Nghiên cứu tác dụng an thần của bài thuốc an thần hoàn (ATH) trên động vật thực nghiệm

Phần dược liệu còn lại tuy không thể hiện tác đụng giải lo âu nhưng thể hiện tác dụng an thần trên mô h nh kéo dài thời gian ngủ của thiopental, tương ứng với tác dụng dưỡng tâm, kiện tỳ[r]

NGHIÊN CỨU TÁC D NG AN THẰN CỦA BÀI THUỎC AN THẦN HOÀN (ATH)

TRÊN ĐỘNG VẬT THựC NGHIỆM

DS Vũ T hị Ngọc Anh*

H ướng dan: ThS Trần Bá Kiên* TÓM T T

Việc sử dụng an thần hoàn (ATH) chủ yểu dựa trên kinh nghiệm điều trị, chưa có nghiên cứu nào được tiến hành để đánh giá tác dụng dược lý thần kinh cũng như độ an toàn trên động vật thực nghiệm Mục tiêu của nghiên cửu này là đánh giá ỉác đụng an thần của ATH và các thành phần trong công thức trên thực nghiệm nhằm cung cấp thếm các bằng chứng vê tác dụng được lý của chế phẩm tnrớc khi tiến hành nghiên cứu trên lâm sàng

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu:

Nguyên liệu: Cao khô An thần hoàn (ATH), hóa chất: Diazepam, thiopental natri, strychnin sulfat, động vậĩ íhực nghiệm: Chuột nhắt ưắng giống đực, chủng Swiss khỏe mạnh (18 ­ 22 g)

Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các ỉiều ATH: X (7,15 g/kg), 2X, 4X và 8X tương ứng với liều bằng x, 2X 4x

và 8x) Đánh giá tác dụng dược lý an íhần của ATH thông qua mô h nh leo dây; Mô h nh chữ thập nâng cao

Kết quả:

­ ATH có tác dụng giãn cơ giài io, an thần và ức chế thần kinh trung ương Tác dụng an thần của ATH phụ thuộc vào liều sử dụng

­ B nh vôi thành phần chính có tác dụng an thần và giải lo âu rõ rệt nhất ưong số 5 thành phần cỏa ATH Các thành phần còn lại (liên nhục, hoài sơn, đảng sâm, bạch truật) không thể hiện tác đụng giải lo âu nhưng có tác dụng an íhần làm kéo dài có ý nghĩa thời gian ngủ do thiopental

* Từ khóa: An thần hoàn; Tác đụng an thần

Sedative effects o f Sedative p ill on experimental animals

Summary

Usage of ‘Sedative Pill’ is only deduced from treatment experience, there has been no research conducted Eo assess the pharmacetical effects on the nervous system, as well as the safety on experimental animals The purpose of this research is to assess the pharmaceticai effects of Sedative pill and its components on the nervous system in order to provide more evidence of the effectiveness of the product before we conduct further clinical research

Materials: Dry ATH powder, chemicals: Diazepam, Sodium thiopental, tested animals: healthy male white Swiss mice (18 ­ 22g)

Research method: Dosage used in research: X (7.15 g/kg), 2X, 4X and 8X are equal to Ix, 2Xj 4x and 8x respectively) Assess the sedative effect through rope climbing model; elevated plus maze model

Results:

­ Sedative pill has the effect of relaxing muscles, reducing anxiety, sedating and controlling the central nervous system The intensity of the effect depends on the dosage

­ Stephania is the main component that has the most sedative and anxiety­reducing effects, as shown by the increase

in number and duration of the times the mice entering open arras, as well as increase in sleeping time by thiopental

* Key words: Sedative pill; Sedative effects

Bài thuốc “An thần hoàn” (ATH) được phát triển bởi lương y Nguyễn Tiến Khẩn, phối hợp liệu pháp dưỡng tâm an thần kết hợp kiện tỳ ích khí vói 5 dược liệu: b nh vôi, bạch truật, đảng sâm, hoài sơn và liên nhục với tỷ lệ thích hợp, bào chế dạng viên hoàn và được sử dụng tại Bệnh viện Y học cổ truyền tỉnh Hải Dương từ năm 1980 cho hầu hét bệnh nhân nhập viện vói triệu chứng mất ngủ do tâm tỳ hư [3] Hiện tại

* Cao đẳng Dược TW Hâi Dư ng

việc sử dụng ATH mới chỉ chủ yểu dựa ừên kinh nghiệm điều trị, chưa có một nghiên cửu nào được tiến hành để đánh giá tác dụng dược lý thần kinh cũng như độ an toàn trên động vật thực nghiệm Mục tiêu của nghiên cứu này là đánh giá tác dụng an thần cùa ATH và các thành phần ữong công thức trên thực nghiệm nhằm cung cấp thêm các bằng chứng về tác dụng dược lý của chế phẩm trước khi tién hành nghiên cứu trên lâm sàng Chúng tôi cũng thăm dò độc tính cấp của ATH để xác định liều thử phù hợp của chế phẩm trong các thí nghiệm này

II. NGUYÊNLIỆU VÀPHƯ ƠN GPHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Nguyên liệu

­ Cao khô An thần hoàn (ATH): các vị thuốc đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam r v do Bệnh viện Y học

Cổ truyền tỉnh Hải Dương cung cấp, được trộn với tỷ lệ thích hợp theo công thức cửa bài thuốc (B nh vôi

2000 g, Bạch traật 300 g, Đảng sâm đi thực 2000 g, Hoài sơn 1000 g, Liên nhục 1000 g), chiết bằng phương pháp ngâm lạnh vói ethanol 96%, sau đó cô dịch chiết đến dạng cao khô (hàm ẩm 3,33%, hiệu suất chiết 3,6%)

­ Hóa chất: Diazepam (biệt dược Seduxen của Gedeon Richter); thiopental natri của Rotexmedica; strychnin sulfat của Công ty cổ phần Dược phẩm TW 2

­ Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss khỏe mạnh, trọng lượng trang b nh 18

­ 22 g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Chuột được chia lô ngẫu nhiên 10­13 con/lô, nuôi trong điều kiện nhiệt độ 24 ± l°c, ánh sáng tự nhiên, được nuôi bằng thức ăn chuẩn, uống nước tự đo

2.2 Phương pháp nghiên cứu

­ Điều kiện tiến hành: Tất cà các thí nghiệm đều được tién hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 8 giờ ­1 7 giờ Chuột nhắt trắng được uống thuốc trong 5 ngày liên tục và tién hành các thí nghiệm vào ngày thứ 5, sau khi cho chuột uống thuốc 60 phút Cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được đuy tr bằng hai bóng đèn 60W

­ Liều sử dụng trong nghiên cứu: Sử dụng các liều ATH: X (7,15g/kg), 2X, 4X và 8X tương ứng với liều bằng lx, 2x, 4x và 8x liều ngoại suy từ liều sử dụng trên người Liều cùa b nh vôi và các thành phần còn lại trong công thức (bạch truật, đảng sâm, hoài sơn và liên nhục) được ngoại suy từ liều của chế phẩm toàn phần và tỷ lệ phần trăm các thành phần này trong công thức Liều của diazepam là 2 mg/kg thể trọng chuột Các thuốc thử được pha trong CMC 0,5% để tạo hỗn dịch cho chuột uống

­ Thăm dò độc tính cấp của ATH: cho chuột uống thuốc với liều tăng dần, từ liều cao nhất không gây chết chuột đến liều thấp nhất gây chết 100% chuột Quan sát hoạt động tự nhiên của chuột trong 7 ngày và ghi lại sổ chuột chết trong 72 giờ đầu sau khi uống thuốc, từ đó xác định liều LDsotheo phưcmg pháp của Litchield­Wilcoxon

­ Đánh giá tác dụng dược lý an thần của ATH

+ Mô h nh leo đây (mô h nh Grip) theo mô tả của Jamal [5] Chuột được đặt nhẹ nhàng lên dây bằng 2 chân trước Hoạt động của chuột được quan sát trong 5 giây và được đánh giá theo thang điểm: 0 điểm: chuột rơi; 1 điểm: chuột giữ nguyên tư thế; 2 điểm: chuột giữ nguyên tư thế và cổ gắng trèo lên; 3 điểm: chuột cố gắng trèo lên bằng 2 chân trước vói 1 hoặc cả 2 chân sau; 4 điểm: chuột trèo lên bằng cả 4 chân và quấn đuôi; 5 điểm: chuột chạy được trên đây

+ Mô h nh chữ thập nâng cao (elevated plus maze) theo mô tả của Lister [6] Dụng cụ bằng gỗ gồm 2 tay

kín kích thướọ 30 X5 X 15 cm (đài Xrộng Xcao), 2 tay mở kích thước 30 X5 X0,2 cm, đặt vuông góc với

nhau và đặt cách nền nhà 60 era tạo thành h nh chữ thập Chuột nhắt được đặt vào vùng trung tâm, mặt hướng về tay hở, sau đó được tự do đi chuyển khám phá trong 5 phứt Chuột được coi là ở trong 1 cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó Ghi nhận sổ lần vào và thời gian lưu lại ờ tay hở của mỗi chuột + Ảnh hư ng trên thời gian ngủ đo thiopental theo mô tả của Đỗ Trang Đàm [2], Chuột được tiêm tĩnh mạch đuôi thiopental liều 40 mg/kg Thời gian ngủ do thiopental được tính từ lúc chuột m t phản xạ thăng bằng cho đến khi chuột có lại phản xạ thăng bằng

464

+ Đối kháng co giật gây ra bời strychnin theo mô tả của Đỗ Trung Đàm [2] Chuột được tiêm dưới đa strychnin sulfat liều ỉ mg/kg sau đó, quan sát đáp ứng của chuột Ghi nhận tỷ lệ phần trăm chuột co giật và thời gian tiềm tàng kể từ khi tiêm strychnin đén khi chuột co giật

2.3 X ử lý số liệu: Dữ liệu được lưu trữ, phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 và được biểu diễn dưới dạng giá trị trang bĩnh ± sai số chuẩn (X ± SE) Qua phân tích kiểm chuẩn Kolmogorow­ Smimow cho thấy một số dừ liệu không tuân theo phân bổ chuẩn V vậy, mẫu không tuân theo phân bố chuẩn và các mẫu mà biến có tính chất không liên tục được kiểm định bằng test phi tham số Kruskal­Wallis sau đó là test Mann­ Whitney để so sánh sự khác biệt giữa các lô Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

r a KẾT QƯẢ

3.1 Thăm dồ độc tín h cấp của ATH

Các lô chuột nhắt trắng (10 con/lô) được uống ATH với mức liều tăng dần: 20X, 30X, 40X, 50X, 60X, 70X và 80X (tương ứng với 572 g/kg) Ở mức liều 20X và 30X, trong vòng 6 giờ đàu sau khi uổng thuốc, chuột ngủ, tụ lại từng đám, giãn cơ Từ mức liều 40X bắt đầu ghi nhận được chuột chết Tỷ lệ chuột chết tăng dần theo liều ATH và đạt 100% ở 2 mức liều 70X và 80X Liều LD50ước tính là 320,32 g/kg (tương đương 44,8X) với khoảng tin cậy 95% là 251,47­376,16 g/kg

3.2 Tác dụng dược lý an th n của ATH

Mô hình l o dây

Khả năng bám giữ trên dây của chuột ở các lô được tr nh bày ở bảng 1 Kết quả cho thấy, ATH ờ tất cả các mức liều thử (X, 2X, 4X và8X) đều có tác dụng làm giảm khả năng bám giữ trên dây của chuột so với lô uống nước muối sinh lỷ, tương tự tác dụng của diazepam 2 mg/kg)

Bảng 1 Ảnh hưởng của diazepam và ATH ỉên khả năng bám giữ trên dây của chuột

ATH8X 13 ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­2,3 ỉ ±0,411­­­­­­­­­­­­­­­­ p =0,000

3.3 Tác dụng đối kháng co giật do strychnin

Tác dụng đối kháng co giật gây ra bời strychnin của diazepam và ATH ở các mức liều khác nhau được

tr nh bày trong bảng 2 Ở tất cả các lô (trừ lô uống ATH liều8X), 100% chuột đều co giật sau khi tiêm strychnin Trên thời gian tiềm tàng co giật, diazepam và ATH ở cả 2 mức liều thử đều có tác dụng kéo dài thời gian này so với lô chứng (p<0,05)

Bảng 2 Ảnh hưởng của diazepam và ATH lên tỷ lệ chuột co giật và thời gian tiềm tàng co giật đo liều cao strychnin

Tỷ lệ co giật (%) Thời gian tiềm tàng (phút)

Diazepam (2 mg/kg) và bài thuốc ATH ở các mức liều 2X và 4X thể hiện tác dụng giải lo âu, làm tăng có

ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở so với lô chứng uống nước muối sinh lý, trong đó diazepam và bài thuốc ATH ở mức liều 4X còn làm tăng có ý nghĩa sổ lẩn vào tay hở so với lô chứng Mức liều 2X và 4X của bài thuốc ATH làm giảm có ý nghĩa số lần chuột vào tay kín nhưng không ỉăm thay đổi tổng số lần di chuyển của động vật trong mê cung chữ thập so với lô chứng {hình ỉ)

M ô h ìn h c h ữ thập n ân g cao

33

3

lẵ 2.5

1'

i 2

1.5

OS

0

120

glQO

•b

M 80

I 'ầ‘60

J*

H 4 0

H 2 0

NaCl Diazepam Bãi thuốc an thẩn hoào

NaCl Diazepam Bãi thuốc an thần hoàn

H nh 1: Tác dụng giải lo âu cùa diazepam và bài thuốc ATH trên mô h nh chữ thập nâng cao A: số lần vào tav hở, B: thời eian lưu lai tav hở *D<0.05 so vứi nhnm c h r t ơ nAnơ mnni cinhK

kéo dài rõ rệt gấp 1,95 và 3,44 lần so với lô chứng, trong khi mức liều X và 2X không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian này (hình 2)

30 25 s*

I 20

15

iữ

NaC I Diazepam Bài tbuốc an thẩDLhoằn

H nh 2 Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam và bài thuốc ATH

p<0,01 so với nhóm chứng uống nuớc muối sinh lý

3.5 Tác dụng a n th ần và giải lo âu của các thành p hần trong bài thuốc ATH

Ở mức tương ứng với mức liều thể hiện tác dụng giải lo âu của bài thuốc ÁTH (2X), b nh vôi có xu hướng ỉàm tăng số lần lưu ỉại tay hở và làm tăng có ý nghĩa thòi gian lưu lại tay này so với nhóm chứng uổng nước muối sinh lý Phần dược liệu còn lại (bạch truật, hoài sơn, đảng sâm, liên nhục) không làm thay đổi các thông số này (hình 3)

466

0 0,002 2X 4X 2X 4X 2X 4X

NaCl DZP Bài thuốc BìnhTÔi DL còn lại NaCl DZF Bài thuốc BìnhTÒi D I còn lại

0 0,002 2S 4X 2X 4X 2X 4S

H nh 3 Tác dụng giải lo âu của diazepam (DZP), bài thuốc ATH và các dược liệu thành phần trên

mô h nh chữ thập nâng cao A: số lần vào ĩay mở, B: thời gian lưu lại tay mở, *p< ,05, **P<0,01

so với nhóm chứng uống nuớc muối sinh lý

Ở mức tương ứng với mức liều thể hiện tác đụng an thần của bài thuốc ATH (4X), b nh vôi có tác đụng kéo dài rõ rệt thời gian ngủ đo thiopental, tăng gấp 2,42 lần so với nhóm chứng uống nước muối sinh lý Tác dụng này tương đương với tác dụng của bài thuốc nhưng yếu hơn tác dụng của diazepam (2 mg/kg) Phần được liệu còn lại (bạch truật, hoài sơn, đảng sâm, liên nhục) cũng kéo dài có ý nghĩa thời gian nhưng không

rõ rệt như dược liệu b nh vôi (hình 4)

H nh 4 Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam, bài thuốc ATH và các thành phần của bặí thuôc, **p<0,01 so với nhóm chứng uống nuớc muối sinh lý

IV BÀN LUẬN

Để tạo cơ sở cho việc áp dụng chế phẩm ATH trong hỗ trợ điều ĩrị mất ngủ và các rối loạn tâm íhần­thần kinh liên quan, trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn một số mô h nh kinh điển để đánh giá tác dụng an thần thực nghiệm của chế phẩm bao gồm: mô h nh leo dây (tác dụng an thần giãn cơ)­ mô

h nh chữ thập nâng cao (tác dụng giải ỉo âu); đối kháng co giật gây ra bởi strychnin (tác dụng ức chế thần kinh TW); ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental (tác dụng an thần) [8] Tren các mô h nh này, ÀTH thể hiện tác dụng an thần thông qua tác dụng giãn cơ làm giảm khả năng bám gỉữ trên đây, tăng sổ lần vào và lưu lại ở tay hở, đôi kháng co giật gây ra bởi strychnin, kéo đài thời gian ngủ đo thiopental của động vật thực

45

0 0,00 2 2 X 4X 2X 4 X 2 X 4X sf g

N aC I D Z P B i thu c B ình vôi Đ I côm lạ i

nghiệm Tác dụng an thần của ATH phụ thuộc vào liều sử dụng Với mức liều tương đương với 2 lần mức liều sử dụng trên người (2X), ATH thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt Tác dụng an thần thể hiện rõ rệt hơn ở mức liều tương ứng với 4 lần liều sử dụng trên người (4X) trong khi tác dụng giải lo âu lại mất đi ở mức liều này Tác đụng đối kháng co giật gây ra bởi strychnin của chế phẩm chỉ thể hiện khi sử dụng liều cao: 4X và 8X Trong khi đó, tác dụng giãn cơ và điều hòa phối hợp hoạt động cơ (mô h nh leo dây) thể hiện ở tất cả các mức liều thử trên động vật thực nghiệm Mối liên quan giữa lilu và các tác dụng dược lý an thần khác nhau nói trên đã được mô tả vói các thuốc an thần kinh điển như đẫn chất benzodiazepin và cho thấy tầm quan trọng cùa việc lưa chọn ỉiều dùng thích hợp của ATH tùy theo tác dụng dược lý mong muốn Điều đáng lưu ý

là các liều thể hiện tác dụng được lý đều thấp hơn đáng kể liều LDso của ATH (~ 44,8X)

Để t m hiểu vai trò của từng thành phần trong công thức liên quan đến tác dụng an thần của ATH, chúng tôi đã đánh giá tác dụng của 2 nhóm thành phần chính: b nh vôi và các dược liệu còn lại trên hai mô h nh chữ thập nâng cao và kéo dài thời gian ngủ của thiopental với liều tương đương có so sánh với chế phẩm toàn phần Kết quả cho thấy: B nh vôi với mức liều tương đương với liều sử dụng trong chế phẩm toàn phần thể hiện tác dụng an thần, giải io âu thông qua việc làm tăng số lần vào và thời gian lưu lại ở tay hở trên mô h nh chữ thập nâng cao cũng như kéo dài thời gian ngủ do thiopental so với nhóm chứng Tác dụng này tương đương với tác dụng của chế phẩm toàn phần cho thấy vai trò quan trọng của B nh vôi với vị trí “Quân” trong bài thuốc Kết quả công bố trước đó của chúng tôi và một số tác giả khác cũng đã chứng minh tác dụng an thần, giải io âu thực nghiệm của nhiều loài trong chi St phania [1,7] Phần dược liệu còn lại tuy không thể hiện tác đụng giải lo âu nhưng thể hiện tác dụng an thần trên mô h nh kéo dài thời gian ngủ của thiopental, tương ứng với tác dụng dưỡng tâm, kiện tỳ để hiệp đồng tăng tác dụng của B nh vôi trong bài thuốc [4]

V K ẾT LUẬN

­ ATH có tác đụng giãn cơ (mô h nh leo dây), giải lo (mô h nh chữ thập nâng cao, an thần (kệo dài thời gian ngủ do thiopental) và ức chế thần kinh trung ương (đổi kháng với co giật gây ra bởi strychnin) Tác dụng an thần của ATH phụ thuộc vào liều sử dụng

­ B nh vôi là thành phần chính có tác đụng an thần và giải lo âu rõ rệt nhất trong số 5 thành phần của ATH thể hiện ở tác đụng làm tăng số lần vào và thời gian lưu lại ở tay hở đồng thời kéo dài thời gian ngủ do thiopental Các thành phần còn lại (Liên nhục, Hoài sơn, Đảng sâm, Bạch truật) không thể hiện tác dụng giải

lo âu nhung có tác dụng an thần, làm kéo dài có ý nghĩa thời gian ngủ do thiopentaĩ

Kết quả này là cơ sở để tiếp tục đánh giá hiệu quả lâm sàng của chế phẩm ATH trong điều trị các rối loạn

lo âu và mất ngủ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Hoàng Anh và c s (2013), “Nghiên cứu tác đụng an thần và chống trầm cảm trên động vật thực nghiệm của St phania sinica Điels và St phania dỉ lsiana Y.c Wu’\ Tạp chí Dược học, 447, tr 35­40

2 Đỗ Trung Đàm, Đỗ Thị Phượng (2006), “Tác dụng an thần của senin, bột alcaloid lá sen”, Tạp chí Dược Học,

368, tr 19­22

3 Trần Bá Kiên và cộng sự, (2012), “Nghiên cứu, sản xuất viên nang An thần từ bài thuốc “An thần hoàn” đang sỏ đụng íạibệnh viện Y học cổ truyền Hài đương”, Thuyết minh đề tài Nghiên cửu khoa học và Phát triển công nghệ tinh Hải dư ng

4 Ngô Danh Lục, Nguyễn Minh Hà (2010), “Nghiên cứu tác dụng an thần của bài thuốc Nhân sâm dưỡng vinh (NSDV) trên động vật thực nghiệm”, Tạp chí Dược Học, 406, tr.9­13

5 Jamal H,, Ansari w H., Rizvi s J (2008), “Evaluation ofchaicones­a flavonoid subclass, for their anxiolytic effects in rats using elevated plus maze and open field behaviour test”, Fundam ntal &ClinicalPharmacology, 22, pp 673­681

6 Lister RG (1987), "The use of a pius­maze to measure anxiety in the mouse", Psychopharmacol, 92,180­185

7 Muchimapura s, Phachonpal w , Tong­Un T et al (2012), "Evaluation of neuropharmacological activities of

St phania v nosa herbs comsumption in healthy rats", Am J Agricult Biol Sci., 1, 271­277

8 Vogel H.G (Editor), (2008), “Drug discov ry and valuation: Pharmacological assay”, 2ndedition, springer­ Verlag Berlin

468