Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương

Kết quả định lượng canxi ở nồng độ chất cảm ứng dexamethasone (100 nM), p­GP (10 mM), L­AsA (0,25 mM) lần lượt cho kết quả định lượng canx: 0,27 mM/I; 0,36 mM/1; 0,39 mM/ỉ, Kết quả này s[r]

TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1 Lindanc, Lieu T, Giang L, et al Rising HIV infection rates in Ho Chi Minh City herald emerging AIDS epidemic in Vietnam AIDS 1997, 11 (Sup pi 1), S5­13

2 Nguyên T, Hoang T, Pham K, van Ameijiden E, Devillew,and Wolffers I HTV monitoring in Vietnam: System, methodology, and results of sentinel surveillance J Acqui Immune Defic Syndr 1999, 21 (4), 338­346

3 The Socialist Republic of Viet Nam Declaration of Commitment on HIV and AIDS adopted at 26th United Nations General Asembly Special Sesion in June 2001 (ƯNGASS), 2010

4 Ishizaki A, Cuong N, Thuc p et al Profile of HIV type 1 infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in Hai Phong Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2009, 25 (2), pp.175­182

5 Phan TTC, Ishizaki A, Phung DC, Bi X, Okasand Ichimura H Characterization of HIV type 1 genotypes and drug resistance mutations among đrag­naỉve HIV type­1 infected patients in Northern Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2010,26 (2), pp.233­235,

6 World Health Organization/ Western Pacific Regional Office and partner Good practice in Asia: Targeted HIV prevention for injecting drag users and sex workers Vietnam’s first large­scale national harm reduction initiative, 2010 http://www.who.mt/hiv/pub/idu/wpro vietnam/en/index.html

7 Johnson VA, Calvez V, Gunthard HF, et al 2011 update of the drug resistance mutations in HIV­1 Top Antivir Med.2011,19 (4), PP.ỈS6­Ỉ64

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GÓC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RÓN NGƯỜI THÀNH TỂ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG

TS Đ M inh Trung*

T Ó M TẲ T

Tế bào gốc (TBG) là các tế bào chưa có chức'năng chuyên biệt, có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tể bào khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương v nhiều nguyên nhân khác nhau

Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị gãy xương lâu liền và khớp giả Tuy nhiên, nguôn TBG ở tùy xương còn ít khó khăn về số lượng tế bào và quy tr nh Èhu thập tế bào tương đối phức tạp Nhằm tăng hiệu quả điều trị tái tạo xuơng, TBG cần được tẫng sinh về số lượng và biệt hóa ỉn viíro thành lượng lớn tế bào tạo xương trưởc khi được cấy ghép vào ồ xương gãy V vậy, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tăng sính và biệt hóa in vitro TBG trung mô màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng loại TBG đặc biệt này vào điều trị trong tương lai

Đổi tượng và phương pháp nghiên cứu:

Dây rốn của 10 trẻ sơ sinh được mẹ đẻ ià các áản phụ > ỉ 8 tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết quả âm tính với xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiễm trùng (bao gồm virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm ganc, virus CMV và vi khuẳn giang raai), trẻ sinh ra ờ độ tuổi thai > 37 tuần, sinh raột và không có tai biến trong quá tr nh sỉnh đẻ

Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô từ màng dây rốn người:

Biệt hóa in vitro TBG trung mô thành TBDTX: Kiểm tra tích tụ canxi quanh té bào sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red, khả năng Eích tụ canxi của TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn, xác định hoạt tính của alkaline phosphates (ALP) Tách chiết ARN và tiến hành phàn ứng RT­PCR để xác định các dâu ấn sinh học của tế bào dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô màng đây rốn

*Học viện Quân y

Tạo mô h nh chuột nhắt suy giảm miễn dịch bằng hóa chất, cấy ghép TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn trên chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất

Nhuộm hematoxylin và eosin

Phương pháp xử lý số liệu: dựa trên phần mềm thổng kê y học SPSS 16.0

Kết quả và kết luận:

Đã nuôi cấy tăng sinh được TBG trung mô từ màng dây rốn:

­ Nuôi cấy tăng sinh trong môi ỉrường cơ bản có bổ sung 10% FBS, Ị% kháng sinh, nuồi cấy ờ 37°c, 5% C02

­ Nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 60­80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy sau 8 ngày

Đã cảm ứng biệt h a được TBG trung mô màng dây rốn thầnh tể bào dạng tạo xư ng trên in vitro:

­ Môi trường cảm ứng biệt hóa gồm có DMEM high glucose/F12 glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh,

100 nM dexamethasone, 10 mM p­glycerolphosphate, 0,25 mM acid ascorbic

­ Trong quá tr nh cảm ứng biệt hóa, hầu hết các tế bào đều ngừng phân chia, có sự thay đổi về h nh dạng, kích thirớc, tế bào bắt đầu chuyển từ dạng thoi, nhỏ sang dạng tròn, ỉớn và cuối cùng là h nh hạt đậu giống tể bào tạo xương sau 21 ngày; có lắng đọng canxi, có hoạt tính phosphatase kiềm; dương tính với các dấu ấn osteocalcin, osteopontin, collagen týp I, phosphatase kiềm; bước đầu thử nghiệm cho thấy có khà nãng tạo nốt tích tụ can­xi khi cấy ghép dưởi đa chuột nhắt suy giảm miễn địch

*Từ khóa: Tê bào gốc trung mô; Màng dây rốn người; Tế bào dạng tạo xương

In vitro osteogenic differentiation o f m esenchymal stem cell from human umbilical cord lining

Summary

Stem cells are cells that do not have specialized functions, but have the ability to differentiate into multiple cell types to replace cells that have been lost for numerous reasons, including natural aging, death or injury

Autologous bone marrow stem cells have been used clinically for transplantation in the treatment of long bone fractures that do not heal However, bone marrow contains few mesenchymal stem cells (MSCs), and they are difficult

to isolate To increase the efficacy of MSCs as a treatment for bone regeneration, stem cells need to be proliferated and differentiated in vitro to generate large amounts of bone­celis before transplantation into broken bones Therefore, the objectives of the current study were to MSCs culture and proliferation from human umbilical cord lining membranes and to differentiate them into osteogenic cells in vitro to establish a basis for future research and therapeutic applications of these cells

Subjects and methods

Subj cts: The umbilical cords (n=10) newborns whose mothers voluntarily participated in the research Selection criteria included mothers > Ỉ8 years of age who did not experience complications during hospitalization delivery and delivered healthy infants with a fetal gestational age of over 37 weeks All of the infants had negative results on screening tests for infectious diseases including hepatitis B virus, hepatitis c virus, HIV virus, CMV and syphilis bacteria

M thods:

­ MSCs culture and proliferation

­ Alizarin Red s stain analysis

­ In vitro induction of MSCs differentiation into osteogenic ceils

­ RNA isolation and reverse transcriptase ­ polymerase chain reaction

­ Acount the number of the cell, harvest and storage cells

­ Modeling immunosuppression mice by chemical and Initial implantation of osteogenic cell in immunosuppression mice by chemical showed capacity of calcium accumulation nodules

­ Hematoxylin and Eosin Stain

Phuơng pháp xác định số lượng tế bào nuôi cấy, thu hoạch và bảo quản tế bào

Results and conclusions:

MSCsfrom human umbilical cord w r cultur dfor prolif ration:

- Culture for proliferation in the Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F­12 (DMEM/F12) media suplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic

­ Culture for proliferation, where the cell reached approximately 60%jto 80% confluence on the surface culture plastic dish after 8 days

In vitro diff r ntiation o fm s nchymal st m c llsfrom human umbilical cord lining m mbran into ost og nic c ll:

­ The osteogenesis differentiation was induced by (DMEM/F12) media suplemented with 10% fetal bovine cerntp (FBS) and 1% antibiotic medium adding 100 nM dexamethasone, 10 mM p­glycerolphosphate, 0,5 mM ascorbic acide

­ The morphology of the cell was monitored during the differentiation process After 21 days of differentiation, the cells have changed its morphology toward the bone cell with calcium accumulation in cytoplasm and positive expression

of molecular markers of bone cell such as osteocalcin, osteopontin collagenase type I and alkaline phosphatase Initial implantation of osteogenic cell in immunosuppression mice by chemical showed capacity of accumulating calcium to form nodules and without transplant rejection

* Key words: Human umbilical cord lining membranes; Bone marrow stem cells;

I ĐẶT V N ĐÈ

Tế bào gốc (TBG) là tế bào có khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng khác nhau để thay thế cho các tế bào già và chết tự nhiên hay tổn thương do các nguyên nhân khác nhau, mở ra triển vọng dùng TBG

để tái tạo ỉại các mô Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân đã được dùng trên lâm sàng để điều trị thành công các trường hợp gãy xương lâu liền và khớp giả Khi được tiêm vào ổ gãy xương, TBG của tủy xương sẽ biệt hoá thành tế bào dạng tạo xương (TBDTX), tái tạo lại ổ khuyểt xuơng Tuy nhiên, nguồn TBG ở tủy xương có khó khăn về số lượng tế bào và qui tr nh thu thập íế bào, Màng dây rốn trẻ sơ sinh có TBG trung mô (Mesenchymal Stem Cell) tương tự như TBG trang mô ở tủy xương Bên cạnh đó, việc phân ỉập TBG từ màng dây rốn có nhiều ưu điểm cả về phương diện kỹ thuật cũng như đạo đức so với phân ỉập TBG từ một

số nguồn khác, do đó, có thể sử dụng chúng như một nguồn TBG thay thế cho TBG ở tủy xương Để ứng dụng điều trị vết thương xương sớm có kết quả, cần biệt hóa TBG thành TBDTX trước khi cấy ghép vào ồ gãy xương Các TBG trung mô được phân lập từ những nguồn khác nhau, sau đó, tăng sinh và biệt hóa in vitro thành TBDTX bằng cách bổ sung yểu tố kích thích biệt hóa và tạo xương vào môi trường nuôi cấy, bao gồm các cytokine, vitamin và canx Tế bào dạng tạo xương được đánh giá bằng h nh thái tể bào, phương pháp nhuộm đặc hiệu với canxi, marker đặc trưng của TBDTX Xuất phát từ những cơ sở lý Ịuận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứa biệt h a tể bào gốc trung mô m àng dây rắn người thành tể bào đọng tạo xư n g” với các mục tiêu sau:

­ Nuôi cấy tăng sinh TBG trung m ô từ m àng dây rến người làm vật liệu đ ể biệt h a tế bào

­ Biệt hoá in vitro TBG trung m ô m àng đây rến người th o hư&ng thành tế bào dọng tạo xtr ng nhằm ứng dụng điều trị tổn thư ng xư ng

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.Đổi tượng nghiên cứu

Dây rốn của 10 trẻ sơ sinh được mẹ đẻ là các sản phụ trên 18 tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết quả âm tính với xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiêm trùng (bao gồm virus IIĨV, virus viêm gan B, virus viêm gan c virus CMV và vi khuẩn giang mai), trẻ sinh ra ở độ tuổi thai > 37 tuần, sinh một và không có tai biển trong quá tr nh sinh đẻ

Chuột nhắt trắng dòng Albino SWISS do Ban Chăn nuôi động vật, Phòng Trang bị Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp

2.2 Phưoug phâp nghiín cứu

­ Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô măng dđy rốn: tế băo được thu nhận vă nuôi cấy tăng sinh trong môi trường DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS vă 1% chất khâng sinh, để ở nhiệt độ 37°c, 5% CƠ2

­ Biệt hóa in,vitro TBG trung mô thănh tế băo dạng tạo xương: sử dụng tế băo ở lần cấy chuyển thứ 4 Khảo sât thay đổi thănh phần môi truờng cơ bản DMEM, F12 Ham glutamax, FBS, % khâng sinh vă bổ sung câc chất cảm ứng biệt hóa tế băo như dexamethasone, acid L­ascorbic vă p­glycerolphosphate Để đânh giâ vă kiểm tra tế bẳ trong quâ tr nh biệt hóa vă tế băo biệt hóa thông qua tích tụ canxi quanh tế băo sau biệt hóa bằng nhuộm alizarin red, đânh giâ khả năng tích tụ canxi của TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô măng đđy rốn, xâc định hoạt tính của alkaline phosphates (ALP) Tâch chiết ARN vă tiến hănh phản ứng RT­PCR

để xâc định dấu ấn sinh học của tế băo dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô măng dđy rốn

­ Phương phâp xâc định số lượng tĩ băo nuôi cấy, thu hoạch vă bảo quản tế băo

­ Cấy ghĩp tế băo tạo xương biệt hóa từ TBG trang mô măng dđy rốn lín chuột nhắt đê gđy suy giảm miễn địch bằng hóa chất: tạo mô h nh chuột nhắt suy giảm miễn dịch bằng hóa chất, cấy ghĩp TBDTX biệt hóa từ TBG trang mô măng dđy rốn trín chuột suy giảm miễn dịch bằng hóa chất để bước đầu đânh giâ khả năng tạo nốt canxi trín mô h nh động vật thực nghiệm

­ Nhuộm hematoxylin vă eosin

­ Phương phâp xử lý số liệu: dựa trín phần mềm thống kí y học SPSS 16.0

in KẾT QUẢ VĂ BĂN LUẬN

3.1 Nuôi c y tăng sinh TBG trung mô măng dđỹ rốn

Câc mẫu TBG trung mô măng dđy rốn mói được thu nhận bằng nuôi cấy mô dđy rốn sau 14 ngăy tế băo đạt mật độ 60 ­ 80% bề mặt nuôi cấy hoặc tế băo bảo quản đông lạnh được giải đông cấy chuyển lại

» ' • : <)

H nh 1 Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mô (200X)

A: tế băo sau khi cấy chuyển; B: tế băo sau 24 giờ cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh; C: Tế băo sau 4 ngăy cẩy chuyển nuôi cấy tăng sinh; D: Tế băo sau 8 ngăy cấy chuyển nuôi cấy tăng sinh

Câc tế băo mới phđn lập hoặc mới giải đông lạnh sau bảo quản đông lạnh khi mới cấy chuyển hoặc cấy lại, tế băo trôi lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, không có h nh dạng đặc trưng Sau 1 ngăy, tế băo bâm dính trín bề mặt nuôi cấy, có h nh dạng đặc trưng vă bắt đầu tăng sinh Đến ngăy thứ 4, tế băo đê trải rộng trín bề

mặt nuôi cấy, có dạng h nh thoi đặc trưng và tiếp tục tăng sinh Sau 8 ngày, tế bào phát triển đạt mật độ

60 ­ 80% bề mặt đĩa, tiếp tục cấy chuyển cho tăng sinh đến P4 th sử dụng cho biệt hóa tế bào thành TBDTX Kết quả này phù hợp với nhận định của M ets và Verdonk (1981) Một nghiên cứu khác sử dụng k ĩ thuật tách TBG trung mô bằng kháng thể gắn hạt từ tính cũng khẳng định: TBỢ trung mô có 3

h nh dạng chính là 10­20% quần thể có dạng dẹt lớn (20­50 um); 80% quần thể là tế bào đài nhỏ (7 ^m)

và 5­10% tế bào tròn nhỏ mà thường quan sát hiện diện ở thế hệ thứ 2, sau đó chuyển sang dạng 7 Jim, Như vậy, đã thu nhận và nuôi cấy tăng sinh được TBG trung mô màng đây rốn, các té bào này tiếp tục nuôi cấy tãng sinh, bảo quản để sử dụng cho nghiên cứu biệt hóa tiép theo và hướng phát triển ứng dụng cho sau này

3.2» Biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xưo ig

Khảo sát m ôi trường c bản đ ể biệt h a TBG trung mô m àng đây rốn thành TBD TX

Các môi trường cơ bản được khảo sát để biệt hóa, kết quả: lựa chọn được môi trường cơ bản là DMEM:F12 (1:1) bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh có bổ sung các thành phẩn chất cảm ứng biệt hóa (BH4)

tế bào sau biệt hóa gần như bắt màu toàn bộ với alizarin red Kết quả trên đã chứng tỏ TBG trung mô đã chuyển sang dạng TBDTX với h nh thành canxi quanh tế bào

Kkão sát nồng độ c h ầ cảm ứng biệt h a TBG trung mô m àng dây rốn thành TBDTX

Sau khi khảo sát, thay đoi nông độ dexamethasohe, 8­glyceroỉphosphãte, L­acid ascobic với mỗi một thành phần được khảo sát ở nồng độ khác nhau, cố định thành phần và yểu tố khác Sau 21 ngày nuôi cấy biệt hóa, tiển hành thu hoạch tế bào và định ỉượng hàm lượng canxi Kết quả định lượng canxi ở nồng độ chất cảm ứng dexamethasone (100 nM), p­GP (10 mM), L­AsA (0,25 mM) lần lượt cho kết quả định lượng canx: 0,27 mM/I; 0,36 mM/1; 0,39 mM/ỉ, Kết quả này so với những nồng độ khác đã được khảo sát là nồng độ thích hợp nhất để bổ sung vào môi trường biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành TBDTX

Thời gm n biệt hổa TBG trung m ô màng dây rến thành TBD TX

Để biết thời gian biệt hóa vào thời điểm nào đạt được mật độ té bào có khả năng tích tụ canxi nhiều nhất Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát thòi gian biệt hóa với những thời điểm từ 0 giờ, 14 ngày và 21 ngày biệt hóa và nhuộm với alizarin red 1% Kết quả, ở thời điểm 21 ngày sau khi nhuộm với alizarin red gần như toàn bộ đĩa nuôi cấy bắt mầu với alizarin red

Xác định hoạt tính alkalin phosphatas (ALP)

Hoạt tính ALP là một dấu ấn sinh hóa cho kiểu h nh của TBDTX, khoáng hóa xương và biệt hóa tể bào Chính v vậy, nghiên cửu đã xác định hoạt tính ALP ở các thời điểm cảm ứng biệt hóa khác nhau Kểt quả’ hoạt tính ALP có xu hướng tăng lên đáng kể trong môi trường biệt hóa, đặc biệt vào ngày thứ 21 cảm ưng biệt hóa Giá trị hấp thụ (OD) ALP ở thời điểm 7 ngày: 0,045 ỉ ± 0,0020,1 4 ngày: 0,2044 ± 0,0034 21 ngày: 0,4959 ± 0,0118 Đã xác định đừợc ỡ thời điểm 21 ngày chỉ sô OD của mẫu té bào biệt hóạ cao nhat san pham của phản ứng cũng tạo ra màu vàng Như vậy, ALP biểu hiện và tăng mạnh sau 21 ngày biệt hóa Đây cũng là một trong những chỉ số để đánh giá tế bào biệt hóa được TBDTX

Sau klii khảo sát các điều kiện khác nhau và chọn được môi trường cơ bản là DMEM F12 (I I) dexamethasone: 100 nM, p­GP: 10 mM, L­AsA: 0,25 mM, thời gian biệt hóa 21 ngày Tién hành biệt hóa 10 mâu TBG trang mô màng dây rốn với điều kiện tối ưu trên

H nh 2 H nh ảnh tế bào biệt hóa sau 21 ngày nuôi cấy được nhuộm bằng alizarin red (200X)

A: TBG trụng mô (nh m chứng không biệt h a trước khỉ nhuộm Alizarin r d); B: Tế bào biệt h a (trước khỉ nhuộm Alizarin R d); C:TBG trung mô (Nh m chứng sau khi nhuộm với Alizarin R d); D: Tế bào biệt

h a (Sau khỉ nhuộm Alizarin R d)

Sau 2 í ngày nuôi cấy, TBG trung mô được bổ sung chất cảm ứng biệt hóa thành tế bào dạng tạo xương sau nhuộm Te bào bắt mầu mạnh với aiizarin red, chứng tỏ những íế bào này có lắng đọng canxi quanh te bào, trong khi đó nhóm đối chứng TBG trang mô nuôi cay không bổ sung các chất cảm ứng biệt hóa không bắt màu với alizarin red, như vậy, các tế bào này không có lắng đọng canxl quanh tế bào

Dexamethasone có khả năng hoặc kích thích hoặc ức ché biệt hóa thành xương phụ thuộc vào nồng độ của nó Nồng độ cao của đexamethasone sẽ cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ, trong khi đó, với nồng độ thâp hơn, chất này sẽ kích thích TBG trung mô biệt hóa thành xương Acid ascobic dễ dàng làm quá tr nh biệt hóa thành xương, bao gồm kích thích tổng hợp collagen, ngoài ra, nó còn làm tăng s nh tế bao Cuối cùng, p­glycerolphosphate là yếu tố quan trọng kích thích h nh thành chất nền được khoáng hóa khi kết hợp với dexamethasone và acid ascorbic Sau khi xác định khả năng tích tụ canxi và hoạt tính ALP trong tế bào, xác định mẫu tế bào biệt hóa bằng dấu ấn bằng kỹ thuật RT­PCR

M ột sổ biển đổi phâ n tử của TBG trung mô màng dây rốn trong quá trình biệt h a thành tế bào dạng tạo xư ngĩ

Các TBG trang mô màng dây rốn và TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn sau khi nuôi cấy

và biệt hóa được thu hoạch và tách chiết ARN, tổng họp cADN, chạy PCR Kết quả: các mẫu tế bào biệt hóa biểu hiện dương tính với osteocalcin, osteopontin, collagenase type I, alkaline phosphatase

310 bp

H nh 3 Xác định đấu ấn 6­Actin,ọ c ,ON của 10 mẫu TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn: B-Actin: đẩu ẩnJỈ-Actin; ON: dẩu ẩn Ost opotỉn; OC; Ost ocalcin; M SC ­ ; Đoi chứng âm; MSC+: Đối chứng dư ng; M: thang DNA chuẩn 100 bp

H nh 4 Xác định dấu ấn ALP, COL của 10 mẫu TBDTX biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn: ALP: dấu ấn Alkalin phosphatas ; COL: Colag n typ ĩ; M SC - : Đối chủng âm; MSC+: Đổi chứng dư ng; M: thang DNA chuẩn 100 bp

Biệt hóa TBDTX từ TBG trung mô in vitro được chia thành ba giai đoạn (Birmingham E t a l, 2012) Giai đoạn đầu từ 1 ­ 4 ngày, tiếp theo là giai đoạn đầu biệt hóa từ 5 ­ 14 ngày, giai đoạn này được đặc trưng vói biểu hiện ALP (Aubin, 2001), sau giai đoạn này, ALP bắt đầu suy giảm Ở giai đoạn này cũng biểu hiện Col ­ tạo nền khoáng hóa xương (Birmingham E vàcs, 2012) Trong nghiên cứu này, chúng tôi dã xác định biểu hiện cùa ALP và Col sau 21 ngày cảm ứng biệt hóa Tiếp đến là giai đoạn biệt hóa cuối từ 14 ­ 28 ngày, kết quả có biểu hiện cao của osteocalcin và osteòpontin, tiếp theo là lắng đọng canxi (Hoemann và cs, 2009) Kết quả này phù hợp với các tác giả khác đã công bố: tế bào biệt hóa có biểu hiện các dấu ấn, o c , ON

và cho dương tính với cả hai dấu ấn sinh học này Từ kết quâ về đặc điểm h nh thái, khả năng lắng đọng canxi, biểu hiện dấu ấn sinh học trên của tế bào được biệt hóa, đã biệt hóa và nhận biết được TBDTX được cảm ứng biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn

3.3 K ết quả bước đ ầu th ử nghiệm cấy ghép TBDTX biệt hóa từ TBG tru ng mô trên động vật

Để thử nghiệm ghép tế bào dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô màng dây rốn ưánh bị thải loại và

có khả năng tích tụ canxi, chuột được tiêm busulfan 20 mg/kg và cyclophosphamide 50 mg/kg Chuột sau khi tiêm thuốc so với lô đối chứng, trọng lượng giảm mạnh, tỷ lệ chuột bị chết sau khi tiêm khoảng < 40%, chuột di chuyển chậm, lông xù Ở thời điểm trước khi tiêm, số lượng tế bào bạch cầu cùa chuột nằm trong khoảng 11.500 tế bào/ml, sau 5 ngày tiêm thuốc số lượng bạch cầu giảm mạnh đều đạt dưới 2000 tế bào/ml Sau khi chuột được tạo suy giảm miễn địch, tiến hành cấy ghép tế bào Kết quả, sau 8 tuần cấy ghép dưới

đa chuột với mật độ tế bào 2,108 tế bào/ml Ở lô cấy ghép bằng TBG trang mô, không thấy xuất hiện tích tụ canxi Ở lô cấy ghép bằng tế bào dạng tạo xương được biệt hóa từ TBG trung mô, xuất hiện tích tụ canxi tại

vị trí cấy ghép

H nh 5 H nh ảnh sau i tháng cấy ghép tế bào dạng tạo xương trên chuột suy giảm miễn dịch (A: Ghép

Một trong những phương pháp đánh giá tế bào dạng tạo xương là khả năng tích tụ canxi và tạo nốt xương khi cấy ghép vào động vật thử nghiệm Kêt quả: sau khi cẩy ghép 8 tuần đã xác định khả năng tích tụ canxi thực hiện băng cách kiểm tra các nốt canxi ở vị trí dưới da sau lưng chuột Chỉ có iô chuột tiêm tế bào biệt hóa có một vài nốt xuất hiện ờ vị trí tiêm dưới da, với mẫu tiêm bằng TBG trung mô và mẫu đối chứng âm tiêm bằng nước muối sinh ỉý không thấy xuất hiện các nốt dưới da Sau khi cấy ghép tạo nốt canxi, lấy các nốt canxi làm tiêu bản nhuộm hematoxylin và eosin

Theo Yo chi Yamada và c s (2003), để kiểm tra và h nh thành tích tụ canxi trên mô h nh chuột thí nghiệm, có sử đụng mô h nh tiêm kểt hợp với phụ gia fibrin để giúp tăng khả năng tích tụ và h nh thành canx , sau 8 tuần đã x u ầ hiện các nốt canxi và hiện tượng vôi hóa xảy ra Trong thí nghiệm này, chúng tôi không sử đụng fibrin, để đánh giá chính xác khả năng tích tụ canxi cần chụp X Quang và lẩy mẫu làm tiêu bản nhuộm HE, nhưng trong khuôn khổ đề tài mới ch dừng lại ở bước kiểm tra không có hiện tượng thải loại khi ghép và có h nh thành các nốt canxi ở vị trí dưới da Mặc dò khả năng tích tụ tế bào lại thấp hơn, nhưng cũng có một vài nốt sau 8 tuần cấy ghép

IV K ẾT LUẬN

Từ kết quả thu được của nghiên cứu biệt hóa TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tế bào tạo xương chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

­ Đã nuôi cấy tăng sinh được TBG trang mô từ màng đây rốn trẻ sơ sinh

­Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường cơ bản có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, nuôi cấy ờ37°c,5 C02

­ Nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 60­80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy sau 8 ngày

­ Đã cảm ứng biệt hóa được TBG trung mô màng dây rốn thành tế bào dạng tạo xương trên ỉn vitro:

­ Môi trirờng cảm ứng biệt hóa gồm: DMEM high glucose/F12 glutamax có bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh, 100 nM dexamethasone, 10 mM p­glycerolphosphate, 0,25 mM acid ascorbic

­ Trong quá ư nh cảm ứngbiệt hóa, hầu hết các tế bào đều ngừng phân chia, có sự thay đổi về h nh dạng, kích thước, tê bào bắt đầu chuyển từ dạng thoi, nhỏ sang dạng tròn, lớn và cuối cùng là h nh hạt đậu giống tế bào tạo xương sau 21 ngày; có lắng đọng canxi, có hoạt tính phosphatase kiềm; dương tính với các dấu ấn osteocalcin, osteopontin, collagen týp I, phosphatase kiềm; bước đầu íhử nghiệm cho thấy có khả năng tạo nôt tích tụ can­xi khi cấy ghép dưới da chuột nhắt suy giảm miễn dịch

KIÉN N GHỊ

­ Cần tiép tục nghiên cứu thử nghiệm trên mô h nh động vật bị tổn thương và gãy xương nhằm đánh giá khả năng biệt hóa và liền vết thương của TBG trung mô màng dây rốn và tế bào dạng tạo xương biệt hóa được

­ Xác định tính an toàn và khả năng sinh u của tế bào biệt hóa khi cấy ghép trên mô h nh động vật