Nhận xét tình trạng đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017

Cũng theo tác giả này, nguyên nhân gây ung thƣ phổi ở bệnh nhân trẻ tuổi liên quan nhiều tới các đột biến gen nhƣ EGFR, ALK, ROS1… do vậy khi chẩn đoán đột biến gen ở bệnh nhân t[r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

BÙI THỊ HOÀI THU

NHẬN XÉT TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƢ PHỔI KHÔNG PHẢI TẾ BÀO NHỎ GIAI ĐOẠN IV TẠI BỆNH VIỆN

BẠCH MAI NĂM 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

BÙI THỊ HOÀI THU

NHẬN XÉT TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ PHỔI KHÔNG PHẢI TẾ BÀO NHỎ GIAI ĐOẠN IV TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Tiến Lung và ThS.BS Huỳnh Thị Nhung, là những người thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em thực hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, là những người đã tận tình truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những thầy cô, đồng nghiệp, những người đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận: PGS.TS Lê Thị Luyến (Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội); GS.TS Mai Trọng Khoa, PGS.TS Trần Đình Hà, PGS.TS Phạm Cẩm Phương (Trung tâm Y học hạt nhân và Ung Bướu, Bệnh Viện Bạch Mai) cùng toàn thể các bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai đã giúp đỡ em trong quá trình thu thập số liệu phụ vụ cho nghiên cứu

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè đã

giúp đỡ và ủng hộ em trong quá trình học tập

Tuy nhiên vì kiến thức chuyên môn còn hạn chế và bản thân còn thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung của khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận sự góp ý để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 05 năm 2018

Bùi Thị Hoài Thu

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu/từ viết tắt Viết đầy đủ/ý nghĩa

AJCC American Joint Committee on Cancer (Ủy ban

liên hiệp Ung thư Hoa Kỳ) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu

tố tăng trưởng biểu bì) ESMO European Society for Medcical Oncology (Hiệp

hội Ung thư học châu Âu) NCCN National Comprehensive Cancer Network (Mạng

lưới Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại

chuỗi) PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase PTEN Phosphatase and tensin homolog TKI Tyrosine kinase inhibitor (Ức chế tyrosine kinase) TMN T: tumor; M: metastasis; N: lymph node

SUV max Maximum Standardized Uptake Values UICC Union for International Cancer Control (Liên hiệp

kiểm soát ung thư quốc tế) UTPKPTBN Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế

giới)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG PHẢI TẾ BÀO NHỎ (UTPKPTN) 3

1.1.1 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ 3

1.1.2 Triệu chứng 3

1.1.3 Chẩn đoán 5

1.1.4 Các phương pháp điều trị 7

1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ 9

1.2.1 Cấu trúc EGFR 9

1.2.2 Hoạt động và chức năng EGFR 10

1.2.3 Đột biến gen EGFR 11

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa 20

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.2.2 Cỡ mẫu 20

2.2.3 Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu 21

2.2.4 Thời gian nghiên cứu 21

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 21

2.2.6 Các bước thực hiện 22

2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ 27

3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 27

3.1.2 Đặc điểm u nguyên phát và tổ chức di căn 28

3.1.3 Giá trị SUV max và chất chỉ điểm khối u 30

3.1.4 Đặc điểm mẫu xét nghiệm đột biến gen 31

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR 31

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

3.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT

BIẾN EGFR 32

3.3.1 Mối liên quan giữa đột biến gen EGFR với đặc điểm bệnh nhân 32

3.3.2 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm mẫu bệnh phẩm 32

3.3.3 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với tình trạng bệnh 33

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN 35

4.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 35

4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 35

4.1.2 Đặc điểm cận lâm sàng 36

4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR 38

4.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR 40

4.3.1 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen EGFR với đặc điểm bệnh nhân 40

4.3.2 Mối liên quan giữa tình trạng đột biến EGFR với tình trạng bệnh 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

KẾT LUẬN 44

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC - 1 -

PHỤ LỤC 1 PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU - 1 -

PHỤ LỤC 2 DANH SÁCH BỆNH NHÂN - 3 -

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR 10

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 11

Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR 12

Hình 1.4 Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến EGFR L858R 14

Hình 1.5 Kết quả Real Time PCR xác định đột biến EGFR T790M 15

Hình 1.6 Phát hiện đột biến gen EGFR bằng phương pháp lai đầu dò 16

Hình 3.1 Lý do vào viện của đối tượng nghiên cứu 28

Hình 3.2 Đặc điểm giai đoạn T và N 28

Hình 3.3 Giá trị SUV max trung bình 30

Hình 3.4 Tỷ lệ phát hiện đột biến gen EGFR 31

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKPTBN theo AJCC 2010 7

Bảng 2.1 Các đột biến EGFR được phát hiện theo kit EGFR XL StripAssay 25

Bảng 3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 27

Bảng 3.2 Đặc điểm khối u tại phổi và các tổ chức di căn 29

Bảng 3.3 Kết quả xét nghiệm chất chỉ điểm khối u trong huyết thanh 30

Bảng 3.4 Phương pháp và vị trí lấy mẫu xét nghiệm 31

Bảng 3.5 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 32

Bảng 3.6 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm mẫu bệnh phẩm 33 Bảng 3.7 Mối liên quan giữa đột biến EGFR với tình trạng bệnh 33

Bảng 3.8 Phân bố đột biến gen EGFR theo một số nghiên cứu 39

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi hay ung thư phế quản là bệnh lý ác tính phát triển từ biểu

mô phế quản, tiểu phế quản, phế nang hoặc từ các tuyến của phế quản [11], trong đó ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) chiếm đa số với 85% [7] Chẩn đoán sớm UTPKPTBN thường khó khăn do triệu chứng lâm sàng nghèo nàn và không đặc hiệu Khi bệnh đã ở giai đoạn muộn, có di căn

xa, phương pháp điều trị chủ yếu là hóa trị và điều trị triệu chứng Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các thuốc ức chế tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor – TKI) có thể giúp trì hoãn bệnh tiến triển và cải thiện chất lượng

sống tốt hơn so với hóa trị ở bệnh nhân có đột biến gen EGFR

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) có vai trò quan trọng trong chức năng phân chia và biệt hóa của tế bào Khi EGFR hoạt hóa quá mức có thể dẫn đến sự tăng sinh bất thường cũng như sự chuyển dạng ác tính của tế bào [11] Các đột biến chủ yếu nằm trên exon 18 – 21 là vị trí mã hóa vùng tyrosine kinase của thụ thể Đột biến trên exon 18, 19 và 21 tạo ra protein EGFR có ái lực mạnh đối với TKI thế hệ

1, do đó bệnh nhân có đột biến ở các vị trí này thường đáp ứng tốt với các thuốc điều trị đích Ngược lại, đột biến T790M và một số đột biến khác trên exon 20 thường liên quan đến hiện tượng kháng TKI thế hệ 1 Các trường hợp

không mang đột biến EGFR cũng hiếm khi đáp ứng với thuốc điều trị đích

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy bệnh nhân UTPKTBN có tỉ lệ đột biến

EGFR từ 10-15% ở châu Âu và 30-50% trên bệnh nhân ở châu Á, thường tập

trung ở nữ giới, nhóm người không hút thuốc, độ tuổi thấp [7]…

Nhiều công trình nghiên liệu pháp điều trị đích bằng TKI chứng tỏ hiệu quả tốt trong việc điều trị cho các bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn cuối: kích thước các khối u giảm đáng kể, thời gian sống kéo dài hơn, chất lượng cuộc sống được cải thiện,… Tuy nhiên, mức độ đáp ứng với TKI ở mỗi bệnh nhân UTPKTBN phụ thuộc phần lớn vào tình trạng đột biến gen Vì vậy, theo khuyến cáo từ Mạng lưới ung thư quốc gia Hoa Kỳ (National comprehensive cancer Network – NCCN) và Hiệp hội Ung thư học châu Âu (European Society for Medcical Oncology – ESMO), bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

tiến triển hoặc di căn nên được xét nghiệm đột biến EGFR một cách thường

quy để giúp sàng lọc ban đầu các trường hợp có khả năng đáp ứng với TKI, giúp tăng hiệu quả, giảm chi phí và tai biến trong điều trị

Như vậy, việc phân tích đánh giá tình trạng đột biến gen EGFR là cần

thiết giúp các bác sĩ có thể lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp, nâng cao hiệu quả điều trị và chất lượng sống của người bệnh UTPKPTBN Do đó, đề tài

nghiên cứu “Nhận xét tình trạng đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017” được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Nhận xét tình trạng đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi

không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017;

2 Nhận xét một số yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR trên bệnh nhân

ung thư phổi không phải tế bào nhỏ giai đoạn IV tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2017

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG PHẢI TẾ BÀO NHỎ (UTPKPTN)

Ung thư phổi hay ung thư phế quản là bệnh lý ác tính phát triển từ biểu

mô phế quản, tiểu phế quản, phế nang hoặc từ các tuyến của phế quản [11]

Tỷ lệ mắc ung thư phổi có xu hướng ngày một tăng Theo GLOBOCAN

2012, Việt Nam có trên 20 nghìn người mắc mới, đứng thứ 2 trong các bệnh ung thư và trên 17 nghìn người chết mỗi năm [49] Dựa trên phân loại mô bệnh học ung thư phổi chia làm 2 nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ (10 – 20%) và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (UTPKPTBN) (80-85%) [13] Theo Phạm Văn Thái (2015), tỷ lệ ung thư phổi biểu mô tuyến là 76,6% [13], còn theo nghiên cứu của Lê Hoàn (2010) và Nguyễn Minh Hải (2010) thì tỷ lệ lần lượt là 65,2% và 53,0% [6, 8]

1.1.1 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ

Thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu và quan trọng nhất Trong số bệnh nhân ung thư phổi, 90% trường hợp có liên quan đến thuốc lá Trong khói thuốc lá có nhiều hợp chất hydrocacbon thơm, đặc biệt là 3,4 benzopyren là những chất được chứng minh là nguyên nhân gây ung thư biểu mô tuyến và vảy Ngoài ra, tiền sử tiếp xúc với khói bụi, khí độc như amiăng, arsen, phóng

xạ và gen di truyền cũng là một trong những yếu tố có liên quan đến bệnh [7]

1.1.2 Triệu chứng

1.1.2.1 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn sớm của ung thư phế quản phổi nghèo nàn và ít đặc hiệu Triệu chứng sớm có thể gặp là ho kéo dài, điều trị kháng sinh không có hiệu quả Ở giai đoạn sau, các triệu chứng rõ rệt hơn, bao gồm:

 Các triệu chứng về hô hấp: ho, khó thở ngày càng tăng, có thể ho đờm lẫn máu, có đuôi khái huyết…

 Các triệu chứng xâm lấn và chèn ép: đau ngực, hội chứng tràn dịch màng phổi, hội chứng Pancoast – Tobias, hội chứng giao cảm, hội chứng trung thất, chèn ép tĩnh mạch chủ trên…

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

 Các triệu chứng di căn: di căn não (hội chứng tăng áp lực nội sọ và liệt thần kinh khu trú); di căn xương (đau và gãy xương bệnh lý); di căn gan, tuyến thượng thận, hạch…

 Hội chứng cận u: hội chứng Pierre – Marie, vú to hai bên, đái tháo nhạt… [7]

1.1.2.2 Triệu chứng cận lâm sàng

 Chẩn đoán hình ảnh

 X – quang phổi: xác định vị trí kích thước, hình thái u, hạch rốn phổi trung thất; hình ảnh hay gặp: bóng mờ nham nhở, bờ tua gai, bóng mờ nhiều vòng cung…

 Chụp cắt lớp vi tính: xác định đặc điểm u, đánh giá giai đoạn, tình trạng hạch, hướng dẫn sinh thiết xuyên thành ngực…

 Siêu âm ổ bụng: đánh giá di căn gan, tuyến thượng thận, hạch ổ bụng…

 Chụp MRI não: đánh giá di căn não

 Xạ hình xương: đánh giá di căn xương

 Chụp PET/CT: đánh giá giai đoạn di căn xa

 Nội soi chẩn đoán

 Nội soi phế quản: thường chỉ định trong các trường hợp u trung tâm, giúp xác định tổn thương và sinh thiết làm mô bệnh học

 Nội soi màng phổi: chỉ định trong trường hợp theo dõi di căn màng phổi

 Nội soi trung thất: chỉ định trong trường hợp có hạch trung thất bất thường, kết hợp làm sinh thiết hạch

 Mô bệnh học

Kết quả mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác định bệnh, thể

mô bệnh học từ đó lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Bệnh phẩm lấy từ sinh thiết khối u xuyên thành ngực, nội soi sinh thiết, hoặc bệnh phẩm từ các tổn thương di căn Các tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại của các type mô học UTPKPTBN theo WHO 2004 bao gồm: ung thư biểu mô vảy; ung thư biểu

mô tuyến; ung thư biểu mô tuyến vảy; ung thư biểu mô tế bào lớn; ung thư biểu mô tế bào sáng; ung thư biểu mô tế bào khổng lồ [48]…

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

 Các xét nghiệm khác

 Định lượng các marker ung thư (các dấu ấn sinh học, chất chỉ điểm): có giá trị trong chẩn đoán, tiên lượng và đánh giá tái phát [2] Định lượng CEA, Cyfra 21-1: giúp tiên lượng, đánh giá đáp ứng, theo dõi sau điều trị (theo Yoshida và cộng sự, trị số ngưỡng của CEA và Cyfra 21-1 tùy thuộc vào từng phòng thí nghiệm, thông thường từ 3 – 5 ng/mL [52]) Định lượng CA 125, CA 15-3, CA 19-9 giúp phân biệt với tổn thương ung thư từ nơi khác di căn đến phổi

 Xét nghiệm gen: xác định các đột biến EGFR, KRAS và một số biến đổi

di truyền khác nhờ kỹ thuật giải trình tự gen, kỹ thuật phân tích cấu trúc

đa hình thái chuỗi đơn, kỹ thuật real-time PCR…[7]

1.1.3 Chẩn đoán

1.1.3.1 Chẩn đoán xác định

Chẩn đoán xác định UTPKPTBN dựa trên lâm sàng (các triệu chứng hô hấp, u chèn ép xâm lấn…), chẩn đoán hình ảnh (X – Quang, CT ngực…) và kết quả mô bệnh học

1.1.3.2 Chẩn đoán giai đoạn

Chẩn đoán giai đoạn TNM của UTPKPTBN theo AJCC (American Joint Committee on Cancer) năm 2010 [26]:

Phân loại về u nguyên phát (ký hiệu: T)

+ Tx: U nguyên phát không thể đánh giá, hoặc có tế bào ác tính trong đờm hay dịch rửa phế quản nhưng không thấy trên hình ảnh hoặc nội soi phế quản

+ T0: Không có bằng chứng về u nguyên phát

+ Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ

+ T1: Kích thước lớn nhất của khối u ≤ 3cm, được bao quanh bởi nhu mô phổi hoặc lá tạng màng phổi, không có bằng chứng về xâm lấn vượt quá đoạn gần của phế quản thuỳ; gồm T1a (kích thước lớn nhất ≤ 2cm) và T1b (kích thước lớn nhất 2-3cm)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

+ T2: Với 3 < kích thước lớn nhất ≤ 7cm hoặc bất kỳ nhưng: xâm lấn phế quản gốc, cách ngã ba khí phế quản ≥ 2cm; xâm lấn lá tạng màng phổi; gây xẹp phổi hoặc viêm phổi tắc nghẽn lan đến rốn phổi nhưng chưa lan toàn

bộ phổi; gồm T2a (3<kích thước lớn nhất ≤ 5cm) và T2b (5 < kích thước lớn nhất ≤ 7cm)

+ T3: Kích thước lớn nhất >7cm hoặc xâm lấn một trong các thành phần: thành ngực (bao gồm cả khối u rãnh liên thuỳ trên), cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất; màng ngoài tim hoặc xâm lấn phế quản gốc, cách carina <2cm nhưng chưa tới carina hoặc gây ra xẹp phổi, viêm phổi

do tắc nghẽn trên toàn bộ phổi hoặc có các nốt riêng biệt trên cùng 1 thuỳ phổi

+ T4: Khối u kích thước bất kỳ nhưng xâm lấn: trung thất, tim, mạch máu lớn, khí quản, thần kinh quặt ngược thanh quản, thực quản, thân đốt sống, carina, các nốt khối u khác ở thuỳ phổi khác cùng bên

Phân loại về hạch vùng (ký hiệu: N)

+ No: Không có di căn hạch vùng

+ N1: Di căn hạch cạnh phế quản và hoặc hạch trong phổi, hạch rốn phối cùng bên, bao gồm cả sự xâm lấn trực tiếp

+ N2: Di căn hạch trung thất cùng bên và hạch dưới carina

+ N3: Di căn hạch rốn phổi đối bên, hạch trung thất đối bên, hạch cơ bậc thang cùng hoặc đối bên, hạch thượng đòn

Phân loại về di căn xa (ký hiệu: M)

+ M0: Không có di căn xa

+ M1: Di căn xa, gồm M1a (có kèm theo các nốt khối u ở phổi đối bên, tràn dịch màng phổi hoặc màng tim ác tính) và M1b (di căn xa)

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKPTBN theo AJCC 2010

Giai đoạn Tiêu chuẩn

Giai đoạn IIA

tử Các phương pháp điều trị gồm có: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, điều trị đích

Có thể lựa chọn một hoặc nhiều phương pháp kết hợp [6]

1.1.4.2 Phẫu thuật

Phẫu thuật là phương pháp điều trị triệt căn đối với UTPKPTBN Mục đích phẫu thuật là cắt bỏ hoàn toàn khối u, hạch di căn và các cấu trúc bị xâm Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

lấn xung quanh Phẫu thuật thường có chỉ định ở giai đoạn I, II và IIIa (kết hợp với hóa trị) hoặc giai đoạn IV với tổn thương di căn ổ đơn độc có khả năng phẫu thuật Phẫu thuật ung thư phổi bao gồm cắt bỏ cấu trúc theo giải phẫu nhu mô phổi, có thể cắt thùy hoặc cắt toàn bộ một phổi kèm theo nạo vét hạch hệ thống

1.1.4.3 Hóa trị

Mục đích của hóa trị là điều trị khi bệnh lan ra toàn thân Tùy từng giai đoạn UTPKPTBN, chỉ định hóa trị bao gồm:

+ Hóa chất tân bổ trợ trong giai đoạn IIIa

+ Hóa chất bổ trợ trong giai đoạn II và IIIa

+ Kết hợp với xạ trị lồng ngực trong giai đoạn IIIb

+ Hóa chất triệu chứng trong giai đoạn IV

Các nhóm hóa chất thường sử dụng trong điều trị UTPKPTBN là: Plastin; Etoposid; Vinorelbine; Gemcitabine; Taxane…

+ Xạ trị đơn thuần triệt căn: giai đoạn I, II, IIIa có chống chỉ định phẫu thuật hoặc bệnh nhân từ chối phẫu thuật và hóa trị

+ Xạ trị triệu chứng: giảm đau, di căn não, xạ trị chống chèn ép

1.1.4.5 Điều trị đích

Chỉ định điều trị đích cho giai đoạn UTPKTBN có di căn xa, bệnh tái phát hoặc thất bại hóa trị Đối với các nhóm thuốc ức chế tyrosin kinase phải

dựa trên kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR

Có hai nhóm thuốc điều trị đích thường dùng trong UTPKPTBN:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

+ Các kháng thể đơn dòng: Là những thuốc ngăn cản sự gắn kết yếu tố tăng

trưởng với phần ngoại bào của EGFR Các thuốc được sử dụng trong điều

trị UTPKPTBN như cetuximab, pantuximab thường dùng kết hợp với các hóa chất [4]

+ Các thuốc phân tử nhỏ: Là thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase của EGFR Các thuốc này cạnh tranh với ATP ở vùng tyrosine kinase, làm thiếu nguyên liệu cho sự phosphoryl hóa của EGFR dẫn đến ngăn chặn quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào, từ đó ức chế các quá trình: bám dính, xâm lấn, di căn, tăng sinh mạch, tăng sinh tế bào và ức chế quá trình chết tế bào theo chương trình và tăng nhạy cảm với hóa trị Các thuốc phân tử nhỏ hiện

có ở Việt Nam bao gồm gefitinib (Iressa) và erlotinib (Tarceva) được chỉ

định cho các bệnh nhân có đột biến gen EGFR [4] Tuy nhiên, những

trường hợp UTPKPTBN được điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib, luôn phát triển khả năng đề kháng các thuốc này Cơ chế phổ biến nhất (khoảng 50%) và được xác định là hình thành đột biến kháng thuốc hoặc sự tăng

biểu hiện của các con đường tín hiệu khác khi con đường EGFR bị ức chế

[31, 48]

1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ

Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) là một nhóm protein thụ thể trên màng các tế bào biểu mô, trung mô

và thần kinh có vai trò trong điều hóa các quá trình sinh trưởng, phát triển, trao đổi chất và sinh lý của tế bào [7]

1.2.1 Cấu trúc EGFR

Protein EGFR gồm 1210 axit amin, cấu tạo gồm 3 vùng:

+ Vùng ngoại bào: nơi để gắn kết các yếu tố tăng trưởng

+ Vùng xuyên màng: tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng tế bào + Vùng nội bào: chứa miền tyrosine kinase, đây là nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hóa của EGFR

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc và hoạt động của EGFR

(A) EGFR gồm ba vùng: vùng ngoại bào, vùng xuyên màng, vùng nội bào chứa miền tyrosin kinase (B) Hoạt động của EGFR: yếu tố tăng trưởng liên kết vào phần ngoại bào của thụ thể EGFR, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau, tự phosphoryl hóa, vùng tyrosin kinase được hoạt hóa sẽ kết hợp với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu [53]

1.2.2 Hoạt động và chức năng EGFR

EGFR được cho là giữ vị trí khởi đầu của con đường tín hiệu tyrosine kinase trong các tế bào có nguồn gốc biểu mô Hai con đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi EGFR là RAS/RAF/MEK/ERK và PI3K/AKT Ngay sau khi được hoạt hóa, vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/AKT (kích thích sự tăng sinh mạch máu, di căn và ức chế quá trình chết theo chương trình), con đường RAS/RAF (kích thích phân bào và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã) [2]… Trong các tế bào khỏe mạnh, con đường tín hiệu nội bào trên được kiểm soát một cách nhịp nhàng và chặt chẽ, đảm bảo sự phát triển bình thường của tế bào Trong các tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR bị rối loạn bởi các cơ chế phát sinh ung thư,

bao gồm đột biến gen, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểu hiện quá

mức protein EGFR dẫn đến tăng tỷ lệ phát sinh, tốc độ phát triển, khả năng xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư [2]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR

EGFR tiếp nhận tín hiệu từ yếu tố tăng trưởng, truyền qua các con đường JAK/STAT, PI3K/Akt, Ras/Raf/MEK/ERK… vào nhân tế bào, kích thích tế bào biệt hóa, tăng sinh, sống sót, tạo u, sinh mạch…[5]

1.2.3 Đột biến gen EGFR

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

+ Đột biến loại I: gồm các đột biến mất đoạn ở exon 19, chiếm khoảng 44% Phổ biến nhất là kiểu đột biến mất đoạn mã hóa chứa các 747 – leucin (L),

748 – arginine (R), 748 – glutamin (E), 759 – alanine (A), gọi tắt là LREA + Đột biến loại II: gồm các đột biến thay thế một nucleotid làm thay đổi axid amin ở exon 18 và 21 Thường gặp nhất là đột biến ở exon 21, thay thế leucine bằng arginine ở codon 858 (đột biến L858R), chiếm khoảng 41%

của tất cả các đột biến gen EGFR Một số đột biến khác thuộc nhóm II như

đột biến thay thế glycin ở vị trí 719 thành serin, alanin hoặc cystein (G719S, G719A, G719C) chiếm 4%, đột biến leucine ở condon 861 thành glutamine (L861Q) chiếm 1 – 2%

+ Đột biến loại III: gồm các đột biến lặp đoạn, thêm đoạn hoặc đột biến điểm tại exon 20 (như T790M, V769L, S768I) và đột biến D761Y trên exon 19 Đột biến loại này chiếm khoảng 5% làm cho tế bào ung thư phổi kháng lại với thuốc điều trị đích [46]

Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR

Các đột biến EGFR thuộc các exon 18 – 21 mã hóa vùng tyrosine kinase của thụ thể, cũng đồng thời là vị trí tương tác của các loại thuốc TKI [42]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Ở những tế bào mang đột biến gen EGFR, các thuốc TKI có khả năng cạnh tranh với ATP ở vùng tyrosine kinase, làm thiếu nguyên liệu cho sự phosphoryl hóa của EGFR dẫn đến ngăn chặn quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào, từ đó ức chế các quá trình: bám dính, xâm lấn, di căn, tăng sinh mạch, tăng sinh tế bào và ức chế quá trình chết tế bào theo chương trình và tăng nhạy cảm với hóa trị

Chính vì vậy, kết quả đột biến gen EGFR là một thông tin quan trọng

giúp các bác sỹ lâm sàng cân nhắc sử dụng liệu pháp điều trị đích cho bệnh nhân Thực tế nghiên cứu trên thế giới như các thử nghiệm lâm sàng SATURN, ATLAS, IPASS… đối với hai loại TKI thế hệ 1 là Erlotinib và Gefitinib cho thấy thuốc giúp cải thiện trung vị thời gian sống thêm không tiến triển, tăng tỷ lệ đáp ứng, tăng tỷ lệ kiểm soát bệnh ở những bệnh nhân

UTPKPTBN giai đoạn tiến triển có đột biến gen EGFR so với những bệnh

nhân sử dụng phác đồ hóa chất Ngược lại, nhóm bệnh nhân không có đột biến này, phác đồ hóa chất mang lại nhiều lợi ích hơn

Ngoài các đột biến trên exon 18-21, còn phát hiện các trường hợp đột biến mất đoạn ở exon 2-7 Dạng đột biến này làm vùng ngoại bào của thụ thể không liên kết được với yếu tố tăng trưởng, tuy nhiên vùng tyrosine kinase vẫn được kích hoạt làm tế bào hoạt động bất thường dẫn đến ung thư Hiện nay ý nghĩa và tỷ lệ dạng đột biến này vẫn chưa được xác định rõ ràng [1]

1.2.3.2 Phương pháp phát hiện đột biến EGFR

Xét nghiệm đột biến gen EGFR có thể được phát hiện bằng nhiều

phương pháp khác nhau như giải trình tự gen, real-time PCR, lai đầu dò phân tử,…

Giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự gen được sử dụng nhiều nhất hiện nay dựa trên nguyên lý của phương pháp Dideoxy hay phương pháp gián đoạn chuỗi, được Sanger phát triển từ năm 1975 Nguyên tắc cơ bản của phương pháp Dideoxy dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3'có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

nucleotide không có nhóm 3'-OH thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4 Do

đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Kết quả sẽ tổng hợp được các đoạn nucleotide

có kích thước dài ngắn khác nhau Các ống phản ứng này được điện di, các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel, tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen Các hệ thống giải trình tự gen theo phương pháp này

đã được phát triển từ nhiều năm trước, trong đó ddNTP được đánh dấu huỳnh quang và kết quả được đọc tự động trên máy [40, 42]

Hình 1.4 Kết quả giải trình tự gen xác định đột biến EGFR L858R

Ở mẫu bình thường (hình trên), codon 858 của gen EGFR là CTG mã hóa leucine Trong mẫu phân tích (hình dưới), tín hiệu huỳnh quang ghi nhận cả

bộ ba CTG (bình thường) và CGG (đột biến, mã hóa arginine), cho thấy có các tế bào mang đột biến L858R xen lẫn các tế bào không đột biến [40]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

 Realtime PCR

Trong phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction – PCR) thông thường, kết quả của phản ứng PCR cần được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di, thực hiện sau khi phản ứng kết thúc Realtime PCR (Real time PCR)

là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng (vì vậy mà được gọi là PCR thời gian thực) Hai phương pháp phổ biến để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng đó là: (1) các dye phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi nào đó, và (2) các đầu dò DNA đặc hiệu có chứa các đoạn oligonucleotide

đã được đánh dấu với chất báo cáo phát huỳnh quang, từ đó cho phép phát hiện chỉ khi có sự lai giữa đầu dò với một trình tự bổ sung với nó

Hình 1.5 Kết quả Real Time PCR xác định đột biến EGFR T790M

Các đường biểu thị cường độ huỳnh quang thu được (từ đó gián tiếp suy ra tương đối nồng độ sản phẩm PCR trong mẫu xét nghiệm) qua các chu kỳ phản ứng Real–Time PCR (PC): đối chứng dương; (NC): đối chứng âm[40]

 Lai đầu dò phân tử

Đây là phương pháp dựa trên nguyên lý lai nucleic acid, dựa trên đặc tính biến tính và hoàn nguyên của acid nucleic Sản phẩm PCR sau khuếch đại được lai ngược với đầu dò DNA (là những đoạn DNA kích thước ngắn, khoảng 50-100 nucleotide, có trình tự bổ sung với DNA đích), các đầu dò này được bố trí trên 1 tấm màng lai (thành các điểm hoặc các băng) Các mồi Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

dùng cho phản ứng PCR thường được đánh dấu bằng chất phát màu, do đó dựa vào vị trí phát màu trên tấm màng lai, người ta có thể nhận định kết quả phát hiện đột biến gen

Hình 1.6 Phát hiện đột biến gen EGFR bằng phương pháp lai đầu dò

Trên mỗi thanh teststrip có sẵn vạch Control cho phản ứng lai, PCR Negative Control (vạch 31–34) và PCR Positive Control (vạch 35–36) Các vạch 1–30 tương ứng với 30 đột biến phát hiện được ở exon 18–21 (A) Mẫu không phát hiện đột biến (B) Mẫu mang đột biến G719S exon 18 (C) Mẫu mang đột biến E746_A750del trên exon 19 và T790M trên exon 20 (D) Mẫu mang đột biến L858R trên exon 21 [40]

1.2.3.3 Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR ở bệnh nhân UTPKPTBN

 Trên thế giới

Các nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên thế giới cho thấy tần số đột

biến thay đổi tùy thuộc vào vùng địa lý, giới tính, tình trạng hút thuốc lá cũng như loại mô bệnh học

Theo đó, tần số đột biến EGFR ở người châu Á khá cao, chiếm

30-50%, trong khi đó tỷ lệ này ở người châu Âu chỉ khoảng 10-15% [24, 43] Năm 2013, theo nghiên cứu của Christian Boch và cộng sự, tỉ lệ đột biến Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

EGFR trong các bệnh nhân UTPKPTBN ở châu Âu chỉ 4,9% [21] Theo một

nghiêu cứu khác được tiến hành trên 2105 bệnh nhân ở Tây Ban Nha năm

2009, tỉ lệ này cũng chỉ 16,6% [40] Tại châu Á, theo nghiên cứu PIONEER (2014) báo cáo tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến Việt Nam là 64,2%, Đài Loan là 62,1%, Trung Quốc là 50,2%, Thái Lan là 53,8% và Ấn Độ thấp nhất là 22,2% Cũng theo công bố này tỷ lệ đột biến gen EGFR ở nữ cao hơn so với nam (61,1% so với 44%), bệnh nhân

không hút thuốc có tỷ lệ đột biến gen EGFR cao hơn bệnh nhân đã từng hút

thuốc (60,7% so với 43,2%) và tỷ lệ cũng khác nhau tùy giai đoạn: giai đoạn

IV là 53,5%; giai đoạn IIIB là 43,2% và giai đoạn còn lại là 48,6% [43]

Một nghiên cứu khác năm 2006 cũng cho kết quả tương tự, đột biến

EGFR thường gặp ở nữ giới nhiều hơn nam giới (38% so với 10%) và những

người không hút thuốc gặp nhiều hơn người từng hút thuốc (54% so với 16%)

[44] Nghiên cứu IPASS (2011) cho thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR ở bệnh

nhân ung thư phổi biểu mô tuyến ở nữ lên tới 76,7% và ở bệnh nhân không

hút thuốc là 92,7% [27] Báo cáo của Cai (2014) phân tích đột biến gen EGFR

trên 76 bệnh nhân ung thư phổi cũng cho thấy tỷ lệ đột biến ở nữ cao hơn ở nam với tỷ lệ tương ứng là 61,1% và 25,0% [23]

Theo một nghiên cứu của Siegelin và cộng sự năm 2014, trong các đột

biến EGFR thì đột biến xóa đoạn trên exon 19 hay gặp nhất chiếm 46%, đột

biến trên exon 18 là 1,03%, exon 21 là 37,5%, exon 20 là 6,4% (trong đó T790M chiếm 4,1%) [45] Một nghiên cứu khác tại Nhật Bản cũng cho thấy đột biến hay gặp nhất là đột biến mất đoạn tại exon 19 (chiếm 48,2%) và đột biến thay thế nucleotid tại exon 21 (chiếm 42,7%) [54]

Về đánh giá mối liên quan giữa chỉ số SUV max đo bằng PET/CT và

đột biến gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn IV, Lee (2015) nhận

thấy giá trị SUV max thấp hơn trong các trường hợp ung thư phổi biểu mô

tuyến giai đoạn IV có đột biến gen EGFR [33]

 Tại Việt Nam

Năm 2011, Hoàng Anh Vũ và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu trên 71

bệnh nhân UTPKPTBN nhận thấy tỷ lệ đột biến gen EGFR là 42% [18] Cũng

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

trong năm 2011, nhóm nghiên cứu khác thuộc Trung tâm Nghiên cứu

Gen-Protein thuộc Trường Đại Học Y Hà Nội đã công bố tỷ lệ đột biến gen EGFR

trong UTPKTBN giai đoạn muộn là 26,2% [14]

Năm 2013, Phạm Lê Anh Tuấn và cộng sự áp dụng kỹ thuật Scorpion ARMS (kỹ thuật khuếch đại alen đột biến) trên 70 bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn cuối nhận thấy 25/70 bệnh nhân mang đột biến (chiếm tỷ lệ 35,7%) [16]

Năm 2014, báo cáo của PIONEER về tỷ lệ đột biến gen EGFR trên

bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến Việt Nam là 64,2% [44] Nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà tại bênh viện Đại học Y Hà Nội phát hiện 106/181 trường

hợp đột biến gen EGFR (58,6%) Trong đó, đột biến xóa đoạn LREA (exon

19) và đột biến L858R (exon 21) chiếm tỷ lệ cao nhất (lần lượt là 48,1% và 40,6%) Phát hiện được 2 trường hợp là đột biến đôi S768I+V769L (exon 20)

và T790M (exon 20)+L858R (exon 21) Các đột biến làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI chiếm ưu thế 99/106 trường hợp (97%) 3/106 trường hợp là các đột biến gây kháng thuốc (3%) [5] Kết quả cũng tương đồng với một nghiên cứu tại Thành phố Hồ Chí Minh của tác giả Trần Minh Thông và cộng sự cho thấy hai loại đột biến thường gặp nhất trong UTPKPTBN là đột biến mất đoạn ở exon 19 và đột biến điểm L858R với tỉ lệ lần lượt là 38% và 27% [15] Một kết quả tương tự trong nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ (2014)

trên 332 bệnh nhân UTPKPTBN, phát hiện tỷ lệ đột biến gen EGFR là 40,7%

Đột biến xảy ra nhiều nhất ở exon 19 (19%) tiếp đến là exon 21 (16,9%), mỗi exon 18 và 20 cùng xuất hiện đột biến với tỷ lệ 3,6% Đột biến thường gặp ở bệnh nhân nữ (48,9%) nhiều hơn nam (35%) [19]

Năm 2016, tại Bệnh viện Bạch Mai nghiên cứu 479 trường hợp bệnh

nhân UTPKPTBN, thấy: 40,5% bệnh nhân có đột biến EGFR, tỷ lệ đột biến ở

nữ giới cao hơn nam giới, ở người không hút thuốc cao hơn người hút thuốc;

mô bệnh học là ung thư biểu mô tuyến cao hơn loại khác Trong số các bệnh nhân có đột biến gen, 53,3% bệnh nhân có đột biến mất đoạn trên exon 19; 40,8% có đột biến L858R trên exon 21 là hai dạng đột biến thường gặp nhất [10]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Năm 2017, một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Lan Anh cũng đƣợc thực hiện tại Bệnh viện Bạch Mai trên 152 bệnh nhân ung thƣ phổi biểu mô

tuyến đƣợc làm xét nghiệm đột biến gen EGFR cho thấy bệnh chủ yếu gặp ở

nam giới (71,7%) từ 50-69 tuổi (69,1%) Khối u nguyên phát phổi phải (65,8%) gặp nhiều hơn phổi trái (34,2%) Phần lớn phát hiện bệnh ở giai đoạn

IV (78,3%) với chỉ số SUV max ở khối u nguyên phát (9,65) cao hơn ở hạch

(6,78) và tổ chức di căn (6,26%) Đột biến gen EGFR chiếm tỷ lệ 39,5%, chủ

yếu là đột biến exon 19 (58,3%) và tỷ lệ bệnh có đột biến nhạy cảm với TKI

là 96,7% Đột biến EGFR có liên quan với giới tính và tình trạng hút thuốc

Khả năng có đột biến gen ở nữ giới cao gấp 2,94 lần so với nam và ở bệnh nhân không hút thuốc cao gấp 3,42 lần so với bệnh nhân đã từng hoặc đang hút thuốc, nhƣng không có mối liên quan có ý nghĩa giữa sự thay nồng độ

CEA, Cyfra 21-1 với tình trạng đột biến gen EGFR [2]

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là những bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV

có chỉ định xét nghiệm đột biến gen EGFR tại Trung tâm Y học hạt nhân và

Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 đáp ứng các tiêu chuẩn chọn lựa và tiêu chuẩn loại trừ

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa

 Bệnh nhân có đầy đủ thông tin hành chính, giai đoạn bệnh, kết quả mô bệnh học và một số xét nghiệm cận lâm sàng khác như CEA, Cyfra 21-1, PET/CT

 Bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định UTPKPTBN dựa trên kết quả mô bệnh học theo tiêu chuẩn của WHO 2004, UTPKPTBN bao gồm: ung thư biểu mô vảy; ung thư biểu mô tuyến; ung thư biểu mô tuyến vảy; ung thư biểu mô tế bào lớn, ung thư biểu mô tế bào sáng; ung thư biểu mô tế bào khổng lồ [48]

 Bệnh nhân UTPKPTBN giai đoạn IV theo tiêu chuẩn của AJCC 2010: T

bất kỳ, N bất kỳ, M1 [26]

 Bệnh nhân đồng ý cung cấp thông tin cho nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân không đáp ứng tiêu chuẩn chọn lựa

 Hồ sơ bệnh án không đủ thông tin phục vụ nghiên cứu

 Bệnh nhân chưa được chẩn đoán xác định và chẩn đoán giai đoạn UTPKTBN

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.3 Các biến số, chỉ số trong nghiên cứu

 Thông tin chung của đối tượng nghiên cứu:

 Tuổi, giới, địa chỉ, lý do vào viện; tiền sử hút thuốc lá, tiền sử bệnh lý ung thư của bệnh nhân và gia đình bệnh nhân, các phương pháp điều trị

trước khi làm xét nghiệm đột biến gen EGFR

 Kết quả xét nghiệm các marker ung thư như CEA, Cyfra21-1, kết quả chẩn đoán hình ảnh, PET/CT…cho thấy vị trí tổn thương ung thư nguyên phát và di căn

 Kết quả xét nghiệm đột biến gen EGFR

 Vị trí lấy mẫu xét nghiệm, kỹ thuật lấy mẫu

 Kết quả có hay không có đột biến, loại đột biến, vị trí đột biến

2.2.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm 2017

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu

Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học Hạt Nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

2.2.6 Các bước thực hiện

Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu:

Thu thập thông tin nghiên cứu

 Tuổi, giới, tiền sử hút thuốc, tiền

sử bệnh lý bản thân, gia đình…

 Lý do vào viện, chẩn đoán giai

đoạn, chẩn đoán mô bệnh học,

di căn, các phương pháp đã điều

trị

 Xét nghiệm chất chỉ điểm khối u

(CEA, Cyfra 21-1), kết quả chẩn

đoán hình ảnh (chụp CT phổi,

PET/CT, MRI…)

Xét nghiệm đột biến gen EGFR

 Vị trí lấy mẫu (u nguyên phát, hạch, tổ chức di căn cơ quan, dịch màng phổi/màng tim…)

 Phương pháp lấy mẫu (sinh thiết, phẫu thuật, chọc dịch màng phổi/màng tim)

 Tình trạng đột biến gen (phát hiện đột biến hay không phát hiện đột biến)

Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng

và đột biến gen EGFR ở bệnh

nhân UTPKPTBN giai đoạn IV

Kết luận 2

Một số yếu tố liên quan của đột

biến gen EGFR với các đặc điểm

2.2.6.1 Thu thập thông tin bệnh nhân

Các thông tin chung của bệnh nhân, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng,

mô bệnh học, giai đoạn bệnh … được thu thập theo mẫu thống nhất bằng cách phỏng vấn kết hợp khai thác hồ sơ bệnh án

2.2.6.2 Quy trình xét nghiệm đột biến EGFR

Tách DNA (theo kit PureLink Genomic DNA Mini Kit – Invitrogen)

 Thu mẫu: Dùng dao mổ cắt mẫu bệnh phẩm (mẫu sinh thiết/phẫu thuật/khối tế bào vùi paraffin), chuyển vào ống ly tâm 1,7 ml

 Loại paraffin: Thêm 160–320 μl Deparaffinization Solution, trộn đều và ủ

56oC trong 3 phút

 Ly giải tế bào: Thêm 180 μl Digestion Buffer, bổ sung 20 μl Proteinase K, trộn đều Ủ 56oC trong 1 giờ hoặc đến khi tế bào bị ly giải hoàn toàn, ủ tiếp

90oC trong 1 giờ

 Cố định DNA lên cột và loại tạp chất: Thêm 200 μl Lysis/Binding Buffer,

bổ sung 200 μl ethanol 96–100% và trộn đều Chuyển toàn bộ dịch ly giải

tế bào lên cột thu DNA, ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, loại dịch

 Rửa cột: Thêm 500 μl đệm rửa, đậy nắp và ly tâm 6.000 ×g trong 1 phút, loại dịch Lặp lại bước rửa trên Ly tâm 20.000 ×g trong 3 phút để làm khô màng của cột

 Thu DNA: Chuyển cột lên ống ly tâm 1,7 ml sạch, thêm 50–100 μl Elution Buffer vào chính giữa màng, ủ 1-5 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 20.000 ×g trong 1 phút

 Định lượng DNA: Định lượng DNA theo phương pháp huỳnh quang sử dụng Qubit dsDNA HS Assay Kit Imvitrogen trên máy Qubit® 3.0 Fluorometer

Khuếch đại gen bằng PCR (theo kit EGFR StripAssay® – ViennaLab)

 Chuẩn bị enzyme Taq DNA Polymerase: Pha Taq DNA Polymerase trong Taq Dilution Buffer theo tỷ lệ thể tích tương ứng là 1:25

 Chuẩn bị phản ứng: Chuẩn bị ống PCR cho mỗi phản ứng, đặt lên đá, lấy hoá chất cho mỗi phản ứng khuếch đại:

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

15 μl Amplification Mix

5 μl Taq DNA polymerase vừa chuẩn bị

5 μl DNA khuôn tổng hợp (1–10 ng/µl)

 Chuyển ống vào máy PCR và chạy theo chế độ sau:

Trước chu kỳ đầu tiên: 37oC – 10 phút

94oC – 2 phút Chu kỳ nhiệt (33 chu kỳ): 94oC – 15 giây

70oC – 60 giây

58oC – 90 giây Sau chu kỳ cuối cùng: 60oC – 3 phút Giữ trên đá hoặc ở 2–8oC để sử dụng lâu dài

Lai với đầu dò đặc hiệu (theo kit EGFR StripAssay® – ViennaLab)

 Biến tính sản phẩm PCR: Trộn 10 μl DNAT với 10 μl sản phẩm PCR trong giếng trên Typing Tray, ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng

 Lai với đầu dò trên Teststrip: Thêm 1ml Hybridization Bufer, đưa Teststrip vào giếng, ủ 30 phút ở 45oC, loại dịch Rửa qua Wash Solution A, ủ lắc cùng 1ml Wash Solution A ở 45oC trong 15 phút, loại dịch (x2 lần)

 Phản ứng enzyme: Thêm 1ml Conjugate Solution, ủ lắc ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, loại dịch Rửa qua Wash Solution B, ủ lắc cùng 1ml Wash Solution B ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, loại dịch (x2 lần)

 Phát triển màu: Thêm 1ml Color Deverloper, ủ lắc 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối Rửa Test strip vài lần bằng nước sạch, để khô trong bóng tối

Phân tích kết quả

Sau quá trình lai, các test strip được so sánh với thang chuẩn để đánh giá kết quả thông qua phần mềm StripAssay Evaluator®

được cung cấp bởi ViennaLab

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

Bảng 2.1 Các đột biến EGFR được phát hiện theo kit EGFR XL StripAssay

STT Exon Trình tự nucleotide Trình tự acid amin

2.2.6.3 Nhập và phân tích số liệu

 Số liệu được mã hóa và nhập bằng phần mềm Epidata 3.1

 Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Stata 12.0 với các test thống kê y học: Chi bình phương, T – test…các yếu tố liên quan đến đột biến gen EGFR có ý nghĩa khi giá trị p<0,05

2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

 Nghiên cứu không gây khó khăn cho bệnh nhân, tất cả các thông tin chỉ phục vụ mục đích nghiên cứu

 Số liệu thu thập đầy đủ, khách quan, trung thực, kết quả đảm bảo tính khoa học, tin cậy và chính xác

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU