Nghiên cứu phương pháp xác định erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Thực trạng của ngành thủy sản của Việt Nam gặp rào cảng các tiêu chuẩn kỹ thuật về dư lượng kháng sinh khi xuất sang các thị trường EU, Nhật, Hàn Quốc… đòi hỏi hệ thống kiểm nghiệm phải

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

ĐINH THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC GIỌT CHẬM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG K2009

MÃ NGÀNH: 60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2011

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS TRẦN BÍCH LAM

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS PHẠM THỊ HUỲNH MAI

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS CÙ THANH SƠN

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

- -oOo -

Tp HCM, ngày 22 tháng 1 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ và tên học viên: ĐINH THỊ THU HẰNG Giới tính : Nam / Nữ6 Ngày, tháng, năm sinh : Nơi sinh :

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm và đồ uống

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2009

1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng Erythromicin trong thủy sản bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông giọt treo thủy ngân” 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: 2.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng erythromycin bằng kỹ thuật cực phổ sóng vuông giọt treo thủy ngân 2.2 Thẩm định phương pháp phân tích để đánh giá giá trị sử dụng của phương pháp trong thực tế

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 25 – 09 - 2010

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 22 – 01 - 2011

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ):

Tiến sĩ Trần Bích Lam

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký)

L ỜI CẢM ƠN

Con xin bày tỏ lòng biết ơn, niềm yêu thương đến bố mẹ đã nuôi dưỡng chăm lo, động viên cho con để con có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Cô TS Trần Bích Lam,

Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM; Thầy Th.S Ngô Chỉnh Quân, Anh Thắng cùng các anh chị cán bộ của Phòng Phân Tích Môi Trường_Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga_chi nhánh phía Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài

Xin chân thành cám ơn các anh, chị phụ trách phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài

Cuối cùng, em cũng hết lòng biết ơn Giám Đốc Cty TNHH Hướng Đi đã tạo điều kiện về thời gian cho em thực hiện đề tài này

Erythromycin

hồi (%)

Hệ số tương quan (R 2 )

LOD (ppb)

RSD (%)

SUMMARY

Erythromycin are now one of antibiotics strictly prohibited in seafood products while exporting to the US, EU and Japan There are many methods used for analysing these antibiotics in the seafoods such as HPLC, LC-MS/MS, GC-MS, ELISA etc However, these methods require costly equipments, long time analysis, pure analytical chemicals etc A stripping square wave fast scanning polarography method (PSA-F) was primarily developed and validated to quantify these antibiotics with simple and short time analysis, low- cost reagents, equipments made in Vietnam It can bring a lot of useful and actual applications

Erythromycin

(%)

Correlation coeficient (R 2 )

LOD (ppb)

RSD (%) Supporting

electrolyte

MỤC LỤC

Mở đầu 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 2

1.1 Phương pháp phân tích cực phổ : 2

1.1.1 Cơ sở của phương pháp cực phổ 2

1.1.2 Các phương pháp cực phổ: 3

1.1.3 Ứng dụng của phương pháp cực phổ: 7

1.1.4 Nguyên lý hoạt động của phương pháp cực phổ quét nhanh trên cực giọt chậm 8

1.2 Tổng quan về Erythromycin: 9

1.2.1 Erythromycin: 9

1.2.2 Một số phương pháp có thể phân tích Erythromycin: 11

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

I NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 13

2.1 Nguyên liệu 13

2.2 Thiết bị, dụng cụ 13

2.3 Hóa chất 13

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.4 Nghiên cứu định lượng Erythromycin 13

2.5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu: 14

2.6 Khảo sát tối ưu các điều kiện cho việc xác định Erythromycin trên máy Analyzer SQF-505 15

- Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền 15

- Khảo sát nồng độ dung dịch nền 15

- Khảo sát dung môi hòa tan Erythromycin 16

- Khảo sát các thông số chạy: 16

- Xây dựng đường chuẩn Erythromycin trên dung dịch nền 17

2.7 Xây dựng quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu 18

- Quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu tôm, cá 18

- Thuyết minh quy trình: 18

- Xây dựng đường cong chuẩn trên mẫu trắng: 19

III XỬ LÝ & ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ 20

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Điều kiện tối ưu cho việc xác định ERY trên máy Analyzer SQF-505 23

3.1.1 Kết quả khảo sát lựa chọn dung dịch nền: 23

3.1.1.1 Lựa chọn dung dịch nền với pH tối ưu: 23

3.1.1.2 Lựa chọn nồng độ dung dịch nền tối ưu: 25

3.1.1.3 Lựa chọn dung môi hòa tan Erythromycin: 29

3.1.2 Khảo sát thông số chạy máy ở chế độ sóng vuơng quét nhanh trên cực giọt chậm (SQW-F) 29

3.1.2.1 Khảo sát thế bắt đầu Vstart và thế kết thúc Vstop (chiều quét thế ) 29

3.1.2.2 Khảo sát các thông số chạy máy trong kỹ thuật sóng vuông quét nhanh, mode đo SQW-F 30

¾ Chọn Vpulse ( biên độ xung vuông): 30

¾ Chọn Vstep ( bước quét thế một chiều) 31

¾ Chọn Tdrop ( thời điểm bắt đầu quét thế trong đời sống một giọt) 32

3.1.2.3 Khảo sát các thông số chạy máy trong kỹ thuật sóng vuông quét nhanh, mode đo PSA-F 34

¾ Chọn Velectrolize (thế tích góp): 34

¾ Chọn Telectrolize (thời gian điện phân tích góp): 34

3.2 Xây dựng đường chuẩn xác định Erythromycin bằng kỹ thuật stripping 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính 37

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 38

3.3 Xác định Erythromycin trong mẫu tôm 39

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn của Erythromycin trong nền CH3COONH4

0,05 M pH = 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu tôm 39

3.3.2 Xác định hệ số thu hồi Erythromycin trong mẫu tôm càng xanh 41

3.3.3 Phân tích mẫu tôm càng xanh 41

3.4 Xác định Erythromycin trong mẫu cá rô phi 42

3.4.1 Xây dựng đường chuẩn của Erythromycin trong nền CH3COONH4

0,05 M pH = 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu cá rô phi 42

3.4.2 Xác định hệ số thu hồi Erythromycin trong mẫu cá rô phi 44

3.4.3 Phân tích mẫu cá rô phi 45

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

I KẾT LUẬN: 47

II KIẾN NGHỊ: 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hệ thống thiết bị ANALYZER SQF-505 8

Hình 1.2 Erythromycin 9

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 14

Hình 2.2 Quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu tơm, cá 18

Hình 3.1 Sĩng phổ ERY trong nền CH3COONH4 ở các nồng độ chất nền khác nhau 27

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dịng vào nồng độ dung dịch nền 28

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc thế bán sĩng vào nồng độ dung dịch nền 28

Hình 3.4 Đồ thị cường độ dòng của Erythromycin ứng với dung môi khác nhau 29

Hình 3.5 Sĩng phổ của ERY thu được ở hai chiều quét thuế khác nhau 30

Hình 3.6 Phổ của Erythromycin tại các Vpulse khảo sát 31

Hình 3.7 Phổ của Erythromycin tại các Vstep khảo sát 32

Hình 3.8 Phổ của Erythromycin tại các Tdrop khảo sát 33

Hình 3.9 Phổ của Erythromycin tại các Velectrolize khảo sát 35

Hình 3.10 Phổ của Erythromycin tại các Telectrolize khảo sát 36

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và cường độ dịng Erythromycin 37

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và cường độ dịng Erythromycin trong nền CH3COONH4 0,05 M pH = 8.0 theo những nồng độ khác nhau và đường chuẩn ở mode PSA-F 38

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và cường độ dịng Erythromycin trong nền CH3COONH4 0,05 M pH = 8.0 cĩ bổ sung dịch chiết tơm càng xanh 40 Hình 3.14 Sĩng phổ vuơng của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4

0,05 M pH= 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu tôm càng xanh 40 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và cường độ dòng

Erythromycin trong nền CH3COONH4 0,05 M pH = 8.0 có bổ sung

dịch chiết cá rô phi 43 Hình 3.16 Sóng phổ vuông của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4 0,05 M pH = 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu cá rô phi 44

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng tra hệ số Student 22

Bảng 3.1 Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Amoni acetate 23

Bảng 3.2 Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Natri acetate 24

Bảng 3.3 Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Natri acetate 24

Bảng 3.4 Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Natri acetate 24

Bảng 3.5 Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Natri acetate 25

Bảng 3.6 Phổ sĩng vuơng Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4 ở các nồng độ khác nhau 26

Bảng 3.7 Phổ sóng vuông của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4 với các chiều quét thuế khác nhau 30

Bảng 3.8 Kết quả đo Erythromycin tại các Vpulse khảo sát 31

Bảng 3.9 Kết quả đo Erythromycin tại các Vstep khảo sát 32

Bảng 3.10 Kết quả đo Erythromycin tại các Tdrop khảo sát 33

Bảng 3.11 Kết quả đo Erythromycin tại các Velectrolize khác nhau 35

Bảng 3.12 Kết quả đo Erythromycin tại các Telectrolize khác nhau 36

Bảng 3.13 Phổ sóng vuông của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4 37 Bảng 3.14 Phổ sóng vuông của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4 0,05 M pH= 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu tôm càng xanh 39

Bảng 3.15 Hiệu suất chiết trên mẫu tôm càng xanh 41

Bảng 3.16 Kết quả xác định hàm lượng Erythromycin trong mẫu tôm càng xanh 42

Bảng 3.17 So sánh kỹ thuật cực phổ sóng vuông với kỹ thuật LC-MS/MS mẫu tôm càng xanh 42

Bảng 3.18 Phổ sóng vuông của Erythromycin trong dung dịch nền CH3COONH4

0,05 M pH= 8.0 có bổ sung dịch chiết mẫu cá rô phi 43

Bảng 3.19 Hiệu suất chiết trên mẫu cá rô phi 45

Bảng 3.20 Kết quả xác định hàm lượng Erythromycin trong mẫu cá rô phi 46

Bảng 3.21 So sánh kỹ thuật cực phổ sóng vuông với kỹ thuật LC-MS/MS mẫu cá rô phi 46

MỞ ĐẦU

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như ung thư, đột

biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng

vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh Để tăng cường kiểm soát dư lượng, Uỷ ban Châu Âu đã ban hành Quyết định số 2377/90 EC qui định giới hạn cho phép thuốc thú y

trong sản phẩm động vật (CE, 1990), theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải

được kiểm soát dư lượng tuân thủ qui trình của Chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996) Đặc biệt các phương pháp phân tích được công nhận và áp dụng trong chiến lược kiểm soát dư lượng phải chuẩn hoá theo quyết định số 2002/657/CE (CE, 2002) Trước sức ép đó, muốn hàng hoá có nguồn gốc từ động vật được phép lưu thông trên thị trường Châu Âu, trước hết, các nước xuất khẩu và các nhà sản xuất phải có chiến lược phân tích kiểm soát

dư lượng tốt và cần thiết phải có những nghiên cứu về hệ thống các phương pháp phân

tích sử dụng trong chương trình giám sát dư lượng

Thực tế hiện nay, đại đa số các cơ sở sản xuất dược phẩm, thuốc thú y, phân bón, thức ăn gia súc, chế biến nông sản, thực phẩm chưa có đủ thiết bị phân tích để kiểm tra chất lượng nguyên liệu hay thành phần trong sản phẩm do mình sản xuất ra Thực trạng của ngành thủy sản của Việt Nam gặp rào cảng các tiêu chuẩn kỹ thuật về dư lượng kháng sinh khi xuất sang các thị trường EU, Nhật, Hàn Quốc… đòi hỏi hệ thống kiểm nghiệm phải chính xác, nhanh gọn để kiểm soát một cách dễ dàng các hàng thủy sản có dư lượng khánh sinh không đạt yêu cầu

Máy phân tích ANALYXER SQF-505 là một thiết bị phân tích dựa theo nguyên lý cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm thủy ngân, ra đời được đánh giá là một công cụ hiệu quả để kiểm tra nguyên liệu ban đầu, sản phẩm trung gian, thành phẩm cuối cùng cho nhiều lĩnh vực sản xuất khác nhau Đề tài luận văn này nhằm mục đích tìm

ra một phương pháp phân tích đơn giản, chính xác cao dư lượng Erythromycin trên thiết

bị ANALYXER SQF- 505 để góp phần giải quyết yêu cầu phát hiện nhanh dư lượng Erythromycin trong các nguồn thủy sản xuất khẩu ở cấp cơ sở cũng như các cấp tuyến trên

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.1 Phương pháp phân tích cực phổ: [1], [2]

Phương pháp này dựa trên việc ứng dụng sự phân cực nồng độ, sinh ra trong quá trình điện phân trên điện cực có bề mặt nhỏ Dựa vào đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của sự biến đổi cường độ dòng trong quá trình điện phân vào thế đặt vào, có thể xác định định tính và định lượng chất cần phân tích với độ chính xác khá cao Đường biểu diễn cường độ dòng tại thời điểm xảy ra sự khử ion cần phân tích bị gãy đột ngột ở phía trên, tạo nên đường gọi lá sóng cực phổ Dựa vào vị trí của sóng đó, cớ thể xác định thành phần định tính của chất điện li, dựa vào chiều cao của sóng có thể xác định được hàm lượng của ion bị khử

Phương pháp cực phổ do Hayropxki (Tiệp Khắc) phát minh năm 1922 Phương phap này có khả năng xác định hỗn hợp các kim loại chứa trong các mẫu kỹ thuật với hàm lượng khoảng 0,001% với độ chính xác trung bình đến 1%

1.1.1 Cơ sở của phương pháp cực phổ: [1], [2]

Nếu đặt một hiệu thế vào hai cực nhúng vào dung dịch chất điện li và tăng dần

thế hiệu đó, thì ban đầu dòng điện chạy qua dung dịch hầu như không đổi Khi hiệu thế tăng đến một giá trị đủ để phân hủy chất điện li thì cường độ dòng sẽ tăng lên một cách đột ngột Giá trị thế hiệu đó gọi là thế phân hủy

Nếu dùng một trong hai cực có bề mặt nhỏ (thường dùng cathode giọt thủy ngân) còn cực kia có bề mặt lớn, thì khi cho dòng một chiều qua dung dịch, ở cực có bề mặt nhỏ xảy ra sự biến thiên nồng độ (do chất điện li bị phân hủy); vì bề mặt điện cực quá nhỏ nên mật độ dòng trên điện cực lớn

Cùng với sự tăng thế hiệu giữa hai cực, cường độ dòng chảy qua dung dịch và mật độ dòng trên cực nhỏ tăng lên, thì ion bị khử ở vùng sát với bề mặt cực nhỏ tăng lên nên làm giảm nồng độ của ion bị khử ở đó xuống Tiếp tục tăng thế hiệu giữa hai cực lên thì sự tăng mật độ dòng trên điện cực nhỏ dẫn tới kết quả là đến một lúc tất cả các ion được chuyển đến catot đều bị phóng điện Sự bổ sung các ion từ dung dịch cho lớp xác điện cực xảy ra chậm hơn quá trình phóng điện trên bề mặt điện cực Khi đó

sự tăng tiếp hiệu điện thế giữa hai cực sẽ không gây ra được sự tăng đáng kể cường độ dòng điện qua dung dịch

Cường độ dòng (dòng khuếch tán giới hạn-tương ứng với chiều cao của cực phổ) tỷ

lệ thuận với nồng độ chất cần phân tích nên dùng cho mục đích định lượng Giá trị thế ứng với điểm uốn gọi là thế bán sóng E1/2 đặc trưng cho từng chất trong từng loại nền, được dùng cho mục đích định tính

Ưu nhược điểm:

Ưu điểm:

- Thời gian phân tích nhanh, chi phí phân tích thấp, giới hạn phát hiện 10-3- 10-5 M

- Có khả năng tiến hành xác định đồng thời một số nguyên tố mà không cần phải tách riêng chúng ra

• Có thể xác định nhiều đại lượng hóa lý như hệ số khuếch tán, số vận chuyển, linh độ ion…

• Độ phân giải thấp

- Phương pháp cực phổ xung vi phân

Nguyên tắc:

Phương pháp cực phổ xung vi phân nằm trong hệ thống các phương pháp cực phổ xung Đây là phương pháp phân cực điện cực làm việc bằng những xung điện áp gián đoạn có biên độ và bề rông xác định Trong phương pháp cực phổ xung vi phân, điện cực làm việc được phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính theo thời gian với tốc độ chậm (lúc mới phát minh là 1-2 mV/s), nhưng vào cuối mỗi chu kỳ giọt (khi giọt Hg lớn cực đại), trên khung điện áp biến đổi một chiều người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ thay đổi trong khoảng 10-100 mV và độ dài xung từ 40-100 ms Cường độ dòng cực phổ sẽ được ghi 2 lần: Lần 1 tại thời điểm τ1 (vị trí S1), thường là 17 ms trước khi nạp xung, tại lúc này có thể xem là dòng Faraday và dòng tụ điện như là trong phương pháp cực phổ cổ điển Ngay sau khi đo dòng, một xung điện thế được nạp vào điện cực,

sự thay đổi về thế đồng thời gây ra sư thay đổi về dòng Dòng tụ điện sẽ giảm theo quy luật hàm mũ của thời gian với tỉ lệ được quy định bởi giá trị điện dung C của lớp kép và tổng điện trở R của mạch điện phân

Kết quả của kỹ thuật xung vi phân bao gồm cường độ dòng iP để định lượng

)1).(

.(

)1.(

2 / 1

2 / 1

σπ

σ+

−

=

m t

C D A F n

I p

Trong đó: e R T

E F n

2

−

=

σ

Thế bán sóng Ep có thể sử dụng để định tính: Ep= E1/2 – (∆E)/2

Ep gần như trùng với thế bán sóng E1/2 nên ta dùng E1/2 để phân tích định tính

Ưu và nhược điểm

Ưu điểm

• Ứng dụng rộng rãi trong phân tích các chất vô cơ và hữu cơ

• Phương pháp DDP có độ nhạy và độ phân giải khá cao:

Estep biến thiên theo thời gian có dạng hình bậc thang và được cộng thêm một xung điện

áp xoay chiều dạng hình vuông Esw Chiều dài mỗi bước bậc thang có điện áp và chu kỳ của xung phải đồng nhất (khoảng 5 ms), bước thế của thang điện áp Estep thường có giá trị 10mV, cường độ xung Esw thường là 10-60mV Các điều kiện này tương ứng với tần số xung là 200 Hz, tốc độ quét thế là 200 mV/s Với các phản ứng thuận nghịch, kích thước của một xung đủ lớn để quá trình oxy hóa các sản phẩm hình thành trong xung ban đầu sẽ diễn ra trong suốt quá trình xung ngược Do đó xung ban đầu sinh ra dòng i1 sau đó sẽ sinh ra dòng i2 Tương ứng như vậy sẽ ghi dòng Faraday 2 lần: lần thứ nhất là cuối ban đầu và lần thứ 2 là cuối xung ngược, tại thời điểm này diện tích bề mặt giọt Hg không đổi

để dòng tụ điện gần như triệt tiêu Sự khác biệt giữa 2 dòng Δi=[i(t2)-i(t1)] được vẽ đồ thị

theo bước thế, ta thu được cực phổ ở dạng sóng, trong đó chiều cao của sóng phổ và diện tích sóng phổ tương ứng với thế bán sóng trong cực phổ DC

Ưu điểm:

Ưu điểm nổi trội của phương pháp này là tốc độ quét cực nhanh Tần số khoảng 1- 100 vòng/s dùng cho tốc độ quét sóng nhanh Giới hạn phát hiện của phương pháp cực phổ sóng vuông trong khoảng 10-7 -10-8 M

- Phương pháp Volt-Ampe hòa tan

Kỹ thuật phân tích stripping nhanh là phương pháp điện hóa có độ nhạy cao, dùng để phân tích các chất có hàm lượng siêu vết, đặc biệt ứng dụng rất nhiều trong phân tích kim loại Kỹ thuật stripping còn được gọi là phương pháp Volt-Ampe hòa tan Nguyên tắc chung của kỹ thuật stripping gồm 2 bước: đầu tiên là làm giàu bằng cách tích tụ (Accumulation) lượng rất nhỏ chất cần phân tích lên điện cực thủy ngân, sau đó hòa tan (stripping) chất đó ra Chính việc tích tụ và hòa tan trở lại như trên đã giúp cho cường độ dòng điện phân tăng lên đáng kể Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là độ nhạy phân tích cao Giới hạn phát hiện của kỹ thuật phân tích stripping có thể lên đến khoảng 10-10đến 10-11M Có hai kỹ thuật stripping cơ bản: stripping cathode và stripping anode

Stripping anode

Stripping anode là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất trong phương pháp Ampe hòa tan Trong kỹ thuật này, bằng cách điều chỉnh một hiệu điện thế nhỏ thích hợp, chất cần phân tích sẽ được tích tụ trên bề mặt điện cực thủy ngân Các chất cần phân tích đến điện cực bằng sự khuếch tán và sự đối lưu (khuấy dung dịch mẫu đo) Tại bề mặt điện cực, chất cần phân tích sẽ oxi hóa tạo hỗn hống với thủy ngân, quá trình này gọi là quá trình tích góp

Mn+ + ne- + Hg = M(Hg)

Thời gian tích tụ thông thường khoảng 30s cho nồng độ 10-7 M, và 20 phút cho nồng độ

10-10 M Sau đó, ta quét thế về phía anode, hỗn hống thủy ngân và chất cần phân tích sẽ khử tạo ra dạng ion hòa tan lại vào trong dung dịch Quá trình này gọi là quá trình hòa tan

M(Hg) = Mn+ + ne- + Hg

Cường độ dòng sinh ra sẽ tăng lên sau 2 quá trình, từ đó ta có thể ghi nhận dễ dàng

Ứng dụng chủ yếu của phương pháp stripping anode là phân tích các kim loại ở hàm lượng thấp như Ag, Au, Bi, Cd, Cu, Ga,Ge, In, Pb, Sb, Ti, Zn,…

Stripping cathode

Kỹ thuật stripping cathode ít được sử dụng hơn kỹ thuật stripping anode Ngược lại với kỹ thuật stripping anode, chất phân tích sẽ tích tụ trên cực anode và sau đó quét thế ngược lại

An- + Hg = HgA + ne-

Phương pháp này có thể đạt được độ nhạy cao Phương pháp này thường dùng để phân tích các chất như Arsen, Cl-, Br-, I-, SO42-, thiocyanate và các hợp chất thio khác

1.1.3 Ứng dụng của phương pháp cực phổ: [1], [2], [3], [4]

- Phân tích các chất vô cơ

Phương pháp này tỏ ra có thế mạnh trong phân tích các kim loại nặng và một số anion Ta

có thể dùng kỹ thuật này để phân tích nhiều kim loại nặng thay cho quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS hay quang phổ phát xạ nguyên tử AES Phân tích các kim loại kiềm và kiềm thổ dùng kỹ thuật này không thích hợp.Kỹ thuật phân tích điện hóa hiện đại có một

ưu điểm mà 2 kỹ thuật AAS và AES không làm được là có thể phân biệt được các dạng hóa trị khác nhau của các ion kim loại hay phân biệt dạng tự do và dạng phức của chúng Điều này rất có ý nghĩa trong nhiều trường hợp ví dụ Asen trong nước ngầm tồn tại chủ yếu dưới 2 dạng As hóa trị 3 và As hóa trị 5 As hóa trị 3 độc hơn dạng hóa trị 5 vài chục lần nên chúng ta cần định lượng As hóa trị 3 Để phân biệt 2 dạng này người ta thường phải ghép kỹ thuật HPLC với ICPMS rất đắt tiền Việc định lượng As hóa trị 3 bằng kỹ thuật điện hóa rất đơn giản Nhiều kim loại nặng định lượng dưới dạng phức tốt hơn dưới dạng tự do Ngày nay để phân tích siêu vết các kim loại người ta thường dùng kỹ thuật stripping trên cực thủy ngân hay cực rắn chế tạo từ thủy tinh cacbon hay vàng

- Phân tích các chất hữu cơ

Để phân tích được một chất hữu cơ, trong chất hữu cơ cần phải có những nhóm chức có thể tham gia phản ứng điện hóa trên điện cực làm việc Với những chất không cho phản ứng điện hóa người ta tiến hành phân tích gián tiếp: dùng một phản ứng hóa học chuyển chất cần phân tích thành một chất có hoạt tính điện hóa để tiến hành phân tích Ví dụ để định lượng đạm tổng trong thực phẩm thay cho kỹ thuật Kjeldalh tốn kém, độc hại, người

ta vô cơ một lượng mẫu rất nhỏ trong các ống nghiệm, dùng dung dịch đệm chứa formaldehyt chuyển (NH4)2SO4 thành một chất có nhóm (–N=C) Hợp chất mới này cho một sóng rất rõ để định lượng Rất nhiều chất hữu cơ có thể chuyển sang dạng phức với các ion kim loại nặng để tiến hành phân tích Ví dụ các nhà khoa học hình sự Nhật tiến hành phân tích chất gây nghiện Amphetamin trong máu bằng cách đo dưới dạng phức với ion đồng hai Cách làm này thuận lợi hơn kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ với kết quả thu được như nhau Khi phân tích các chất hữu cơ, cực giọt thủy ngân vẫn là loại cực làm việc được ưu tiên lựa chọn vì nó có một ưu điểm mà không một cực nào có thể thay thế được: bề mặt điện cực luôn đổi mới sau mỗi lần ghi Điều đó đảm bảo độ lặp lại cao Cực thủy ngân chủ yếu làm việc ở vùng thế khử của các chất nên thuận tiện cho việc phân tích các chất mang những nhóm chức có khả năng tham gia các phản ứng điện hóa

1.1.4 Nguyên lý hoạt động của phương pháp cực phổ quét nhanh trên cực giọt chậm: [3], [4]

Hình 1.1 Hệ thống thiết bị ANALYZER SQF-505

ANALYZER SQF-505 là thiết bị phân tích điện hóa hiện đại hoạt động theo nguyên lý sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm, cực tĩnh, cực rắn Nguyên lý hoạt động có thể tóm tắt: Ta nhúng vào dung dịch nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực:

• Cực làm việc-Working Electrode: là một cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy

ổn định khoảng 7giây 1 giọt (với kỹ thuật stripping ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy trên 10 giây 1 giọt)

• Cực so sánh-Reference Electrode: cực Ag/AgCl/KCl bão hòa có thế không đổi

• Cực hỗ trợ-Auxiliary Electrode: cực Platin

Ta đặt lên cực làm việc hai thành phần thế: thế một chiều tăng dần theo thời gian dạng bậc thang với các bước thế 2, 4, 6, 8, 10 mV Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độ xung: 10, 20, 30, 40 mV và tần số vài trăm Hz Để triệt tiêu dòng tụ điện gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoay chiều ở đầu xung và cuối xung Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sự biến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều Đường thu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh Phổ thường chứa nhiều đỉnh Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hóa của một chất Thế bán sóng (E1/2) với một dung dịch nền nào đó là một giá trị đặc trưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh (công suất tạo sóng) tỷ

lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trên cực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng

- Erythromycin là kháng sinh nhóm macrolid, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu là kìm khuẩn đối với vi khuẩn Gram dương, Gram âm và các vi khuẩn khác bao gồm Mycoplasma, Spirochetes, Chlamydia và Rickettsia

Tính chất hóa lý:

- Có màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi hoặc có mùi đặc trưng

- Độ tan: tan tốt trong dung môi phân cực như alcohol, aceton, cloroform, ethyl axetat, acetonitril

- pH tối ưu: 7.8 -8 , phân hủy ở pH =10 và 5.5

ít bị ảnh hưởng bởi thức ăn trong dạ dày

- Phân bố: dịch nội bào, khuếch tán vào khắp các mô nhất là phổi, xương, gan, nhau thai

- Bài thải: chủ yếu qua mật, tuyến sữa, nước bọt dạng còn hoạt tính

- Erythromycin và các macrolid khác gắn thuận nghịch với tiểu đơn vị 50S của ribosom vi khuẩn nhạy cảm và ức chế tổng hợp protein Tác dụng chính của Erythromycin là kìm khuẩn nhưng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao đối với các chủng rất nhạy cảm Tác dụng của thuốc tăng lên ở pH kiềm nhẹ (khoảng 8.5), đặc biệt với các vi khuẩn Gram âm

Tương kỵ:

Ðộ bền của các dẫn xuất Erythromycin phụ thuộc pH Sự phân hủy xảy ra rất nhanh ở

pH lớn hơn 10 hoặc thấp hơn 5.5 Tương kỵ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ các dung dịch và các dung dịch để pha loãng Tuy vậy đã có những thông báo về tương kỵ giữa các dạng pha tiêm của Erythromycin (như gluceptat hoặc lactobionat) với

amikacin, aminophylin, barbiturat, một số cephalosporin như cephazolin, cephalothin, cloramphenicol, colistin sulfomethat natri, heparin natri, metaraminol, metoclopramid, phenytoin, streptomycin, tetracyclin và một số vitamin

1.2.2 Một số phương pháp có thể phân tích Erythromycin:

¾ Phương pháp điện hóa [5], [10], [14]

Để phân tích Erythromycin theo phương pháp điện hóa có thể sử dụng các kĩ thuật von-ampe stripping quét tuyến tính (linear sweep stripping voltammetry), kĩ thuật cực phổ xung vi phân, hoặc có thể dùng phương pháp chuẩn độ điện hóa

Với kĩ thuật von-ampe stripping thì điều kiện để phân tích Erythromycin là: điện cực làm việc là điện cực Hg treo (HMDE), điện cực so sánh là Ag/AgCl, còn điện cực hỗ trợ là dây Pt với thế tích góp là -1000mV, thời gian tích góp là 20s, tốc độ quét là 445 mV/s, dung dịch nền là dung dịch đệm NH3NH4Cl (pH = 9.0) Kĩ thuật này cho giá trị LOD là 5.0 x 10-9 µg/ml

Với kĩ thuật xung vi phân thì điều kiện phân tích Erythromycin được xác định là

pH = 8.- 9; vùng quét sóng từ +0.2V - +1.3V, thế bán sóng Ep = 0.86 V, phương pháp này cho phép xác định Erythromycin tại nồng độ từ 2.5×10-8 đến 3.5×10-7M, với RSD < 4.5%

¾ Phương pháp ELISA [8]

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:

(1) Kháng nguyên - antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;

(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó Kháng thể này được gắn kết với enzyme;

(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được

Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa KN-KT Sự hiện diện của phức hợp KN-KT sẽ quyết định cường độ sáng phát ra

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng

KN trong mẫu nghiên cứu

Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc hiệu cho KN chưa biết Thông thường KN được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate)

- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa;

- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra KT đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp KT-KN có thể sảy ra Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra Trong trường hợp

sử dụng KT thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp này

Giữa các bước của ELISA, các protein và các KT không đặc hiệu, KT không gắn với KN

sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa" Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn KT liên kết với KN được giữ lại Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với KT trong phức hợp KT-KN Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ xảy ra Giới hạn phát hiện của phương pháp ELISA khi phân tích Erythromycin :

- Cột sắc kí với pha tĩnh không phân cực C8 hoặc C18

- Pha động có tính phân cực cao như: hỗn hợp acid orthophosphoric (pH = 3) và acetonitril (0.05 M), đệm phosphat (65:35) chỉnh pH = 7.0

- Đầu dò UV ở bước sóng 215 nm hay đầu dò MS Đầu dò UV có độ nhạy kém hơn đầu dò MS, (đầu dò UV có LoD khoảng 50 ng/ml, còn đầu dò MS nhỏ hơn 1ng/ml)

Kỹ thuật LC/MS/MS có các mũi m/z đặc trưng cho Erythromycin là 332, 288 Còn LC/MS3 thì cho các mũi m/z là 200

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Mẫu nguyên liệu được mua tại siêu thị Coopmart chợ AN ĐÔNG, được xác định không

có dư lượng Erythromycin theo chứng thư MM101112137, MM10112136

- Erythromycin chuẩn được cung cấp bởi Công ty dược Hậu Giang Độ tinh khuyết > 98%

- Các dung môi: Ethanol, Aceton, Ethyl Acetate, Acetonitril (Merck)

- CH3COONH4; CH3COONa; NaOH; NH4OH, HCL, CH3COOH….của Trung Quốc

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4 Nghiên cứu định lượng Erythromycin

- Khảo sát các loại dung dịch nền khác nhau (thường là các dung dịch đệm như Amoni acetate, Natri acetate, Phosphat, Borat…) để tìm ra loại dung dịch nền có pH và nồng độ tối ưu nhất

- Khảo sát các loại dung môi hòa tan Erythromycin (như Methanol, ethyl acetate, acetonitril) để tìm ra loại dung môi tối ưu nhất

- Khảo sát các thông số chạy máy tối ưu

- Dựng đường chuẩn trên dung dịch nền để bước đầu đưa ra giới hạn phát hiện của phương pháp

- Xây dựng quy trình trích ly Erythromycin trên mẫu tôm càng xanh, cá rô phi

- Dựng đường chuẩn trên dịch chiết thật của mẫu tôm càng xanh, cá rô phi Từ đây xác định hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện LoD của phương pháp

- Phân tích trên mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có đối chứng với phương pháp LC/MS-MS

2.5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Khảo sát lựa chọn dung dịch nền

Khảo sát lựa chọn pH, nồng độ dung dịch nền

Khảo sát lựa chọn dung môi hòa tan ERY

Khảo sát lựa chọn thông số chạy máy

Dựng đường chuẩn ERY trên dung dịch nền

Xây dựng quy trình chiết mẫu

Tính hiệu suất, dựng đường chuẩn

Xác định dư lượng ERY trên mẫu thật đối chứng LC/MS

2.6 Khảo sát tối ưu các điều kiện cho việc xác định Erythromycin trên máy Analyzer SQF-505

- Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền

Tạo dung dịch mẫu đo:

Cho 25 mL dung dịch đệm đang khảo sát vào cốc đo Dùng miropippette hút

chính xác 100µL dung dịch chuẩn Erythromycin gốc 1000ppm cho vào cốc đo Như vậy, nồng độ dung dịch Erythromycin có trong cốc đo là 4 ppm

- Khảo sát nồng độ dung dịch nền

Sau khi chọn được dung dịch nền cho tín hiệu tốt nhất, tiếp tục khảo sát dung dịch nền đó với các nồng độ khác nhau để chọn ra nồng độ cho tín hiệu tốt nhất

Tạo dung dịch mẫu đo:

Cho 25 mL dung dịch đệm đang khảo sát vào cốc đo Dùng miropippette hút chính xác 100µL dung dịch chuẩn Erythromycin gốc 1000ppm cho vào cốc đo Như vậy, nồng độ dung dịch Erythromycin có trong cốc đo là 4 ppm

- Khảo sát dung môi hòa tan Erythromycin

Khảo sát các dung môi dùng hòa tan Erythromycin: Methanol, Acetonitril, Ethyl acetate Tạo dung dịch mẫu đo:

Cho 25 mL dung dịch đệm Amoni Acetate 0.1M, pH 9.5 đang khảo sát vào cốc đo Dùng miropippette hút chính xác 100µL dung dịch chuẩn Erythromycin gốc 1000ppm cho vào cốc đo Như vậy, nồng độ dung dịch Erythromycin có trong cốc đo là 4ppm

- Khảo sát các thông số chạy:

Chọn dung dịch nền với nồng độ tối ưu ở trên để chạy khảo sát các thông số của máy

Dung dịch nền: Amoni Acetate 0.05M, pH 8.0

Tạo dung dịch mẫu đo: Cho 25 mL dung dịch đệm Amoni Acetate 0.05M,

pH 8.0 đang khảo sát vào cốc đo Dùng miropippette hút chính xác 100μL dung dịch chuẩn ERY gốc 1000ppm (pha bằng Ethyl acetate) cho vào cốc đo Như vậy, nồng

độ dung dịch ERY có trong cốc đo là 4ppm

- Xây dựng đường chuẩn Erythromycin trên dung dịch nền

Tạo dung dịch mẫu đo: Cho 25 mL dung dịch đệm tối ưu đã khảo sát vào cốc đo Dùng miropippette hút chính xác 5µL, 10µL 15µL, 20µL, 25µL, 30µL, 35µL , 40 µL , 45 µL dung dịch chuẩn Erythromycin gốc 1000ppm cho vào cốc đo Như vậy, nồng độ dung dịch Erythromycin có trong cốc đo để ghi nhận lần lượt là 100ppb, 200ppb, 300ppb, 400ppb, 500ppb, 600ppb, 700ppb, 800ppb, 900 ppb

2.7 Xây dựng quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu

- Quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu tôm, cá

Cân 1g mẫu + 10 mL ethyl acetat

Hình 2.2 Quy trình phân tích Erythromycin trên mẫu nguyên liệu tôm, cá

- Thuyết minh quy trình:

- Dung dịch gốc chuẩn Erythromycin 500ppm: cân chính xác 0.025g Erythromycin chuẩn pha trong bình định mức 50mL, định mức bằng Ethyl acetate

- Mẫu giả định: cân 5 g nguyên liêu (đã nghiền mịn ) đã được xác định không có

Nghiền nhỏ Trộn đều

Ly tâm 3000 g / 10 phút

Hút 5 ml phần dịch trong phía trên

Để bay hơi dung môi

Hòa tan phần cặn với 3 ml n-Hexan

Thêm 5 mL dung dịch đệm

Erythromycin cho vào ống nhựa ly tâm 50mL Thêm chuẩn Erythromycin 500ppm vào, trộn đều Thêm 10 mL dung môi Đậy nắp ống nhựa ly tâm rồi lắc đều, sau đó đem ly tâm

3000 g / 10 phút Dùng pipet hút 5mL dung dịch trong phía trên cho vào ống nhựa ly tâm 15mL Để mẫu bay hơi dung môi Hòa tan phần cặn sau khi sấy khô bằng 3mL n-Hexan Thêm tiếp 1mL dung dịch đệm dung dịch đệm Lắc đều rồi ly tâm 3000 g / 10 phút Dùng pipet Pasteur hút phần dịch trong phía dưới rồi đem đo bằng máy Analyzer SQF-505

- Mẫu trắng: mẫu thức ăn đã được xác định không có Erythromycin trong đó Tiến hành trích ly theo quy trình trên

Quy trình chiết được đánh giá bằng hiệu suất chiết:

It: cường độ dòng của mẫu thêm chuẩn (nA)

Ic: cường độ dòng của Erythromycin chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng (nA)

Tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu chuẩn ở nồng độ 100ppb, 200 ppmb, 300 ppb, 400 ppb, 500 ppb, 600 ppb, 700 ppb

Đo cường độ dòng của mẫu giả định và so sánh với cường độ dòng của Erythromycin chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng để tính hiệu suất chiết Mỗi nồng độ tiến hành đo 5 lần và lấy trung bình

- Xây dựng đường cong chuẩn trên mẫu trắng:

Đo Erythromycin chuẩn, thêm vào dịch chiết mẫu trắng ở nồng độ 100ppb, 200 ppb, 300 ppb, 400 ppb, 500 ppb, 600 ppb, 700 ppb

Máy Analyzer sẽ tự xây dựng và thiết lập đường chuẩn để đưa ra phương trình đường chuẩn, giới hạn phát hiện LoD và hệ số hồi quy tuyến tính Radjust

- Tiến hành phân tích trên mẫu thật

Dùng micropipette hút 200µL Erythromycin 500 ppm cho vào bình định mức 25mL rồi định mức bằng dung môi thích hợp đến vạch Lúc này ta được 25mL Erythromycin 4 ppm Dùng 25mL Erythromycin 4 ppm này trộn đều với 500g nguyên liệu đã xay nhuyễn Lúc này hàm lượng Erythromycin trong 1g mẫu thức ăn là 0.2ppm

Thực hiện quy trình chiết tương tự như mẫu giả định Phần dịch sau chiết được đem đo bằng máy Analyzer SQF-505 ở chế độ PSA-F Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp

thêm chuẩn để tìm ra nồng độ thật của mẫu cần xác định

III XỬ LÝ & ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Xử lý các kết quả thực nghiệm theo phương pháp thống kê

- Giá trị nồng độ trung bình cộng

- Giá trị tín hiệu trung bình cộng

n

- Độ lệch chuẩn đối với 1 trị đo được

- Độ lệch chuẩn đối với giá trị trung bình

- Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (biên giới tin cậy hoặc độ tín nhiệm giới hạn)

- Độ biến động của phép đo

Kết quả chấp nhận được khi: RSD≤5%, nhưng với phân tích nồng độ vết (nồng độ <ppm) có thể chấp nhận RSD≤10%

- Hệ số tương quan

- Hệ số tương quan bình

R=r2

- Hệ số tương quan bình hiệu chỉnh

- Phương sai dư

- Giới hạn phát hiện LoD (Limit of detection)

b: hệ số trong phương trình hồi quy y = a.x + b

m: số lần lặp lại khi đo tín hiệu phân tích của mỗi mẫu phân tích

t0.95,f: hệ số student, với f = n-π: số các hệ số hồi quy có mặt trong phương

trình hồi quy tuyến tính → π = 2

Hệ số student được tra trong bảng sau:

Bảng 2.1: Bảng tra hệ số student

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Điều kiện tối ưu cho việc xác định Erythromycin trên máy Analyzer SQF-505 3.1.1 Kết quả khảo sát lựa chọn dung dịch nền:

Chất nền đóng vai trò quyết định trong khả năng xác định một chất hữu cơ bằng phương pháp cực phổ Khi xác định cùng một chất, sử dụng dung dịch nền khác nhau sẽ cho cường độ dòng và thế bán sóng khác nhau Dung dịch nền thích hợp giúp loại bỏ thành phần điện di, khi đó dòng điện chỉ là dòngkhuếch tán giới hạn Ngoài ra, dung dịch nền thích hợp còn giúp làm tăng độ nhạy và tính chọn lọc của phương pháp

3.1.1.1 Lựa chọn dung dịch nền với pH tối ưu:

Thành phần của dung dịch nền đóng vai trò quyết định sự thành công của phương pháp cực phổ khi phân tích một chất hữu cơ Những yếu tố quan trọng nhất trong thành phần của dung dịch nền giúp đảm bảo khả năng cho sóng phổ cao và rõ cũng như đảm bảo khả năng phân tách sóng phổ của những chất liên quan bao gồm:

pH tối ưu là 8.0 ( E1/2 = -1426mV, I = 351 nA)

Bảng 3.1: Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Amoni acetate

¾ Nền Natri acetate 0.1 M ở các pH 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0

pH tối ưu là 8.0 ( E1/2 = -1456mV, I = 320 nA)

Bảng 3.2: Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Natri acetate

pH tối ưu là 9.0 ( E1/2 = -1414 mV, I = 259 nA)

Bảng 3.3: Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Borate

pH tối ưu là 7.0 ( E1/2 = -1380 mV, I = 184 nA)

Bảng 3.4: Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Tris

¾ Nền Citrat- Phosphat 0.1 M ở các pH 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0

pH tối ưu là 9.0 ( E1/2 = -1426 mV, I = 226 nA)

Bảng 3.5: Phổ sóng vuông Erythromycin trong dung dịch nền Citrat – Phosphat

Dựa vào kết quả khảo sát, (xem hình sóng phổ tự ghi ở Phụ lục), ta nhận thấy dung dịch nền Amoni acetate, pH= 8.0 cho cường độ dòng cao nhất và ổn định nhất Chúng tôi chọn dung dịch Amoni acetate, pH = 8.0 cho những khảo sát tiếp theo

3.1.1.2 Lựa chọn nồng độ dung dịch nền tối ưu:

Chất phân tích đến được bề mặt của điện cực thủy ngân là do tác động của hai lực độc lập:

¾ Lực khuếch tán: Tỷ lệ thuận với chênh lệch nồng độ của chất phân tích ở bề mặt điện cực và throng lòng dung dịch

¾ Lực điện: Tỷ lệ chênh lệch điện thế ở điện cực

Khi có quá nhiều chất nền trong dung dịch, tác động của lực diện trên chất diện ly sẽ không còn do những ion của chất nền sẽ chịu trách nhiệm chính tạo thành dòng điện Khi

đó khu vực chênh lệch điện thế sẽ ngắn lại hay bị thu hẹp đến khu vực rất gần với bề mặt điện cực, không còn tác dụng thu hút những chất phân tích nữa Trong trường hợp này