Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn Insulin trong quá trình nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta tụy đảo

Biểu hiện của d u n insulin trong quá trình bỉệt hóa TBG màng ối thành tế bào p tụy đảo Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa plastic thấy nồng độ ARNtt của insuli[r]

NGHIÊN CỨU BIÊU HIỆN DẤU ẤN INSULIN TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẮY BIỆT HÓA TÉ BÀO GỐC MÀNG ÓI NGƯỜI THÀNH TÉ BÀO BETA T Y ĐẢO

ThS Nguyễn Văn Tầng*

H ướng dẫn; TS Phạm Văn Trân**

TÓ M T T

ỉ.Nghiên cứu quy tr nh phân iập, bàoquản vànuôi cấy tế bào gốc (TBG) màngổi người

2.Biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào beta tụy đảo có khả năng biểu hiện dấu ấn insulin

Phương pháp nghiên cữu:

Tách tế bào bằng enzym trypsin, nuôi cấy định hướng biệt hóa bằng môi trường DMEM có bổ sung Nicotinamide, p­mercaptoethanol và các yếu tố sinh trưởng Xác định tính gốc của TBG bằng dấu ấn OCT­4 và xác định khà năng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo bằng dấu ấn insulin

Kết quả nghiên cứu:

Quy tr nh tách phân lập TBG từ màng ối đạl hiệu quả cao, dấu ấn insulin được xác định bằng kỹ thuậ£ RT­PCR tăng dần theo thời gian nuôi cấy

Kểt luận:

TBG tách từ màng ối có thể nuôi cấy định hướng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo để phục vụ cho nghiên cứu và điều trị

* Từ khóa: Tê bào gốc; Màng ối; Tế bào beta tụy đảo

E xpr ssion o f in su lin m ark rs in th proc ss o f sp cm lzin g a n d culturing st m c ils fro m hum an am nw tic m m bran into b ta c ils

Summary

Research objectives:

­ To study process of isolating, preserving and culturing stem cells from human araniotic membrane

­ To differentiate stem cells from human amniotic membrane into beta cells with the ability of expressing insulin markers

Research methodology: Isolating stem cells by enzyme trypsin, culturing them in specialized orientation in DMEM added to Nicotinamide, B­mercaptoethanol and other growth factors The origin of stem cells was determined by OCT­4 and specialized abilities into beta cells by insulin markers

Results: Protocol for isolating stem cells from amniotic membrane achieved high efficiency, insulin which was determined by RT­PCR technique increase gradually according to culturing time

Conclusion: Stemcells isolated from amniotic membrane can differentiate into beta cells to serve for study and treatment

* Key words: Stem cells; Amniotic membrane; Beta cells

I.ĐẶ T V ẤN Đ Ề

Tế bào gốc là những tể bào có tiềm năng phát triển, tự làm mới và có thể biệt hóa thành những loại

tế bào b nh thường khác nhau của cơ thể T ừ TBG có thể biệt hoá thành nhiều loại tế bào chuyên biẹt

để điều trị các bệnh như: Đái tháo đường týp 1, đột quỵ não, nhồi máu cơ tim, chấn thương tuỷ sống bòng và nhiều bệnh khác Cho tới nay, biện pháp hữu hiệu nhất để điều trị những trường hợp này ỉà ghép mô, cơ quan ­ nhưng nhu cầu ghép lại cao hơn rất nhiều so với nguồn cung cấp

* Cao đẳng Y tể Thanh H a

** Học viện Quân y

Màng ối là sản phẩm thường bỏ đi sau quá tr nh sinh nở, chứa một số ỉượng tiềm năng các TBG gọi

là TBG màng ối Đây là TBG đa tiềm năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, trong đó, có tê bào beta tụy đảo [6]

V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:

­ Nghiên cứu quy trình phân lập, bảo quản và nuôi cậy TBG màng ối người

- Biệthóa TBG màng ầ ngườithành tể bào beta tuy đảo có khả năngbiầi hiện dấu ẩn ừtsuUn

II ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đối tượng nghiên cửu

Màng ối và TBG m àng ối được lấy từ các sản phụ mổ đẻ có kết quả âm tính với HIV, HBV, HCV

và giang mai tại Khoa sản ­ Bệnh viện Quân y 103 ­ Học viện Quân y

2.2 Phưong pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả thực nghiệm in vitro Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học quân sự, Học viện Quân y

2.3 Các quy trình kỹ thuật

2.3.1 Kỹ thuật phân lập

Các TBG được phân lập từ màng ối bằng kỹ thuật sử dụng enzym phân cắt mô (Trypsin, Hyaluronidase và CoUagenase B 0,1%) phối họp vói các biện pháp cơ học

2.3.2 Quy trình nuôi c y tăng sinh số lượng và biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào p tụy đảo Nuôi cấy tăng sinh

TBG màng ối được nuôi cấy ữong môi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 Ư/mỉ), streptomycin (50 Jig/ml),_L­glutamin (2 X 10’3M), huyết thanh bào thai bê (10%), hai ngày thay môi trường một lần để loại

bỏ những tế bào chết và cung cấp chất dinh dưõng đồng thời cấy chuyển tế bào 2 tuần một lần để duy tr trong phòng thí nghiệm

Nuôi cấy biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đào (Beta cells)

Sử dụng tế bào P2 (passage 2) để biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đảo Nuôi cấy tăng sinh trong vòng

7 ngày Quan sát thấy tế bào bao phù kín đĩa nuôi cây Sau đó, bổ sung vào môi trường cơ bản các yếu tố định hưóng biệt hóa TBG màng ối thành tê bào beta tụy đảo bao gồm 10 mM nicotinamide, 55 (iM B~mercaptoethanol, ỉ mmol natri pyruvat [2,3] Thu hoạch tế bào vào ngày thứ 1 (N l) ngày thứ 7 (N7) và ngày thứ Í4 (N14) sau khi bổ sung yếu tố biệt hóa vào môi trường nuôi cấy

Đánh giá két quả biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đảo bằng giảm dấu ấn TBG (OCT­4, xác định bằng W estern blot) với sự xuất hiện và tăng dấu ấn của tế bao beta insulin ở cả mức độ protein (định iượng theo phương pháp hóa miễn dịch phát quang) và mức độ ARNtt (RT­PCR) 2.3.3 Các kỹ thuật khác

­ Xác định khả năng biệt h a bằng định lượng nồng độ insulin trong dịch ly giải tế bào: Định lượng nông độ insulin theo phương pháp miên dịch điện hóa phát quang sử dụng kit (Abbott) Erên máy miễn dịch tự động hoàn toàn Asxym (Abbott)

­ K ỹ thuật W st rn blot: Xác định biểu hiện protein trong địch ly giải tế bào

­ Phư ng pháp điện h a phá t quang định lượng insulin: Định lượng insulin trong nghiên cứu này

sử dụng phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng kít của hãng Abbott trên máy Asxym

r a K ẾT QUẢ

3.1 K ết qu ả ph ân lập

­ Màng ối sau khi bồc tấch được rửa sạch bằng dung dịch PBS IX, các TBG màng ối được phân lập theo quy tr nh

­ Chúng tôi đã lựa chọn được môi trường phân lập TBG màng ối người Chọn được môi trường tối ưu là Trypsin 0,25% + Coliagenase B 0,1% thể hiện trong bảng 1

Bảng 1 Thòi gian tác.đụng của enzym phân cắt mô

Sau khi lựa chọn môi trường tối ưu, chúng tôi tiến hành phân lập và sau đó nuôi cấy tế bào màng

ối vừa phân lập trên đĩa nuôi cấy với môi trường DMEM Sau 24 giờ, các tế bào bám dính vào bề mặt đáy đĩa nuôi cấy, các TBG màng ối có h nh thoi, kích thước trung binh Sau 24 giờ phân lập thu được

h nh ảnh TBG từ màng ối như h nh 1

H nh 1 Ảnh TBG màng ối sau 24 giờ phân lập (Chụp từ kính hiển vi đối pha,X200)

3.2 K ết quả nuôi cấy tăng sinh TBG m àng ổi ngưòi

TBG được nuôi cấy trong đĩa plastic đường kính 10 cm, với môi trường DMEM high glucose có thêm 10% FBS + 1% Peniđỉỉine­Streptomycme + ĩ % L­glutamat, trong tủ nuôi cấy HEPA­NƯAĨRE ở37°c,không khí

có 5% C 0 2, độ ẩm bão hòa như đã mô tả ưong phàn đối tượng và phương pháp nghiên cứu Kết quả nuôi cấy

và môi trường nuôi cấy cũng tương tự như kết quả của các nghiên cứu khác (hình 2)

H nh 2 H nh ảnh tế bào chụp trực tiếp trên đĩa nuôi cấy qua kính hiển vi đối pha A: Sau 2 ngày nuôi cấy B: Sau 14 ngày nuôi cấy

Ngaỵ sau khi nuôi cấy 24 giờ, các TBG màng ối có xu hướng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy phát triển thành những cụm tế bào h nh đa diện hoặc h nh thoi và có kích thước trung b nh Sau 2 tuần nuôi cây, mật độ tế bào phát triển bao phủ khoảng 50 ­ 60% bề mặt^ổĩa nuôi cấy

3.3 Biểu hiện d u n sinh học trong quá trình nuối c y

3.3.1 Biểu hiện của OCT-4 - d u n của TBG

Trái với đấu ấn insuỉỉn, nồng độ ARNtt OCT­4, dấu ấn TBG giảm dần theo thời gian trong nhóm được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nicotinamid và 8­mercaptoetanol H nh ảnh hóa miễn dịch tế bào ngày thứ 14 rất ít tế bào còn biểu hiện OCT­4

►

a

OCT-4 H 5 kDa) Act n

H nh 3 A H nh ảnh TBG màng ối ngirời sau 7 ngày nuôi cấy B Nhuộm hóa miễn dịch tế bào với OCT­4, màu xanh lá OCT­4, màu xanh tím nhuộm nhân bằng DAPĨ, c.H nh ảnh western blot phát hiện OCT­ 4 protein của TBG màng ối trong quá tr nh biệt hóa thành tế bào p tụy đảo Lượng protein OCT­ 4 giảm dần trong quá tr nh biệt hóa p ­ actin là protein nội chứng cho thấy lượng protein tỷ số như nhau Nồng độ protein OCT­4, dấu ấn TBG giảm dàn theo thời gian của nhóm đựợc nuôi cấy trong môi trường có bổ sung nicotinam id và p­mercaptoethanol H nh ảnh western blot cho thấy OCT­4 giảm dần theo thời gian, trong quá tr nh biệt hóa

3.3.2 Biểu hiện của Insulin - D u n TBG màng ối người biệt hóa thành tế bào p íụy đảo

XiÍJ

e l

3,5

2.5

i

i f

j p s

'ễ S

‘ủọẹ

s>«

iNhómchứng ■Nhỏmbìệt hỏâ 3.5­1

2.5-'ì ­

i5

-i ­

Thời gian nuôi cấy

H nh 4 Đồ thị nồng độ ARNtt của insulin so với

nhóm chứng

lóm biệt óa 3.25

Thời gian nuôi cấy

H nh 5 Đồ thị nồng độ của insulin so với

nhóm chứng

Có sự biệt hóa của TB G m àng ối người thành tế bào beta tụy đảo Sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa plastic thấy nồng độ ARNtt của insuỉin (xác định bằng RT­PCR) không tăng Sau 14 ngày nuôi cấy

trên plastic, trong nhóm có bổ sung trong môi trường nuôi cấy Nicotinam ide và p ­ M ercaptoetanol thấy tăng cao insulin Kết quả định lượng protein insulin cũng phù hợp với kết quả định lượng ARNtt Kết quả hóa miễn dịch tế bào thấy TBG biểu hiện rõ nét insulin trong nhóm được xử lý vói nicotinamide và p­mercaptoethanol

IV BÀN LƯẶN

4.1 Quy trình phân lập

Từ những kết quả đạt được về phân lập TBG từ màng ối bằng các enzym chúng tôi nhận thấy: Nếu chỉ phân cắt màng ối bằng Trypsin th số lượng tế bào thu được thấp và thòi gian thường phải kéo dài, có khi

60 phút các tế biểu mô màng ối mới bị phân cắt hết

Nếu cho thêm enzym collagenase B vào Trypsin với tỷ ỉệ 1:1 th số lượng tế bào thu được sẽ nhiều hơn và thời gian tan rã màng ối sẽ nhanh hơn (bàng ĩ)

Chúng tôi sử dụng trypsin và collagenase B để làm tan rã màng ối giải phóng tế bào Sờ dĩ sử dụng trypsin trong quá tr nh phân lập v trypsin là enzym protease có khả năng phân giải protein ngoại bào tương tự như collagenase N goài ra, các enzym này hầu như không có tác đụng trên màng tế bào do cấu trúc đặc biệt của màng tế bào

4.2 Bảo quản và nuôi cấy tăng sinh TBG m àng ối

Khi bảo quản màng ối và TBG màng ối trong glycerol ở4°c, các tế bào sẽ chết toàn bộ Bảo quản đông lạnh với dimethyl sulphoxide (DMSO) ở nhiệt độ-80°ccho phép giữ lại tới 50% tế bào sống trong vài tháng [7] Một số yếu tố sinh trưởng và cytokine bị mất trong quá tr nh này [5,7] Tuy nhiên, khi bảo quản màng ối trong dung dịch glycerol 50% khả năng sống của tế bào không còn [5] Nh n chung, khả năng sống của tế bào trên màng ối phụ thuộc vào môi trường bảo quản, nhiệt độ

4.3 Biểu hiện của d u n insulin trong quá trình bỉệt hóa TBG màng ối thành tế bào p tụy đảo Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa plastic thấy nồng độ ARNtt của insulin (xác định bằng RT­PCR) không tăng Sau 14 ngày nuôi cấy trên plastic, trong nhóm có bổ sung trong môi trường nuôi cấy nicotinamide và B­mercaptoetanol thấy tăng tổng hợp ARNtt của insulin

v ề h nh thái, tế bào trong nhóm chứng được nuôi cấy trong môi trường cơ bản DMEM vẫn đuy trì

h nh thoi tương tự như các TBG màng ối ban đầu Trong khi té bào định hướng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo, dần biến đổi h nh thái Sau 2 ­ 3 ngày, các tế bào bám dính tốt vào bề mặt đĩa nuôi cấy, phát triển nhưng chưa thấy thay đổi h nh thái Các tế bào vẫn phát triển h nh thoi giống như tế bào ban đầu Điều này chứng tỏ, ở mật độ thấp, khi các tế bào chưa tiếp xúc với nhau, th các tế bào vẫn chưa biệt hóa mặc dù đã có các cytokin định hướng biệt hóa Tới ngày thứ 14, phần lớn tế bào có h nh

đa diện, h nh dạng điển h nh của tế bào biểu mô tuyến khi nuôi cấy

Quá tr nh biệt hóa TBG thành tế bào beta tụy có thể chia thành hai giai đoạn: Giai đoạn biệt hóa chức năng, tức là giai đoạn mà các TBG bắt đầu biểu hiện các dấu ấn đặc hiệu của tế bào tụy Giai đoạn thứ hai là giai đoạn biệt hóa về h nh thái, các tể bào tụy sắp xếp tạo thành tiểu đảo Langerhans

và h nh thành các cấu trúc h nh thái của tụy Chóng tôi đùng kỹ thuật phân tử để xác định các tế bào

đó có biểu hiện của các dấu ấn tế bào tụy hay không Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi chỉ xác định dấu ấn sinh học cùa tể bào beta tụy đảo là insulin v đây à loại tế bào tiết insulin Sở d ĩ chúng tôi chọn đấu ấn này v insulin có biểu hiện cả ở TBG và tế bào tụy với mức độ khác nhau Khi TBG biệt

hóa thành tế bào tụy th biểu hiện của insulin tăng lên Như vậy, khi tế bào tăng sản xuất insulin có thể nói về chức năng, TBG đã trờ thành tế bào có chức năng cùa tế bào tụy

Qua cả h nh thái và sự biểu hiện của dấu ấn sinh học đã chứng tỏ các TBG màng ối đã cósựbiệt hóa thành tế bào tụy Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù họp với các tác giả khác [4, 8]

V KẾT LUẬN

5.1 Phân iập, đinh danh, nuôi c y tăng sinh và bảo quản TBG m àng ối người

­ Đã phân lập thành công TBG từ màng ối người bằng môi trường tối ưa trypsin 0.25% + Coliagenase

B 0.1%

­ Nuôi cấy tăng sinh các TBG màng ối người Bảo quản được TBG màng ối người thành công Không khác biệt về khả năng sống và bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy của tế bào

5.2 Biểu hiện d u n insulin trong quá trình nuôi c y

­ Đã biệt hóa được tế bào có chức năng của tế bào beta tụy đảo từ TBG màng ối người

­ Biểu hiện được AR Ntt của insulin chứng tỏ có sự biệt hóa của TB G màng ối người thành tế bào beta tụy đảo

TÀ I LIỆ U TH A M KHẢO

[Ỉ Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Tiến Bình, Lý Tuấn Khải, Trư ng Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh Bình, Ngô Văn Toàn (2007), “Ghép TBG tự thân điều trị khớp già thân xương chày5' TCNCYH Phụ trư ng 5/ (4)/2007): 4 ­8

[2] Bhandarỉ, D.R., t al (1997), The simpliest method for in vitro beta­cell production from human adult stem cells Diff r ntiation 82(3): pp 144 ­ 452

[3] Furth, M.E and A Atala (2009) Stem cel sources to treat diabetes J C ll Bioch m 106(4): pp 507 ­511 [4] G lling, R.W., t al (2003), Lower blood glucose, hyperglucagonemia, and pancreatic alpha cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice Proc NatlAcad Sci USA 100(3): pp 1438­ 1443

5] Hao, Y., t al (2000), Identification of antiangiogenic and anti­inflammatory proteins in human amniotic membrane Corn a 19(3): pp 348 ­ 352

[6] Koik , T., t at (1999), Cultured epithelial grafting using human amniotic membrane: the potential for using human amniotic epithelial cells as a cultured oral epithelium sheet Arch Oral Biol 56(10): pp 1170 ­ 1776

[7 Kubo, T., t al (2001), Time­sequential changes in biomechanical and morphological properties of articular cartilage in cryopreserved osteochondral allografting J Orthop Sci 6(3): pp 276 ­ 281

[8 Ma da, H., t al ( 2004), Epidermal growth factor and insulin inhibit cell death in pancreatic beta cells by activation of PI3­kinase/AKT signaling pathway under oxidative stress Transplant Proc 36(4): pp 1163 ­ 1165