Cố định enzyme lactase trên chất mang alginate cmc và khảo sát tính chất của chế phẩm thu được

Khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme lactase cố định : - Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lactase cố định - Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme lactase cố định - Ả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

MAI THỊ HẢI ANH

CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE TRÊN CHẤT

TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: MAI THỊ HẢI ANH MSHV: 10110168 Ngày, tháng, năm sinh: 20/10/1984 Nơi sinh: Nghệ An Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống Mã số: 605402

I TÊN ĐỀ TÀI:

“CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE TRÊN CHẤT MANG ALGINATE-CMC

VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Khảo sát quá trình cố định enzyme lactase trong chất mang alginate-CMC (Carboxyl methyl cellulose):

- Tỷ lệ về khối lượng alginate/CMC (w/w),

- Tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w)

2 Khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme lactase cố định :

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lactase cố định

- Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme lactase cố định

- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường lactose của lactase cố định

- Xác định các thông số động học của enzyme lactase tự do và cố định

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy – PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn, người đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo môi trường học tập và nghiên cứu khoa học trong thời gian tôi theo học tại trường

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sĩ

Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình đã ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như luôn động viên, cổ vũ tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn làm việc tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm đã đồng hành và chia sẻ, giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tp Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 03 năm 2012

Mai Thị Hải Anh

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Cố định lactase trong chất mang alginate-CMC làm tăng hiệu suất cố định và hoạt tính của enzyme cố định khi so với chất mang truyền thống (alginate) Hiệu suất cố định đạt được cao nhất là 70,23% khi tỷ lệ về khối lượng alginate/CMC là 1.5, tỷ lệ về khối lượng chế phẩm enzyme/chất mang

là 0.2 Sự cố định lactase trong chất mang alginate-CMC không làm thay đổi giá trị nhiệt độ tối ưu và pHopt so với enzyme tự do (550C và pH 4.5) Tuy nhiên, lactase cố định bền nhiệt và bền pH hơn so với lactase tự do và lactase cố định trong gel alginate Ở nhiệt độ 550C thời gian bán hủy của enzyme cố định trong chất mang alginate-CMC là 315 phút trong khi lactase

cố định trong gel alginate truyền thống và enzyme tự do có thời gian bán hủy lần lượt là 248 phút và 139 phút Ở pH 6.5, hoạt tính lactase cố định trong gel alginate/CMC là 44.59% so với giá trị hoạt tính cực đại, trong khi hoạt tính của lactase cố định trong gel alginate và enzyme tự do chỉ lần lượt

là 36.99% và 26.58% so với giá trị cực đại

Chúng tôi nhận thấy, khi cố định lactase trong gel alginate và CMC thì làm tăng hằng số Km lên 1.36 và 1.46 lần so với enzyme lactase tự

alginate-do Việc bổ sung CMC cũng làm tăng nhẹ hệ số Km của lactase cố định so với khi không bổ sung CMC Đồng thời, vận tốc phản ứng cực đại Vm giảm

từ 105(µM/ph) ứng với lactase tự do xuống còn 75 và 85(µM/ph) tương ứng với lactase cố định trong gel alginate-CMC và gel alginate

ABSTRACT

Immobilizezation of lactase in alginate-CMC carrier increased the yield

of protein fixation and the catalytic activity in comparison with enzyme immobilization in conventional carrier (alginate gel) The highest protein immobilization achieved 70.23% when the weight ratio of alginate/CMC was 1.5 (w/w) and the weight ratio of enzyme/alginate-CMC mixture was 0.2 (w/w) The immobilization of lactase did not change the optimum temperature and pH of the biocatalyst (Topt: 550C and pH: 4.5) However, the immobilized lactase was more stable at high pH and temperatures than the free enzyme At 550C, the half-life of immobilized lactase in alginate-CMC gel was 315 minutes while the half-life of immobilized lactase in alginate gel and of free enzyme is 248 minutes and 139 minutes, respectively At pH 6.5, the relative activity of immobilized lactase in alginate/CMC gel was 44.59% of maximum activity value, while that of immobilized lactase in alginate gel and of free enzyme was 36.99% and 26.58% of maximum

The constant Km increased to 1.36 and 1.46 times for the fixed lactase

in calcium alginate gel and alginate-CMC gel, respectively in comparison with that of the free enzyme The addition of CMC to alginate gel slightly increased Km The maximum reaction rate, Vm of the free lactase decreased from 105 (μM/min) to 75 and 85 (μM/min) when the enzyme was fixed in alginate-CMC and alginate gel, respectively

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Enzyme lactase 3

2.2 Kỹ thuật cố định enzyme 6

2.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định 6

2.2.2 Các phương pháp cố định enzyme lactase 6

2.2.3 Tính chất của enzyme lactase cố định 9

2.2.4 Chất mang alginate và carboxylmethyl cellulose (CMC) 13

Chương 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1 Nguyên liệu và hóa chất 23

3.2 Sơ đồ nghiên cứu 24

3.3 Bố trí thí nghiệm 24

3.4 Phương pháp cố định lactase trong gel alginate-CMC 28

3.5 Phương pháp phân tích 28

3.6 Công thức tính toán 31

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Nghiên cứu cố định lactase trong chất mang alginate-CMC 34

4.1.1 Xác định tỷ lệ alginate/CMC 34

4.1.2 Xác định tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w) 38

4.2 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định trong chất mang alginate-CMC 40

4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định 40

4.2.1.1 Xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme lactase cố định 40

4.2.1.2 Xác định độ bền nhiệt của enzyme lactase cố định 42

4.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cố định 45

4.2.2.1 Xác định pH hoạt động tối ưu của enzyme lactase cố định 45

4.2.2.2 Xác định độ bền pH của enzyme lactase cố định 47

4.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường lactose của lactase cố định 49

4.2.4 Xác định thông số động học của enzyme tự do và enzyme cố định 52

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Alginate/CMC đến hiệu suất cố định protein và hoạt tính lactase sau cố định 34 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w) đến hiệu suất cố định protein và hoạt tính enzyme lactase cố định 38 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố định 40 Bảng 4.4 Thời gian bán hủy và hệ số ức chế k của enzyme lactase tự do và cố định trong chất mang alginate-CMC và alginate ở ba nhiệt độ khác nhau 45 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố định 45 Bảng 4.6 Thời gian bán hủy và hệ số ức chế k của enzyme lactase tự do và cố định trong chất mang alginate-CMC và alginate ở ba giá trị pH khác nhau 49 Bảng 4.7 Nồng độ dung dịch đường glucose trong dung dịch phản ứng thủy phân đường lactose bởi xúc tác lactase tự do và lactase cố định sau 15 phút phản ứng 50 Bảng 4.8 Giá trị Km và Vm của enzyme tự do và cố định 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Mô hình trung tâm xúc tác của β–galactosidase từ A oryzae 3

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân đường lactose với xúc tác lactase 3

Hình 2.3 Phương pháp bẫy enzym 6

Hình 2.4 Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị 7

Hình 2.5 Phương pháp cố định bằng liên kết chéo 7

Hình 2.6 Cấu hình của 2 gốc monomer trong phân tử acid alginic 13

Hình 2.7 Các dạng phân đoạn trong phân tử acid alginic 15

Hình 2.8 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp 16

Hình 2.9 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 16

Hình 2.10 Cấu tạo phân tử CMC 20

Hình 2.11 Cấu tạo phân tử CMC có DS bằng 1 20

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 24

Hình 3.2 Enzyme được nhốt trong hạt gel alginate sau khi cố định 28

Hình 3.3 (a) Công thức cấu tạo hóa học của Coomassie Brilliant Blue G-250, (b) Phổ hấp thu ánh sáng của Coomassie Brilliant Blue khi không liên kết (đường màu đỏ) và khi liên kết với protein (đường màu xanh) 29

Hình 3.4 Cơ chế định lượng protein bằng thuốc thử Bradford 29

Hình 4.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ alginate/CMC đến hiệu suất cố định (trái) và hoạt tính của lactase cố định (phải) 34

Hình 4.2 Hình SEM quan sát hình thái bề mặt và mặt cắt hạt gel 37

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w) đến hiệu suất cố định protein và hoạt tính của lactase cố định 39

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố định 41

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của lactase tự do, lactase cố định trong gel alginate-CMC và lactase cố định trong gel alginate ở 550C, 600C, 650C 43

Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lactase tự do và cố định 46 Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của lactase tự do, lactase cố định trong gel alginate-CMC, lactase cố định trong gel alginate 48

ở pH 4.5, pH 5.5, pH 6.5 48 Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn nồng độ dung dịch đường glucose trong dung dịch phản ứng thủy phân đường lactose bởi xúc tác lactase tự do và lactase cố định sau 15 phút phản ứng 51

Hình 4.9 Đồ thị Lineweaver-Burk của lactase tự do và cố định 53

PVA: Polyvinyl alcohol

SEM: Scanning Electron Microscope

Topt: Nhiệt độ tối ưu

U: Unit

Vm: Vận tốc cực đại

Chương 1 GIỚI THIỆU

Lactase (β-Galactosidase) là chế phẩm enzyme quan trọng trong công nghiệp để thủy phân đường lactose trong sữa và whey Một số người tiêu dùng không thể tiêu hóa được đường lactose có trong sản phẩm sữa do cơ thể của họ thiếu enzyme lactase thủy phân loại đường này Ngoài ra, chế phẩm lactase còn được sử dụng trong sản xuất các galacto-oligosaccharide là một prebiotic có lợi cho sức khỏe

Chế phẩm enzyme lactase đã được sử dụng với quy mô lớn ở dạng tự do

và cố định Tuy nhiên, enzyme lactase cố định tỏ ra ưu việt hơn enzyme lactase

tự do Đó là do:

- Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ enzyme chống lại các ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng độ cơ chất cao, sự thay đổi pH, nhiệt

độ, sự có mặt của các chất ức chế như galactose, ion kim loại…

- Khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme cố định rộng hơn, nhờ đó cải thiện khả năng ứng dụng của chế phẩm trong thực tiễn

- Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng, do đó giảm chi phí về thiết bị và năng lượng

- Có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần trong khi vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học ổn định

- Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục

Bên cạnh những yêu cầu chung của một chất mang như thân thiện với môi trường, kĩ thuật cố định đơn giản, bền và có khả năng tái sử dụng tốt thì chất mang cần có giá thành thấp và dễ tìm để góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế cho quy trình sản xuất

Alginate là một chất mang phổ biến, được ứng dụng nhiều để cố định enzyme và tế bào vi sinh vật Bên cạnh những ưu điểm như phương pháp cố định đơn giản, rẻ tiền thì độ bền cơ học và hiệu quả cố định enzyme lactase trong chất mang này chưa cao, đặc biệt là có sự thất thoát protein enzyme trong quá trình hình thành gel (Dashevsky, 1998; Bakken và cộng sự, 1992; Champluvier và cộng sự, 1988)

Cellulose và dẫn xuất của nó như carboxylmethyl cellulose (CMC), Diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), triacetate cellulose, diacetate cellulose… được sử dụng rộng rãi làm chất mang để cố định tế bào vi sinh vật

và enzyme do tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ

Phương pháp tạo gel gồm hỗn hợp của cellulose và các polymer tự nhiên khác được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian gần đây vì dễ thực hiện, chi phí thấp và có thể tạo ra những chất mang có cấu trúc mới (Bakken và cộng

sự, 1992)

Trong luận văn này, chúng tôi thử kết hợp CMC cùng alginate làm chất mang mới dạng gel để cố định enzyme lactase Chúng tôi sẽ so sánh hoạt tính enzyme lactase cố định trên chất mang mới (alginate-CMC) và hoạt tính lactase

cố định trên chất mang truyền thống (alginate) để đánh giá khả năng sử dụng hỗn hợp alginate và CMC làm chất mang trong lĩnh vực cố định enzyme và ứng dụng enzyme cố định trong công nghệ thực phẩm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Enzyme lactase

Enzyme lactase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên: động vật, thực vật

và vi sinh vật Các chế phẩm lactase hiện nay chỉ được thu nhận từ vi sinh vật

Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme lactase gồm có vi khuẩn (E.coli…), nấm men (Kluyveromyces lactics…) và nấm mốc (A oryzae, A niger…) (Parmjit và

cộng sự, 2010)

Danh pháp: Mã enzyme lactase: 3.2.1.23 (3 - Hydrolases, 2- Glycosylases,

1 - Glycosidases , 23 - Lactase hoặc beta-galactosidase)

Hình 2.1 Mô hình trung tâm xúc tác của β–galactosidase từ A oryzae

Enzyme lactase xúc tác phản ứng thủy phân cắt liên kết β-glycoside trong lactose thành 2 monosaccharide là galactose và glucose

Hình 2.2 Phản ứng thủy phân đường lactose với xúc tác lactase

Một vài lợi ích chính của sự thủy phân lactose:

Lợi ích về mặt sức khỏe: Những người thiếu β-galactosidase trong ruột non

không tiêu hóa được lactose trong các sản phẩm sữa Vấn đề này sẽ được khắc phục nếu lactose trong sản phẩm sữa đã được thủy phân bởi β-galactosidase để tạo thành đường glucose và galactose (Garrett và cộng sự, 2002) Một thuận lợi khác là khi thủy phân lactose sẽ kèm theo sự hình thành đồng thời của galacto-oligosaccharides (GOS), được xem là thành phần prebiotic

Lợi ích trong công nghệ thực phẩm: Hàm lượng lactose cao trong các sản

phẩm sữa như kem, sữa cô đặc và một số sản phẩm tráng miệng từ sữa có thể làm xuất hiện các tinh thể lactose như các hạt sạn trong sản phẩm Việc dùng β-galactosidase sẽ ngăn ngừa sự kết tinh của các phân tử đường lactose, do đó cải thiện các chỉ tiêu hóa lý và cảm quan của các sản phẩm sữa như tăng khả năng tiêu hóa, tăng tính đồng nhất…Ngoài ra, sự thủy phân lactose trong whey,

sẽ biến đổi whey thành syrup và có thể được dùng trong các ngành công nghiệp bánh kẹo, thức uống không cồn hoặc có cồn nhẹ (Parmjit và cộng sự, 2010) Các chế phẩm enzyme lactase từ những loài vi sinh vật khác nhau sẽ có những tính chất khác nhau Bảng 1.1 tổng hợp các tính chất quan trọng của enzyme lactase từ các loài vi sinh vật khác nhau (Otieno, 2010)

5

Bảng 2.1 Các tính chất của β-galactosidase từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

pH opt Topt Km (mM) M kD Nấm mốc

Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

3.5 5.0

37

30

60

35 0.23-0.99 (0NPG)

800 2.6 41.7

Na+, K+

- EDTA

2.2 Kỹ thuật cố định enzyme

2.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định

Các enzyme không tan là những enzyme bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2009)

Các yêu cầu của quá trình cố định enzyme

Hiệu suất cố định và hoạt tính enzyme sau khi cố định càng cao càng tốt Enzyme cố định có hoạt tính ổn định cao để có thể sử dụng được nhiều lần, giảm chi phí sản xuất

Enzyme cố định có giá thành phù hợp (Cao, 2005)

2.2.2 Các phương pháp cố định enzyme lactase

Bốn nhóm phương pháp cố định enzyme lactase:

Phương pháp hấp phụ: enzyme được gắn với giá thể nhờ hấp phụ vật lí trên

bề mặt giá thể Phương pháp này dựa trên sự tương tác vật lý giữa chất xúc tác sinh học và chất mang bằng các liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực Van der Waals…

Phương pháp bẫy: enzyme được nhốt trong một cấu trúc như mạng lưới gel hay màng polymer nhằm ngăn chặn sự giải thoát protein enzyme ra bên ngoài cấu trúc đó nhưng vẫn cho phép cơ chất hoặc sản phẩm đi qua

Hình 2.3 Phương pháp bẫy enzyme (Cao,2005)

Phương pháp cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa enzyme và chất mang trong các điều kiện ôn hòa

Hình 2.4 Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị (Cao,2005)

Phương pháp cố định bằng liên kết chéo: là sự liên kết giữa các phân tử enzyme khi có mặt hoặc không có mặt các tác nhân hóa học làm tay nối

Hình 2.5 Phương pháp cố định bằng liên kết chéo

Một số phương pháp và chất mang để cố định chế phẩm lactase được thu nhận từ các nguồn vi sinh vật khác nhau được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các phương pháp và chất mang cố định enzyme lactase (Parmjit

và cộng sự, 2010)

Phương pháp Nguồn thu β-galactosidase Chất mang

Hấp phụ

K fragilis và K lactis

A.oryzae

A oryzae

E.coli

B circulans

B stearothermophilus Chitosan Nhựa Phenol-formaldehyde Polyvinyl chloride và màng Silica

Chromosorb-W Polyvinyl chloride và Silica Chitosan

A niger

K fragilis

K fragilis

K lactis Thermus sp T2

K fragilis

A oryzae Pisum sativum

Đá ceramic Hạt Chitosan Chitosan CPC-silica và agarose PEI- sepabeads, DEAE-agarose Hạt cellulose

Celite và chitosan Sephadex G-75 và hạt chitosan

Bẫy

K bulgaricus

E coli

A oryzae Thermus aquaticus YT-1

A oryza Penicillium expansum F3

K lactis, A oryzae, Saccharomyces cerevisiae

Gel alginate sử dụng BaCl3Gel polyacrylamide Nylon-6 và zeolite Hạt agarose Spongy polyvinyl alcohol cryogel Calcium alginate

Gelatin Thiosulfinate/thiosulfonate Eupergit C(Spherical acrylic polymer) Silica-alumina

Bề mặt graphite Hạt chitosan và màng nylon Vải cotton hoạt hoá bởi tosyl chloride Amino-epoxy sepabead

Sợi cotton Polysiloxane-polyvinyl alcohol Silica

Gel polyvinylalcohol và Fe 3 O 4 -chitosan

2.2.3 Tính chất của enzyme lactase cố định

2.2.3.1 Hoạt tính xúc tác của enzyme lactase cố định

Các nghiên cứu về enzyme cố định nói chung và enzyme lactase nói riêng đều cho thấy hoạt tính của enzyme cố định thấp hơn so với enzyme tự do, ví dụ như:

Makkar và cộng sự (1981) đã cố định enzyme β-galactosidase từ

Lactobacillus bulgaricus trong gel polyacrylamide, hoạt tính của enzyme cố

định chỉ đạt 31% so với hoạt tính của enzyme tự do

Benevides và cộng sự (2007) cố định lactase từ E coli lên các chất mang

khác nhau và thấy rằng hiệu suất cố định đều đạt 100% Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme cố định cao nhất là ở chất mang sepharose được hoạt hóa bởi BrCN, hoạt tính chỉ đạt 95% so với enzyme tự do Và hoạt tính lactase cố định thấp nhất là ở chất mang agarose được hoạt hóa bởi polyethyleneimine (PEI),

sử dụng tay nối glutaraldehyde, hoạt tính chỉ bằng 55% so với enzyme tự do

Nguyên nhân xảy ra hiện tượng giảm hoạt tính của enzyme khi cố định trên chất mang có thể là do:

Khi gắn enzyme vào chất mang, dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất mang, cấu hình của phân tử enzyme sau khi cố định bị thay đổi làm cho khả năng xúc tác của enzyme cũng bị thay đổi

Khi gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, một số hóa chất

sử dụng trong quá trình cố định có thể làm vô hoạt bất thuận nghịch enzyme Tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã cố định làm biến đổi một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó hoạt độ xúc tác cũng giảm

Đối với trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt trong khuôn gel, sự có mặt của chất mang có thể hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme (nhất là đối với các cơ chất có kích thước phân tử lớn), do đó hoạt lực của enzyme cố định bị giảm đi (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004; Bailey và cộng

sự, 1986)

2.2.3.2 Động học của enzyme lactase cố định

Động học của enzyme cố định cũng là một vấn đề rất được quan tâm khi nghiên cứu về enzyme cố định Kết quả của hầu hết các nghiên cứu về enzyme lactase cố định cho thấy động học phản ứng thủy phân lactose bằng lactase cố định cũng tuân theo định luật Michaelis-Menten Đa số enzyme cố định có hệ số

Km lớn hơn enzyme tự do

Tanriseven và cộng sự (2002) đã cố định lactase từ A oryzae trong hệ gel

alginate-gelatin Hằng số Km của enzyme tự do và cố định lần lượt là 42mM và 51mM Vm của enzyme tự do và cố định lần lượt là 1.30 và 0.73 (mg glucose/phút.mg enzyme)

Grosova và cộng sự (2008) đã cố định lactase từ A oryzae trong gel

polyvinyl alcohol (PVA) và thấy rằng giá trị Km của enzyme lactase cố định là 71mM, giá trị Km của enzyme tự do là 61mM

2.2.3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính của enzyme lactase cố định

- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm

Enzyme lactase cố định cũng như enzyme lactase tự do bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các chất ức chế có mặt trong môi trường phản ứng như urea, đường galactose, muối calcium chloride, các protease như tripsin, pepsin…Tuy nhiên, enzyme lactase cố định tỏ ra bền hơn dưới tác dụng của các chất ức chế Tác giả Haider và cộng sự (2009) đã khảo sát tác dụng ức chế enzyme của dung dịch ure nồng độ 4.0M β-galactosidase tự do mất gần như hoàn toàn hoạt tính sau 2h ở 370C; trong khi đó, β-galactosidase cố định vẫn còn 64% hoạt tính

so với ban đầu

Cũng trong nghiên cứu của tác giả này, hoạt tính của β-galactosidase tự do

sẽ bị giảm 72% trong dung dịch có 5.0% galactose sau 1h ở 370C; trong khi đó, hoạt tính của β-galactosidase cố định chỉ bị giảm đi 35% trong điều kiện tượng tự Haider và cộng sự (2009) cũng khảo sát tác dụng ức chế enzyme của dung dịch calcium chloride Khi xử lí lactase tự do với dung dịch 5.0% calcium chloride trong 1h ở 370C sẽ làm giảm 58% hoạt tính của nó; trong khi đó, hoạt

tính enzyme cố định trên chất mang immunoglobulin-cellulose theo phương pháp hấp phụ sinh học đặc hiệu chỉ bị giảm đi 29% so với ban đầu

Ngoài ra, tác giả này cũng đã khảo sát ảnh hưởng của các protease đến hoạt tính của enzyme lactase Enzyme lactase cố định trên chất mang immunoglobulin-cellulose còn 85% và 79% hoạt tính tương ứng khi cho enzyme tiếp xúc với dung dịch trypsin và pepsin với nồng độ 1.0mg/mL trong thời gian 1h Ngược lại, lactase tự do chỉ còn 71% và 50% hoạt tính ban đầu Khi tiếp xúc với dung dịch trypsin và pepsin trong điều kiện tương tự nhưng nồng độ trypsin và pepsin tăng lên 2.5mg/mL thì β- galactosidase cố định còn 60% và 50% hoạt tính ban đầu, trong khi đó, lactase tự do chỉ còn 27% và 20% hoạt tính Điều này chứng minh rằng, cố định lactase theo kiểu tương tác hấp phụ sinh học đã ổn định hoạt tính lactase trước sự phá huỷ của các enzyme protease

Ngoài ra, theo Grosova và cộng sự (2008), khi bẫy β-galactosidase vào trong PVA hydrogel sẽ loại trừ được sự ức chế enzyme bởi cả hai sản phẩm của quá trình thủy phân lactose (glucose và galactose) so với enzyme tự do, trong đó galactose là chất ức chế chính Đây là ưu điểm đáng lưu ý của lactase cố định

- Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH

Tác giả Haider và cộng sự (2009) đã cố định β-galactosidase từ Aspergillus

oryzae theo phương pháp hấp phụ sinh học đặc hiệu và nhận thấy không có sự

khác biệt pHopt giữa enzyme tự do và cố định, tuy nhiên enzyme cố định có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do Ngoài ra, enzyme cố định bền nhiệt hơn so với enzyme tự do Enzyme cố định còn 87% hoạt tính ban đầu sau 2h ở 600C trong khi ở dạng tự do, enzyme chỉ còn lại 15% hoạt tính ở điều kiện đó

Tanriseven và cộng sự (2002) đã cố định lactase từ loài A oryzae trong hệ

gel alginate-gelatin có sử dụng glutaraldehyde để làm tăng độ cứng của gel và cũng thu được kết quả tương tự Nhiệt độ tối thích cho cả hai loại enzym cố định và tự do là 50oC Hai loại enzyme cùng có giá trị pH tối ưu như nhau là

4.5 Ở nhiệt độ 70oC và pH 4.5, enzyme tự do mất hết hoạt tính nhưng enzyme

cố định trong gel alginate-gelatin vẫn còn giữ lại 27% hoạt tính ban đầu Ở pH 9.0 và nhiệt độ 50oC, enzyme cố định còn 25% hoạt tính ban đầu trong khi enzym tự do chỉ còn lại 11.5% hoạt tính

Grosova và cộng sự (2008) đã cố định β-Galactosidase từ Aspergillus

oryzae trong gel polyvinylalcohol Sự cố định không làm thay đổi pHopt, nhưng làm tăng độ bền của enzyme cố định đối với pH

Trong một số trường hợp, phương pháp cố định enzyme bằng liên kết cộng hoá trị cũng không làm thay đổi Topt và pHopt của enzyme cố định và tự do Ví

dụ như David và cộng sự (2008) khi cố định lactase trên chất mang có từ tính polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã thu được quy luật tương tự Tuy nhiên một số công trình nghiên cứu cho kết quả khác biệt về nhiệt độ

và pH hoạt động tối ưu giữa enzyme tự do và enzyme cố định:

Tác giả GonzalezSaiz và cộng sự (2001) đã cố định lactase từ Escherichia

coli ATCC2757 trong gel polyacrylamide Enzyme tự do có hoạt tính lớn nhất ở

pH xấp xỉ 8.5, còn enzyme cố định có pHopt dịch chuyển về phía kiềm hơn và cao hơn

Albayrak và cộng sự (2002) đã cố định β-Galactosidase từ Aspergillus

oryzae bằng phương pháp ngưng tụ trên màng Nylon gắn glycidyl methacrylate

Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố định là 660C, cao hơn so với enzyme tự do là

500C Ngoài ra, pHopt của enzyme cố định dịch chuyển về vùng acid hơn so với dạng tự do, pHopt của enzyme cố định là 3.5 trong khi pHopt của enzyme tự do là 4.7

Sự thay đổi pHopt phụ thuộc vào trường tĩnh điện do chất mang tạo ra Sự

có mặt của trường tĩnh điện mạnh làm nồng độ ion H+ gần chất mang và trong dung dịch khác nhau Khi lực ion của dung dịch thấp thì nồng độ ion H+ gần chất mang điện tích âm cao hơn, gần chất mang điện tích dương thấp hơn so với trong dung dịch Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết với chất mang (-) sẽ dịch chuyển về pH kiềm hơn và ngược lại, enzyme liên kết với chất mang (+) sẽ

có pHopt dịch chuyển về phía acid hơn Khi lực ion của dung dịch lớn, điện tích

của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu nên pHopt là không đổi (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2009)

2.2.3.4 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định

Các công trình nghiên cứu thấy rằng khả năng tái sử dụng của lactase cố định khá tốt Sau 10-15 chu kỳ sử dụng, hoạt tính enzyme vẫn còn khá cao Theo Haider và cộng sự (2009), lactase cố định bằng phương pháp hấp phụ sinh học trên chất mang immunoglobulin-cellulose sau 10 lần tái sử dụng vẫn còn khoảng 46% hoạt tính so với ban đầu

Theo Magdy và cộng sự (2009), khi cố định enzyme lactase lên bề mặt gel carageenan được phủ bởi màng chitosan và hoạt hóa bởi glutaraldehyde, sau 15 lần tái sử dụng, hoạt tính enzyme cố định còn 97% so với ban đầu

2.2.4 Chất mang alginate và carboxylmethyl cellulose (CMC)

2.2.4.1 Cấu tạo và đặc điểm của alginate

Alginate là một polymer sinh học có nguồn gốc từ các loài tảo biển thuộc

họ Phaephyceae Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Acid

alginic là một polymer mạch thẳng được cấu tạo từ 2 loại monomer là acid mannuronic và acid -L-guluronic (Phillips và cộng sự, 2000)

-D-H

O HOOC

OH H HO H OH

H OH H H

OH

OH H H

HO HO

H COOH

O

Acid -D-manuronic Acid -L-guluronic

Hình 2.6 Cấu hình của 2 gốc monomer trong phân tử acid alginic

Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block Có 3 loại block: Block homopolyguluronate: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau (-G-G-G-)

Block homopolymannuronate: gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau

(-M-M-M-)

Block luân phiên: gồm các gốc acid guluronic và acid mannuronic luân

phiên nối với nhau (-M-G-M-G-)

Cũng như các loại polysaccharide khác có nguồn gốc từ tảo biển, alginate

có khả năng tạo gel nên nó được đưa vào ứng dụng trong kỹ thuật cố định các

chất xúc tác sinh học và cố định tế bào Việc sử dụng alginate làm chất mang cố

định có những ưu điểm sau:

Điều kiện tạo gel của alginate ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của

enzyme được cố định

Gel alginate tương đối bền với nhiệt, khi gia nhiệt đến 1000C, gel không bị

chảy lỏng

Độ bền cơ học của gel alginate khá tốt

Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho sự khuếch tán cơ chất

Gel alginate có bản chất sinh học và không gây độc cho người sử dụng

cũng như không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường

H H

OH

O HO

H COOH

H

O

O COOH

H

H

H H

H

O

COOH OH

OH

OH COOH

H

O

G G G G

H H

OH

O HO

H COOH

O

O H

Hình 2.7 Các dạng phân đoạn trong phân tử acid alginic

2.2.4.2 Cơ chế tạo gel của alginate

Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginate bị acid hóa (David, 2004; Phillips và cộng sự, 2000)

Cơ chế tạo gel bằng cách hình thành liên kết ion với các cation kim loại hóa trị cao của alginate là phương pháp tạo gel phổ biến nhất Phương pháp này

có ưu điểm là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ bên trong (David, 2004; Phillips và cộng sự, 2000)

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài: Khi nhỏ dung

dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thường gặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa Quá trình này xảy ra

từ bề mặt hạt và phát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao Phương pháp này được ứng dụng phổ biến để cố định enzyme và tế bào

Hình 2.8 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài

(Phillips và cộng sự, 2000)

Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong: Cho các muối có

chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca…) vào dung dịch alginate Thay đổi pH của dung dịch về pH acid bằng các tác nhân acid hóa (như D-glucono--lactone (GDL)), các cation tạo gel đang ở dạng

vô hoạt sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp tạo gel

từ bên ngoài

H 2 O

GDL H+

Hình 2.9 Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong

( GDL: D-glucono-  -lactone) (Phillips và cộng sự, 2000)

2.2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của hạt gel alginate

Alginate có một tính chất đặc biệt là có thể tạo gel ở nhiệt độ thường và hạt gel tạo thành rất bền nhiệt Hạt gel có thể được xử lý ở nhiệt độ cao mà không

bị tan chảy Nhưng điều đó không có nghĩa là quá trình tạo gel ít phụ thuộc vào nhiệt độ Ngược lại, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tạo gel Trên thực

tế, nhiệt độ có thể được dùng để điều chỉnh quá trình tạo gel Tính chất của hạt gel cũng thay đổi khi chúng được tạo ra ở các nhiệt độ khác nhau (Phạm Trọng Khoa, 2002; Draget, 2000)

Ngoài ra, quá trình tạo gel alginate còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nguồn gốc, cấu tạo hóa học và nồng độ dung dịch alginate, nồng độ ion tạo gel,

sự có mặt của các tác nhân tạo phức (complexing agent) như phosphate, citrate (Draget, 2000)

Theo Martinsen và cộng sự (1989), các tính chất vật lý của hạt gel phụ thuộc rất nhiều vào thành phần cấu tạo, cấu trúc chuỗi và kích thước phân tử alginate Hạt gel có độ xốp tốt nhất khi alginate có hàm lượng acid L-guluronic chiếm hơn 70% và độ dài trung bình của phân đoạn G có nhiều hơn 15 gốc guluronic

Cũng theo Martinsen và cộng sự (1989), đối với alginate có phân tử lượng lớn hơn 2,4.105Da, độ bền hạt gel không phụ thuộc vào phân tử lượng nữa Có thể giải thích điều này như sau: Mạch phân tử alginate ngắn sẽ tạo thành các mắt lưới nhỏ Alginate có mạch phân tử dài hơn sẽ chứa nhiều gốc guluronic hơn và các mắt lưới tạo thành cũng có kích thước lớn hơn Khi kích thước mắt lưới đạt một giá trị nhất định thì dù có tăng độ dài mạch phân tử thì cũng không làm thay đổi đáng kể kích thước của các mắt lưới

Nghiên cứu của Martinsen và cộng sự (1992) cho thấy:

Tốc độ khuếch tán của serum albumin ra khỏi hạt gel calcium alginate phụ thuộc vào nồng độ và thành phần uronic acid của alginate (tỉ lệ ManA/GulA),

điều kiện tạo hạt gel, pH, nhiệt độ Hệ số khuếch tán giảm khi tăng nồng độ alginate, tăng tỉ lệ ManA/GulA và giảm pH

Gel calcium alginate dễ bị phá vỡ bởi lực cơ học và dần dần bị hòa tan khi

có mặt các tác nhân “bắt” ion calcium như ion phosphate hay citrate (Tanaka và cộng sự, 1999)

2.2.4.4 Cố định enzyme lactase trong gel alginate

Khi sử dụng chất mang alginate, người ta có thể cố định lactase bằng cách nhốt enzyme trong mạng gel (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004; Dashevsky, 1998; Haider và cộng sự, 2008) hoặc nhốt enzyme vào trong màng bao alginate (Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự, 2007) Cách tiến hành của 2 phương pháp trên

có một số điểm khác biệt như sau:

Đối với phương pháp nhốt enzyme trong mạng gel, hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ vào trong dung dịch CaCl2 Quá trình tạo gel sẽ diễn ra ngay lập tức trên bề mặt hạt alginate và khuếch tán dần vào bên trong Cấu trúc hạt gel là “đặc”

Đối với phương pháp nhốt enzyme trong màng bao alginate, hỗn hợp enzyme và CaCl2 được nhỏ vào dung dịch alginate Quá trình tạo gel cũng ngay lập tức xảy ra nhưng chỉ hình thành lớp màng bao bên ngoài Sau đó, người ta tiến hành vớt hạt alginate ra và ngâm trong dung dịch CaCl2 để làm bền cấu trúc hạt Cấu trúc hạt gel được xem là “rỗng”

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành cố định lactase trên gel alginate bằng phương pháp bẫy enzyme trong mạng gel

Cố định enzyme trong gel calcium alginate có nhiều ưu điểm như qui trình thực hiện nhanh, chế phẩm đảm bảo an toàn thực phẩm, không đắt tiền Tuy nhiên hiệu suất cố định chưa cao (Haider và cộng sự, 2009; Dashevsky, 1998; Banerjee và cộng sự, 1984)

Theo Dashevsky (1998), khi cố định enzyme lactase trong hạt alginate, lượng protein thất thoát đạt xấp xỉ 36%; do vậy, hiệu suất cố định không cao Nguyên nhân là do trong quá trình tạo hạt gel, các nhóm carboxylate của

monome guluronate kết hợp với các cation calcium để hình thành mạng gel, loại

đi các phân tử nước, vì thế làm thất thoát protein hòa tan trong nước

Haider và cộng sự (2009) đã cố định β-galactosidase trong hạt gel calcium alginate và so sánh 3 trường hợp cố định: (i) β-galactosidase cố định trong gel alginate, (ii) hỗn hợp gồm Concanavalin A và β-galactosidase được cố định trong gel alginate, (iii) tạo liên kết ngang giữa Concanavalin A và β-galactosidase sau đó cố định trong gel alginate Các tác giả nhận thấy sodium alginate là một polymer hiệu quả trong việc cố định enzym β-galactosidase Cơ chất lactose có thể khuếch tán vào; sản phẩm glucose và galactose đi ra khỏi hạt gel qua các mắt lưới của hạt dễ dàng Tuy nhiên điều này cũng cho thấy mặt hạn chế của nó đối với enzyme cố định Do các hạt alginate có độ xốp cao, các enzym cố định trong nó cũng có thể bị tuột ra khỏi mạng lưới gel một cách dễ dàng Để ngăn chặn sự thất thoát của enzyme khỏi hạt calcium alginate, theo tác giả, tạo liên kết ngang giữa Concanavalin A và β-galactosidase sau đó cố định trong gel alginate là một biện pháp khắc phục có hiệu quả

Những nhược điểm khi cố định enzyme và tế bào trong gel alginate cũng

đã được một số nhà khoa học đưa ra giải pháp khắc phục như tạo gel tinh bột (Haider và cộng sự, 2008), alginate-gelatin (Tanriseven và cộng sự, 2002), alginate-cellulose và dẫn xuất của cellulose (Huỳnh Ngọc Oanh, 2007; Nguyễn Thúy Hương, 2010; Blandino và cộng sự, 1999; Pourjavadi và cộng sự, 2006)

alginate-Banerjee và cộng sự (1984), đã sử dụng hạt calcium alginate để cố định galactosidase và nhận thấy nồng độ Ca2+ cao ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

Do vậy tác giả đã kết hợp Ca-alginate và Kali-carragenan để cố định galactosidase

β-Haider và cộng sự (2008) đã cố định β-galactosidase lên bề mặt ConcanavalinA phủ lên hạt gel alginate-tinh bột Enzyme cố định bền hơn trong các điều kiện như thay đổi pH, sự có mặt của pepsin, tripsin Enzyme cố định có cùng pHopt với enzyme tự do và vẫn giữ được hoạt tính 65% sau 6 lần sử dụng

Tanriseven và cộng sự (2002) đã cố định enzym từ loài A oryzae trong

chất mang là sợi gel alginate-gelatin có sử dụng glutaraldehyde để tăng độ cứng của gel Kết quả cho thấy sự cố định không làm thay đổi giá trị tối ưu về pH và nhiệt độ của enzyme, tuy nhiên độ bền nhiệt và pH của enzyme cố định tốt hơn

so với enzyme tự do

2.2.4.5 Carboxylmethyl cellulose

Carboxymethyl cellulose (CMC; E466 ) là một dẫn xuất của cellulose được hình thành bởi phản ứng của nó với chất kiềm và acid chloroacetic

Hình 2.10 Cấu tạo phân tử CMC

Chỉ số DS (Degree of substitution): là mức độ thay thế nhóm hydroxyl bởi nhóm cacboxylmethyl và dao động từ 0 đến 3 (max) Trên hình 2.11, phân tử CMC có DS bằng 1.0

Hình 2.11 Cấu tạo phân tử CMC có DS bằng 1

Cellulose NaOH CMC + H 2 O + NaCl

ClCH 2 -COONa

Tan nhanh trong nước nóng và nước lạnh

Có khả năng giữ nước

Trong nội dung luận văn này, CMC được kết hợp với alginate làm chất mang dạng gel để cố định enzyme lactase

Dưới đây là một số kết quả nghiên cứu kết hợp alginate với cellulose và các dẫn xuất của nó trong lĩnh vực cố định enzyme và tế bào:

Nguyễn Thúy Hương và cộng sự (2010) đã cố định vi khuẩn Ocnococcus

oeni bằng chất mang alginate - cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose - BC) và

ứng dụng để lên men malolactic So sánh với cố định vi khuẩn trên chất mang riêng lẻ là alginate thì thấy rằng chất mang dạng kết hợp có tính chất cơ lí bền vững hơn

Huỳnh Ngọc Oanh và cộng sự (2007) đã cố định enzyme α-amylase (Termamyl) bởi chất mang CMC-alginate Các tác giả cho rằng việc bổ sung CMC đã làm tăng hiệu suất cố định enzyme so với trường hợp chỉ sử dụng alginate Hoạt tính enzyme Termamyl cố định trong gel CMC-alginate đạt cao

nhất khi nồng độ dung dịch alginate 0,75%, nồng độ dung dịch CaCl2 6% và nồng độ CMC thích hợp là 2%

Chương 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Nguyên liệu và hóa chất

Chế phẩm dạng bột rắn màu trắng, do công ty Merk (Đức) sản xuất Khả

năng hòa tan trong nước ở 200C là 161 g/L

- Bovine serum albumin (BSA), thuốc thử Bradford và các hóa chất khác

trong các thí nghiệm phân tích:

Protein chuẩn BSA, thuốc thử Bradford, và các hóa chất cần thiết khác do hãng Merck (Đức) sản xuất

3.2 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định

2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường lactose của lactase cố định

 Nồng độ chất khô của dung dịch alginate-CMC: 3%

 Nồng độ chất khô dung dịch chế phẩm enzyme: 1mg/mL

“Bẫy” enzyme lactase vào trong gel alginate-CMC theo phương pháp cố định ở mục 3.4 để thu được chế phẩm enzyme cố định trong chất mang alginate-CMC

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trong chất mang truyền thống là

alginate

Hàm mục tiêu: Hiệu suất cố định protein và hoạt tính của enzyme cố định

3.3.1.2 Xác định tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w)

Thông số khảo sát: nồng độ chế phẩm enzyme trong dung dịch thay đổi: 1,

3, 6, 9, 12, 15 (mg chế phẩm/mL) - tương đương với tỷ lệ về khối lượng chế phẩm enzyme so với khối lượng chất mang alginate-CMC là 0.02, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 (w/w)

Thông số cố định: Tỷ lệ alginate/CMC theo khối lượng được chọn từ kết

quả thí nghiệm 3.3.1.1

“Bẫy” enzyme lactase vào trong gel alginate-CMC theo phương pháp cố định ở mục 3.4 để thu được chế phẩm enzyme cố định trong chất mang alginate-CMC

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate

Hàm mục tiêu: Hiệu suất cố định protein và hoạt tính của enzyme cố định

3.3.2 Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định trong chất mang alginate-CMC

Cố định enzyme theo điều kiện đã tìm được từ kết quả thí nghiệm 3.3.1.1

và 3.3.1.2 Các kết quả này được sử dụng xuyên suốt cho các thí nghiệm nghiên cứu tính chất của chế phẩm enzyme cố định

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định

a Xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme cố định

Thông số khảo sát: Thay đổi nhiệt độ khảo sát: 30, 45, 50, 55, 60, 65,

700C

Cơ chất là dung dịch lactose 0.1M pha trong đệm acetate có giá trị pH 4.5

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate và chế phẩm enzyme tự do

Hàm mục tiêu: Hoạt tính của enzyme cố định

b Xác định độ bền nhiệt của enzyme lactase

Thông số khảo sát: Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát sự

thay đổi hoạt tính của enzyme lactase cố định trong gel alginate-CMC theo thời gian ở 3 mức nhiệt độ 55, 60 và 65oC

Thông số cố định: Dung dịch phản ứng là dung dịch lactose 0.1M pha

trong đệm acetate, pH 4.5

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate và chế phẩm enzyme tự do

Hàm mục tiêu: Hoạt tính của enzyme cố định

3.3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cố định

a Xác định pH hoạt động tối ưu của enzyme cố định

Thông số khảo sát: dung dịch lactose 0.1M được pha trong các các đệm có

b Xác định độ bền pH của enzyme lactase

Thông số khảo sát: Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát sự

thay đổi hoạt tính của enzyme lactase cố định trong gel alginate-CMC theo thời gian ở 3 giá trị pH là 4.5, 5.5 và 6.5

Nhiệt độ phản ứng là giá trị nhiệt độ tối ưu tìm được từ thí nghiệm 3.3.2.1

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate và chế phẩm enzyme tự do

Hàm mục tiêu: Hoạt tính của enzyme cố định

3.3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường lactose của lactase cố định

Thông số khảo sát: Dung dịch lactose có nồng độ cơ chất ban đầu khảo sát

thay đổi từ 0,06-1.08M (tương đương với nồng độ 20-365g/l)

Thông số cố định: Nhiệt độ và pH là những giá trị tối ưu tìm được lần lượt

từ thí nghiệm 3.3.2.1 và thí nghiệm 3.3.2.2

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate và chế phẩm enzyme tự do

Hàm mục tiêu: Nồng độ glucose tạo thành trong dung dịch phản ứng

3.3.2.4 Xác định thông số động học của enzyme tự do và enzyme cố định

Thông số khảo sát: dung dịch lactose có nồng độ cơ chất ban đầu dao động

trong khoảng 0,06-0,60M (tương đương với nồng độ 20-205g/L)

Thông số cố định: Nhiệt độ và pH là những giá trị tối ưu tìm được lần lượt

từ thí nghiệm 3.3.2.1 và thí nghiệm 3.3.2.2

Mẫu đối chứng: chế phẩm enzyme cố định trên chất mang truyền thống là

alginate và chế phẩm enzyme tự do

Hàm mục tiêu: Lượng cơ chất được thủy phân theo thời gian

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xác định Km và Vm (xem phần 3.6.2)

3.4 Phương pháp cố định lactase trong gel alginate-CMC

Sodium alginate được trộn với CMC theo một tỷ lệ về khối lượng nhất định Hòa tan hỗn hợp alginate-CMC với nước để thu được dung dịch có nồng

độ chất khô là 3% (w/v) Bổ sung dung dịch chế phẩm enzyme lactase vào hỗn hợp alginate-CMC theo tỷ lệ về thể tích dung dịch alginate-CMC/dung dịch chế phẩm enzyme là 2/1 Khuấy trộn hỗn hợp trong 30 phút bằng máy khuấy từ để hỗn hợp đạt được độ đồng nhất

Hỗn hợp gồm alginate-CMC và chế phẩm enzyme lactase sau khi khuấy từ được bơm nhỏ giọt bằng syringe 5mL vào dung dịch CaCl2 0.2M, khoảng cách

từ đầu ống thoát của syringe đến bề mặt dung dịch CaCl2 là 10cm

Để yên 2h cho hạt gel cứng hoàn toàn Tách và rửa hạt gel bằng dung dịch CaCl2 Sau đó, enzyme cố định sẽ được đem đi xác định hoạt tính lactase

Hình 3.2 Enzyme được nhốt trong hạt gel alginate sau khi cố định

3.5 Phương pháp phân tích

3.5.1 Phương pháp định lượng protein

Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp quang phổ so màu

Bradford (Bradford, 1976)

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp