Tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic

Một trong những hợp quan trọng nhất được xác định đó là acid ursolic vì hoạt tính tuyệt vời của nó trong kháng viêm, bảo vệ gan, điều trị tiểu đường, và đặc biệt có hoạt tính mạnh mẽ tro

ĐẶNG THẾ SƠN

TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT

CỦA ACID URSOLIC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2011

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS TỐNG THANH DANH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

Tp HCM, ngày tháng năm ……

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ĐẶNG THẾ SƠN Phái: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 02/05/1983 Nơi sinh: Cần Thơ Chuyên ngành: Công Nghệ Hóa Học MSHV: 10050130 I- TÊN ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA ACID URSOLIC

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic chủ yếu bằng phản ứng ester hóa, oxy hóa

và xác định cấu trúc của sản phẩm bằng phổ 1 H-NMR, MS Xác định hoạt tính kháng ung thư trên 3 dòng tế bào HeLa, NCI-H460, MCF-7

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày … tháng … năm 20…

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày … tháng … năm 20…

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS TỐNG THANH DANH

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy TS Tống Thanh Danh, Thầy

đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các Thầy Cô và các anh chị trong bộ môn Hóa Hữu Cơ, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Xin cảm ơn Ban Tổng Giám, các bạn và các anh chị đồng nghiệp phòng Nghiên Cứu & Phát Triển Công ty Cp Dược Hậu Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các khóa học và thực hiện luận văn

Xin gởi lời biết ơn đến cha, mẹ và toàn thể gia đình của tôi Đã sinh thành, nuôi dưỡng và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn

H-ABSTRACT

In an effort to improve potential hepatoprotective and anti-tumor activities, eleven novel ursolic acid derivatives were designed and synthesized with substitution at positions of C-3, and C-28 of ursolic acid Their structures were confirmed using MS and 1H-NMR Their in vitro cytotoxicity against various cancer cell lines (HeLa, NCI-H460 and MCF-7) was evaluated by the standard MTT assay

MỤC LỤC

2.2 Mô tả qui trình tổng hợp 17

2.5.1 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 21 2.5.1.1 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid (2) 21 2.5.1.2 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (3) 22 2.5.1.3 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4) 23 2.5.1.4 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5) 23 2.5.1.5 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) 24 2.5.1.6 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (7) 25

2.5.1.7 Tổng hợp 3-Oxo(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (8) 25 2.5.2 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 26 2.5.2.1 Tổng hợp 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid (9) 27 2.5.2.2 Tổng hợp 3,4 lactone(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (10) 27 2.5.2.3 Tổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (11) 28 2.5.2.4 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (12) 29 2.5.2.5 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (13) 29 2.5.3 Tổng hợp 3-acetoxy-(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (15) 30

3.1 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 32 3.1.1 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid (2) 32 3.1.2 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (3) 33 3.1.3 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4) 35 3.1.4 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5) 37

3.1.5 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) 39 3.1.6 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (7) 41 3.1.7 Tổng hợp 3-Oxo(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (8) 43 3.2 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 45 3.2.1 Tổng hợp 3,4 lactone(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (10) 45 3.2.2 Tổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (11) 46 3.2.3 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (12) 48 3.2.4 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate (13) 50 3.3 Tổng hợp 3-acetoxy-(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione (15) 52 3.4 Thử hoạt tính sinh học 54

PHỤ LỤC

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Hình 2.1 Cấu trúc acid ursolic 17

Hình 3.1 Kết quả tạo sản phẩm (2) thể hiện trên bản mỏng 32

Hình 3.2 Kết quả tạo sản phẩm (3) thể hiện trên bản mỏng 34

Hình 3.3 Kết quả tạo sản phẩm (4) thể hiện trên bản mỏng 36

Hình 3.4 Kết quả tạo sản phẩm (5) thể hiện trên bản mỏng 37

Hình 3.5 Kết quả tạo sản phẩm (6) thể hiện trên bản mỏng 39

Hình 3.6 Kết quả tạo sản phẩm (7) thể hiện trên bản mỏng 41

Hình 3.7 Kết quả tạo sản phẩm (8) thể hiện trên bản mỏng 43

Hình 3.8 Kết quả tạo sản phẩm (10) thể hiện trên bản mỏng 45

Hình 3.9 Kết quả tạo sản phẩm (11) thể hiện trên bản mỏng 47

Hình 3.10 Kết quả tạo sản phẩm (12) thể hiện trên bản mỏng 49

Hình 3.11 Kết quả tạo sản phẩm (13) thể hiện trên bản mỏng 50

Hình 3.12 Kết quả tạo sản phẩm (15) thể hiện trên bản mỏng 52

DANH SÁCH SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Qui trình tổng hợp dẫn xuất acid ursolic 18

Sơ đồ 2.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic 19

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester 21

Sơ đồ 2.5 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 22

Sơ đồ 2.6 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 23

Sơ đồ 2.7 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 23

Sơ đồ 2.8 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 24

Sơ đồ 2.9 Tổng hợp Allyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate 25

Sơ đồ 2.10 Tổng hợp 3-Oxo(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione 25

Sơ đồ 2.11 Tổng hợp các dẫn xuất ester của 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 26

Sơ đồ 2.12 Tổng hợp 3,4 lactone-urs-12-en-28-oic acid 27

Sơ đồ 2.13 Tổng hợp 3,4 lactone(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione 27

Sơ đồ 2.14 Tổng hợp Benzyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 28

Sơ đồ 2.15 Tổng hợp Allyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 29

Sơ đồ 2.16 Tổng hợp Octyl 3,4 lactone-urs-12-en-28-oate 29

Sơ đồ 2.17 Tổng hợp 3-acetoxy-(1H-Imidazole-1-yl)-urs-12-en-28-dione 30

DMSO : Dimethyl sulfoxide

MS : Khối phổ (infrared spectroscopy)

m-CPBA : Meta-Chloroperoxybenzoic acid

NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance spectroscopy) THF : Tetrahydrofuran

là những hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên Trong đó phải kể đến các hợp chất thuộc họ triterpenoid được phân bố rộng rãi trong thế giới thực vật Và cũng đã trải qua hàng nghìn năm, các loài thực vật có chứa các hợp chất triterpenoid trong các bài thuốc dân gian dùng để chữa trị rất nhiều căn bênh như: nhiễm trùng, sưng tấy, tiêu chảy, đau bụng…

Hiện nay, bằng các phương tiện khoa học công nghệ hiện đại, người ta đã phân lập và xác định chính xác cấu trúc của một số hoạt chất thuộc họ triterpenoid,

và đồng thời xác định hoạt tính sinh học của chúng Một trong những hợp quan trọng nhất được xác định đó là acid ursolic vì hoạt tính tuyệt vời của nó trong kháng viêm, bảo vệ gan, điều trị tiểu đường, và đặc biệt có hoạt tính mạnh mẽ trong kháng ung thư, virus HIV…

Vì hoạt tính hữu dụng của acid ursolic và nhằm hướng đến mục tiêu tối đa hóa hiệu quả điều trị, đặc biệt đối với những căn bệnh mãn tính như ung thư, HIV…, hiện nay rất nhiều nhà khoa học đang tập trung tổng hợp các dẫn xuất của acid ursolic nhằm tìm ra hợp chất có hoạt tính ưu việt dùng trong phòng và chữa bệnh

Hòa nhập với xu hướng chung đó chính là lý do triển khai đề tài “Tổng hợp các

dẫn xuất acid ursolic”

PHẦN 1

TỔNG QUAN

1.1.2 Nguồn gốc thực vật

Giống như hầu hết các triterpenoid, acid ursolic tồn tại rộng khắp trong thế giới thực vật Acid ursolic được phân lập từ vỏ quả táo, lê, nam việt quất, mận, và nhiều loại trái cây khác [6]; còn trong rong biển thì giàu các dẫn xuất acid ursolic [6] Một số cây dược liệu có chứa acid ursolic như được trình bày trong bảng 1 [7]

Bảng 1.1 Một số cây dược liệu có chứa acid ursolic và hoạt tính sinh học

Calluna vulgaris

(Ericaceae)

Ức chế lipoxygenase và cyclooxygenase trong tế bào bạch cầu HL-60

Bảo vệ gan Shukla et al., 1992

Glechoma heakracea L Chống sự hình thành Ohigashi et al., 1986;

(Labiatae) khối u Tokuda et al., 1986

Melaleuca leucadendron L

(Myrtaceae)

Ức chế phóng thích histamine

Tsuruga et al., 1991

Ocimum sanctum L

(Labiatae)

Ức chế sự peoxy hóa lipid và và bảo vệ trước độc tính adriamycin

Balanehru and Nagarajan, 1991; 1992

Rosmarinus ofjicinalis L

(Labiatae)

Kháng khuẩn

Ức chế sự tạo u ở da chuột

Gây độc tế bào bạch cầu Lee et al., 1988

Sambucus chinesis Lindl

Acid ursolic [(3)-3-Hydroxyurs-12-en-28-oic acid] hiếm khi tồn tài mà không

có đồng phân của nó, acid oleanolic [(3b)-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid] Chúng có thể tồn tại ở dạng acid tự do như trong Hình 1.1, hoặc như aglycones của triterpenoid saponins bao gồm một triterpenoid aglycone liên kết với một hoặc nhiều nhóm chức đường Acid ursolic và oleanolic có tác dụng dược lý tương tự nhau [1]

Tên Latin: Ursolic Acid

Tên Hóa học: (3 beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid;

3-epi-ursolic acid Merotaine

ursolic acid, (3beta)-isomer, 2-(14)C-labeled ursolic acid, (3beta)-isomer, monopotassium salt Công thức phân tử: C30H48O3

Khối lượng phân tử: 456.7 g/mol

Dạng tồn tại: Bột trắng ngà

Nhiệt độ nóng chảy: 292°C

Mùi: Đặc trưng

1.1.4 Một số công trình nghiên cứu về acid ursolic ở Việt Nam

Ở nước ta, Acid ursolic được phát hiện và nghiên cứu chủ yếu trên cây Hedyotis họ cà phê, với nhiều chi khác nhau Một số công trình được nghiên cứu như:

- Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Góp

phần tìm hiểu thành phần hóa học của cây Hoa kim cương Hedyotis Nigricans L.,

Họ cà phê (Rubiaceae)” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành

Phố Hồ Chí Minh

Hình 1.1 Cấu trúc của acid ursolic và oleanolic

- Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng “Tìm

hiểu thành phần hóa học của một số cây thuộc chi Hedyotis mọc ở Việt Nam và điều chế một số dẫn xuất thioflavon từ các flavon cô lập được” Khoa hóa- Trường Đại

Học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh

- Phạm Đình Hùng “Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc các hợp chất có

hoạt tính sinh học cao từ cây thuốc họ cúc, cà phê, ô rô, bứa và một số họ khác mọc phổ biến ở miền nam Việt Nam” Khoa hóa- Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

Thành Phố Hồ Chí Minh

- Thiard Franck, Tất Tố Trinh, Nguyễn Thụy Vy, Nguyễn Hoài Nghĩa, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Nguyễn Kim Phi Phụng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Hồ Huỳnh Thùy

Dương “Khảo sát hoạt tính ức chế tăng trưởng của các cây thuốc Việt Nam trên

dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa” Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

ĐHQG-HCM Viện Công Nghệ Hóa Học tại Tp HCM

Với những nghiên cứu này đã cho kết quả tách chiết được hàm lượng cao các hợp chất triterpenoid acid trong đó có acid ursolic hàm lượng rất cao so với các triterpenoid acid khác Bên cạnh đó còn cho thấy hoạt tính kháng ung thư trên một

số dòng tế bào

1.1.5 Tác dụng dược lý của acid ursolic

Các cây dược liệu có chứa acid ursolic, từ lâu đã được dùng trong các bài thuốc dân gian trước khi xác định được các thành phần trong nó có tác dụng chữa bệnh Nghiên cứu khoa học hiện đại đã phân lập và nhận dạng acid ursolic với các tác dụng dược lý như kháng ung thư, kháng viêm, chống ung nhọt, chống nhiễm trùng, virus… [1]

 Hoạt tính kháng viêm

Acid ursolic là một hoạt chất kháng viêm mạnh Vì vậy, nó được khuyến cáo

sử dụng trong thuốc mỡ trị bỏng [4] Nó ức chế hoạt động của human leucocyte elastase (HLE), 5-lipoxygenase và cyclooxygenase [21,22] Acid ursolic (1.0

mg/lần) ức chế 72,4% phù nề tai chuột gây ra bởi TPA [23] Hirota và cộng sự [24]

đã xác định liều dùng 200 mg và 50 mg acid ursolic ức chế lần lượt 49% và 33%

đối với 12-O-hexadecanoyl-16-hydroxyphorbol-13-acetate (HPPA) – gây viêm

Ngoài ra, nó ức chế concanavalin A (Con A) – gây phóng thích histamine, có thể gây viêm nhiễm nghiêm trọng, đạt 95% ở nồng độ 0,001 M [25]

 Hoạt tính chống nhiễm trùng

Acid  ursolic (triterpenoid sapogenin từ nhóm ursan) ức chế sự tăng trưởng của một số chủng tụ cầu [28] Nhiều loài cây từ họ Lamiaceae chứa acid ursolic thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và nấm [29] Các nồng độ tối thiểu có thể ức chế

Rosmarinus officinalis, Origanum majorana, và Lavandula officinalis lần lượt là

500, 250, and 500 mg/cm3 [29] Acid ursolic cũng ức chế sự tăng trưởng của

Microsporium lenosum và Candida albicans ở 250 mg/ml [30]

 Hoạt chất chống lão hóa

Acid ursolic và các dẫn xuất của nó hình thành dầu chống nhiễm trùng trên da

và tóc như lớp sáp phủ bên ngoài một số loại trái cây [6] Acid ursolic được dùng để điều trị da bị lão hóa do quang hóa vì nó ngăn ngừa và cải thiện sự xuất hiện của nếp nhăn và các đóm đồi mồi bằng cách phục hồi tính co giản và cấu trúc collagen của da [31] Nồng độ của acid ursolic trong khoảng 0.01 – 50 mg được báo cáo là thích hợp để đưa vào điều trị bệnh về da [32,33]

 Kích thích sự tăng trưởng của tóc

Acid ursolic và các đồng phân được dùng trong nics để tăng cường sự phát triển của tóc và ngăn ngừa kích ứng da đầu [26,27] Hợp chất kích thích tóc phát triển bằng cách kích thích lưu lượng máu ngoại biên trong da đầu và hoạt hóa các tế bào tạo ra tóc Chúng cũng chống rụng tóc và ngăn ngừa gàu hiệu quả [27]

 Hoạt tính bảo vệ gan

Tác dụng của acid oleanolic, một đồng phân của acid ursolic, đối với gan lần đầu tiên được công bố năm 1975 trong nghiên cứu của Swertia mileensis Shi, và

được dùng cho nghiên cứu hoạt tính trên bệnh viêm gan Kế đó, acid oleanolic tiếp tục được chứng minh về khả năng loại bỏ và ngăn ngừa CCl4 cùng với cồn gây xơ gan mãn tính ở chuột (Han et al., 1981) Do đó acid oleanolic rất hiệu quả trong bảo

vệ chống lại các chất hóa học gây tổn hại gan ở chuột (Liu et al.,)

Acid ursolic có cấu trúc tương tự acid oleanolic, và đều là đồng phân của acid triterpenoid với cấu trúc pentacyclic triterpen acid nên tính chất và hoạt tính gần như giống nhau Do vậy acid ursolic cũng được xác định là một trong những hoạt chất có hoạt tính trong chữa trị các bệnh về gan, với vai trò kháng CCl4, D-galactosamine – nguyên nhân gây tổn thương gan ở chuột, và ngăn ngừa acetaminophen gây ra ứ mật (Shukla et al., 1992) Trong đó, acid ursolic thậm chí còn mạnh hơn acid oleanolic trong hạn chế tác hại của hóa chất gây tổn thương gan

ở chuột (Liu et al., 1994)

 Ức chế hình thành khối u ở da

Acid ursolic và acid oleanolic, được phân lập từ cây Glechoma hederacea, ức

chế hoạt động của virus Epstein-Barr gây ra bởi 12-O-tetradecanoylphorbol acetate (TPA) ở da chuột Các tác dụng ức chế được đánh giá trong 20 tuần Dùng liên tục acid ursolic và acid oleanolic (41 nmol/lần) trước khi xử lý TPA (4,1 nmol)

13-đã trì hoãn sự hình thành khối u trong da chuột và giảm tỉ lệ (%) số chuột mang khối u Cả hai acid ursolic và acid oleanolic thể hiện hoạt tính ức chế rõ rệt đối với

sự hình thành khối u khi so sánh với chất kháng ung thư đã biết, acid retinoic So với acid retinoic hoặc acid oleanolic, acid ursolic thể hiện hoạt tính ức chế khối u tốt hơn, như trình bày trong Hình 1.2 Điều này cho thấy sự khác biệt về vai trò ức chế khối u của acid ursolic so với acid retinoic hoặc acid oleanolic Có ý kiến cho rằng nếu tiền xử lý da với acid ursolic thì có thể ức chế đáng kể sự hình thành khối

u gây ra bởi TPA [17]

Tác dụng tại chỗ của acid ursolic, được tách từ dịch chiết lá hương thảo, là ức chế TPA (gây ra sự hình thành khối u, chứng viêm, và hoạt động ornithine decarboxylase ở da chuột) Acid ursolic thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh, và ức chế sự hình khối u ở da chuột – khi chỉ dùng 1 hoặc 2 mmol acid ursolic cùng với 5nmol TPA cho họat tính kháng sự hình khối u ở chuột sau 20 tuần lần lượt là 45 hoặc 61%

Ở liều thấp hơn (0,1 hoặc 0,3 mmol), acid ursolic có tác dụng ức chế giống như dùng ở liều cao Mỗi tuần, bôi tiếp xúc acid ursolic với nồng độ lần lượt là 0.1, 0.3, 1 hoặc 2 mmol cùng với 5nmol TPA trong 8,12, và 18 tuần làm giảm tỉ lệ chuột

bị ung thư lần lượt là 52 – 86%, 49 – 63 %, và 44 – 61% [18]

Acid ursolic và dẫn xuất của nó, acid oleanoic được chỉ định cho điều trị ung thư da ở Nhật [19] Các mỹ phẩm bôi có chứa acid ursolic / acid oleanolic đã được cấp bằng sáng chế ở Nhật để phòng ngừa ung thư da [20] Thuốc mỡ acid ursolic/ acid oleanolic ức chế 7,12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) – gây ra ung thư

da ở chuột Kết quả cho thấy, chỉ có 0% và 3% số chuột bị ung thư trong 15 và 30

Hình 1.2 Khả năng ức chế hình thành khối u do TPA trên da chuột khi sử dùng

reatinoic acid (RA), ursolic acid (UA), và oleanolic acid (OA)

tuần, trong khi lần lượt có tới 50% và 90% số chuột bị ung thư nếu chỉ dùng TPA [20]

1.2 Tổng quan về dẫn xuất acid ursolic

Acid ursolic là một hợp chất triterpene được phân lập từ nhiều loại cây dược liệu [34] Các dẫn xuất của nó được báo cáo là có một loạt tác dụng dược lý, bao gồm kháng viêm, chống dị ứng, kháng khuẩn, kháng virus và kháng ung thư Trong

số các hoạt tính sinh học, đáng chú ý nhất là hoạt tính gây độc tế bào cao

1.2.1 Hoạt tính kháng ung thư của một số dẫn xuất acid ursolic

Acid ursolic và các dẫn xuất được báo cáo là ức chế khả năng sản sinh interferon – gây tạo ra NO, và hoạt tính sẽ được gia tăng đáng kể khi thêm vào các nhóm carbonyl, methoxycarbonyl, hoặc cyano- Căn cứ trên các báo cáo, nhóm chức ester tại C-3 là cần thiết cho hoạt tính dược lý của các pentacyclic triterpenes [36], và nhóm cho hydrogen tại vị trí C-3 hoặc C-28 của acid ursolic là cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào [37] Từ đó một loạt các dẫn xuất acid ursolic được tổng hợp và hoạt tính của chúng được đánh giá in vitro trên các dòng tế bào ung thư (HeLa, SKOV3, BGC-823…) Các kết quả đã khẳng định cấu tạo tại vị trí C-3 có vai trò quan trọng quyết định hoạt tính , dẫn xuất 3-amino có hoạt tính gấp 20 lần

so với tiền chất acid ursolic [37]; acetyl hóa nhóm OH- ở vị trí C-3 cùng với tạo liên kết amino ở vị trí C-28 thì thu được các dẫn xuất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào mạnh hơn so với acid ursolic, Hình 1.3a [38] Ngoài ra, đưa nhóm carbonyl vào C-11 của acid ursolic cũng có thể ức chế sự phát triển của tế bào khối

u [38]

Hình 1.3a Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư

Trong một nghiên cứu khác, Yan-Qiu Meng và cộng sự đã tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic và hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất này cũng được xác định đối với các dòng tế bào (HeLa, SKOV3, BGC-823), Hình 1.4b [41]

Hình 1.3b Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng ung thư

Trong đó, các dẫn xuất acetyl hóa C-3 alcohol cùng với tạo liên kết amino acid methyl ester hoặc amino alcohol acetate tại C-28 có hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với tiền chất acid ursolic.Tuy nhiên, các dẫn xuất có nhóm hydroxyl tại C-3 thì hoạt tính kém hơn; còn nhóm hydroxyl trên mạch amide tại C-28 thì không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của hợp chất Trường hợp có quá nhiều mạch nhánh alkyl trên mạch amide ở C-28 sẽ làm giảm hoạt tính do hiệu ứng không gian

Bên cạnh đó, theo một hướng khác, Huang-Yao Tu và cộng sự cũng đã nghiên cứu các dẫn dẫn xuất của acid ursolic trên dòng tế bào NTUB1 [40]

Hình 1.4 Một số dẫn xuất acid ursolic

Hầu hết các dẫn xuất đều thể hiện hoạt tính gây độc đối với đối với dòng tế bào NTUB1 Các dẫn xuất acetyl hóa tại vị trí C3-OH đều thể hiện tăng cường hoạt tính gây độc, như dẫn xuất 28 có hoạt tính gia tăng đáng kể đối với dòng tế bào NTUB1 Tuy nhiên, trong số các dẫn xuất trên, việc tăng chuỗi carbon trên nhóm tạo sản phẩm ester sẽ làm giảm hoạt tính, còn tăng tính chưa no của chuỗi sẽ làm hoạt tính tăng hơn Các quá trình oxy hóa của C3-OH tạo nhóm keton làm tăng hoạt tính, còn tạo dẫn xuất lactone làm giảm hoạt tính Tuy nhiên khi thủy phân lactone

tạo các dẫn xuất 3,4-seco- cho khả năng ức chế có hiệu quả đối với sự tăng trưởng của tế bào khối u, nguyên nhân có thể do hình thành cấu trúc dạng seco-

1.2.2 Hoạt tính kháng HIV của một số dẫn xuất acid ursolic

Trong xu hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hiệu quả kháng HIV, acid betulinic, một acid triterpenoic tương tự acid ursolic, được phân lập từ lá cây Syzygium claviflorum (Myrtaceae), được xác định là một hoạt chất kháng HIV (EC50 = 1,4 µM; TI = 9,3) Và điều đặc biệt là từ acid betulinic người ta đã tổng hợp được dẫn xuất 3-O-(3′,3′-dimethylsuccinyl) có hoạt tính kháng HIV vượt trội (EC50

< 0,00035 µM; TI > 20 000)

Với chỉ số EC50 = 4.4 µM, acid ursolic, được phân lập từ Pr glandulosa, Ph juniperinum, S claviflorum, và H capitata, cũng được xem là hợp chất có hoạt tính kháng HIV tương tự acid betulinic Yoshiki Kashiwada và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và xác định hoạt tính kháng HIV của các dẫn xuất acid ursolic [39]

Hình 1.5 Một số dẫn xuất acid ursolic có hoạt tính kháng HIV

Trong số các dẫn xuất 3-O-acyl-ursolic acid, 3-O-diglycoryl-ursolic acid (10) được xác định là có hoạt tính kháng HIV tương đối mạnh so với tiền chất Tuy nhiên, so với dẫn xuất tương tự của acid betulinic thì hoạt tính kém hơn Còn dẫn

xuất 3-oxo (15) và muối potassium (16) có hoạt tính kháng HIV tương tự tiền chất Tóm lại, các dẫn xuất acid ursolic cũng thể hiện hoạt tính kháng HIV nhưng kém hơn so với các dẫn xuất cùng loại từ acid betulinic

1.3 Phản ứng Jones Oxidation

Phản ứng Jones Oxidation cho phép dễ dàng chuyển hóa rượu bậc 2 thành

ketone:

Hầu hết rượu bật 1 được oxy hóa thành acid carboxylic:

Và trong một số trường hợp, các rượu alkylic và benzylic được chuyển thành aldehyde:

Tác chất Jones là dung dịch chromium trioxide trong acid sulfuric loãng, được dùng để oxy hóa chất hữu cơ trong acetone Tác chất cũng có thể được tổng hợp từ sodium dichromate và potassium dichromate

Rượu và acid chromic hình thành ester chromate, trong hợp chất trung gian này xảy ra phản ứng nội phân tử và giữa các phân tử với nhau trong môi trường base (nước) để hình thành hợp chất carbonyl tương ứng:

1.4 Phản ứng Baeyer–Villiger oxidation

Baeyer–Villiger oxidation là một phản ứng hữu cơ, trong đó keton bị oxy hóa thành ester bằng phản ứng với các acid peroxy hoặc hydrogen peroxide

Tác chất được dùng cho chuyển hóa là acid meta-chloroperoxybenzoic

(mCPBA), acid peroxyacetic, hoặc acid peroxytrifluoroacetic Ketones (cyclobutanones, norbornanones) phản ứng với hydrogen peroxide hoặc hydroperoxides để hình thành lactones Disodium phosphate hoặc sodium bicarbonate thường được thêm vào phản ứng với vai trò là chất đệm để ngăn không cho phản ứng thủy phân xảy ra

 Cơ chế phản ứng:

Trước tiên acid peroxy được cộng vào carbonyl để hình thành hợp chất trung gian tetrahedral với sự bố trí lại phân tư giống như tên gọi Giai đoạn chuyển tiếp này có thể hình dung như sau: một hydrogen di chuyển qua ba vị trí theo tuyến tương tác O-H-O; kế đó một trong những carbon liền kề di chuyển đến nguyên tử oxy làm tách rời acid carboxylic

Khả năng di chuyển: H > alkyl bậc 3 > cyclohexyl > alkyl bậc 2, aryl > alkyl bậc 1 > methyl

1.5 Một số phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất

1.5.1 Phương pháp phổ khối lượng

Phương pháp phổ khối

lượng là một kĩ thuật dùng để

đo đạc tỉ lệ khối lượng trên điện

tích của ion; dùng thiết bị

 Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất

 Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó

 Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí (ngành hóa học về ion và chất trung tính trong chân không)

 Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay cả sinh học của hợp chất với nhiều hướng tiếp cận khác nhau

1.5.2 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

Cộng hưởng từ hạt nhân là hiện tượng vật lí dựa trên từ tính của hạt

nhân nguyên tử Cộng hưởng từ hạt nhân cũng được xem là một nhóm các phương pháp khoa học áp dụng cộng hưởng từ hạt nhân vào việc nghiên cứu các phân tử

Hình 1.6 Khối phổ kế

Mọi hạt nhân chứa một số lẻ các proton hay neutron có một mômen từ nội tại

và mômen động lượng Các hạt nhân thường được đo nhất là hydro-1 (đồng vị nhiều nhất trong tự nhiên) và carbon-13, mặc dù cũng có thể gặp hạt nhân từ các đồng vị của nhiều nguyên tố khác (như 15N, 14N 19F, 31P, 17O, 29Si, 10B, 11B,

23

Na, 35Cl, 195Pt)

Tần số cộng hưởng từ hạt nhân đối với một chất cụ thể trực tiếp tỉ lệ với cường

độ từ trường áp dụng, phù hợp với phương trình tần số tuế sai Larmor

PHẦN 2

THỰC NGHIỆM

2 THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

 Khảo sát một số phản ứng tổng hợp hữu cơ bao gồm phản ứng ester hóa và oxy hóa

 Tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic

 Xác định cấu trúc và hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất đã tổng hợp

2.2 Mô tả qui trình tổng hợp

Các dẫn xuất acid ursolic được tổng hợp với sự biến đổi tại vị trí C-3 và C-28 của tiền chất acid ursolic

Hình 2.1 Cấu trúc acid ursolic

Tác chất phản ứng được hòa tan trong dung môi hữu cơ thích hợp, được cho vào bình phản ứng cùng với xúc tác (nếu cần) Phản ứng được thực hiện trong điều kiện khuấy, gia nhiệt hoặc làm lạnh, đồng thời được theo dõi bởi sắc ký bản mỏng với hệ dung môi thích hợp Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được lọc, chiết bằng nước, rửa nhiều lần bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetate hoặc dichloromethane), và làm khan bằng Na2SO4 (muối sodium sulfate khan) Sau đó cô quay tách loại dung môi và tinh khiết bằng cột silicagel với hệ dung môi Hexane : Ethyl acetate ở tỉ lệ thích hợp Sản phẩm được xác định cấu trúc qua phổ 1H-NMR, MS…, và được xác định hoạt tính kháng ung thư trên các dòng tế bào HeLa, NCI-H460, MCF-7

Chuỗi phản ứng tạo các dẫn xuất acid ursolic

Acid Ursolic

Thiết bị phản ứng

Lọc, tách chiết, sấy khô

Tinh chế (cột silicagel)

Xác định hoạt tính kháng ung thư Xác định cấu trúc

Tác chất khác,

xúc tác

Sơ đồ 2.1 Qui trình tổng hợp dẫn xuất acid ursolic

H

H COOH HO

17

H

H COOH O

H COOH O

O

17

H H

H COOR2O

8

O

e b

17

H H

H ON N O

N,N-Dimethylformamide (DMF) Tetrahydrofuran (THF)

Sơ đồ 2.2 Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất acid ursolic Tác chất và điều kiện: (a) Cr2O3, H2SO4, acetone, 5°C; (b) R1Br, K2CO3, acetone, rt; (c) m-CPBA, CHCl3, rt ; (d) Andydrous acetic, triethylamine, THF, rt; (e) CDI,

CH2Cl2, rt

Anhydride acetic-(CH3CO)2O

Silicagel nhồi cột

 Dụng cụ thí nghiệm

- Bình phản ứng

- Bếp khuấy từ có hỗ trợ gia nhiệt

- Thiết bị cô quay chân không, bình cô quay

- Hệ thống triển khai sắc ký bản mỏng

- Hệ thống sắc ký cột

- Một số thiết bị khác,

2.4 Phương pháp nghiên cứu

- Các dẫn xuất acid ursolic được tổng hợp trong chuyên luận này chủ yếu là sản phẩm ester hóa và oxy hóa

- Tiến trình phản ứng được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng

- Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi Hexane : Ethylacetate ở tỉ lệ thích hợp

- Cấu trúc của các dẫn xuất được xác định bằng phổ 1H-NMR, MS tại Viện Hóa Học, Viện KHCN VN

- Hoạt tính sinh học được thử (tại Trung tâm phân tích, Trường Đại học KHTN TP.HCM) trên ba dòng tế bào ung thư: HeLa (ung thư cổ tử cung), NCI-H460 (Ung thư phổi), NCF-7 (Ung tư vú)

2.5 Nội dung thí nghiệm

2.5.1 Tổng hợp các dẫn xuất N-[3-oxo-urs-12-en-28-oyl]-ester (3-7)

2.5.1.1 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid (2)

Sơ đồ 2.4 Tổng hợp 3-Oxo-urs-12-en-28-oic acid

Phản ứng tạo sản phẩm (2) là phản ứng oxi hóa với tác nhân oxi hóa là Jones’ reagent Cân 50mg acid ursolic hòa tan trong acetone (20 ml), làm lạnh hỗn hợp trong bề muối – đá (khoảng 5°C), thêm từ từ dung dịch Jone’s reagent (0,2 ml)

Hỗn hợp phản ứng được làm ấm đến nhiệt độ phòng (25°C) và được khuấy trong 2 giờ Kiểm tra bản mỏng thấy phản ứng kết thúc Sau đó làm lạnh hỗn hợp đến 5°C, 2-propanol (2 ml) được cho vào và khuấy thêm 20 phút ở nhiệt độ phòng Kết tủa xanh được tách ra và rửa bằng aceton Phần dung dịch sau lọc được cô và sấy khô (loại bỏ dung môi) Sản phẩm được tinh chế trên cột silicagel với hệ dung môi 15% Etylacetate : 85% Hexane Thu được sản phẩm (2), đây là sản phẩm trung gian cho phản ứng tiếp theo

Sơ đồ 2.5 Tổng hợp Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2CO3(50mg), và thêm tiếp 1- Bromohexane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa Phản ứng trong 2h thì kiểm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làm khan bởi Na2SO4 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi etylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9

(tức 10%) Thu được sản phẩm ester hóa Hexyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (3) với dẫn

xuất alkyl halide tương ứng là 1-Bromohexane

2.5.1.3 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4)

Sơ đồ 2.6 Tổng hợp Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2CO3

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromobutane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa Phản ứng trong 2h thì kiểm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làm khan bởi Na2SO4 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi etylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9

(tức 10%) Thu được sản phẩm ester hóa Butyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (4) với dẫn

xuất alkyl halide tương ứng là 1-Bromobutane

Sơ đồ 2.7 Tổng hợp Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2CO3

(50mg), và thêm tiếp 1- Bromomethylbenzene (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa Phản ứng trong 2h thì kiểm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làm khan bởi Na2SO4 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi etylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương

ứng 1:9 (tức 10%) Thu được sản phẩm ester hóa Benzyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (5)

với dẫn xuất alkyl halide tương ứng là 1-Bromomethylbenzene

Sơ đồ 2.8 Tổng hợp Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate

Hòa tan 30mg (2) trong 10ml acetone, khuấy khoảng 5 phút thêm K2CO3(50mg), và thêm tiếp 1- Bromooctane (0.2ml), hỗn hợp phản ứng có màu đục sữa Phản ứng trong 2h thì kiểm tra sắc ký bản mỏng một lần, theo dõi phản ứng xảy ra Rồi để qua đêm thử lại sắc ký bản mỏng, sau khoảng 24h thấy phản ứng chuyển hóa hoàn toàn thì ngừng phản ứng đem chiết trong nước và etylacetat 3 lần, kết hợp làm khan bởi Na2SO4 Chiết xong đem cô quay chân không để đuổi hết dung môi etylacetat, rồi đem chạy cột trong hệ dung môi Etylacetat : Hexane tương ứng 1:9

(tức 10%) Thu được sản phẩm ester hóa Octyl 3-Oxo-urs-12-en-28-oate (6) với dẫn

xuất alkyl halide tương ứng là 1-Bromooctane