứa GH, cô thu hồi dung môi và kết tinh nhiều lần trong methanol thu được 0,230 g

Đánh giá GA và GH điều chế:

­ Định tính và xác định cấu trúc: sắc ký lóp mỏng, HPLC phân tích, điểm chảy, phổ IR, phổ MS và phổ NMR

­ Định iượng: Khảo sát và đánh giá quy tr nh định lượng cho hai chất chuẩn điều chế, xác định hàm lượng của hai chất chuẩn điều chế

III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kiểm nghiệm nguyên liệu

Định danh: Các chỉ tiêu kiểm nghiệm đều phù họp với mô tả trong DĐ VNIV

Định lượng: Hàm lượng cắn chứa GẠ chiếm 13,1% tính theo dược liệu khô kiệt, phù hợp với DĐVNIV 3.2 Đánh giá GA và G H điều chế

3

sấy 105°c trong 5 phút H nh 1 Sắc ký lớp mỏng GA (C: Chuẩn, T: Thử)

Pha động: 1: Cloroform ­ ethanol ­ axít acetic (40:10:26)

2: Cloroform ­ methanol ­ nước ­ axít acetic (64:20:10:20)

3: n­butanol ­ nước ­ methanol ­ axít acetic (70:20:10:10)

GA điều chế chí cho một vết duy nhất có h nh dạng, màu sắc và Rftương ứng với vết GA chúẩn

HPLC phân tích: Tiển hành tiêm ỉần lượt dung địch mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký

3.2.2 Đánh giá GA

Bột vô định h nh, màu trắng, không mùi (820 mg)

­ Sắc ký lóp mỏng:

1* ' IM.ta.'

»

H nh 2 Sắc ký đồ HPLC định tính GA mử (a) và chuẩn (b) Thòi gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thừ là 17,1 phút, trùng với thời gian lưu pic GA chuẩn

­P hổ UV­Vis:

H nh 3 Phổ ƯV­Vis của GA thử (a) và chuẩn (b) Phổ UV­Vis của GA thử trùng với phổ ƯV­Vis của GA chuẩn vói đỉnh hấp thu cực đại 254 nm

Phổ HR­MS: Phổ HR­MS của GA điều chế cho pic ion phân tử giả [M + Na]+845,3949 m/z; phù họp với công thức phân tử C42IÍ62O16của GA

mỉ*)*,

*10*iã

ICO 075 0.30 0.25

Qùữ

•U8.

H nh 4 Phổ HR­MS của axít glycyrrhizic điều chế Phổ NMR:

H nh 5 Công thức phân từ GA Bảng 1 So sánh dữ liệu phổ 13C­NMR (125 MHz, 5 = ppm, C5Đ5N) và 1H­NMR (500MHz, 5 = ppm, C5D5N) của GA điều chế với GAtheo tài iiệu [1]

5 0,76 55,87 0,76 55,6 26 ỉ ,04 19,23 1,06 18,9

ỈO ­ 37,67 ­ 37,4 1’ 5,04 (d, I ­ 7,5) 105,58 5,03 (đ, J = 7,9) 105,1

16 2,09; 0,93 27,20 2,09; 0,96 26,7 1” 5,42 (d,J =7,5) 107,42 5,37(d, J = 7,9) 106,9

Dữ liệu phổ n C­NMR và ^ ­N M R của GA điều chế phù hợp với GA theo tài liệu

­ Định lượng:

Điều kiện sắc ký [4]:

Cột: RP C18 250X4,6 mm, kích thước hạt 5J im ; pha động: Hỗn hợp dung môi gồm dung dịch axít acetic loãng (1 ml axít acetic với 14 ml nước) và acetonitril (tỷ lệ 3:2); tốc độ dòng: 1 m /phút; detector:u v 254 nm; nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; thể tích bơm: 20 |il; dung môi pha mẫu: Pha động

\ ­A

H nh 6 Sắc ký đồ HPLC định lượng GA thử (a) và chuẩn (b) Bảng 2 Hàm lượng GA điều chế

Xtb ­ 99,1 ỉ% RSD ­ 0,2043%

Mầu GA điều chế có hàm lượng trung b nh 99,11% Như vậy, GA điều chế đủ điều kiện để làm chuẩn đối chiếu và có độ tinh khiết cao (chuẩn GA (SH) của công ty Chromadex (Mỹ) ch có độ tinh khiết 75,1 %)

657

Tinh thể trắng, h nh kim, không mùi (230 mg).

­ Sắc ký lớp mỏng:

3.2.3 Đánh giá GH

ƯV254 nm

ưv 365 nm Axít H2SO410%/ElOH,

sấy 105°c trong 5 phút

H nh 7 Sắc ký lóp mỏng GH (C: Chuẩn, T: Thử) Pha động: 1; Cloroform ­ methanol (10:0,5)

2: Cloroform ­ methanol ­ n­hexan (70:10:20)

3: n­butanol ­ ethanol ­ amoniac 2M (60:20:10)

GH điều chế ch cho một vết duy nhất có h nh dạng, màu sắc và Rf tương ứng với vết GH chuẩn

Điểm chảy: Két quả đo điểm chảy GH là293°cnằm trong giới hạn cho phép (292 ­ 295°C) [5]

HPLC phân tích: Tiến hành tiêm lần lượt dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử vào hệ thống sắc ký

Ò­IẢ&

ị

I

H nh 8, Săc ký đồ HPLC định tính GH thử (a) và chuẩn (b) Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ mẫu thử là 29,8 phút, trùng với thòi gian lưu pỉc GH chuẳn

­ Phổ UV­Vis:

í A

A

V

300

H nh 9 Phổ ƯV­Vis của GH thử (a) và chuẳn (b) Phổ ƯV­Vis của GH thử trùng với phổ UV­Vis của GH chuẩn với đỉnh hấp thu cực đại 250 nm

­PhỔHR­MS:

Phổ HR­MS của GH điều chế cho pic on phẫn tử giả [M 4­ N a f 493,3262 m/z, phù hợp với công thức phân tử C3oH4604CỦa GH

»1«

o e

° '

0 4 , » » « ­’’f 40

H nh 10 Phổ HR­MS củaGH điều ché

658

­ Phổ NMR:

H nh 11 Công thức phân tử GH Bảng 3 So sánh dữ liệu phổ 13C­NMR (125 MHz, 5 = ppm, CDC13) và 1H­NMR (500 MHz, 5 = ppm, CDC13) cùa GH điều chể với GH theo tài liệu [6]

Phổ 3C­NMR của GH điều chế phù hợp GH theo tài liệu

Định lượng:

Điều kiện sắc ký: Cột: RP C18 250 X4,6 mm, kích thước hạt 5 pm; pha động: Acetonitril ­ dung dịch

H3PO40,5% (tỷ lệ 60:40); tốc độ dòng: 0,8 ml/ phút; detector: ƯV 250 nm; nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; thể tích bơm: 2 01*1; dung môi pha mẫu; Acetonitril

Đánh giá quy tr nh định lượng: Quy tr nh định lượng HPLC trên được thiết lập và đánh giá bao gồm các chỉ tiêu: Tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ lặp lại và độ đúng Tất cả các chi tiêu trên đều đáp ứng yêu cầu phân tích

H nh 12 Sắc ký đồ định lượng HPLC của GH thử (a) và chuẩn (b)

Bảng 4 Hàm ỉượng GH điều chế

M ẫu Hàm lưọng (% ) Hàm u­ọng tru n g b nh (% )

Xaverage = 98,07% RSD = 0,2575%

5 r»r\ A98,21«

Mau GH điều chế có hàm lượng trung b nh 98,07% Như vậy, GH điều chế đủ điều kiện để làm chuẩn đối chiếu và có độ tinh khiết cao (chuẩn GH (p) của công Ey Chroraađex (Mỹ) chỉ có độ tinh khiết 97,3%)

IV K ẾT LUẬN

Nghiên cứu đã thu được những kết quả sau đây:

­ Điều chế được 820 mg GA và 230 mg GH đạt hàm lượng 99,11% và 98,07% tính theo nguyên trạng, cao hơn chất chuẩn đối chiếu mua từ công ty Chromađex (Mỹ) (GA (SH): 75,1%; GH (P): 97,3%), đủ điều kiện để làm chất chuẩn đối chiếu

­ Kiểm tra và đánh giá hai chất chuẩn đã điều chế theo các tiêu chí đánh giá chất chuẩn như: SKLM, điểm chảy, phổ ƯV­Vis, phổ IRt phổ MS, phổ NMR và định lượng Kết quả cho thấy các chất chuẩn điều chế đạt tất cả các tiêu chí đánh giá

­ Xây dựng và hoàn thiện quy tr nh chiết xuất, phân lập và tinh khiết hóa GA và GH ổn định và có tính lặp lại, thuận lợi cho việc áp dụng để tiếp tục sản xuất với số lượng lớn hơn để đưa vào thẩm định và áp dụng rộng rãi

ỉ Baltina LA High ­ resolution 'h and 13c NMR of glycyrrhizic acid and its esters Chemistry of Natural Compounds 2005,41 (4), pp.433­434

2 Baltina LA, S rdyuk NG, Krasnova LV, Kondrat nko RM, Tolstỉkov GA Preparation of glycyrrhizic acid from licorice extracts Pharmaceutical Chemistry Journal 1994, 28 (9), pp.5 i­54

3 Bộ Y tế Dược điển Việí Nam, tập IV Nhà xuất bản Y học Hà Nội 2010, tr.705­706, phụ lục 105

4 FDA U.S Pharmacopoeia (ƯSP) 2009, p.1041,

5 Murav' v A, Savch nko LN Preparation of glycyrrhetinic acid from extracts of licorice root The Pyatigorsk Pharmaceutical Institute Í979, 13 (5), pp.97­102

6 Tolstikov GA 3C~NMR Spectta of a number of penta­ and hexacyclic iriterpenoids derived from glycyrrhelic acid Institute of Chemistry, Bashkir Branch, Academy of Sciences of the USSR, Ufa., 1985, 5, pp.645­653