Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp nano bạc bằng chủng nấm fusarium oxysporum

Do những tính chất ưu việt trên, nano bạc ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y dược, nông nghiệp, công nghiệp đồ gia dụng… Về các phương pháp sinh tổng h

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐINH HÙNG THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP NANO BẠC

BẰNG CHỦNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TP HỒ CHÍ MINH - 01/2012

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

-

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG -

Cán bộ chấm nhận xét 1: -

-

Cán bộ chấm nhận xét 2: -

-

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …

tháng… năm …

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: ĐINH HÙNG THANH PHƯƠNG Giới tính: Nữ

Khóa (năm trúng tuyển) : 2010

1 TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP NANO

BẠC BẰNG CHỦNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM”

2 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Khảo sát các đặc điểm sinh học của chủng nấm Fusarum oxysporum

Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận nano bạc từ chủng nấm Fusarum

oxysporum

Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận sinh khối của chủng nấm Fusarum

oxysporum

Khảo sát phương pháp sinh tổng hợp nano bạc từ chủng Fusarum oxysporum

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc

Thăm dò ứng dụng khẩu trang nano bạc

3 NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 6/2011

4 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 12/2011

5 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung và để cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÍ CHUYÊN NGÀNH

PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, em xin cám ơn chân thành đến cô PGS TS Nguyễn Thúy Hương,

đã tận tình giúp đỡ, động viên, khuyến khích, tạo điều kiện cho em học tập tốt Người đã dẫn dắt, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong hai năm học qua Đó chính là nền tảng giúp em vượt qua những khó khăn để hoàn thành luận văn của mình

Em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất trong thời gian em thực hiện luận văn này

Con xin cám ơn ba, mẹ đã hết lòng yêu thương, chăm sóc và cổ vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua những khó khăn nhất trong công việc cũng như trong cuộc sống

Tôi xin cám ơn các bạn học cùng lớp cao học CNSH K10, những người bạn đã cùng tôi học tập, cùng trao đổi, động viên và sẵn sàng giúp đỡ tôi khi cần thiết

Tp.HCM, ngày 04 tháng 01 năm 2012

ĐINH HÙNG THANH PHƯƠNG

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về hạt nano kim loại 3

1.2 Tính chất hạt nano kim loại 4

1.3 Kỹ thuật chế tạo hạt nano kim loại 6

1.4 Hạt nano bạc 7

1.4.1 Sơ lược về nano bạc và tính kháng khuẩn 7

1.4.2 Phương pháp tạo nano bạc phổ biến 9

1.4.2.1 Phương pháp khử hóa học 9

1.4.2.2 Phương pháp vật lý 10

1.4.2.3 Phương pháp sử dụng lò vi sóng 12

1.4.2.4 Phương pháp sinh học 13

1.5 Các ứng dụng của nano bạc 14

1.6 Sơ lược về Fusarium oxysporum 19

1.6.1 Đặc điểm sinh thái 19

1.6.2 Sinh tổng hợp nano bạc bởi Fusarium oxysporum 20

1.7 Các phương pháp cố định vi sinh vật 21

1.7.1 Các loại chất mang dùng cố định vi sinh vật 21

1.7.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật 26

1.7.3 Phương pháp cố định Fusarium oxysporum lên BC 33

1.7.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp hấp phụ 33

1.7.3.2 Phương pháp tiến hành 33

1.7.3.3 Ưu nhược điểm của phương pháp 34

1.7.3.4 Cố định vi khuẩn Fusarium oxysporum bằng BC 35

1.8 Hệ thống lên men 35

1.8.1 Các khái niệm chung 35

1.8.2 Phân loại fermenter 36

1.8.3 Các bước tiến hành thiết kế bioreactor liên tục 37

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1 Vật liệu nghiên cứu 38

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 40

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 42

2.2.2.1 Khảo sát những đặc điểm sinh học của chủng Fusarium oxysporum 42

2.2.2.2 Khảo sát sự phát triển của Fusarium oxysporum trên một số môi trường dinh dưỡng 42

2.2.2.3 Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận lượng sinh khối của chủng Fusarium oxysporum 44

2.2.2.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng 45

2.2.2.5 Khảo sát phương pháp tổng hợp nano bạc bằng cách sử dụng toàn bộ

sinh khối hay sử dụng enzym do nấm tiết ra 46

2.2.2.6 Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận lượng nano bạc từ chủng Fusarium oxysporum 46

2.2.2.7 Phương pháp thống kê số liệu 47

2.2.2.8 Cố định trên chất mang BC – alginate 47

2.2.2.9 Khảo sát quá trình tổng hợp nano bạc từ chủng Fusarium oxysporum trên hệ thống bioreactor liên tục 48

2.2.2.10 Kiểm tra khả năng ổn định của dung dịch nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp sinh học 2.2.2.11 Hướng ứng dụng khẩu trang nano bạc 51

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 53

3.1 Khảo sát những đặc điểm sinh học của chủng Fusarium oxysporum 53

3.1.1 Quan sát hình thái đại thể 53

3.1.2 Quan sát hình thái vi thể 53

3.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng 54

3.3 Khảo sát sự phát triển của Fusarium oxysporum trên một số môi trường dinh dưỡng 55

3.4 Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận lượng sinh khối của chủng Fusarium oxysporum 58

3.5 Khảo sát phương pháp tổng hợp nano bạc 62

3.6 Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận lượng nano bạc từ chủng Fusarium oxysporum 65

3.7 Khảo sát quá trình tổng hợp nano bạc trên hệ thống bioreactor liên tục bằng chế phẩm Fusarium oxysporum cố định trên chất mang BC – alginate 70

3.7.1 Cố định trên chất mang BC – alginate 70

3.7.2 Khảo sát quá trình tổng hợp nano bạc trên hệ thống bioreactor liên tục 71

3.7.2.1 Khảo sát chất lượng của dung dịch nano bạc thu từ hệ thống 74

3.7.2.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc thu được từ hệ thống 76

3.8 Kiểm tra khả năng ổn định của dung dịch nano 78

3.9 Thăm dò hướng ứng dụng khẩu trang nano bạc 79

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành dung dịch nano Ag 10

Hình 1.2 Hình TEM và sự phân bố kích thước hạt nano Ag được chế tạo bằng xung laser ở 120 fs và 8 ns 11

Hình 1.3 Lò vi sóng và dung dịch nano bạc được điều chế 12

Hình 1.4 Phổ UV-Vis của phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng và phương pháp gia nhiệt thông thường 13

Hình 1.5 Các sản phẩm điện máy ứng dụng công nghệ nano bạc 15

Hình 1.6 Băng gạc y tế có tẩm nano bạc 16

Hình 1.7 Thuốc trừ sâu MIFUM 0,6 DD 17

Hình 1.8 Bình sữa Mummybear có tráng lớp nano bạc 19

Hình 1.9 Hình thái sợi đa bào, bào tử hình liềm và bào tử hình cầu 20

Hình 1.10 Giả thuyết về cơ chế quá trình sinh tổng hợp nano bạc 21

Hình 1.11 So sánh đường kính sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và nhân tạo 24

Hình 1.12 “Lớp da BC” (BC pellicle) được hình thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh 25

Hình 1.13 Các hạt BC (BC pellets) được hình thành trong điều kiện nuôi cấy lắc 25

Hình 1.14 Tế bào vi sinh vật cố định trên bề mặt chất mang 28

Hình 1.15 Tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel 30

Hình 1.16 Tế bào vi sinh vật cố định bằng cách liên kết với nhau 32

Hình 1.17 Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane 33

Hình 1.18 Fermenter làm việc liên tục 37

Hình 2.1 Thiết bị kiểm tra vi sinh vật không khí 51

Hình 3.1 Hình thái đại thể của Fusarium oxysporum 53

Hình 3.2 Hình thái Fusarium oxysporum dưới kính hiển vi 53

Hình 3.3 Đường kính phát triển vòng lan tơ sau 5 ngày nuôi cấy Fusarium oxysporum trên các môi trường khác nhau 56

Hình 3.4 Sự chuyển màu của dung dịch AgNO3 của các mẫu 62

Hình 3.5 Hệ thống lên men liên tục 73

Hình 3.6 Kết quả chụp TEM lượng nano bạc tạo thành tự hệ thống bioreactor 75

Hình 3.7 Khẩu trang có tẩm nano bạc 80

DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng theo sinh khối của Fusarium oxysporum 55

Đồ thị 3.2 Đường kính phát triển của vòng lan tơ của Fusarium oxysporum sau 5 ngày 57

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sự phát triển của Fusarium oxysporum 59

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sự phát triển của Fusarium oxysporum

60

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của Fusarium oxysporum 61

Đồ thị 3.6 UV-Vis của dịch nano bạc thu từ sinh khối Fusarium oxysporum 63

Đồ thị 3.7 UV-Vis của dịch nano bạc thu từ dịch lọc Fusarium oxysporum 63

Đồ thị 3.8 Phổ UV-Vis của dịch sinh khối Fusarium oxysporum trong 10 tuần 78

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng thành phần môi trường để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ 44

Bảng 2.2 Bảng thành phần môi trường để khảo sát ảnh hưởng của nguồn cabon 45

Bảng 2.3 Những thông số và giới hạn trên dưới 47

Bảng 2.4: Các dung dịch nano bạc thử nghiệm kháng khuẩn với các hàm lượng bạc khác nhau 49

Bảng 3.1 Kết quả sinh khối (g) của Fusarium oxysporum trên môi trường lỏng 54

Bảng 3.2 Kết quả đường kính vòng lan tơ (cm) của Fusarium oxysporum tương ứng với thời gian nuôi cấy như nhau trên các môi trường rắn khác nhau 57

Bảng 3.3 Kết quả khối lượng sinh khối (g) Fusarium oxysporum trong thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ 58

Bảng 3.4 Kết quả khối lượng sinh khối (g) Fusarium oxysporum trong thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn cacbon 60

Bảng 3.5 Kết quả khối lượng sinh khối (g) Fusarium oxysporum trong thí nghiệm

khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ 61 Bảng 3.6 Bảng đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch nano bạc bằng

cách sử dụng toàn bộ sinh khối hay sử dụng enzym do nấm tiết ra 64 Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch cấu trúc cấu trúc có tâm với hàm mục tiêu là giá trị

OD đo được 65

Bảng 3.8 Hiệu suất cố định ở các nồng độ alginate khác nhau 71 Bảng 3.9 Hiệu suất cố định khi gói bằng alginate 3% trong Ca(NO3)2 trước rồi hấp

phụ vô BC sau 71 Bảng 3.10 Các thông số quá trình lên men liên tục 73

Bảng 3.11 Hiệu suất kháng S aureus của các dung dịch nano bạc với nồng độ khác

nhau 76

Bảng 3.12 Hiệu suất kháng E.coli của các dung dịch nano bạc với nồng độ khác

nhau 77 Bảng 3.13 Giá trị OD đo được trước và sau khi qua khẩu trang 80

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Các bước thí nghiệm của đề tài 41

LỜI MỞ ĐẦU

Trong thời đại ngày nay, vật liệu với kích cỡ nano ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong mọi mặt của đời sống con người, do những khả năng ưu việt của nó, đặc biệt là tính kháng khuẩn cao Công nghệ nano đã có những ứng dụng

to lớn và hữu ích trong các ngành điện tử, năng lượng, y dược, mỹ phẩm… và sẽ còn đi xa hơn nữa trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong sinh y học

Trong đó, nano bạc là loại được quan tâm nghiên cứu rộng rãi nhất với khả năng kháng khuẩn cao gấp 20-60 lần so với Ag+ và khả năng kháng được trên 650 loại vi khuẩn, nấm và cả virus và hầu như ít bị kháng bởi các loại vi sinh vật này Đồng thời nano bạc cũng được khẳng định là an toàn với sức khỏe người

sử dụng, hầu như không có các triệu chứng phụ nào, chúng có thể được giải phóng ra khỏi cơ thể sau một thời gian sử dụng

Do những tính chất ưu việt trên, nano bạc ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y dược, nông nghiệp, công nghiệp đồ gia dụng…

Về các phương pháp sinh tổng hợp nano bạc ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Trước đây nano bạc hầu như chỉ được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, vật lý… Tuy nhiên, hiện nay một phương pháp mới hoàn toàn thân thiện với môi trường và đạt hiệu quả cao, đó là phương pháp sinh học đang ngày càng phổ biến Phương pháp này sử dụng các chủng có khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ Ag+ bao gồm các chủng vi khuẩn (như Bacillus subtilis,

E.coli…) và nấm (Aspergilus niger, các chủng Fusarium …) Trong đó chủng

nấm Fusarium oxysporum hiện đang được nghiên cứu thử nghiệm rộng rãi nhất

do khả năng tạo được nano bạc với hiệu suất rất cao và dễ nuôi cấy, dễ tự động hóa…

Sử dụng phương pháp sinh học để tổng hợp nano bạc nhằm tránh những nhược điểm của phương pháp hóa học, vật lý Trong khuôn khổ nghiên cứu, tôi

Fusarium oxysporum” tạo nano bạc với nồng độ, hoạt tính kháng khuẩn cao và

ổn định

Nội dung nghiên cứu:

 Khảo sát các đặc tính của chủng Fusarium oxysporum

 Tối ưu các điều kiện môi trường để thu nhận sinh khối của chủng

Fusarium oxysporum (nguồn nitơ, cacbon, nhiệt độ, pH)

 Tối ưu điều kiện môi trường để thu nhận lượng nano bạc từ chủng

Fusarium oxysporum (tối ưu đồng thời các điều kiện thời gian ủ, nhiệt độ,

tỉ lệ khuấy lắc, nồng độ bạc nitrate)

 Phương pháp sinh tổng hợp nano bạc từ chủng Fusarium oxysporum

 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc

 Thăm dò ứng dụng khẩu trang nano bạc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về hạt nano kim loại

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành từ các kim loại Người ta biết rằng hạt nano kim loại như hạt nano vàng, nano bạc được sử dụng từ hàng nghìn năm nay Nổi tiếng nhất có thể là chiếc cốc Lycurgus được người La Mã chế tạo vào khoảng thế kỉ thứ tư trước Công nguyên

và hiện nay được trưng bày ở Bảo Tàng Anh Chiếc cốc đó đổi màu tùy thuộc vào cách người ta nhìn nó Nó có màu xanh lục khi nhìn ánh sáng phản xạ trên cốc và có màu đỏ khi nhìn ánh sáng đi từ trong cốc và xuyên qua thành cốc Các phép phân tích ngày nay cho thấy trong chiếc cốc đó có các hạt nano vàng và bạc có kích thước 70 nm và với tỉ phần mol là 14:1 Tuy nhiên, phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu một cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phương pháp chế tạo, tính chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự được bắt đầu Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [12]

Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng Tuy nhiên, ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sang màu da cam khi kích thước của hạt thay đổi Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng

có hiện tượng quang học thú vị như trên Ngoài tính chất trên, các hạt nano bạc còn được biết có khả năng diệt khuẩn Hàng ngàn năm trước người ta thấy sữa để trong các bình bạc thì để được lâu hơn Ngày nay người ta biết đó là do bạc đã tác động lên enzyme liên quan đến quá trình hô hấp của các sinh vật đơn bào [12]

1.2 Tính chất hạt nano kim loại

Hạt nano kim loại có hai tính chất khác biệt so với vật liệu khối đó là hiệu

ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước Tuy nhiên, do đặc điểm các hạt nano có tính kim loại, nghĩa là có mật độ điện tử tự do lớn Do vậy tính chất của vật liệu còn có những đặc trưng riêng khác với vật liệu đơn thuần chỉ có hai tính chất trên, hay các vật liệu không có mật độ điện tử tự do hoặc có nhưng thấp trong thành phần cấu trúc của vật liệu

1.2.1 Tính chất quang

Tính chất quang của các hạt nano vàng, bạc trộn trong thủy tinh làm cho các sản phẩm từ thủy tinh có các màu sắc khác nhau được người La Mã sử dụng từ hàng ngàn năm trước Các hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt (surface plasmon resonance) do điện tử tự do trong hạt nano hấp thụ ánh sáng chiếu vào Kim loại có nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dưới tác dụng của điện từ trường bên ngoài như ánh sáng Thông thường các dao động bị dập tắt nhanh chóng bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng đường tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thước Nhưng khi kích thước của kim loại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình thì hiện tượng dập tắt của các điện

tử dẫn đến từ quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ Khi dao động như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho các hạt bị phân cực điện tạo thành một lưỡng cực điện Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng các yếu tố về hình dạng, độ lớn của hạt nano và môi trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất Ngoài ra, mật độ hạt nano cũng ảnh hưởng đến tính chất quang Nếu mật độ loãng thì có thể coi như gần đúng hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải tính đến ảnh hưởng của quá trình tương tác giữa các hạt [28]

1.2.2 Tính chất điện

Tính dẫn điện của kim loại rất tốt hay điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật

độ điện tử tự do cao trong đó Đối với vật liệu khối, các lí luận về độ dẫn dựa trên cấu trúc vùng năng lượng của chất rắn Điện trở của kim loại đến từ sự tán xạ của điện tử lên các sai hỏng trong mạng tinh thể và tán xạ dao động với nhiệt của nút mạng Tập thể các điện tử chuyển động trong kim loại dưới tác dụng của điện trường (U) có liên hệ với nhau thông qua định Ohm: U = IR, trong đó R là điện trở kim loại Định luật Ohm cho thấy đường I-U là một đường tuyến tính Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện

tử, C và R là điện dung và điện trở kháng nối hạt nano với điện cực [6]

1.2.3 Tính chất từ

Các kim loại quý như vàng, bạc…có tính nghịch từ ở trạng thái khối do sự

bù trừ cặp điện tử Khi vật liệu thu nhỏ kích thước thì sự bù trừ trên sẽ không toàn diện nữa và vật liệu có từ tính tương đối mạnh Các kim loại có tính sắt từ trạng thái khối như kim loại chuyển tiếp sắt, coban, niken thì khi kích thước nhỏ sẽ phá vỡ trật

tự sắt từ làm chúng chuyển sang trạng thái siêu thuận từ Vật liệu ở trạng thái siêu thuận từ có từ tính mạnh khi có từ trường và không có từ tính khi từ trường bị ngắt

đi, tức là từ dư và lực kháng từ hoàn toàn bằng không [7]

1.2.4 Tính chất nhiệt

Nhiệt độ nóng chảy Tm của vật liệu phụ thuộc vào mức liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể Trong tinh thể, mỗi một nguyên tử có một số các nguyên tử lân cận có liên kết mạnh gọi là số phối vị Các nguyên tử trên bề mặt vật liệu sẽ có số phối trí nhỏ hơn số phối vị của nguyên tử bên trong nên chúng có thể

dễ dàng tái sắp xếp để có những trạng thái khác hơn Như vậy, nếu kích thước của

hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm

1.3 Kỹ thuật chế tạo hạt nano kim loại

Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu bằng kỹ thuật nghiền Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim,… thì phương pháp thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên Nguyên tắc là khử các ion kim loại như Ag+

, Au+ để tạo thành các nguyên tử Ag và Au Các nguyên tử liên kết với nhau tạo ra hạt nano Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này

1.3.1 Phương pháp ăn mòn laser

Đây là phương pháp từ trên xuống Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt trong một dung dịch có chứa một chất hoạt hóa bề mặt Một chùm Laser xung có bước sóng 532 nm, độ rộng xung là 10 ns, tần số 10 Hz, năng lượng mỗi xung là 90

Mj, đường kính vùng kim loại bị tác dụng từ 1-3 mm Dưới tác dụng của chùm laser xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10 nm được hình thành và được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt CnH2n+1SO4Na với n = 8, 10, 12, 14 với nồng độ từ 0,001 đến 0,1 M [6]

1.3.2 Phương pháp khử hóa học

Phương pháp khử hóa học là dùng các tác nhân hóa học để khử ion kim loại thành kim loại Thông thường các tác nhân hóa học ở dạng dung dịch lỏng nên còn gọi là phương pháp hóa ướt Đây là phương pháp từ dưới lên Dung dịch ban đầu có chứa các muối của các kim loại như HAuCl4, H2PtCl6, AgNO3 Tác nhân khử ion kim loại Ag+, Au+ thành Ag0, Au0 ở đây là các chất hóa học như Citric acid, vitamin

C, Sodium Borohydride NaBH4, Ethanol (cồn), Ethylene Glycol (phương pháp sử dụng các nhóm rượu đa chức như thế này còn có một cái tên khác là phương pháp polyol) Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám,

người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt hóa bề mặt Phương pháp tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử Phương pháp bao phủ phức tạp nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng Các hạt nano Ag,

Au, Pt, Pd, Rh với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này [43]

1.3.3 Phương pháp khử vật lí

Phương pháp khử vật lí dùng các tác nhân vật lí như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamma, tia tử ngoại, tia laser khử ion kim loại thành kim loại Dưới tác dụng của các tác nhân vật lí, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi

và các phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại Ví dụ, người ta dùng chùm laser xung có bước sóng 500 nm, độ dài xung

6 ns, tần số 10 Hz, công suất 12-14 MJ chiếu vào dung dịch có chứa AgNO3 như là nguồn ion kim loại và Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) như là chất hoạt hóa bề mặt

để thu được hạt nano bạc [19]

1.4 Hạt nano bạc

1.4.1 Sơ lược về nano bạc và tính kháng khuẩn

Bạc được biết đến như một trong những chất sát trùng tự nhiên có tính kháng khuẩn cao và ít độc nhất, không ảnh hưởng đến sức khoẻ của con người Đặc biệt là hạt bạc có kích thước nanomet (1-100 nm) có khả năng kháng khuẩn vượt trội Một

số công bố cho rằng nano bạc có khả năng kháng trên 650 loại vi khuẩn và virus khác nhau trong đó có cả virus HIV [21]

Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer để các hạt nano bạc không bị kết tụ Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với bạc bình thường Đó là một kháng sinh tự nhiên rất mạnh, có khả năng phòng ngừa mọi sự truyền nhiễm Nó đóng vai trò là một chất xúc tác, có

thể vô hiệu hóa tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi oxygen của vi khuẩn, virút và nấm [48]

Các công trình nghiên cứu đã giải thích tính kháng khuẩn của nano bạc do các hạt nano bạc có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, cản trở sự chuyển hóa chất trong tế bào Điều này còn được chứng minh qua tác động của nano bạc đối với

vi khuẩn Gram âm và Gram dương Các vi khuẩn Gram dương có kích thước màng

tế bào dày hơn so với các vi khuẩn Gram âm nên tác động của nano bạc trên các vi khuẩn Gram dương kém hơn so với các vi khuẩn Gram âm [39]

Trường ĐH California (Los Angeles) đã thử nghiệm bạc keo và kết luận:

“Dung dịch bạc là chất sát trùng đối với Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

aureus, Neisseria gonorrhea, Gardnerella Vaginalis, Salmonella Typhi… và những

tác nhân gây bệnh khác, là chất trừ nấm đối với Candida albicans, Candida

globata, và M furfur, có thể giết tất cả các virus trong phòng thí nghiệm” BS Gary

Smith (Trường ĐH John Hopkins): “Khi có mặt bạc, các tế bào ung thư không phân chia được và cơ thể được phục hồi” [53]

Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khoẻ con người, các nhà khoa học cho rằng nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con nguời có được là do các vi khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng

có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khoẻ Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc Các nghiên cứu tại Odense Universitets Hospital (ở Đan Mạch) cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc chỉ trượt lên nhau ở trong cơ thể và không hề gây ra một tác dụng phụ nào cũng như gây độc cho cơ thể Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra khỏi cơ thể theo thời gian [51] Các hãng sản xuất những sản phẩm chứa nano bạc chẳng hạn như Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng định tính an toàn của nó đối với sức khoẻ của người sử dụng [50]

1.4.2 Phương pháp tạo nano bạc phổ biến

cụ thể của phương pháp đó tương ứng với tác nhân khử cụ thể

Cơ chế của các phương pháp cụ thể cũng có rất nhiều điểm khác nhau Có nhiều cơ chế để giải thích Ví dụ phương pháp khử NaBH4 có hai cơ chế để mô tả quá trình:

Cơ chế 1: 4 Ag+ + BH4- +3H2O → 4 Ag + H2BO3- + 4H+ +2H2 (1.2)

Cơ chế 2: 8 Ag++ BH4- +3H2O → 8 Ag + H2BO3- +8 H+ (1.3)

Việc lựa chọn một hóa chất phù hợp tùy thuộc vào tính kinh tế, yêu cầu của quá trình điều chế cũng như chất lượng của hạt nano vì mỗi loại hóa chất sẽ tạo ra một cỡ hạt khác nhau ví dụ như khử bằng NaBH4 có thể cho cỡ hạt từ 5 nm đến 20

nm, khử citrate cho cỡ hạt trong khoảng 30 nm đến 120 nm Đồng thời mỗi loại hóa chất cũng cho tính bền vững của dung dịch các hạt nano Ag khác nhau và khả năng

đưa nano bạc từ dung dịch nano tạo bởi các hóa chất này tùy thuộc vào sản phẩm ta cần ứng dụng, do đó khi tiến hành điều chế hạt nano bạc bằng phương pháp hóa học cần lựa chọn thật kỹ lưỡng hóa chất sử dụng

Hình 1.1 Quá trình hình thành dung dịch nano Ag [9]

Sự va chạm của các phân tử kim loại

Sự cấu tạo hạt nhân

Sự tăng trưởng

Sự ổn định của phân tử Khử

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và các chất phụ gia trong dung môi để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion bạc thành bạc kim loại để chúng kết tụ tạo các hạt bạc nano

Một thí dụ sử dụng phương pháp vật lý để chế tạo hạt nano bạc là dùng các tia laser xung có bước sóng 500 nm, độ dài xung 6 ns, tần số 10 hz công suất 12-14

Mj [36] chiếu vào dung dịch AgNO3 như là nguồn kim loại và sodium dodecyl sulfate (SDS) như chất hoạt hóa bề mặt để thu được hạt nano bạc Kích thước của hạt nano Ag tạo ra bằng phương pháp laser phụ thuộc vào chiều dài bước sóng và cường độ của laser (hình 1.3) [13] Phương pháp vật lý có nhiều ưu điểm như: đơn giản hơn phương pháp hóa học, tuy nhiên để tạo tác nhân vật lý cần thiết bị hiện đại

và mắc tiền

Hình 1.2 Hình TEM và sự phân bố kích thước hạt nano Ag được chế tạo

bằng xung laser ở 120 fs và 8 ns [13]

1.4.2.3 Phương pháp sử dụng lò vi sóng

Lò vi sóng là một thiết bị gia nhiệt, nó cung cấp một nhiệt lượng ổn định và gia nhiệt đồng đều Sử dụng lò vi sóng tiến hành khử ion Ag+ thành Ag0 theo qui trình polyol để tạo thành hạt nano bạc Trong phương pháp này muối bạc và chất khử êm dịu có tác dụng trợ giúp cho quá trình khử Ag+ về Ag0 như: C2H5OH,

C2H5(OH)2 , C3H5(OH)3, HCHO…cũng như chất ổn định hạt nano bạc khi nó tạo thành Dưới tác dụng của vi sóng các phân tử có cực như các phân tử Ag+

và các chất trợ khử sẽ nóng lên rất nhanh, nhiệt cung cấp đều cho toàn dung dịch do vậy

mà quá trình khử bạc sẽ diễn ra một cách nhanh chóng và êm dịu hơn các phương pháp khác [14]

Hình 1.3 Lò vi sóng và dung dịch nano bạc được điều chế [14]

Gia nhiệt trong lò vi sóng là phương pháp có ưu thế hơn rất nhiều so với phương pháp cơ bản khác Bởi vì gia nhiệt trên một diện tích phẳng thì sẽ có những

vị trí mà nhiệt độ trên bề mặt sẽ khác xa so với trong lòng dung dịch, đồng thời gia nhiệt trên các bề mặt sẽ dễ dẫn đến là nhiệt độ tại thành của thiết bị gia nhiệt cao hơn rất nhiều so với nhiệt độ trung bình của dung dịch Ngược lại, gia nhiệt bằng vi

sóng thì nhiệt sẽ được cung cấp trên toàn thiết bị gia nhiệt, và nhiệt độ của cả dung dịch cũng như thành thiết bị hầu như đều nhau và đây là yếu tố tới hạn để tạo ra các hạt nano bạc có kích thước đồng đều nhau và nhỏ bé hơn nhiều so với phương pháp gia nhiệt thông thường Bên cạnh đó, một ưu điểm của phương pháp này là thiết bị đơn giản và dễ sử dụng Trong phương pháp vi sóng chúng ta có thể tạo ra hạt nano bạc có kích thước khoảng 10 nm [14]

Hình 1.4 Phổ UV-Vis của phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng

và phương pháp gia nhiệt thông thường [14]

1.4.2.4 Phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như nấm, vi khuẩn, virus và tảo

có khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại

tác nhân sinh học

Các tác nhân có thể kể đến như: vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis [40], các loại nấm như Verticillium [29], Fusarium oxysporum [33]

Phương pháp này sử dụng đơn giản và thân thiện với môi trường có thể tạo hạt khoảng 2-5 nm

1.5 Các ứng dụng của nano bạc

Do vi khuẩn ngày càng kháng thuốc, nên các nhà khoa học đang tập trung đi tìm các tác nhân mới để diệt chúng Và bạc là một trong những chất được tập trung nghiên cứu nhiều Với sự phát triển của công nghệ nano,các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng các hạt bạc có kích thước cực nhỏ để diệt khuẩn

1.5.1 Trong công nghiệp điện máy

Dựa trên tính năng diệt khuẩn của bạc, Samsung đã đưa ra phương pháp sử dụng nano bạc trong các thiết bị dân dụng để khử trùng Trong máy giặt, nano bạc tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước Cách làm này vừa ít hao tốn điện năng nhưng vẫn bảo đảm hiệu quả Bên cạnh việc diệt khuẩn, công nghệ nano bạc cũng giúp khử mùi Các lưới lọc trong điều hòa nhiệt độ hay các khoang trong tủ lạnh cũng được áp dụng công nghệ tương tự để bảo vệ sức khỏe cho người dùng Thời gian bảo quản thực phẩm có thể lên tới 15 ngày mà không ảnh hưởng đến mùi vị

Sau Samsung, công ty điện tử LG cũng công bố ứng dụng công nghệ nano để diệt khuẩn vào các thiết bị dân dụng như điều hòa nhiệt độ, tủ lạnh, máy hút bụi và máy giặt Nguyên tắc chung của diệt khuẩn, khử mùi là sử dụng các hạt bạc và các-bon siêu nhỏ Kết quả trên đã được các cơ quan có uy tín như cơ quan thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (EPA), hiệp hội công nghiệp tự động Singapore (SIAA) kiểm định [46]

Tại Việt Nam qua kết quả nghiên cứu lâm sàng của Viện bỏng Quốc gia được báo cáo trong Hội thảo tổ chức tại Hà Nội Các giáo sư đầu Ngành Bỏng Việt Nam – GS.TS Lê Thế Trung, TS Lê Năm và cộng sự đã khẳng định về tính an toàn và hiệu quả sử dụng của sản phẩm Anson:

+ Không gây tác dụng phụ, không độc hại

+ Bảo vệ vết thương tốt, giảm đau

+ Khi thay băng không làm đau đớn cho bệnh nhân

+ Vết mổ nhanh lành, nhanh lên da non, hình thành vi mạch máu, không để lại

s o

Hình 1.6 Băng gạc y tế có tẩm nano bạc [44]

Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta đã tìm ra một loại thuốc hữu hiệu phối hợp giữa kinh nghiệm cổ truyền và kỹ thuật nano Người Hy Lạp xưa thường dùng bạc để sát khuẩn và kích thích vết thương mau lành Cách này gần đây ít dùng vì có nhiều loại thuốc hiệu nghiệm hơn Hiện nay, hãng Nucryst đã cải tiến bằng cách dùng những phân tử bạc kích cỡ nano để bao bọc những vết loét

do bỏng vì chúng có tác dụng diệt khuẩn mạnh hơn việc dùng bạc ở kích thước bột bình thường Do là hạt siêu nhỏ nên chúng có thể thấm sâu vào da để tác động đều đặn Kết quả tuyệt vời, trước kia hàng ngày phải tiến hành việc thay băng gạc (có trường hợp phải vài lần trong một ngày) cho bệnh nhân, vừa gây đau đớn cho họ,

vừa tốn kém nhưng nay dùng loại thuốc mới này chỉ cần thay băng một lần trong một tuần và thời gian khỏi bệnh nhanh hơn [44]

1.5.3 Trong nông nghiệp

Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được Viện khoa học vật liệu ứng dụng sản xuất với nồng độ hạt nano bạc 1000 ppm và Chitosan 5000 ppm MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã chứng tỏ ưu việt của mình, cả 2 liều lượng: 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều cho đạt hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong giai đoạn 3-7 ngày sau khi phun [52]

Hình 1.7 Thuốc trừ sâu MIFUM 0,6 DD [52]

Trường Đại học Copenhaghen - Đan Mạch đang tiến hành nghiên cứu nano sinh học, được gọi là “nanobiotic”, đặc biệt là những nghiên cứu về nano bạc (Nanobiotic Silver) ứng dụng trong ngành chăn nuôi gia cầm Những nghiên cứu này của Đại học Copenhaghen đã kết hợp với Đại học Warsaw từ năm 2007 Công nghệ nano đã tạo ra được những hạt bạc có kích thước nano (Nanobiotic-Ag) có đặc tính sinh học cao, độc tính thấp và không có tính kháng thuốc Không những thế Nanobiotic-Ag còn có thể tăng hoạt động chuyển hoá tế bào, từ đó dẫn đến tăng tốc

độ sinh trưởng của động vật Các nhà khoa học của các trường đại học trên dự kiến Nanobiotic có thể thay thế kháng sinh cũng như các thuốc chống cầu trùng (coccidiostate) vào năm 2010

Một dự án công nghệ nano của Đan Mạch mang tên “Dự án bảo vệ gà mái và

gà thịt chống lại bệnh truyền nhiễm” (viết tắt là CHIP) đã được triển khai với sự tham gia của 13 đối tác thuộc khu vực nhà nước và tư nhân Mục tiêu của CHIP là

sử dụng những thành quả mới nhất của công nghệ nano và công nghệ sinh học để phá vỡ những con đường truyền bệnh và hạn chế các bệnh truyền nhiễm trong ngành chăn nuôi gia cầm Dự án nhắm chủ yếu vào vấn đề vệ sinh bằng cách thử nghiệm những thuốc vô trùng mới và những chất phủ bề mặt các thiết bị chuồng nuôi bằng chất liệu nano (nanocoating) Các chất phủ bề mặt này vừa dễ làm sạch, vừa có tính sát khuẩn [48]

Ngoài ra, Đan Mạch còn nghiên cứu hiệu quả của công nghệ nano bề mặt (nanocoating) đối với các thiết bị quạt thông gió trong chuồng nuôi Sự tiêu thụ điện của quạt đã được đánh giá theo một số loại chất phủ bề mặt khác nhau, trong đó có nano bạc Thí nghiệm sử dụng quạt phủ nano bạc đã thấy giảm 6% chi phí về điện Những ion từ nano bạc đã ngăn không cho bề mặt bị phủ bởi một lớp biofilm, nhờ vậy bụi không có cơ hội dính vào lớp biofilm này (biofilm tạm dịch là màng sinh học do sự kết tập của các vi khuẩn trên bề mặt các chất vô cơ hay hữu cơ) [48]

1.5.4 Trong các sản phẩm gia dụng

Hãng Mummybear gần đây đã giới thiệu công nghệ nano bạc được ứng dụng vào sản xuất khăn ướt, bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ Những sản phẩm này đều được tráng phủ bạc tiệt trùng ứng dụng công nghệ nano, vì vậy các bà m

sẽ tiết kiệm được thời gian, không phải luộc bình hàng ngày mà vẫn bảo quản được thực phẩm lâu dài Theo kết quả cuộc nghiên cứu của Viện nghiên cứu và thử

nghiệm Hàn Quốc (FITI) khi so sánh sự sinh trưởng của khuẩn E.Coli gây tiêu chảy

và Staphyloccoci gây bệnh ung thư trong bình sữa nano bạc cho thấy sau 5 giờ

lượng khuẩn trong bình sữa thường tăng lên 84,6% còn bình nano bạc giảm 44,6% Ngoài ra, bình sữa nano bạc còn có tác dụng khử mùi hôi, tiêu độc, chống đầy hơi, trướng bụng khi trẻ bú sữa [47]

Hình 1.8 Bình sữa Mummybear có tráng lớp nano bạc [47]

Ngoài ra, hiện nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như tất khử mùi, bàn chải đánh răng, nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, ca uống nước, … mang lại nhiều lợi ích cho cuộc sống

1.6 Sơ lƣợc về Fusarium oxysporum

1.6.1 Đặc điểm sinh thái

Nấm Fusarium oxysporum là loại nấm sống trong đất và phân bố rộng rãi

trong các loại đất trồng trọt và đất cỏ, loài nấm này có hơn 100 dạng chuyển hóa Nấm phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-30oC Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách

ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già Fusarium oxysporum

sinh sản vô tính trung bình giữa ba kiểu bào tử vô tính là bào tử đính lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử -

Chlamydospores) Bào tử lớn cong nh một đầu thon nhọn, một đầu thon gãy khúc

dạng bàn chân nhỏ, thường có ba ngăn ngang Bào tử nhỏ đơn bào hình trứng, bầu dục dài hoặc hình quà thận được hình thành trong bọc giả trên cành bào tử không phân nhánh trên sợi nấm, trong khi đó bào tử lớn hình thành từ cành bào tử phân nhiều nhánh xếp thành tầng Nấm còn sinh ra bào tử hậu hình cầu, màng nhày màu nâu nhạt Kích thước bào tử lớn 35-50 x 3,5-5,5 m và bào tử hậu từ 9-10 m

Được nuôi cấy tốt trong môi trường Malt extract + Yeast extract Hình thái khuẩn lạc: ban đầu sợi nấm có màu trắng, khuẩn lạc xốp, sau 5 – 6 ngày sợi nấm mọc kín bề mặt đĩa, khuẩn lạc chuyển dần sang màu hồng hay tím nhạt

Hình 1.9 Hình thái sợi đa bào, bào tử hình liềm và bào tử hình cầu [54]

1.6.2 Sinh tổng hợp nano bạc bởi Fusarium oxysporum

Nhiều vi sinh vật như tảo, vi khuẩn và nấm sản xuất các hạt nano kim loại qua

con đường nội bào Nhiều sinh vật đơn bào như là vi khuẩn Magnetotactic sản xuất

các hạt nano sắt từ và các loại tảo cát tổng hợp nên các vật liệu silic Còn ở sự sản xuất ngoại bào, có nhiều nghiên cứu đã đạt được kết quả khi sử dụng tế bào nấm

Fusarium oxysporum để sinh tổng hợp nano bạc Hiện nay, các loài Fusarium khác

như F acuminatum Aspergillus niger, Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus sp

Thermomonospora , Phaenero chaete chrysosporium cũng đang được nghiên cứu

Tuy chỉ mới tiếp cận nhưng phương pháp này đã được các nhà khoa học xem như là một nhà máy sản xuất nano

Các enzyme khử nitrate thường là yếu tố cần thiết cho sự khử sắt Nhiều chủng nấm thể hiện những thuộc tính đặc trưng, nói chung là có khả năng trong việc khử

Au (III) hay Ag (I) Ngoài ra, nhiều enzyme ngoại bào, vài naphthoquinone, và

anthraquinone ở chủng F oxysporum với đặc tính khuếch tán nổi bật có thể hoạt

động như là electron trong các phản ứng khử kim loại

Một cơ chế khác đã được miêu tả, có liên quan đến việc sản xuất các hạt nano bạc nhờ sự xúc tác của các oligopeptide, làm tủa các hạt thành vài dạng như (hình lục giác, hình cầu, và hình tứ diện) Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sự

đa dạng của loài Fusarium để tìm hiểu rõ hơn về cơ chế, hiệu quả của sự khử các

ion bạc có liên quan đến một loại enzyme khử hay sự hoạt động của quinone trong quá trình sinh tổng hợp nano bạc

Hình 1.10 Cơ chế quá trình sinh tổng hợp nano bạc [22]

1.7 Các phương pháp cố định vi sinh vật

1.7.1 Các loại chất mang dùng cố định vi sinh vật

Chất mang dùng cố định tế bào chia làm hai loại: chất mang hữu cơ và chất mang vô cơ

1.7.1.1 Phân loại chất mang

Chất mang hữu cơ: gồm chất mang hữu cơ tự nhiên và tổng hợp

 Chất mang hữu cơ tự nhiên

Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang được sử dụng rộng

rãi hiện nay, bao gồm cellulose, agarose, alginate, carrageenan, chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng

Chitin và dẫn xuất của chitin (chitosan)

Chitin là polymer rất phổ biến trong tự nhiên, có cấu tạo tương tự cellulose Chitin và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo mạng, tạo hạt, có khả năng hấp phụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, dùng để nhốt tế bào trong khuôn gel khi xử lý với glutaraldehyde hay sodiumtripolyphosphate… Tuy nhiên chúng có nhược điểm là

độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ Để khăc phục nhược điểm này, người

ta ghép các copolymer với các monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxyethylacrylate nhằm cải thiện những nhược điểm trên

Chất mang là protein: các chất thường dùng là collagen, gelatin, keratin…

Vật liệu này sử dụng tạo khuôn gel nhốt tế bào với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde Nhưng nhóm chất mang này thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn

Có các loại polymer tổng hợp được sử dụng như polyacrylamide, polyester, polyvinylacetate, polyacrylic… Ưu điểm của loại này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi sinh vật, độ trương tốt và đặc biệt có thể điều chỉnh được kích thước chất mang để nâng cao hiệu quả quá trình cố định Bên cạnh

đó, còn có những nhược điểm như giá thành vật liệu cao, sự tương hợp sinh học kém, và vì là tổng hợp hữu cơ nên khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường, nhất là trong công nghệ sản xuất polymer

Chất mang vô cơ

 Chất mang vô cơ tự nhiên: than hoạt tính, cát, zeolit, silicat

 Chất mang vô cơ tổng hợp: silicat, silicagel, Al2O3, TiO2, ceramic, sợi bông thủy tinh

Các loại chất mang này có cấu trúc lỗ xốp và có thể điều chỉnh đuợc, khả năng hấp phụ tốt Nhưng một số chất mang vô cơ như thủy tinh xốp, silicagel, silochrom đều phải trải qua giai đoạn xử lý bề mặt trước khi đưa vào cố định tế bào để đảm bảo độ bền, độ chọn lọc và độ hấp thu tốt

Mỗi loại chất mang đều có ưu nhược điểm nhất định Vì vậy, tùy thuộc vào phương pháp cố định mà ta sẽ chọn loại chất mang phù hợp để cho hiệu quả tốt nhất Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển tạo ra nhiều loại vật liệu mới làm chất mang thích hợp trong việc cố định tế bào vi sinh vật cũng như chất xúc tác sinh học khác

Cellulose thu được từ vi khuẩn có cấu tạo hóa học giống với cellulose thực vật, nhưng khác cấu trúc đa phân tử dẫn đến sự khác nhau về thuộc tính và tính chất hóa lý

Trong khi kích thước của cellulose vi khuẩn nhỏ rất nhiều so với cellulose thực vật (khoảng 1/100 lần) Ngoài ra BC còn khác PC về chỉ số kết chặt, mức độ polymer hóa (thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000-6000); có vài trường hợp đạt tới 16000-20000, trong khi PC là 13000-14000

Hình 1.11 So sánh đường kính sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và nhân

tạo [1]

Cấu trúc cellulose vi khuẩn thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy: nuôi cấy tĩnh hay lắc Khi nuôi cấy tĩnh, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng màng keo có độ kết lớp chặt chẽ Khi nuôi cấy lắc, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng huyền phù phân tán tạo thành dạng hạt nhỏ, hình sao, sợi dài Bên cạnh điều kiện nuôi cấy thì cấu trúc BC còn phụ thuộc vào từng dòng vi khuẩn.

Hình 1.12 “Lớp da BC” (BC pellicle) được hình thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [24]

Hình 1.13 Các hạt BC (BC pellets) được hình thành trong điều kiện nuôi cấy lắc [24]

- Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt: trong điều kiện ngập nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt

- Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần qua bước trung gian Chẳng hạn như sản xuất giấy không cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ Đặc biệt là vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ Trong cấu trúc BC thu được trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạo nên chặt chẽ hơn [5]

1.7.2 Các phương pháp cố định vi sinh vật

1.7.2.1 Khái niệm

Cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị lại trong một khu vực không gian nhất định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tác sinh học của chúng và có thể sử dụng lại nhiều lần

Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và ta có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn

1.7.2.2 Phân loại các phương pháp

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều ngành như các ngành công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp, xử lý môi trường… Vì vậy có rất nhiều phương pháp khác nhau và vật mang khác nhau được

sử dụng để cố định tế bào

Phân loại các phương pháp cố định tế bào dựa trên sơ đồ sau:

Tất cả các phương pháp trên đều có cùng mục đích: giữ được mật độ tế bào cao trong vùng không gian nhất định cũng như trong bình phản ứng sinh học để làm gia tăng khối lượng sản phẩm

1.7.2.3 Chuyển hóa vật chất của tế bào cố định

Chất mang có gắn tế bào vi sinh vật được đưa vào bình phản ứng sinh học Cơ chất được đưa vào từ đỉnh bình phản ứng, trong bình phản ứng sinh học xảy ra quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và cơ chất tạo sản phẩm Sản phẩm được lấy ra ở đáy bình là sản phẩm sạch Quá trình này được thực hiện liên tục

So với tế bào tự do, tế bào cố định có những thuận lợi như: mật độ tế bào cao, khối lượng sản phẩm tăng, rút ngắn thời gian phản ứng, kích thước thiết bị nhỏ gọn, khả năng tái sử dụng nhiều lần

Ngoài ra, trong quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi

Ta có thể sử dụng được nhiều loại cơ chất, quy trình thiết kế đơn giản hơn, chất lượng sản phẩm đồng đều Hơn nữa, tế bào cố định được bảo vệ không bị ức chế bởi cơ chất và sản phẩm cuối

Với những thuận lợi trên, ta thấy quá trình lên men sử dụng tế bào cố định xảy ra nhanh hơn so với lên men sử dụng tế bào tự do [11]

1.7.2.4 Yêu cầu đối với tế bào vi sinh vật cố định

Tế bào vi sinh vật cố định giống như một tác nhân xúc tác bao gồm: sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp nhất, tế bào vi sinh vật cố định phải có khả năng chiếm thể tích riêng của reactor nhiều nhất nhằm làm tăng năng suất thể tích

Ngoài ra, cơ chất và sản phẩm tạo trong quá trình trao đổi chất của tế bào phải

có khả năng khắc phục được hàng rào cản khuếch tán, đó là chất mang và thành tế bào Tế bào cố định phải bền về mặt cơ học để có thể dễ dàng khuấy trộn trong bình phản ứng

Chất xúc tác (tế bào cố định) phải ổn định trong khoảng nhiệt độ hoạt động của quy trình công nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ Phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào quá trình trao đổi chất đặc thù đối với từng cơ thể vi sinh vật [10]

1.7.2.5 Các phương pháp cố định

a Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật lên bề mặt chất mang

Hình 1.14 Tế bào vi sinh vật cố định trên bề mặt chất mang [5]

Phương pháp này dựa trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và chất mang không tan trong nước thông qua các liên kết như liên kết cộng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý Vật liệu làm bằng chất mang có chức năng phù hợp để liên kết

được với tế bào vi sinh vật, có độ bền cơ học tốt, ổn định trạng thái lý hóa tốt, không tạo độc tố, ngoài ra còn dễ dàng tạo hình dạng phù hợp với loại thiết bị phản ứng

Sau đây là một vài phương pháp hay được dùng nhiều trong thực tế

Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên kết cộng hóa trị giữa bề mặt chất mang đã được hoạt hóa và tế bào vi sinh vật

Lúc này trên bề mặt tế bào tồn tại một số nhóm chức hoạt động như amino, cacboxyl, thiol, hydroxyl, unidazole, phenol của protein đều có khả năng tham gia tạo phản ứng liên kết với chất mang

Phương pháp hấp phụ

Đây là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về sự cố định tế bào Hai nhà khoa

học Hattori và Furusaka đã báo cáo về việc gắn những tế bào Escherichia coli lên

một cột nhựa trao đổi ion Tiếp sau đó, nhiều loại tế bào vi sinh vật khác đã được cố định bằng phương pháp hấp phụ trên những giá thể khác như gỗ, đất sét, thủy tinh, chất dẻo…

Phương pháp này tạo nên dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và

bề mặt chất mang So với phương pháp liên kết cộng hóa trị, ở phương pháp hấp phụ, tế bào và chất mang ngoài liên kết cộng hóa trị ra, chúng còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết khác [8]

b Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel

Các loại gel cơ bản

Có nhiều loại cấu trúc gel cơ bản

Ion gel: khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang đa diện tích và dung dịch đa diện tích trái dấu Hay nói cách khác ion gel là một loại gel có

cấu trúc mạng lưới được hình thành từ những liên kết ion có khả năng phân hủy sinh học, dễ tìm nhưng độ bền cơ học và hóa học kém Loại vật liệu này đòi hỏi phải là chất đa diện tích như chitosan, alginate

Covalent gel: là một loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình thành

từ những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng các liên kết cộng hóa trị Một số chất tạo covalent gel là polyacrylamide (polymer tổng hợp được hình thành từ monomer acrylamide) và một số chất vô cơ (gel vô cơ hình thành từ một số oxide như (SiO2)x, (TiO2)x.)

Non-covalent gel: là loại gel mà mạng lưới trong cấu trúc gel cố định tế bào

vi sinh vật được hình thành bằng những liên kết khác không phải là liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử polymer, thường là liên kết hydro Các loại chất mang như agar-agar, agarose, carrageenan

Cryogel: là cấu trúc polymer mới, được tạo nên bằng phương pháp lạnh đông các tiền polymer có phân tử lượng thấp hoặc cao Dưới điều kiện nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi và hình thành cấu trúc mới Loại chất mang này khắc phục được tính chất kém bền nhiệt và không bền trong dung dịch nước so với các loại chất mang khác Việc cố định tế bào trong cryogel là phương pháp mới nên vật liệu

sử dụng chưa nhiều, điển hình là polyvilyl alcohol [8]

Tóm lại, các chất dùng tạo gel đòi hỏi phải có khả năng tạo gel tốt, đa dạng

phù hợp với kỹ thuật cố định tế bào