Nghiên cứu chế biến rượu vang thốt nốt

HCM, ngày 02 tháng 02 năm 2011 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống MSHV: 09110164 I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN RƯỢU VANG THỐT NỐT II- NHIỆM VỤ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu (Chủ tịch hội đồng)

2 TS Nguyễn Dương Tâm Anh (Thư kí)

3 PGS.TS Đống Thị Anh Đào (Uỷ viên)

4 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng (Uỷ viên)

5 TS Nguyễn Hữu Phúc (Uỷ viên)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Bộ môn quản lý chuyên ngành

Tp HCM, ngày 02 tháng 02 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm và Đồ Uống MSHV: 09110164

I- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN RƯỢU VANG THỐT NỐT

II- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

 Tổng quan về cây thốt nốt;

 Khảo sát các chủng nấm men phù hợp để chọn chủng phù hợp lên men rượu vang thốt nốt;

 Chọn ra 3 chủng nấm men có cảm quan tốt để tiến hành khảo sát các đều kiện lên men;

 Xác định các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng nấm men trước khi tiến hành các thí nghiệm;

 Khảo sát các điều kiện lên men: pH, % Brix, nhiệt độ, tỷ lệ giống, chế độ thanh trùng;

 Theo dõi quá trình lên men của 3 chủng nấm men: %Brix, số lượng tế bào, pH;

 So sánh giá trị chất lượng sản phẩm

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 02/2011

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/07/2011

V- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

PGS.TS Phạm Thành Quân PGS.TS Đống Thị Anh Đào Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

(Họ tên và chữ ký)

PGS TS Phạm Thành Quân PGS.TS Đống Thị Anh Đào

Hiện nay, rượu vang rất phổ biến trên thị trường, đặc biệc là rượu vang nho Ở Việt Nam, hiện cũng có các nhả máy sản xuất rượu vang nho như nhà máy vang Đà Lạt Tuy nhiên, do đặc tính của vùng nho nhiệt đới nên rượu vang nho chưa được ưa chuộng và không có tính cạnh tranh so với các sản phẩm rượu vang nho trên thế giới Vấn đề đặt ra ở đây là cần thiết tạo ra những loại rượu vang đặc sản từ sản phẩm nông nghiệp đặc trưng của nước ta Thốt nốt là cây rất phổ biến ở cực Nam Nam Bộ, trồng chủ yếu ở các tỉnh An Giang và các tỉnh giáp biên giới Campuchia, thốt nốt được biết đến qua các sản phẩm như: đường thốt nốt, bánh bò thốt nốt, chè thốt nốt và đặc sản là nước thốt nốt chua Hiện nay, người dân làm rượu thốt nốt (còn gọi là nước thốt nốt chua) chỉ đơn giản bằng cách để lên men tự nhiên, do vậy thời gian bảo quản chỉ vài ngày Vì vậy, vấn đề đặt ra là tạo ra 1 sản phẩm rượu vang từ nước thốt nốt Do vậy, chúng tôi chọn đề tài:

“NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN RƯỢU VANG THỐT NỐT”

Trong luận văn này, chúng tôi khảo sát các giống nấm men thích hợp cho quá trình lên men rượu từ nước thốt nốt Sau đó chọn ra ba giống nấm men tốt nhất: C1,

Rh, RD để tiến hành khảo sát đặc tính hóa lý của 3 giống các điều kiện lên men như: chế độ thanh trùng, khảo sát các đặc tính hóa lý của 3 giống, khảo sát các điều kiện lên men, theo dõi các thông số quá trình lên men để chọn ra chủng tốt nhất trong 3 giống khảo sát

Kết quả nghiên cứu chúng tôi đạt được, cà 3 giống đều tạo ra sản phẩm rượu có

độ cồn từ 11,5%v/v đến 12,5%v/v, pH cuối sản phẩm là 4,79 (giống RD) 4,94 (giống Rh) 4,92 (giống C1) và tổng hàm lượng chất khô hòa tan của sản phẩm đạt được là 6,5

đến 7%Brix Cả 3 giống đều thuộc loài Saccharomyces cerevisiae Với kết quả này, ta

hoàn toàn có thể tạo ra sản phẩm rượu từ nước thốt nốt

we have many factories which produces wine such as Da Lat wine However, beacause

of many features of tropical grapes in Vietnam, Vietnam grape wine is not popular and not as competitive as others So, it is neccesary to create many kinds

of wine from popular agricultural products in Vietnam? Palm tree is very popular in Southern Vietnam, grows mainly in An Giang province and others nearby many Campodian provinces Palm products are known such as: sugar, sponge cake, and especially thot not chua Today, thot not chua is fermented naturally so that preservation time is short just few days So that, we choose this study:

“STUDY ON PALM WINE FERMENTATION”

In this study, we isolate yeast from many different sources for femented wine and choose three kinds of yeast to survey fermentation conditions such as: pasteurization, physical and chemical property of three strains Then we compare the quality of wine which is fermented well and delicious flavors

According to our results, the products which are fermented from three strains have following characteristics: ethanol content = 11,5 ÷ 12,5%v/v, pH = 4,79 (RD) 4,94 (Rh) 4,92 (C1) and 6,5 ÷ 7oBx Three strains are Saccharomyces cerevisiae With

this result, we can product palm wine

I Tính cấp thiết của đề tài

Thốt nốt được biết nhiều qua các sản phẩm như đường thốt nốt, trái thốt nốt, cùng nhiều thứ khác được làm từ lá, từ thân cây thốt nốt, một loại cây được trồng rất nhiều ở khu vực 2 huyện Tịnh Biên và Tri Tôn Từ bao đời cây thốt nốt gắn liền với cuộc sống sinh hoạt của người Khmer An Giang

Cây thốt nốt có rất nhiều công dụng, hầu như bộ phận nào của cây cũng có thể

sử dụng được, như thân cây xẻ gổ làm nhà, làm đồ gia dụng như đũa, muỗng, thước kẻ Lá thốt nốt dùng để lợp nhà Trái thốt nốt và nước thốt nốt là thức uống giải khát đặc sản của người Khơme Nhưng trên hết, người Khmer trồng thốt nốt để làm đường

từ nước thốt nốt

Hiện nay, thị trường rượu vang trong và ngoài nước chủ yếu là vang nho, loại rượu truyền thống của cả thế giới Tuy nhiên, xu hướng hiện nay con người thích được thưởng thức các loại nước trái cây lên men Một số nước trái cây lên men đã có mặt trên thị trường bao gồm: rượu bưởi, rượu dừa,… Ở vùng sông nước ĐBSCL, miền quê

An Giang có một loại trái cây rất lạ và thân thuộc với người dân, đó là cây thốt nốt Nói đến thốt nốt, người ta sẽ nghĩ ngay đến đường thốt nốt (một đặc sản của vùng núi Châu Đốc), bánh thốt nốt, nước thốt nốt chua…

Nước thốt nốt chua là một dạng rượu lên men từ nước thốt nốt Tuy nhiên, người dân chỉ làm thủ công bằng cách để lên men tự nhiên Để hoàn thiện thức uống này, ta cần tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất rượu vang từ nước thốt nốt

II Mục tiêu nghiên cứu

Tạo ra một loại rượu vang với nguồn nguyên liệu mới: nước thốt nốt

Chọn chủng nấm men phù hợp với điều kiện lên men thốt nốt

III Nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu tổng quan về nguồn nguyên liệu thốt nốt;

- Nghiên cứu lựa chọn các chủng nấm men phù hợp cho lên men rượu từ thốt nốt;

kiện lên men;

- Xác định các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng nấm men trước khi tiến hành các thí nghiệm;

- Khảo sát các điều kiện lên men: pH, % Brix, nhiệt độ, tỷ lệ giống, chế độ thanh trùng;

- Theo dõi quá trình lên men của 3 chủng nấm men: %Brix, số lượng tế bào, pH;

- So sánh chất lượng sản phẩm

IV Ý nghĩa của đề tài

Sử dụng nguồn nguyên liệu mới: nước thốt nốt để nghiên cứu tạo ra một loại rượu vang mới: rượu thốt nốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây thốt nốt

Hình 1.1: Cây thốt nốt ở An Giang 1.1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng) Monocots

(không phân hạng) Commelinids

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 2

Chi Thốt nốt hay chi Thốt lốt[1] (danh pháp khoa học: Borassus) là một chi của

5-10 loài thốt nốt thuộc họ Cau (Arecaceae), có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới châu

Phi nhƣ Ethiopia, Niger, Nigeria, miền bắc Togo, Senegal v.v, miền nam châu Á và New Guinea Chúng là các loại cây thân cau cao thẳng đứng, có thể cao tới 30 m Lá dài, hình chân vịt, dài 2 - 3m Các lá chét dài 0,6-1,2m Cuống lá (mo) mở rộng Hoa nhỏ, mọc thành cụm dày dặc, thuộc loại đơn tính khác gốc Hoa đực nhỏ, có 3 lá đài, 3 cánh rời xếp lợp, 6 nhị ngắn, bao phấn 2 ô Hoa cái to, gốc có lá bắc, đài và tràng rời, bầu hình cầu, có 3 - 4 ô, 3 đầu nhị cong Quả lớn màu nâu hoặc nâu hạt dẻ hình dạng hơi tròn với 3 hạch, hạt thuôn chia 3 chùy ở đỉnh Tại Việt Nam mọc và đƣợc trồng ở các tỉnh khu vực Nam Bộ giáp với Campuchia Tên gọi thốt nốt trong tiếng Việt có

nguồn gốc từ tiếng Khmer th'not Đây là loài cây biểu tƣợng không chính thức của

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 3

Các cuống (bẹ) lá cũng có thể dùng làm hàng rào và có thể lấy ra sợi rắn chắc phù hợp cho việc làm thừng, chão hay chổi Gỗ màu đen là loại gỗ cứng, nặng và bền,

có giá trị trong xây dựng

Từ cây này người ta cũng tạo ra nhiều loại thức ăn Các cây non được đem nấu nướng như là một loại rau hoặc nghiền, giã hay nướng để làm thức ăn Quả được ăn dưới dạng tươi hay nướng, người ta còn ăn cả các hạt non tựa như thạch Dịch ngọt có thể thu được từ các bông mo non (kể cả hoa đực lẫn hoa cái), nó được dùng lên men

để làm một loại đồ uống, gọi là rượu arac, hoặc được cô đặc để sản xuất một loại

đường thô gọi là đường thốt nốt Tại Indonesia người ta gọi nó là Gula Java (đường

Java) và được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực của người dân Java Ngoài ra, nhựa từ thân cây cũng được dùng làm một loại thuốc nhuận tràng Các giá trị y học cũng đã được quy cho các phần khác của cây

Hình 1.2: Trái thốt nốt

Thốt nốt được biết nhiều qua các sản phẩm như đường thốt nốt, trái thốt nốt, cùng nhiều thứ khác được làm từ lá, từ thân cây thốt nốt, một loại cây được trồng rất nhiều ở khu vực 2 huyện Tịnh Biên và Tri Tôn Từ bao đời cây thốt nốt gắn liền với cuộc sống sinh hoạt của người Khmer An Giang

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 4

Hình 1.3: Người dân đi lấy nước thốt nốt

Cây thốt nốt có rất nhiều công dụng, hầu như bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng được, như thân cây xẻ gổ làm nhà, làm đồ gia dụng như đũa, muỗng, thước kẻ Lá thốt nốt dùng để lợp nhà Trái thốt nốt và nước thốt nốt là thức uống giải khát đặc sản của người Khơme Nhưng trên hết, người Khmer trồng thốt nốt để làm đường từ nước thốt nốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 5

Hình 1.4: Cách lấy nước thốt nốt

Hình 1.5: Thu hoạch nước thốt nốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 6

Leo cây để lấy nước thốt nốt không phải đơn giản, vì cây rất cao nên người ta buộc những thanh tre chừa các nhánh nhỏ để người leo bước lên thay thế cho thang Leo thốt nốt rất nguy hiểm vì đôi khi sơ ý trượt chân hay những thanh tre lâu ngày mục gãy

Hình 1.6: Thu hoạch nước thốt nốt vào buổi sáng sớm hoặc chiều tối

đồ uống có cồn phổ biến ở hầu hết các nước Đông Nam Á [20]

Trong quá trình thu hoạch nhựa được lên men từ hoa của cây thốt nốt, ở một giai đoạn nhất định, được xử lý để kích thích dòng chảy của nhựa trong một loạt các hoạt động được gọi là "khai thác" (Nathanael 1970) Nhựa tươi bắt đầu rỉ ra từ vết cắt

ở cuối các mo hoa từ 3 đến 4 tuần sau khi "khai thác" Trong ngành công nghiệp lên

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 7

men truyền thống ở Sri Lanka, dịch thốt nốt được thu thập trong bình đất sét mở được gắn trên cây và vận chuyển đến các trung tâm thu gom mỗi 24 giờ một lần Nhựa cây lên men được tiêu thụ trong vòng 2 ngày [20]

Dịch thốt nốt khi chảy ra từ mo hoa là một loại xi-rô ngọt trong suốt có chứa 15-18% đường chủ yếu là ở dạng sucrose (Nathanael 1960) Xi-rô ngọt này được gọi

là 'toddy' trải qua quá trình lên men gần như ngay lập tức bởi một nhóm vi sinh vật không đồng nhất, có thể có nguồn gốc từ thực vật bản địa của cây thốt nốt, không khí hoặc các thiết bị khai thác Toddy đã lên men là một chất lỏng màu trắng sữa có chứa 6-7% rượu theo thể tích và số lượng đáng kể các vi sinh vật sống Tại Sri Lanka, nhựa toddy lên men được tiêu thụ tươi, đóng chai và tiệt trùng hoặc chưng cất để sản xuất được gọi là 'rượu a-rắc’ [20]

Các báo cáo của các tác giả Damoderan 1928, Liyanage Senthee Nathan năm 1970, Jayatissa và các cộng sự 1978 đã trình bày về bản chất của vi sinh vật hiện diện trong quá trình lên men dịch thốt nốt ở Sri Lanka, đã phân lập và tìm hiểu đặc tính của nấm men trong dịch thốt nốt lên men Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành để tìm hiểu sự phát triển vi sinh vật học và sinh hóa trong quá trình lên men tự nhiên [20]

Shanmuga-Trong quá trình nghiên cứu, các thay đổi về vi sinh vật học, vật lý và hóa học khác nhau xảy ra trong toàn bộ thời gian lên men tự nhiên được theo dõi một cách cẩn thận và các mối quan hệ của chúng cũng được xác định [20]

 Ở Ấn Độ

Rượu cọ, phổ biến là “rượu thốt nốt” là một loại đồ uống có cồn có được do sự

lên men dịch thốt nốt Ở Ấn Độ, cây thốt nốt (Phoenix sylves-tris), thốt nốt, (Cocos nucifera), cây thốt nốt (Borassus flabellifer), bột thốt nốt sagus (Metroxylan sago) và rượu thốt nốt (Phoenix humilis var pedunculata) Mặc dù rượu thốt nốt là một loại đồ

uống có cồn truyền thống phổ biến, được tiêu thụ ở Ấn Độ từ thời xa xưa, các tài liệu khoa học về lĩnh vực lên men của loại này vẫn còn đang thiếu [17]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 8

Theo cách truyền thống, dịch thốt nốt rừng được thu thập qua đêm được đựng vào trong bình đất sét, từ đường rạch ở phần trên của thân cây (theo The Wealth of India 1969) Bình chứa một lớp váng của các vi sinh vật ở đáy bình được hình thành

từ việc lên men trước đó Lớp váng được giữ lại không bị xáo trộn và được sử dụng như một nguồn của chất dùng để cấy qua các mùa lấy mủ Nhựa cây được lấy bằng cách hứng vào trong bình thu được gắn trên cây và sự lên men xảy ra ngay lập tức Sau thời điểm thu nhựa cây, sự lên men vẫn diễn ra và nhựa cây được chuyển hóa thành rượu ngọt (rượu tươi) Sản phẩm này có màu trắng của sữa và sủi bọt Quá trình lên men vẫn tiếp tục một vài giờ nữa sau khi nhựa cây được chia ra từ các bình và được vận chuyển tới các cửa hàng Nhựa cây không lên men được đựng vào trong một bình tươi (gọi là nhựa tươi) có màu nâu tía và vị ngọt (10-15% sucrose) Quá trình lên men xảy ra trong nhựa tươi cũng là do vi sinh vật tự nhiên nhưng tạo ra sản phẩm không mong đợi Các nghiên cứu về quá trình lên men của nhựa tươi và rượu thốt nốt tươi được triển khai để tìm ra các vi sinh vật có liên quan, hệ thống phát triển của chúng và những sự thay đổi hóa học xảy ra trong cơ chất trong suốt quá trình lên men này Khi quá trình lên men rượu thốt nốt tươi được tiến hành vào lúc nhựa được lấy từ cây, những sự thay đổi xảy ra trong các giai đoạn đầu của quá trình lên men được nghiên cứu trong nhựa cây tươi được kết hợp với chất để cấy vào rượu thốt nốt tươi [17]

Rượu thốt nốt Raphia được làm từ nhựa của cây thốt nốt Raphia Nhựa chứa nhiều đường đơn Các đường được lấy từ cây thốt nốt Raphia, bao gồm sucrose,

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 9

glucose, fructose và maltose (Faparusi, 1981) Nhựa được thu từ các khe dọc theo thân cây và các mo hoa chưa nở và được lên men bằng nấm men tự nhiên trong rượu thốt

nốt Tế bào nấm men, chủ yếu là Schizosachromyces prombe (Bassir 1962), Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces pastriorianus, Saccharomyces ellipsoides và Saccharomyces vafer (Okafor, 1972; Abalaka & Opara,

năm 1990) tích lũy hàng triệu xung quanh cuống hoa và kết tinh nhựa một cách tự nhiên Nấm men rượu thốt nốt được trình bày bởi Abalaka và Opara (1990) cung cấp sản lượng sinh chất thấp nhưng cho năng suất ethanol cao [18]

Một loại vi khuẩn kỵ khí có khả năng sản xuất ethanol cao, có khả năng di

chuyển, hình que có họ gần với Zymonomas mobilis, đã được báo cáo (Van Pee &

Swings, 1971) xảy ra trong rượu thốt nốt Công-gô Các chủng loại khác của vi khuẩn

Zymonomas, được tách từ rượu thốt nốt Zaire, cũng cho thấy có tác dụng trong việc

lên men đường sucrose (Van Pee & Swings, 1972) Vi khuẩn được tách từ mẫu rượu thốt nốt Nigeria được sản xuất từ dầu thốt nốt và các cây thốt nốt Raphia bao gồm

Micrococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus, Acetobacter, Serratia, Aerobacter (Klebsiella), Racillus, Zymononas và các loại Previbacterium Sự suy

giảm nồng độ pH từ khoảng 7 đến khoảng 4 xuất hiện trong suốt quá trình lên men rượu thốt nốt là do vi khuẩn sản xuất acid lactic và một số vi khuẩn gram âm như các

loại Serratia và Aerobacter (Okafor, 915a, b) [18]

Theo truyền thống, Sacaglottis Gabonensis được thêm vào thốt nốt tươi để ngăn

ngừa hiện tượng lên men chua Tác giả Faparusi và Bassir (1972) đã nghiên cứu tìm

thấy chất chiết xuất từ vỏ cây của Sacaglottis gabonensis có thể ngăn chặn đáng kể sự phát triển của một số vi khuẩn phân lập từ rượu thốt nốt như Leuconostoc mesenteroides và Lactobacillus plantarum giúp rượu thốt nốt có nồng độ ethanol cao

Hương vị chua tăng lên theo thời gian do hoạt động của vi sinh vật trong sản xuất cũng như tích lũy các acid hữu cơ Báo cáo của tác giả Morah năm 1986 đã từng cho thấy rằng các ion metabisulfit bảo toàn hương và vị của rượu thốt nốt và giảm thiểu quá trình lên men lactic [18]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 10

Sự có mặt của các loại nấm men sản sinh sulfur-dioxide đã được Wurdig và Schlotter (1971) trình bày Đây là nguyên nhân gây ra việc rượu đã hoàn thành có chứa sulfur dioxide nhiều hơn lượng đã được thêm vào trước, trong và sau khi lên men Các chủng nấm men sản sinh sulfur-dioxide như vậy vẫn chưa được xác định trong các loại nấm men rượu thốt nốt Các bài nghiên cứu hiện tại viết về tác động của việc gia tăng ion metabisulfit để sản xuất rượu trong quá trình lên men rượu thốt nốt

Số lượng ethanol được sản xuất tại các thời điểm khác nhau trong quá trình lên men

đã được ước tính theo phương pháp khuếch tán (Morah, 1994) [18]

1.2 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào, không di động

và thường sinh sản bằng cách nảy chồi [1]

Con người đã sử dụng nấm men từ rất lâu đời Từ thời tiền sử con người đã ép nước hoa quả và ngâm hạt để làm rượu vang và bia Nấm men còn được dùng làm bột

nở và xốp vì trong đó hình thành các bọt khí [1]

Năm 1680, Leewenhoek đã quan sát thấy nấm men bao gồm những hạt nhỏ hình cầu Vào những năm 1836 và 1837, các nhà sinh học trong đó có Schwann đã thấy quá trình nảy chồi ở nấm men thành những hạt cầu nhỏ bé mới Năm 1857, nhà bác học Pháp Louis Pasteur (1822-1895) đã nghiên cứu khá sâu về men rượu Ông đã phát hiện ra qui luật khá lý thú là rượu vang và bia được bảo quản tốt có chứa những tế bào nấm men tròn nhỏ Còn nếu chất nước đó bị chua thì những tế bào nấm men bị kéo dài

ra Như vậy có hai loại nấm men: loại tạo thành rượu và loại làm rượu chua dần[1]

Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, trong nước, trong không khí, trên lương thực thực phẩm, hoa màu, ) Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu vì vậy được sử dụng để nấu bia, nấu rượu, sản xuất cồn, glycerin Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng lại giàu protein và vitamin Vì vậy còn được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người và gia súc Nấm men cũng được sử dụng để làm nở bột mì, tạo hương nước chấm, sản xuất một

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 11

số dược phẩm… và gần đây còn được sử dụng để sản xuất lipid Bên cạnh những nấm men có ích cũng có một số loài gây bệnh cho người và gia súc, hoặc có thể làn hư hỏng lương thực, thực phẩm…[1]

1.3 Hình thái tế bào và phân loại nấm men

biệt khác[2]

Một số tế bào nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những hình sợi gọi

là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả các tế

bào không nối liền với nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty

giả thường được quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…

Nhiều loài nấm men chỉ sinh khuẩn ty giả khi môi trường thiếu oxy[2]

Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp 5-10 lần vi khuẩn Kích thước trung bình của tế bào nấm men là chiều dài từ 9-10µm, chiều rộng 2-7µm Kích thước này cũng thay đổi tùy thuộc loài, giống, thời gian và điều kiện của môi trường sống…Trong môi trường lỏng rất nhiều nấm men có khả năng sinh ra một lớp màng

bao bọc giống tấm voan mỏng như Saccharomyces cerevisiae hoặc dày như Drojdiile micodermice Còn trong môi trường đặc, tế bào nấm men có nhiều dạng khác nhau,

nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc vàng nhạt, bề mặt tế bào thường khô và căng

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi[3]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 12

Ở một số loài nấm men thì vỏ tế bào có khả năng kết dính nên các tế bào nấm men

có thể kết lại với nhau Quá trình này gọi là sự kết lắng và có ý nghĩa lớn trong sản xuất bia và rượu vang Các tế bào nấm men dính với nhau sẽ nhanh chóng lắng xuống dưới đáy làm cho dịch lên men trong hơn gọi là men chìm Những tế bào nấm men không có khả năng kết lắng được gọi là men nổi.[7]

1.3.2 Phân loại nấm men

Phân loại nấm men là một công việc không đơn giản Từ trước đến nay đã có rất nhiều khoá phân loại nấm men của các tác giả khác nhau Theo khóa phân loại của Lodder (1971) nấm men được chia thành 39 giống:

1 Nấm men hình thành nang (túi): gồm 22 giống là: Citeromyces, Debaryomyces, Coccidiaseus, Dekkera, Endomycopsis, Hanseniaspora, Hansenula, Kluyveromyces, Lipomyces, Lodderomyces, Metschnikowia, Nadsonia, Nematospora, Pachysolen, Pichia, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Wickerhamia và Wingea

2 Các giống nấm men giả thuộc bộ Ustilaginales gồm hai giống là: Leucosporidium và Rhodosporidium

3 Các giống nấm men giả thuộc họ Sporobolomycetaceae gồm ba giống là: Bullera, Sporidiobolus và Sporobolomyces

4 Các giống nấm men không sinh bào tử không thuộc họ

Sporobolomycetaceae gồm 12 giống là: Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Oosporidium, Pityrosporum, Rhodotorula, Schizoblastosporion, Sterignatomyces, Torulopsis, Trichosporon, Trigonopsis

Trong số 39 giống nói trên một số giống chỉ có một loài

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 13

1.4 Đặc điểm về sinh lý, sinh hóa của nấm men

1.4.1 Lên men các nguồn cacbonhydrate

Khả năng lên men các nguồn cacbonhydrate của các loài nấm men không giống nhau, có loài lên men rất mạnh nhiều nguồn cacbonhydrate nhưng cũng có loài không lên men hoặc lên men yếu Vì vậy khả năng này được sử dụng để định danh nấm men

Để xác định khả năng lên men người ta thường khảo sát lượng CO2 từ nguồn cacbonhydrate nhưng cách phổ biến nhất là sử dụng ống Durham.[1]

1.4.2 Đồng hóa các nguồn cacbon

Kiểm tra đặc tính đồng hóa các nguồn cacbon là kiểm tra khả năng phát triển của nấm men trên môi trường chỉ chứa một nguồn cacbon như là nguồn năng lượng duy nhất Thử nghiệm này có thể được thực hiện trên môi trường rắn hoặc môi trường lỏng Tuy nhiên môi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hơn[1]

1.4.3 Đồng hóa các nguồn nitrogen

Nấm men có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen nhưng trong thử nghiệm kiểm tra đặc tính đồng hóa nguồn nitrogen người ta thường sử dụng: nitrate, nitrite, ethylamin hydrochloride, cadaverine, dihydrochloride, L-lysine, imidazole, glucosamine, creatine và creatinine như nguồn nitrogen duy nhất[1]

1.4.4 Phát triển trên môi trường áp suất thẩm thấu cao

Nồng độ đường hay muối cao trong môi trường tạo áp suất thẩm thấu gây ức chế khả năng tăng trưởng của một số loài nấm men Tuy nhiên cũng có một số loài nấm men có thể phát triển mạnh trên môi trường này [1]

 Môi trường có nồng độ đường cao

Có nhiều loài nấm men phát triển tốt trên môi trường có nồng độ glucose 40%, nhưng chỉ có vài loài có thể phát triển trên môi trường có nồng độ đường từ 50-70% Khả năng phát triển của nấm men trên môi trường có nồng độ đường cao được kiểm

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 14

tra bằng cách quan sát sự tăng trưởng của nấm men trên môi trường agar chứa 50% glucose và 60% glucose

 Môi trường có nồng độ muối cao

Phần lớn vi khuẩn mẫn cảm với nồng độ NaCl hơn nấm men, do vậy đây cũng là tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh

1.4.5 Phát triển ở các nhiệt độ khác nhau

Hầu hết các loài nấm men phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20-280

1.4.6 Sinh acid từ glucose

Một số loài nấm men có khả năng sinh acid làm tan CaCO3 Đặc điểm này được sử dụng để định danh nấm men bằng cách dựa vào vòng trong suốt quanh khuẩn lạc được cấy trên môi trường cacbonate agar [1]

1.4.7 Phân giải urê

Urease là enzyme chính được sinh ra từ nấm men để phân giải urê Urease xúc tác thủy phân urê cho khí amoniac (NH3) và cacbonate, sau đó cacbonate tạo thành acid cacbonic Phản ứng thủy phân này làm cho pH của môi trường tăng lên Vì vậy có chất chỉ thị màu phenol red môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ sang vàng.[1]

1.4.8 Phân giải gelatin

Một số loài nấm men có khả năng sinh enzyme gelatinase xúc tác thủy phân gelatin Sự thủy phân gelatin tạo ra cacbonhydrate tan cung cấp nguồn cacbon và năng lượng Hoạt tính thủy phân có thể được phát hiện dựa vào khả năng sinh enzyme xúc tác phân hủy gelatin tạo thành viền trong suốt.[1]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 15

1.5 Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men

Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men thay đổi tùy theo giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy [12]

Nấm men có chứa các thành phần dinh dưỡng sau:

- Protein chứa trong nấm men rượu chiếm khoảng 35-40% trọng lượng khô của nấm men và có chứa các acid amin không thể thay thế được (lysine, methionin, tryptophan) Về giá trị dinh dưỡng, protein nấm men tương đương với protein động vật nhưng cao hơn protein thực vật Dưới tác dụng của enzyme protease có sẵn trong nấm men, protein sẽ chuyển thành pepton, peptid và acid amin.[12]

- Glucid của nấm men chủ yếu là glycogen, đây là chất dự trữ của tế bào Trong quá trình trao đổi chất nói chung và quá trình dị hoá nói riêng, phân tử glucose đóng vai trò trung tâm Đó là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể sống Bình thường, glucose tích lũy dưới dạng polysaccharide (tinh bột, glycogen) Khi có nhu cầu, glucose sẽ được giải phóng rất nhanh từ nguồn dự trữ nói trên trong quá trình phân rã polymer dự trữ được xúc tác bởi enzyme và được điều hoà chặt chẽ, hợp lý Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất Trong nấm men còn chứa ecgosterin (tiền vitamin D), chất này dễ chuyển thành vitamin D dưới tác động của ánh sáng mặt trời.[12]

- Chất khoáng tuy chiếm số lượng ít nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của nấm men, đặc biệt là phospho Phospho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của acid nucleic Ngoài ra tế bào nấm men còn chứa các ion K, Ca, Mg, Fe, S và acid silic Lưu huỳnh có trong protein ở dạng –SH hoặc –S-S- Fe cùng với các chất vô cơ khác như: Zn, Mn, Cu, Mg… là những chất không thể thiếu đối với nhiều enzyme oxy hoá như: oxidase, catalase, peroxidase, Mg, S và P còn có tác dụng hoạt hoá enzyme phosphatase trong quá trình lên men Canxi giúp

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 16

loại bỏ các chất độc hại thải ra khi lên men, đẩy mạnh quá trình oxy hoá và có tác dụng tạo thành một số vitamin.[12]

Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin B1, có trong thành phần của coenzyme carboxylase Biotin và acid p-aminobenzoic là những chất kích thích tăng trưởng của nấm men Tế bào nấm men có chứa nhiều loại vitamin với hàm lượng khá cao nên hiện nay nấm men được xem là nguồn nguyên liệu quý trong sản xuất một số vitamin.[12]

1.6 Sinh khối nấm men

Từ cuối thể kỉ trước L.Pasteur (1958) và Duclaux (1864) đã phát hiện thấy nấm men có khả năng sinh sôi nảy nở trên môi trường có nguồn thức ăn N vô cơ.[10]

Năm 1915, Classen đã chứng minh có thể nuôi nấm men trong môi trường chứa 0,5-1% đường, một lượng nhỏ sulfat-amon Thuật ngữ “Men gia súc” (fodder yeast)

đã được nghiên cứu áp dụng.[10]

Người ta nhận thấy sinh khối nấm men có thể là nguồn bổ sung dinh dưỡng quan trọng trong chăn nuôi mà còn có thể bổ sung cho cả người Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, Đức đã dùng rộng rãi nấm men làm nguồn protein cho người khi bị bao vây kinh tế.[10]

Ngày nay người ta dùng thông dụng thuật ngữ “protein đơn bào” để chỉ dạng protein từ sinh khối nấm men Sinh khối nấm men được sản xuất trên cơ sở nuôi cấy nấm men trong môi trường phù hợp, đủ chất dinh dưỡng trong điều kiện hiếu khí, để nấm men sinh sản, phát triển mạnh mẽ, tăng nhanh chóng khối lượng tế bào và do vậy cũng tăng cao tổng lượng protein, vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B3, PP…) và một số chất khác - trong sinh khối tế bào

* Ý nghĩa của nhân sinh khối nấm men: [10]

Sản xuất sinh khối nấm men là tạo nguồn thức ăn giàu vitamin, protein và một

số chất khác bổ sung cho người và động vật Trong hoàn cảnh nhân loại thiếu protein,

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 17

điều này có ý nghĩa rất to lớn Nguồn protein thu từ nấm men có ưu việt là rất kinh tế Bởi vì nấm men phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng - so với các loại động vật nuôi- cho protit như cá, bò, heo, trâu, v.v…người ta gọi đó là “tốc độ siêu công nghiệp”

Năm 1963, sản lượng nấm men thế giới đã đạt 260 ngàn tấn, đến năm 1976 sản lượng nấm men thế giới đã đạt 2 triệu tấn.[9]

+ Ở Liên Xô cũ sản xuất 900 ngàn tấn/năm

sự ô nhiễm môi trường do nước thải này tạo ra.[10]

1.7 Ứng dụng của nấm men:

Nấm men có nhiều ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp như công nghiệp sản xuất cồn, sinh khối (thực phẩm, bánh mì, bổ sung trong thức ăn gia súc) và nhiều sản phẩm trao đổi chất khác Gần đây nấm men được dùng để sản xuất enzyme, vitamin, polysaccharide, carotenoid, polyhydric alcohol, lipid, glycolipid, acid citric, ethanol, khí cacbonic và các hợp chất được tổng hợp bằng cách tái tổ hợp DNA vào nấm men Trong các sản phẩm kể trên có nhiều sản phẩm được sản xuất với qui mô thương mại

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 18

1.7.1 Saccharomyces cerevisiae và các chủng nấm men khác được dùng

trong sản xuất ethanol

Có nhiều nấm men được dùng trong sản xuất ethanol, như là men bánh mì, men rượu và các chủng nấm men từ hạt ngũ cốc được dùng trong sản xuất rượu chưng cất Ngày nay, các chủng nấm men dùng trong sản xuất ethanol được cải tiến bằng cách biến đổi gen và hợp nhất tế bào trần để nâng cao năng suất của quá trình sản xuất Tuy nhiên, trước đây có một thời gian, việc sản xuất alcohol bằng vi sinh vật ít được sử dụng mà thay vào đó là phương pháp tổng hợp hóa học từ dầu Nhưng hiện nay xu hướng đã thay đổi Vào năm 1977, sản xuất alcohol bằng nấm men thấp hơn tổng hợp hóa học 20% Lượng alcohol sản xuất bằng sinh tổng hợp nấm men cao hơn 87% so với lượng ethanol tông hợp bằng phương pháp tổng hợp hóa học Hiện nay, người ta vẫn sản xuất ethanol từ nấm men với cơ chất là đường và tinh bột.[3]

Đối với nguồn nguyên liệu thực vật chứa cellulose và hemicellulose,

S.cerevisiae không thể thủy phân được, nhưng các loài nấm men khác như Candida lusitaniae và Pachysolen tannophilus có thể biến đổi cellobiose và xylose thành ethanol Inulin từ cây artichoke Jerusalem cũng được dùng lên men tạo ethanol nồng

độ 5-7% bởi Kluyveromyces marxianus, Torulaspora delbrueckii, Debaryomyces occidentalis và Torulopsis [3]

1.7.2 Enzyme trong công nghiệp

Enzyme của nấm men được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp gồm có

invertase dùng trong công nghiệp sản xuất kẹo và mứt (K.marxianus, Saccharomyces carlsbergensis, S.cerevisiae), -galactosidase (lactase) dùng trong sản xuất syrup từ sữa (Kluyveromyces marxianus nay là Kluyveromyces lactis) và -galatosidase sản xuất đường từ củ cải đường (S.pastorianus) Có nhiều loài nấm men sinh inulinase có khả

năng tạo fructose với hàm lượng cao từ inulin của cây artichoke Jerusalem và rau cải diếp xoăn.[8]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 19

1.7.3 Candida utilis dùng bổ sung trong thức ăn gia súc

Candida utilis được sử dụng để bổ sung trong thức ăn gia súc vì chúng có ưu

điểm là sử dụng cơ chất rẻ tiền, không cần bổ sung thêm vitamin Mặt khác, chúng có khả năng sử dụng được ammonium hay nitrate và đồng hóa được nhiều nguồn cacbon (trong đó có cả cellobiose và D-xylose), phát triển được ở 370C Do đó, có thể sử dụng

nước thải sunfite từ nhà máy giấy và dịch thủy phân gỗ làm tăng sinh khối C.utilus để

bổ sung vào thức ăn gia súc.[23]

1.7.4 Tạo ra các hợp chất có mùi thơm

Một số sản phẩm của nấm men được sử dụng trong công nghiệp hương liệu sản

xuất ethyl acetate và acetaldehyde (C.utilus), ester và các chất dễ bay hơi (Kluyveromyces lactic), monoterpen (Ambrosiozyma monospon) Ngoài ra, nấm men

trong sản xuất rượu vang Tây Ban Nha cũng tạo ra acetaldehyde và acid citric dùng trrong công nghiệp hương liệu cũng được sinh ra bởi nhiều loại nấm men và nấm mốc

Aspergillus niger.[23]

1.7.5 Nấm men sử dụng methanol

Nấm men Phaffia rhodozyma có tiềm năng trong công nghệ sinh học bởi vì

chúng chứa sắc tố carotenoid chủ yếu là astaxanthin, một sắc tố có màu thay đổi từ cam đến hồng của thịt cá hồi và hơi đỏ của vỏ loài giáp xác khi được nấu chín Cá hồi được nuôi bằng thức ăn có chứa sinh khối nấm men này sẽ tạo sắc tố, và phá vỡ tế bào

để giải phóng sắc tố giúp cá hồi hấp thu tốt hơn.[26]

Tế bào P.rhodozyma được phá vỡ vách bằng hỗn hợp enzyme NovozymTM234

từ Trichoderma harzianum hay là một phức -glucanase từ Bacillus circulans WL-12,

làm tăng phần dịch chiết và giá trị của carotenoid trong thức ăn của cá hồi.[26]

Tuy nhiên, một vấn đề được đặt ra là P.rhodozyma hoang dại chứa hàm lượng

sắc tố astaxanthin thấp (khoảng 350µg/g) Vì vậy, người ta làm tăng hàm lượng

astaxanthan của P.rhodozyma bằng cách gây đột biến với antimycin A, kết quả thu

được chủng nấm men chứa 1500µg astaxanthin/g nấm men Gần đây, hai công ty

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 20

thương mại đã tạo ra chủng P.rhodozyma với hàm lượng astaxanthin hơn 300µg/g,

làm cho hàm lượng sắc tố astaxanthin thu được từ nấm men có tính kinh tế hơn so với tổng hợp hóa học.[26]

1.7.6 Nấm men sản sinh riboflavin

Trong nuôi cấy nấm men không cần bổ sung thêm riboflavin (vitamin B2) bởi

vì hầu hết nấm men có khả năng sinh ra đủ riboflavin cần thiết cho sự phát triển của chúng và có một vài loài sinh ra vitamin này với số lượng trội hơn Sự tổng hợp

riboflavin với số lượng lớn được phát hiện thấy ở hai loài Eremothecium gossypii và Eremothecium ashbyi Eremothecium ashbyi được dùng để tạo ra riboflavin bổ sung vào thức ăn gia súc Bên cạnh đó, việc lai tế bào trần và gây đột biến Candida famata

đã tạo ra 20g/L riboflavin.[26]

1.7.7 Nấm men sinh acid citric

Vào cuối thập niên 60, nấm men Yarrowia lipolytia được phát hiện có khả năng sinh ra acid citric cao từ n-alkane, vì vậy chúng có thể cạnh tranh với Aspergillus niger Năm 1985, Phaff đã tìm ra các điều kiện sinh lý sinh hóa để sản sinh acid citric của Yarrowia lipolytia Những nghiên cứu gần đây chứng minh rằng Yarrowia lipolytia, Candida zelanoides và C.citrica có thể tạo ra acid citric từ dầu thực vật dưới

điều kiện hiếu khí.[23]

1.7.8 Nấm men sản sinh polysaccharide ngoại bào

Hầu hết polysaccharide được ứng dụng trong công nghiệp đều được sản xuất ra

từ vi khuẩn, nhưng một vài loại polymer được sản sinh từ nấm men dùng trong thực phẩm hay trong sản xuất công nghiệp.[7]

Nhiều loài của chi Pichia tạo ra một số lượng lớn polysaccharide ngoại bào từ glucose trong điều kiện hiếu khí P.capsulata có khả năng biến đổi 55% cơ chất thành

phosphomannas.[7]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 21

Một ví dụ thứ hai là Aureobasidium pullulans, nấm men đen, sinh ra glucan

pullulan Pullulan là polymer mạch thẳng được hình thành từ các đơn vị maltotriose bởi liên kết -1,6 Hiệu suất sinh pullulan từ sự thủy phân tinh bột ở nồng độ 10% là 75% Pullulan được sử dụng như nhân tố gây kết bông trong quá trình luyện kim, dùng làm thuốc bao trong thực phẩm và thuốc.[7]

1.7.9 Nấm men được dùng làm tế bào chủ để phát hiện DNA tái tổ hợp

Saccharomyces cerevisiae không gây bệnh cho con người, do đó protein dùng

trong dược phẩm và trong thực phẩm được tổng hợp từ nấm men này Những ưu điểm

của Saccharomyces cerevisiae là: (i) Tính ổn định cao của tế bào, không bị hoặc bị

ảnh hưởng rất ít bởi điều kiện bất lợi của môi trường (ii) Môi trường phát triển chứa ít protein ngoại bào dưới những điều kiện bình thường và tạo thuận lợi cho việc kiểm soát sự tiết ra các sản phẩm của gen tái tổ hợp DNA (iii) Nấm men khác với vi khuẩn

là nó có thể glyco hóa protein, điều này làm cho protein bền vững hơn (III)

Saccharomyces cerevisiae được dùng trong công nghiệp lên men từ rất lâu đời (v) Nấm men tiết protein ra môi trường ngoài tế bào nhiều hơn Escherchia coli.[17]

Một ví dụ về gen ngoại lai được dòng hóa trong Saccharomyces cerevisiae và

các sản phẩm được tiết ra bởi nấm men tái tổ hợp: interferon của người, -amylase của lúa mì, nhân tố phát triển biểu bì người, interleukin- của người, calcitonin, nhân tố giải phóng hormon tăng trưởng ở người, albumin huyết thanh người, nhân tố tăng trưởng insulin của người, prochymosin, insulin và somatostation Interferon- của người được tạo ra 5-10% tổng lượng protein của tế bào hemoglobin người, chiếm 2-3% tổng số protein.[17]

Ngày nay, với nhiều nghiên cứu các nhà khoa học đã chứng minh rằng, nấm

men methylotrophic như Pichia pastoris và Pichia angusta có nhiều ưu điểm hơn Saccharomyces cerevisiae khi làm tế bào chủ cho gen ngoại lai (i) Những loại nấm

men này có thể tăng trưởng ở mật độ tế bào cao (100-130 trọng lượng khô/L) (ii)

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 22

Chúng tạo ra sản phẩm protein ở mức cao (iii) Gen ngoại lai được chèn nhiều bản sao vào chromosome của nấm men methylotropic Tốc độ tăng trưởng và tạo sản phẩm

của các loài nấm men này cao P.pastoris với gen oxidase alcohol được chèn vào, sử

dụng cơ chất methanol tạo ra lượng oxidase alcohol chiếm 30% protein hòa tan.[17]

1.8 Khái quát quá trình lên men rượu

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng

sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2

Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

1.8.1 Cơ chế của quá trình lên men

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Do diện tích

bề mặt của tế bào nấm men lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng mạnh Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó được khuếch tán vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất mạnh vào trong môi trường

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 23

CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn Ở áp suất 800 mmHg, nhiệt độ 25o-30oC thu được khoảng 0,837-0,856 lít CO2/lít nước Vì thế CO2sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa Khi bão hòa CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí tạo ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi trên bề mặt Khi đến bề mặt, do

có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ làm cho khí CO2 phóng thích

ra ngoài Lúc này do khối lượng của tế bào nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình diễn ra liên tục nên tế bào nấm men chuyển từ trạng thái tĩnh sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng sự tiếp xúc giữa các tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn, khi đó sẽ làm gia tăng quá trình lên men

Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men đều ảnh hưởng đến quá trình thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men

1.8.2 Động học quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men, quan sát bằng cách theo dõi sự thay đổi hàm lượng rượu và CO2 tạo thành cũng như sự thay đổi trị số của nồng độ dịch lên men

Quá trình lên men chia làm 3 giai đoạn chính:

+ Giai đoạn đầu: nấm men tiếp xúc với dịch lên men Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

+ Giai đoạn lên men chính Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh và đạt cực đại

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 24

+ Giai đoạn cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời ổn định tạo mùi cho sản phẩm

Giai đoạn lên men chính là giai đoạn biến đổi sâu sắc các thành phẩn trong dịch lên men Ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men

9 CH3OH + 4H2O  (CH2COOH)2(OH)2 COOH + 6C2H5OH Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một aldehyt acetic:

2CH3COOH + CH3CHO  COOHCH2COOH + C2H5OH

 Sự tạo thành alcol cao phân tử

Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai (gọi chung là alcol cao phân

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 25

tử) Các alcol này tuy ít nhưng lẫn vào cồn etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu tới chất lượng sản phẩm Đó là các alcol propylic, isoamylic, amylic…chúng gây cho sản phẩm mùi hôi khó chịu

Các aldehyt cũng có thể ngưng tụ với nhau để tạo thành chất mới, vừa chứa nhóm –CHO vừa chứa nhóm –OH

CH3CHO + CH3CHO  CH3CHOHCH2CHO

1.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ lên men có ảnh hưởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lượng của sản phẩm

Nấm men phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 - 35oC, nấm men chịu được nhiệt độ khá rộng từ 1 - 45oC, nếu nhiệt độ quá 50oC thì nấm men sẽ chết

Nhiệt độ lên men cao, thời gian của quá trình lên men ngắn, độ cồn có thể thấp, đường sót còn nhiều và hương vị của sản phẩm có khi không tốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 26

 Ảnh hưởng của pH

Độ pH môi trường có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình lên men rượu Tuỳ thuộc vào sản phẩm thu được mà người ta điều chỉnh pH môi trường cho thích hợp Nấm men có thể phát triển trong môi trường pH từ 2 - 8 nhưng vùng tối thích của nấm men là pH từ 4 - 6

 pH môi trường acid thì sản phẩm thu được là rượu etylic

 pH môi trường acid yếu thì sản phẩm thu được là rượu etylic và glyxerin

 pH môi trường kiềm yếu thì sản phẩm thu được là rượu etylic, acid axetic và glyxerin

 Ảnh hưởng của độ rượu

Rượu được tích tụ dần trong dịch lên men và chính nó lại là chất độc kìm hãm các nấm men Nấm men chịu nồng độ cồn từ 8 ÷ 12 %, từ 16 ÷ 18 % đại đa số nấm men bị ức chế Nếu nồng độ cồn quá cao sẽ ức chế tất cả các nấm men

Khả năng chịu cồn của nấm men là nồng độ cồn ức chế sự phát triển và hoạt động của nấm men sau 72 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30o

C

Tuỳ theo khả năng chịu được nồng độ cồn khác nhau mà người ta sản xuất ra các sản phẩm khác nhau

 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Tất cả nấm men chỉ có khả năng lên men các đường đơn giản như đường đơn (glucose, fructose) và đường đôi (maltose, saccarose) riêng đường lactose chỉ có nấm

men Saccharomyces lactic sử dụng được Nấm men hoàn toàn không có khả năng

thủy phân các loại đường đa

Nồng độ đường thích hợp nhất cho quá trình lên men rượu từ 8 ÷ 20% Khi nồng độ đường lớn hơn 25% sẽ ức chế quá trình lên men rượu Tuỳ thuộc vào sản phẩm của quá trình lên men mà người ta sử dụng nồng độ đường thích hợp Trong sản

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 27

xuất cồn người ta sử dụng nồng độ đường từ 14 ÷ 20%, quá trình lên men xảy ra mạnh

và hết lượng đường sau đó người ta chưng cất để thu cồn Đối với việc sản xuất rượu vang người ta sử dụng nồng độ đường từ 16 ÷ 25% và dùng nấm men chìm, nên quá trình lên men chậm và sau khi lên men vẫn còn một lượng đường trong rượu vì vậy rượu vang thường có vị ngọt Còn trong sản xuất bia thường dùng nồng độ đường từ 9

÷ 12%

 Ảnh hưởng của số lượng tế bào nấm men

Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn Nếu lượng tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm; nếu sinh khối tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ chất dinh dưỡng cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần, sản phẩm sinh ra mùi lạ, vị lạ đồng thời phí đi một lượng đáng kể men không có ích

Vì vậy khi có mặt của oxy sẽ kiềm hãm quá trình lên men rượu

Hiệu ứng Pasteur: là sự ức chế quá trình lên men rượu khi có mặt của oxy Sự chuyển từ lên men sang hô hấp ngoài việc giảm hiệu suất tạo thành rượu và khí cacbonic và giảm hiệu suất sử dụng đường

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 28

Vì vậy giai đoạn đầu của quá trình lên men cần thông khí vào môi trường để kích thích nấm men sinh trưởng tăng sinh khối sau đó không cần oxy nữa để tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men rượu đạt hiệu suất cao nhất

1.9 Các bài báo khoa học trong và ngoài nước nói về nghiên cứu lên

men rượu thốt nốt:

Nghiên cứu của tác giả Frank N I Morah (Khoa Hóa, Đại Học Calabar, Calabar, Nigieria) trình bày về ảnh hưởng của ion metabisulfit đối với nồng độ ethanol trong quá trình lên men rượu thốt nốt Tỷ lệ ethanol trong rượu thốt nốt tăng hơn 20% khi quá trình lên men xảy ra với sự có mặt của ion metabisulfit Vì vậy nghiên cứu này đề nghị sử dụng natri metabisulfit để tăng sản lượng ethanol trong suốt quá trình lên men.[15]

Bảng 1.1: Ảnh hưởng của Na 2 SO 3 lên sự tạo thành ethanol trong rượu thốt nốt [15]

Bảng 1.1 cho thấy quá trình lên men rượu thốt nốt với sự hiện diện của các ion metabisulfit dẫn đến việc gia tăng nồng độ ethanol trong rượu vang Do các ion metabisulfit có tính sát khuẩn và diệt nấm tốt (Tolly, 1971) giúp cho quá trình lên men ethanol tăng hiệu suất cao và hạn chế được quá trình lên men acetic hay lactic [15]

Quan sát từ bảng 1.1 cũng cho thấy kết quả rằng sự gia tăng trong nồng độ của natri metabisulfit trên 480 mg/L (tức là khoảng 323 mg/L SO2) dẫn đến sự giảm sút

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 29

lượng ethanol trong rượu thốt nốt Sự gia tăng tính acid thông thường của quá trình lên men rượu thốt nốt theo thời gian cũng đã được chứng minh là ở một mức độ tối thiểu của ion metabisulfit (Morah 1986), cho thấy sự loại bỏ đáng kể hoạt động của

các chủng vi khuẩn Acetobacter Vì vậy, có thể suy ra rằng các ion metabisulfit hay

sulfur dioxit có một số tác dụng lên men rượu thốt nốt Tuy nhiên, mức độ ion metabisulfit cần thiết để làm giảm sự tăng trưởng và hoạt động của men rượu thốt nốt

là trên 200 mg/L [15]

Bài báo của tác giả T R Shamala and K R Sreekantiah (Cục Vi Sinh Vật và Vệ Sinh, Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Thực Phẩm Trung Ương, Mysore 570 013, Ấn độ) nghiên cứu về các vi sinh vật lên men ethanol từ dịch thốt nốt tự nhiên là: nấm

men Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Acetobacter aceti, vi khuẩn axêtic hóa rancens, vi khuẩn acetic hóa suboxydans, Leuconostoc dextranicum,

bên cạnh đó còn có cầu khuẩn gram dương trong các khuẩn lạc sp, Pediococcus sp.,

khuẩn hình que và hạt kê sp được tìm thấy trong nhựa cây tươi [17]

Leuconos-toc sp., Streptococcus sp và Lactobacillus sp được tạo ra trong giai

đoạn đầu của quá trình lên men Acid lactic được tạo ra nhờ vi khuẩn làm giảm nhanh chóng độ pH của nhựa cây từ khoảng 1k,2 xuống còn 5,5 trong vòng 8 giờ (Bassir,

1967; Okafer, 1975) Ở giai đoạn này, hoạt tính của men (Saccharomyces cerevisiae)

trở nên mạnh mẽ hơn và nồng độ ethanol tăng nhanh chóng lên 5% (v/v) Độ pH từ từ giảm dần còn 4,3 ÷ 4,0, do hoạt động của vi sinh vật trong đó có vi khuẩn acid lactic [17]

Các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men dịch thốt nốt là Saccharomyces cerevisiae (BYA, pH 5-5), Bacillus sp (NA), Schizosaccharomyces pombe (BYA, 3-5), Acetobacter rancens (BYA, 3-5), Acetobacter aceti (BYA, 3-5), Acetobacter suboxydans (GYA), Leuconostoc dextranicum (PSA), Pediococcus sp (BYA, 3-5), Micrococcus sp (NA) và Sarcina sp (NA) Theo Swings và De Ley (1977) thì Zymomonas sp Là nhân tố chủ yếu tạo ra ethanol và cacbon dioxit trong quá trình lên men rượu thốt nốt Mặc dù Zymomonas mobilis được tìm thấy ở các mẫu rượu thốt nốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 30

lấy từ thị trường địa phương và dịch thốt nốt lấy từ cây thốt nốt ở vùng khác trong nước, vi sinh vật này không được tìm thấy trong các mẫu sử dụng thí nghiệm Ethanol

tạo ra vi sinh vật tìm thấy trong nghiên cứu là S cerevisiae và Sch pombe Okafer

(1978) đã báo cáo rằng các chủng loại và số lượng vi sinh vật tìm thấy trong các quá trình lên men rượu thốt nốt rất khác nhau và thậm chí khác nhau ở cây này so với cây kia Mặc dù quan sát từ các mẫu khác nhau, vẫn có một số đặc điểm chung như vi sinh

có khả năng tạo ra acid lactic, ethanol và acid acetic được tìm thấy trong khi lên men nhựa và sản phẩm truyền thống có hương vị và mùi vị đặc trưng [17]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 31

Hình 1.7 Sự phát triển của vi sinh vật trong nước thốt nốt tươi lên men (O), nhựa tươi

(x) và nhựa tươi không có tế bào lên men được kết tinh với toddy tươi (•) [17]

Những dữ liệu được ghi lại cho thấy những thay đổi vi sinh vật học và hóa sinh xuất hiện trong quá trình lên men dịch thốt nốt rừng theo phương pháp truyền thống và những nguyên nhân có thể làm hỏng nhựa tươi Họ cũng cho thấy khả năng cấy thêm dịch thốt nốt tươi để giúp cho quá trình lên men nhựa tươi (sau khi thu thập) và điều này có thể kéo dài thời gian bảo quản của rượu [17]

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 32

Bài báo của tác giả JD Atputharajah, S Widanapathiranaf và U Samarajeewai đã nghiên cứu về số lượng vi khuẩn và nấm men có trong nước thốt

nốt tươi và định danh được các loài vi khuẩn, nấm men có sẵn trong nước thốt nốt

HVTH: Nguyễn Thị Minh Ngọc Trang 33

chủng nấm men thuộc về 8 loại trong đó có 120 chủng được xác định thuộc về loại

Candida, Pichia và Sacchromyces Trong đó Saccharomyces chevalieri chiếm đa số

Nó được quan sát thông qua quá trình lên men và ước tính có khoảng 35 % tổng số

nấm men được phân tách Có 4 loại Candida và 5 loại Pichia chiếm 22 % và 16 %

tương ứng với tổng số men được phân tách [18]

Một nghiên cứu về nấm men trong quá trình lên men dịch thốt nốt từ các vùng khác nhau ở Sri Lanka Jayatissa (1978) công bố có 17 chủng thuộc về 5 loại Ở đây

Saccharomyces cũng là một loại nổi trội Saccharomyces chevalieri được báo cáo là

loại nổi trội trong dịch thốt nốt lên men tại Philipin (Yamagata, 1980) [18]

Trong dịch thốt nốt, Saccharomyces chevalieri xuất hiện sinh vật lên men nổi trội Saccharomyces chevalieri khác với Saccharomyces cerevisiae ở chỗ không có

khả năng lên men mantozo Người ta cho rằng sự lên men maltose đạt được là do

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces chevalieri được mô tả là sinh vật nửa bền hoặc tạm thời trong sự phát triển Saccharomyces cerevisiae (Lodder 1970) Một điều

lưu ý thú vị là dịch thốt nốt không có dấu hiệu của mantozo (Bảng 1.3) [18]

Bảng 1.3: Các loại đường có trong nước thốt nốt

Trong số các men được phân tách, các loại như là Pichia ohmeri, Pichia membranaefaciens, Candida valida và Candida parapsilosis được tìm thấy ở các giai