nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen curcuma zedoaria roscoe

Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đe[r]

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP

CURCUMINOID

Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria

Roscoe)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS NGUYỄN HOÀNG LỘC

LỜI CÁM ƠN

Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ giảng viên của Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa cơ bản,

Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án

Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ cả vật chất lẫn tinh thần

Xin trân trọng cảm ơn!

Huế, ngày tháng năm 2019

Tác giả

Trương Thị Phương Lan

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả luận án

Trương Thị Phương Lan

CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1

CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2

CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3

DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

dw dry weight (khối lượng khô)

FRAP ferric reducing antioxidant power

fw fresh weight (khối lượng tươi)

HPLC high-performance liquid chromatography IBA 3-indolebutyric acid

MAPK mitogen-activated protein kinase

MeJA methyl jasmonate

MS Murashige and Skoog (1962)

NAA naphthaleneacetic acid

PAA phenyl acetic acid

ROS reactive oxygen species

SA salicylic acid

SNP sodium nitroprusside

YE yeast extract (dịch chiết nấm men)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 CÂY NGHỆ ĐEN 5

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.2 Phân bố 5

1.1.3 Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen 6

1.1.3.1 Tinh dầu 6

1.1.3.2 Curcuminoid 7

1.1.4 Công dụng của nghệ đen 8

1.1.4.1 Hoạt tính giảm đau 8

1.1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư 9

1.1.4.3 Hoạt tính bảo vệ gan 9

1.1.4.4 Hoạt tính kháng viêm và chống loét 9

1.1.4.5 Hoạt tính chống oxy hóa 10

1.1.4.6 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 10

1.1.4.7 Các hoạt tính khác 11

1.3 ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG 15

1.3.1 Elicitor 15

1.3.1.1 Khái niệm 15

1.3.1.2 Phân loại 15

1.3.1.3 Cơ chế kích kháng 16

1.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng 18

1.3.2 Ứng dụng của elicitor 20

1.3.2.1 Elicitor sinh học 20

1.3.2.2 Elicitor phi sinh học 26

1.4 CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID 27

1.4.1 Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid 27

1.4.2 Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid 31

1.4.2.1 Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS) 31

1.4.2.2 Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS) 31

1.4.2.3 Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase 32

1.4.2.4 Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase 33

1.4.2.5 Các gen khác 34

1.4.3 Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp 35

1.4.4 Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor 37

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen 40

2.2.1.1 Khử trùng mẫu vật 40

2.2.1.2 Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro 41

2.2.1.3 Nuôi cấy callus 41

2.2.1.4 Nuôi cấy tế bào 41

2.2.2 Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid 42

2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 42

2.2.2.2 Khuếch đại PCR 43

2.2.2.3 Tạo dòng và chú giải gen 43

2.2.2.4 Xây dựng cây phả hệ 45

2.2.3 Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid 46

2.2.3.1 Xử lý elicitor 46

2.2.3.2 Phân tích RT-PCR 46

2.2.3.3 Phân tích HPLC 48

2.2.4 Xử lý thống kê 49

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 50

3.1.1 Nhân giống cây nghệ đen in vitro 50

3.1.1.1 Tái sinh chồi 50

3.1.1.2 Tạo rễ in vitro 52

3.1.2 Nuôi cấy callus 54

3.1.2.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN 54

3.1.2.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA 55

3.1.2.3 Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3 55

3.1.3 Nuôi cấy tế bào nghệ đen 57

3.2 NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 59

3.2.1 Phân lập gen 59

3.2.2 Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid 68

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID 72

3.3.1 Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid 72

3.3.2 Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid 74

3.3.3 Tích lũy curcumin 76

Chương 4 BÀN LUẬN 79

4.1 THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO 79

4.1.1 Nhân giống cây nghệ đen in vitro 79

4.1.2 Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen 81

4.2 PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 83

4.2.1 Phân lập gen tổng hợp curcuminoid 83

4.2.2 Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid 85

4.3 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID 85

4.3.1 Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu 85

4.3.1.1 Dịch chiết nấm men 85

4.3.1.2 Salicylic acid 87

4.3.2 Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào 89

4.3.3 Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen 90

4.3.4 Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin 92

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95

KẾT LUẬN 95

KIẾN NGHỊ 95

DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO 97

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại các elicitor khác nhau 17 Bảng 1.2 Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất

thứ cấp trong nuôi cấy in vitro 21

Bảng 2.1 Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 45 Bảng 2.2 Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 47

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in

vitro nguyên vẹn 51

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in

vitro đã được chẻ đôi 52

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro 53

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen 55 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen 56

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen 56 Bảng 3.7 Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen

CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ

đen 70 Bảng 3.8 Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp curcuminoid 76 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong

tế bào nghệ đen 77

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của các curcumin 8

Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng 30

Hình 1.3 Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng 32

Hình 2.1 Cây nghệ đen 39

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 40

Hình 2.3 Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ) 44

Hình 2.4 Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1 48

Hình 3.1 Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi 53

Hình 3.2 Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 1 mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B) 57

Hình 3.3 Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen 58

Hình 3.4 Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L 59

Hình 3.5 Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen 59

Hình 3.6 Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số của nghệ đen 61

Hình 3.7 Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 61

Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS (MF663785) ở nghệ đen và DCS ở nghệ vàng (AB495006.1) 62

Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1 (MF402846) ở nghệ đen và CURS1 ở nghệ vàng (AB495007.1) 63

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS2 (MF402846) ở nghệ đen và CURS2 ở nghệ vàng (AB506762.1) 64

Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3 (NCBI: MF987835) ở nghệ đen và CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763.1).

65

Hình 3.12 So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS (C0SVZ5.1) 66

Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1 (AJF45913.1) 66

Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS2 và CURS2 (BAW81545.1) 67

Hình 3.15 So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS3 và CURS3 (AJF45914.1) 67

Hình 3.16 Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid 68

Hình 3.17 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen 70

Hình 3.18 Phổ HPLC của curcumin chuẩn 71

Hình 3.19 Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen 71

Hình 3.20 Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen 72

Hình 3.21 RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor 73

Hình 3.22 Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor 74

Hình 3.23 Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen 75

Hình 3.24 Phổ HPLC của curcumin chuẩn 78

Hình 3.25 Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày nuôi cấy 78

Hình 3.26 Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5 ngày nuôi cấy 79

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae)

còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ở Ấn

Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7] Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của chu kỳ kinh nguyệt [157]

Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76] Các nghiên cứu gần đây cho thấy curcuminoid, đặc biệt là curcumin, có phạm vi tác dụng dược lý rộng như kháng viêm, kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa mạnh, chống tia tử ngoại, ức chế phát triển khối u và bảo vệ thần kinh (kháng β-amyloid) [14], [58], [116] Curcuminoid được chiết xuất từ củ (thân rễ) của các loài nghệ

khác nhau, chẳng hạn C caesia [24], C amada [50], C longa [67], C

aromatica [74] và C zedoaria [78] Curcuminoid hiện đang được sử dụng như

dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư trực tràng, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, bệnh vảy nến… [35] Nhiều nghiên cứu cũng đã cho thấy curcuminoid có độ an toàn cao, dung nạp tốt với

cơ thể, không độc đến liều 8 g/kg thể trọng [46]

Hiện nay, các gen tham gia trong quá trình tổng hợp curcuminoid ở nghệ

vàng (C longa) đã được xác định và phân tích mức độ biểu hiện, bao gồm hai

nhóm gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase là diketide-CoA

synthase (DCS) và các curcumin synthase (CURS1, CURS2 và CURS3) [66],

[67] Trước đó, Brand và cs (2006) cũng đã mô tả một gen mã hóa enzyme

type III polyketide synthase khác là chalcone synthase (CHS) có ở cây

Wachendorfia thyrsiflora, và gen này cũng tham gia vào quá trình tổng hợp

curcuminoid [28] Behar và cs (2016) khi phân tích biểu hiện của các gen tham

gia tổng hợp curcuminoid ở C caesia bao gồm DCS, CURS, CURS2, CURS3

và CHS1 đã nhận thấy mức độ biểu hiện của chúng trong củ cao hơn ở lá [24]

Tuy nhiên, các gen tham gia tổng hợp curcuminoid ở loài nghệ đen đến nay vẫn chưa được công bố

Elicitor là những chất hóa học được dùng để tác động vào con đường chuyển hóa thứ cấp nhằm tăng cường sinh tổng hợp các chất có giá trị dược phẩm trong nuôi cấy tế bào thực vật [62], [111] Theo Abraham và cs (2011),

dịch chiết nấm men (YE) đã được ứng dụng trong nuôi cấy in vitro thực vật do

khả năng kích thích cơ chế bảo vệ, tăng sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp

có hoạt tính sinh học [9] Salicilic acid (SA) được xem là một trong những tín hiệu quan trọng trong phản ứng tự vệ của cây và cũng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các chất chuyển hóa từ nuôi cấy tế bào thực vật [22] Methyl jasmonate (MeJA) cũng đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu điều chỉnh khả năng phòng vệ của thực vật và

có thể kích thích sự sản sinh các chất chuyển hóa thứ cấp trong nuôi cấy tế bào [158], [169]

Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gia vào quá trình

tổng hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)” nhằm

xác định các loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng để điều hòa tăng biểu hiện của các gen mã hóa enzyme type III polyketide synthase trong con đường phenylpropanoid ở tế bào nghệ đen Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò của SA, YE và MeJA như là những chất điều hòa dương tính của biểu hiện gen ở loài dược liệu có giá trị này

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu lý thuyết

Cải thiện mức độ biểu hiện của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và

CzCURS3 tham gia trong con đường chuyển hóa phenylpropanoid sinh tổng

hợp curcuminoid ở tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro bằng một số elicitor

Mục tiêu thực nghiệm

Tăng hiệu suất sinh tổng hợp curcumin, một thành phần chính của nhóm chất curcuminoid được ứng dụng nhiều trong dược phẩm, ở tế bào nghệ đen

nuôi cấy in vitro

3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu

- Nuôi cấy sinh khối tế bào nghệ đen in vitro hiệu suất cao bằng cách bổ

sung AgNO3 vào môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm

- Phân lập các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS tham gia

trong quá trình tổng hợp curcuminoid (các gen curcuminoid) ở nghệ đen

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số elicitor như YE, SA và MeJA lên mức

độ biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid và khả năng tích lũy curcumin

trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro

4 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án có các đóng góp mới như sau:

- Các nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào cây nghệ đen trước đây đều chưa

sử dụng AgNO3 để tăng hiệu quả nuôi cấy, trong nghiên cứu này, bổ sung AgNO3 1,5 mg/L vào môi trường nuôi cấy (bao gồm tạo cây in vitro, nuôi cấy

callus) đều làm tăng hiệu quả của quá trình nuôi cấy so với các nghiên cứu trước đây

- Đã phân lập thành công 4 gen tham gia vào quá trình tổng hợp curcuminoid, các gen này tương đồng 99% so với các gen tương ứng ở cây nghệ vàng và đã được đăng ký trên ngân hàng gen với các mã số lần lượt là

MF663785, MF402846, MF402847 và MF987835 Các gen này đều có sự biểu hiện ở trong củ và callus của cây nghệ đen

- Gen DCS có vai trò lớn nhất trong các gen tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp curcumin ở cây nghệ đen, mức độ biểu hiện của gen này quyết định trực tiếp đến hàm lượng curcumin thu được

- Đã nghiên cứu được ảnh hưởng của một số loại elicitor (dịch chiết nấm men và salicilic acid) lên khả năng tích lũy curcumin và mức độ biểu hiện của các gen liên quan Giá trị tốt nhất thu được khi xử lý dịch chiết nấm men (1 g/L) sau 5 ngày nuôi cấy, mức độ biểu hiện cao hơn 2,78 lần so với đối chứng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

cm Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù, màu xanh lục nhạt, mép đỏ;

lá bắc phía trên màu vàng nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa Hoa màu vàng, đài hoa có thùy hình mác tù dài 15 mm, thùy giữa nhọn, cánh môi hẹp ở phía dưới nhưng hơi mở rộng phía trên [59], [105]

Trong hai tháng 3 và 4, các cụm hoa từ chồi nách của thân và chồi đỉnh của củ bắt đầu vươn lên mặt đất Trên các điểm gần cụm hoa thường phát triển các chồi và từ đó bắt đầu hình thành các nhánh mới Vào mùa thu, lá trên mặt đất bắt đầu lụi Từ tháng 11 đến tháng 12, các chất chuyển hóa thứ cấp ở củ bắt đầu được tích lũy [7]

1.1.2 Phân bố

Cây nghệ đen được xem như là cây bản địa của vùng Đông Bắc Ấn Độ nhưng hiện đang được trồng khắp nơi ở Ấn Độ, Malaysia, Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái… và một số tỉnh ở

miền Trung Hiện nay, cây nghệ đen cũng đã được trồng tại một số địa phương khác của miền Bắc và Tây Nguyên [6]

1.1.3 Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen

Nghệ đen là loài thảo dược có củ chứa các nhóm chất chủ yếu như tinh dầu (sesquiterpene và monosesquiterpene) và curcuminoid (curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin) Ngoài ra, cây nghệ còn chứa một số hợp chất khác như tinh bột, chất dẻo và các chất có vị đắng như tannin, flavonoiod [76]

1.1.3.1 Tinh dầu

Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như α-pinen, borneol, camphen, camphor và cineol bên cạnh các sesquiterpene, nhưng không phân lập và xác định được loại sesquiterpene nào Xingyi (1999) khi nghiên cứu tinh dầu nghệ đen ở Trung Quốc nhận thấy chúng chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone (45,02%), curcumenol (8,31%), β-elemene (5,79%) và isocurcumenol (4,05%) [164] Trong tinh dầu nghệ đen sinh trưởng ở vùng Đông Bắc Ấn Độ, Tohda và cs (2006) đã thu được 37 hợp chất, chiếm 87,7% lượng tinh dầu tổng số, chủ yếu là curzerenone (22,3%), tiếp đến là 1,8-cineole (15,9%) và germacrone (9%), β-tumerone (19,88%) và zingiberene (7,84%) [155] Duke và cs (2003) đã tìm thấy trong củ nghệ đen một số sesquiterpenoid như ar-turmerone zederone, β-turmerone, curcumadiol, curcumenol, curcumol, curcolone, curdione, curzerene, curzerenone, dehydrocurdione, epicurzerenone, furanodiene, isocurcumenol, procurcumenol và zingiberene [41]

Ở Việt Nam, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu Thành phần chính trong tinh dầu củ nghệ thu được tại Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [3], trong khi tinh dầu nghệ

đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) đều giàu epicurzerenon

và germacrone Các hợp chất khác trong tinh dầu có hàm lượng thấp hơn đó là α-cadinol, β-elemen, β-pinen, δ-cadinen, 1,8-cineol, 2,4-diisopropenyl-1-vinyl-cyclohexan, benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5 isopropyl, camphor, germacrene, isoborneol, T-muurolol và zingiberen [1] Thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt có chứa các hợp chất như γ-elemen (14,18-18,79%), curzeren (14,28-16,67%), và germacrone (22,53-24,28%) [4]

1.1.3.2 Curcuminoid

Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu, các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng được quan tâm Syu và cs (1998) nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa các hợp chất nhóm curcuminoid là curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin (Hình 1.1) [149]

Curcumin (C21H20O6) là một hợp chất dạng tinh thể, màu vàng cam, có

trong các loài thực vật thuộc chi Curcuma, tan tốt trong các dung môi hữu cơ

như acetone, methanol, ethanol và isopropanol nhưng không tan trong nước Các dung môi hòa tan thích hợp để tách chiết curcumin là acetone, dichloromethan, ethanol ethyl acetate, methanol, n-butanol và hexane Curcumin có thể được thu hồi bằng cách kết tinh từ dịch chiết [2], [60]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của các curcumin

1.1.4 Công dụng của nghệ đen

Cây nghệ đen được trồng phổ biến dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các nước vùng Đông và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Nhật Bản, Trung Quốc, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam [59], [135] Từ lâu, nghệ đen đã được sử dụng như một vị thuốc trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh Nghệ đen cũng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều trị hội chứng “Oketsu” gây

ra do tắc nghẽn mạch máu, điều kinh và cải thiện kinh nguyệt với nhiều dạng pha chế khác nhau [96] Ở Thái Lan, nghệ đen được dùng để làm dịu cơn đau

dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt hoặc làm se các vết thương ở ngoài da [135] Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong gân, ung nhọt và vết thương [41] Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa bệnh phù hay phong hủi [64], [109] Ngày nay, nhiều hoạt chất sinh học của nghệ đen đã được chứng minh có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống đột biến…

1.1.4.1 Hoạt tính giảm đau

Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của hai loại sesquiterpene là cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen trên thỏ và chuột thực nghiệm Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối [144] De Navarro và cs (2002) khi nghiên cứu hoạt tính giảm đau của nghệ đen ở Brazil đã nhận thấy hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao hơn nhiều lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường như aspirin và dipyrone [38]

1.1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư

Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt tính chống ung thư và kháng viêm Khả năng ức chế sinh tổng hợp các chất prostalandin và NO của dịch chiết nghệ được cho là có tiềm năng trong việc kháng viêm và trong hóa trị liệu chống ung thư [59] Seo và cs (2005) nhận thấy dịch chiết nước của củ nghệ có hoạt tính chống di căn phổi của các tế bào khối u ác tính B16 [140] Syu và cs (1998) đã nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của các curcuminoid thu được từ dịch chiết ethanol của củ nghệ Kết quả cho thấy, chúng có hoạt tính gây độc đối với các tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-3 ở người [149] Các nghiên cứu của Jiang và cs (1996), Hanif và cs (1997) cũng cho thấy curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô gan ở người [55], [63]

1.1.4.3 Hoạt tính bảo vệ gan

Matsuda và cs (1998) nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen

có hoạt tính bảo vệ gan, sesquiterpene và curcumin chống lại sự hình thành galactosamine/lipopolysaccharide làm giảm tổn thương gan ở chuột [95] Kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen có thể được sử dụng như một loại thuốc tiềm năng trong điều trị chứng xơ gan mãn tính [70]

D-1.1.4.4 Hoạt tính kháng viêm và chống loét

Nghệ đen còn được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu để điều trị các

vị trí bị loét trong hệ tiêu hóa Nghiên cứu của Raghuveer và cs (2003) cho thấy dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm loét dạ dày [122] Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét của 8 loại dịch chiết từ nghệ đen trồng ở Yakushima (Nhật Bản) trên chuột gây viêm loét dạ dày cấp tính Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)-(+) germacrone 4,5-epoxide phân lập từ tinh dầu nghệ đen có hoạt tính ức chế sự hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [161] Jang và cs (2001) nhận thấy

ba hợp chất epiprocurcumenol, procurcumenol và 7-bis 1,4,6-heptatrien-3-one từ dịch chiết củ nghệ đen có hoạt tính kháng viêm [61]

(4-hydroxyphenyl)-1.1.4.5 Hoạt tính chống oxy hóa

Theo Matsuda và cs (1993), các hợp chất curcumin, demethoxycurcumin

và bisdemethoxycurcumin phân lập từ củ nghệ đen có hoạt tính chống oxy hóa

và kháng viêm tương đương với các chất này thu được từ củ nghệ vàng [94] Dịch chiết ethanol của củ nghệ đen ở Thái Lan có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH với nồng độ ức chế 50% (EC50) từ 18,29-40,33 μg/mL (trung bình 25,71 μg/mL) Khả năng bắt gốc tự do của các curcuminoid phân tách từ dịch chiết ethanol của nghệ đen lần lượt là: curcumin (EC50 = 7,89 μg/mL), demethoxycurcumin (EC50 = 9,52 μg/mL) và bisdemethoxycurcumin (EC50 = 149,09 μg/mL) [114] Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy tinh dầu nghệ đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20 mg/mL có khả năng chống oxy hóa tương đối cao, từ 74,8-77,8% [4] Nghiên cứu của Loc và cs (2008) cho thấy hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa như peroxidase, superoxide dismutase và catalase trong tế bào nghệ đen đạt giá trị cao nhất sau 14 ngày nuôi cấy, lần lượt là 0,63 U/mg, 16,60 U/mg và 19,59 U/mg protein [81]

subtilis NCIM 2603, Escherichia coli NCIM 2574, Klebsiella pneumoniae

NCIM 2957, Micrococcus luteus NCIM 2103 và Proteus mirabilis NCIM

2300, và hai chủng nấm là Aspergillus niger NCIM 596 và Candida albicans

NCIM 3102 [162] Dịch chiết ethanol của nghệ đen trồng ở Ấn Độ có khả năng

kháng B cereus ở nồng độ 1.000 μg/mL và có hoạt tính ức chế tương đối với

C albicans và K pneumoniae [145] Nghiên cứu của Giang và cs (2000) cho

thấy, dịch chiết củ nghệ đen trồng ở Việt Nam có phổ kháng khuẩn rộng Các chất như a-humulene, humulene-8-hydroperoxide, zerumbone và zerumbone-2,3-epoxide có hoạt tính kháng lại các loài vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) được thử nghiệm [49]

1.1.4.7 Các hoạt tính khác

Ansari và Ahmad (1991) nhận thấy dịch chiết alcohol từ củ nghệ đen nồng

độ 1-10 mg/mL có khả năng ức chế sự phát triển của amoeba (Entamoeba

histolytica) [16] Champakaew và cs (2007) khi phân tích thành phần hóa học

và thử hoạt tính kháng muỗi Aedes aegypti mang virus gây bệnh sốt Dengue

của tinh dầu nghệ đen đã nhận thấy chúng thật sự có hiệu quả trong việc giết chết các ấu trùng muỗi, đây được xem là nguồn tinh dầu thay thế triển vọng để phát triển các loại thuốc diệt ấu trùng muỗi trong tương lai [30] Daduang và cs (2005) nghiên cứu khả năng kháng nọc độc rắn của dịch chiết nghệ đen cho thấy nó có tác dụng ngăn cản nọc độc di chuyển trước khi bổ sung kháng thể kháng độc [37]

1.2 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP

1.2.1 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có nhiều triển vọng và ứng dụng lâu dài trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là các chất dùng trong y học Hướng nghiên cứu này sẽ dẫn đến sự ổn định về mặt chất lượng và số lượng sản phẩm, ít phụ thuộc vào tự nhiên Đồng thời, là nguồn nguyên liệu cho những

thí nghiệm sinh lý, hóa sinh và ứng dụng để tách chiết các hợp chất thứ cấp khác nhau [5]

Các nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các chất đó được chiết

từ cây ngoài tự nhiên Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:

- Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong các điều kiện nhân tạo nên không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý, không cần phải vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

- Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm bằng cách loại

bỏ các trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật

- Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong

tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng)

- Một số sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [5]

- Chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau

- Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm sẽ tăng lên [108] Thực vật có khả năng sản xuất số lượng lớn các hợp chất thứ cấp và sự phân bố các hợp chất thứ cấp ở mức độ tế bào phụ thuộc vào con đường sinh tổng hợp và đặc điểm cấu trúc của chúng [112] Trong đó, các không bào dự trữ thường chiếm 40-90% thể tích tế bào thực vật, chúng đóng vai trò then chốt trong sự tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong không bào có ít nhất hai vai trò được xác định đó là lưu trữ tạm thời các hoạt chất sinh học nội sinh trong tế bào và bảo vệ chúng khỏi quá trình dị hóa [52] Các nghiên cứu cũng cho thấy có hai cơ chế vận chuyển các hợp chất thứ cấp chủ yếu trong không bào đó là vận chuyển theo gradient H+ qua kênh

vận chuyển ion H+ và vận chuyển sơ cấp cần năng lượng trực tiếp bởi các chất mang dạng hình hộp liên kết với phân tử ATP [93] Một số nghiên cứu khác cũng nhận thấy, gen không những liên quan đến sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mà còn liên quan đến các yếu tố vận chuyển chúng Kết quả nghiên cứu này sẽ hữu ích trong công nghệ trao đổi chất nhằm tăng khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị ở thực vật [165]

1.2.2 Các phương pháp nuôi cấy sử dụng trong sản xuất hợp chất thứ cấp từ thực vật

1.2.2.1 Nuôi cấy callus

Nuôi cấy callus là quá trình nuôi cấy các tế bào thực vật không biệt hóa được hình thành bằng cách nuôi cấy các mô trên môi trường chứa nồng độ

auxin cao hoặc kết hợp auxin và cytokinin trong điều kiện in vitro Nuôi cấy

callus đã được ứng dụng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật đặc biệt

là các hợp chất flavonoid Quy trình nuôi cấy callus ổn định và tối ưu là bước quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy huyền phù để sản xuất hợp chất thứ cấp ở quy mô lớn hơn [153]

1.2.2.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào là quá trình nuôi cấy các tế bào hay một khối

tế bào nhỏ không biệt hóa của thực vật trong môi trường lỏng và được duy trì trong điều kiện sục khí, kích thích, ánh sáng, nhiệt độ và các thông số vật lý thích hợp Các tế bào nuôi cấy không chỉ có thể tạo ra các hợp chất hóa sinh tiêu chuẩn xác định với khối lượng lớn mà còn loại bỏ sự hiện diện của nhiều hợp chất không mong muốn khác với trong cây tự nhiên Nuôi cấy huyền phù

tế bào được ứng dụng phổ biến nhất để sản xuất thứ cấp ở quy mô lớn Một số loại bioreactor khác nhau đã được sử dụng cho quá trình nuôi ấy Ứng dụng thương mại đầu tiên về nuôi cấy tế bào quy mô lớn được thực hiện trong các

bioreactor bể khuấy có công suất 200 lít và 750 lít để sản xuất shikonin từ

Lithospermum erythrorhizon Tế bào của Catharanthus roseus, Dioscorea deltoidea, Digitalis lanata, Panax notoginseng, Taxus wallichiana và Podophyllum hexandrum đã được nuôi cấy trong các bioreactor khác nhau để

sản xuất các sản phẩm thực vật thứ cấp Những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy

tế bào để sản xuất các hợp chất dược phẩm đã tạo ra nhiều loại dược phẩm như alkaloids, terpenoids, steroid, saponin, phenolics, flavanoid Bằng cách cải biến quy trình nuôi cấy, sản lượng hợp chất thứ cấp thu được có thể tăng cao (dẫn theo Plunkett và cs 2004) [119]

1.2.2.3 Nuôi cấy rễ tơ

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ (hairy root) đã trở nên phổ biến trong hai thập

kỷ qua như một phương pháp để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp trong rễ Rễ tơ là các rễ đột biến trong quá trình nuôi cấy biệt hóa

được tạo ra bởi sự lây nhiễm của Agrobacterium rhizogenes vào các loài thực

vật bậc cao bị tổn thương Tác nhân gây bệnh này gây ra sự nhiễm bệnh dẫn đến sự phát triển các khối u của rễ được đặc trưng bởi tốc độ tăng trưởng cao trong môi trường không chứa hormone và sự ổn định di truyền khi nuôi cấy trong một thời gian dài Rễ tơ có con đường tổng hợp các hợp chất cũng giống với ở các cơ quan hoang dại nhưng lại cho năng suất cao hơn nhiều lần Chính đặc tính ổn định và năng suất cao cho phép khai thác rễ tơ là công cụ công nghệ sinh học có giá trị để sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật [113], [119]

1.2.3 Vai trò của AgNO 3 trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nano bạc bao gồm các hạt bạc có kích thược nano, khoảng từ 1-100 nm, thông thường kích thước đo được khoảng 25 nm Theo Kumar và cs (2009) và

Sandra & Maira (2013), AgNO3 khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô thực vật có tác dụng ức chế hoạt động của ethylene nội sinh, vì thế quá trình sinh trưởng của tế bào sẽ được thuận lợi hơn [73], [134]

Đến nay, AgNO3 đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật để tái sinh chồi, tăng hệ số nhân giống, phát sinh cơ quan, cải thiện các thông số

hóa sinh và thậm chí chuyển gen thông qua Agrobacterium… (Kumar và cs

2009) [73], Sandra và Maira 2013 [134], Sgamma và cs 2015 [141], Sarropoulou và cs 2016 [137], Mohiuddin và cs 1997 [104], Tamini và cs

2015 [151], Harathi và cs 2016 [56], Da Silva và cs 2013 [152]) Park và cs (2016) cho rằng YE và AgNO3 có thể cảm ứng làm tăng mức độ biểu hiện của gen sinh tổng hợp phenylpropanoid và tăng cường tích lũy rosmarinic acid

trong tế bào cây hoắc hương núi (Agastache rugosa) [115]

1.3.1.2 Phân loại

Elicitor có thể được phân loại dựa trên bản chất tự nhiên của chúng là elicitor phi sinh học (abiotic elicitor) và elicitor sinh học (biotic elicitor), hoặc dựa vào nguồn gốc của chúng là elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) và elicitor nội sinh (endogenous elicitor) Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn

gốc không thuộc sinh vật, chủ yếu là các muối vô cơ và các tác nhân vật lý, ví dụ: các ion Cu2+, Cd2+, Ca2+, độ pH cao Elicitor sinh học là các chất có nguồn gốc từ sinh vật, bao gồm các polysacharide của thành tế bào thực vật (cellulose hoặc pectin) và vi sinh vật (chitin hoặc glucan), hoặc các glycoprotein, G-protein hay các protein nội bào có chức năng gắn các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa hay bất hoạt một số các enzyme hoặc các kênh ion Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngoài tế bào như các acid béo, các polysaccharide và polyamine Ngược lại, elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào như là galacturonide, hepta-β-glucoside (Bảng 1.1)

[111]

1.3.1.3 Cơ chế kích kháng

Elicitor là các chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh ra khi thực vật chịu tác động của các tác nhân gây bệnh) Chúng có thể là các elicitor phi sinh học như ion kim loại, hợp chất vô cơ hoặc elicitor sinh học có nguồn gốc

từ nấm, vi khuẩn hoặc động vật ăn cỏ, mảnh vỡ của thành tế bào thực vật cũng như các chất được giải phóng ra tại vị trí tổn thương của thực vật do mầm bệnh hoặc động vật tấn công

Thực vật được xử lý elicitor hoặc bị mầm bệnh tấn công gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ, bao gồm sự tích lũy các hợp chất thứ cấp bảo vệ ở cả

trong cây tự nhiên cũng như trong nuôi cấy in vitro Mặc dù đã có nhiều nghiên

cứu về cơ chế ảnh hưởng của elicitor lên quá trình sinh tổng hợp các chất thứ cấp ở thực vật nhưng cơ chế của sự kích kháng vẫn chưa được hiểu đầy đủ Có nhiều giả thuyết đã được đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến sự nguyên vẹn của màng tế bào, các con đường ức chế/hoạt hóa nội bào hay sự thay đổi áp suất thẩm thấu [111]

Bảng 1.1 Phân loại các elicitor khác nhau [111]

A Theo bản chất

Elicitor sinh học Elicitor phi sinh học

- Được giải phóng trực tiếp từ vi sinh

vật và được nhận diện bởi tế bào thực

vật (các enzyme, các mảnh vỡ của

thành tế bào)

- Được tạo thành bởi hoạt động của vi

sinh vật trên thành tế bào thực vật

(pectin)

- Được tạo ra từ hoạt động của

enzyme thực vật trên thành tế bào vi

khuẩn (chitosan, glucan)

- Các hợp chất nội sinh được hình

thành hoặc tiết ra bởi tế bào thực vật

khi đáp ứng các kích thích khác nhau

- Tác dụng của các tác nhân vật lý hoặc hóa học tự nhiên theo đường nội sinh tạo thành các elicitor sinh học

B Theo nguồn gốc

- Hình thành từ bên ngoài tế bào, bao

gồm các phản ứng trực tiếp hoặc qua

các chất nội sinh trung gian

- Các polysaccharide: chitosan,

glucan, và glucomanose

- Peptide và chuỗi các ion dương:

glycoprotein, monilicolin, polyamine,

trên màng sinh chất để kích hoạt quá trình chống chịu [32], [54] Gelli và cs (1997) cho rằng khi có kích kháng, Ca2+ di chuyển vào tế bào chất từ bên ngoài

tế bào [48] Một số tác giả nhấn mạnh đến sự thay đổi nhanh chóng của quá trình phosphoryl hóa protein và kích hoạt kinase chính là cơ chế của quá trình kích kháng [47], [129] Trong khi đó, nhiều tác giả khác nhận thấy có sự tích lũy mitogen-activated protein kinase (MAPK) và kích hoạt G-protein trong quá trình kích kháng [10], [40] Armero và Tena (2001) cho rằng, có sự acid hóa màng nguyên sinh chất gây ra bởi sự bất hoạt H+-ATPase, trong khi giảm sự phân cực của màng, tăng pH bên ngoài màng được quan sát thấy khi xử lý elicitor [19] Apostol và cs (1989), Bolwell và cs (1995) và Pugin và cs (1997) giải thích rằng, việc sản xuất các ROS như anion superoxide và H2O2 tạo ra hiệu ứng kháng khuẩn trực tiếp cũng như góp phần tạo ra các dẫn xuất của acid béo có hoạt tính sinh học [17] Tương tự, ROS tham gia vào quá trình liên kết với protein giàu proline gắn trên thành tế bào sau đó hoạt động như là tín hiệu thứ cấp và kích hoạt dịch mã các gen bảo vệ [89]

Theo một giả thuyết khác, sự tích lũy của các protein liên quan đến việc bảo vệ thực vật khỏi các tác nhân gây bệnh như chitinase, glucanase và endopolygalacturonase góp phần giải phóng các pectic oligomer tín hiệu (elicitor nội sinh), glycoprotein giàu hydroxyproline và chất ức chế protease [25] Ngoài ra, sự kích hoạt phiên mã của các gen bảo vệ trong quá trình kích kháng cũng đã được công bố [99], [139]

1.3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng

Tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ nuôi cấy tế bào thực vật bằng cách xử lý chúng với các elicitor thích hợp đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong công nghiệp dược phẩm Các thông số như thành phần và nồng độ elicitor, thời gian xử lý, tuổi của tế bào, dòng tế bào, chất điều hòa sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng và đặc điểm thành tế bào phù hợp có

thể tăng khả năng tích lũy các sản phẩm thứ cấp [111]

Nồng độ elicitor: Nồng độ elicitor đóng vai trò rất quan trọng trong quá

trình kích kháng Namdeo và cs (2002, 2007) nhận thấy sự tích lũy ajmalicine

cao trong tế bào cây dừa cạn (Catharanthus roseus) được xử lý dịch chiết nấm

Trichoderma viride, Aspergillus niger và Fusarium moniliforme ở các nồng độ

khác nhau Lượng ajmalicine trong tế bào được xử lý elicitor nồng độ cao (5%)

lớn hơn so với nồng độ thấp (0,5%) Tuy nhiên, nồng độ elicitor >10% đã ảnh hưởng bất lợi lên sự tích lũy ajmalicine do chúng gây ra hiện tượng đáp ứng quá ngưỡng, dẫn đến chết tế bào [111], [110]

Thời gian xử lý elicitor: Nghiên cứu của Namdeo và cs (2002, 2007) cho

thấy lượng ajmalicine tăng khoảng 3 lần ở tế bào dừa cạn được xử lý dịch chiết

của T viride trong 48 giờ, trong khi đó chất này chỉ tăng 2 lần ở tế bào được

xử lý dịch chiết của A niger và F moniliforme trong cùng thời gian Khi thời

gian xử lý lớn hơn 96 giờ khả năng tích lũy ajmalicine của tế bào đã giảm rõ rệt [111], [110]

Tuổi của tế bào: Thời điểm cấy chuyển là một yếu tố quan trọng trong

sản xuất các chất chuyển hóa sinh học từ các tế bào được xử lý elicitor Namdeo

và cs (2002, 2007) nhận thấy lượng ajmalicine đạt cao nhất (166 µg/g khối

lượng khô (dw)) ở tế bào 20 ngày tuổi được xử lý dịch chiết của T viride [111],

[110]

Môi trường dinh dưỡng: Thành phần môi trường cũng đóng một vai trò

quan trọng trong quá trình kích kháng Theo Namdeo và cs (2002, 2007), ajmalicine được tích lũy ở tế bào sinh trưởng trong môi trường Zenk nhiều hơn

so với môi trường MS [111], [110]

Ngoài ra, sự kích kháng cũng phụ thuộc vào đặc tính của các elicitor, dòng

tế bào hoặc chủng vi sinh vật được sử dụng làm elicitor, sự có mặt của các chất điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [111]

1.3.2 Ứng dụng của elicitor

Đến nay, đã có nhiều công trình ứng dụng elicitor để kích thích sản xuất

các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy in vitro thực vật Các nghiên cứu đều cho thấy

sự tích lũy của những chất này đã tăng lên đáng kể so với đối chứng sau khi được xử lý với loại elicitor và nồng độ thích hợp của chúng (Bảng 1.2)

1.3.2.1 Elicitor sinh học

Thông thường, các elicitor có nguồn gốc phi sinh học hoặc kết hợp elicitor sinh học và phi sinh học được sử dụng phổ biến hơn Tuy nhiên, cũng có tác giả chỉ sử dụng elicitor sinh học trong các nghiên cứu của mình Chẳng hạn:

Cousins và cs (2010) đã nuôi cấy cây nghệ vàng (C longa) trong hệ lên

men thể tích 2,5 L có bổ sung nhiều loại elicitor khác nhau để cải thiện khả năng sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng Chẳng hạn: 1) phenylalanine được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ tuần thứ 12-17; và 2) proline, dịch chiết cá giàu proline hoặc chitosan được bổ sung vào tuần thứ 20

Ở trường hợp 1, sinh khối của cây và sự tích lũy các chất chống oxy hóa của chúng đã giảm sau 5 tuần xử lý Ở trường hợp 2, hàm lượng các hợp chất phenol tăng lên 4,7% dw (đối chứng 4,1% dw) khi xử lý nitrogen ở nồng độ thấp sau 1,5 tuần [36]

Khi nuôi cấy in vitro cây nghệ C mangga, Abraham và cs (2011) nhận

thấy xử lý YE không ảnh hưởng lên sinh khối và hình thành chồi ở cây con Ngoài ra, cây con có hình thái bất thường khi được xử lý YE ở nồng độ cao (>3,5 mg/L) Tuy nhiên, ở các môi trường có bổ sung YE, cây con tích lũy nhiều chất có hoạt tính bắt gốc tự do Cây con được nuôi trên môi trường có bổ sung chitosan 150 mg/L và YE 3,5 mg/L có hàm lượng chất bắt gốc tự do nhiều hơn các môi trường khác [9]

Bảng 1.2 Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro [111]

nuôi cấy

Không xử lý Xử lý

Hyoscyamus muticus Rễ tơ Rhizoctonia solani Sesquiterpenes 0 1 mg/10 g fw

Lithospermum

erythrorhizon

Tế bào Các tác nhân nội sinh (thô) Shikonin 0 28 µg/10mL

dw

Ảnh hưởng của các oligosaccharide DP4, DP7 và DP10 tách chiết từ

chủng nấm F oxysporum Dzf17 lên khả năng tích lũy diosgenin ở D

zingiberensis đã được Li và cs (2011) nghiên cứu Tế bào được xử lý với hỗn

hợp oligosaccharide nói trên ở nồng độ 20 mg/L sau 26 ngày nuôi và thu sinh khối vào ngày thứ 32 Hàm lượng diosgenin đạt được cao nhất là 2,187 mg/L, gấp 5,65 lần đối chứng Xử lý từng oligosaccharide riêng lẻ từ 2-10 mg/L cho thấy DP7 ở 6 mg/L cho hiệu quả cao nhất, lượng diosgenin đạt 3,202 mg/L, gấp 8,27 lần đối chứng Khi xử lý DP7 hai lần vào ngày 24 và 26 và thu vào ngày 30, lượng diosgenin còn tăng lên cao hơn nữa đạt 4,843 mg/L, gấp 12,38 lần đối chứng [77]

Bota và cs (2012) dùng dịch chiết của hai chủng nấm Botrytis và

Sclerotinia để tăng hàm lượng flavonoid ở Digitalis lanata Bổ sung 1-2 mL

dịch chiết nấm vào 100 mL dịch tế bào của dòng số 11 và 13 đã cải thiện sự tích lũy flavonoid theo thời gian và nồng độ xử lý Hàm lượng flavonoid thu

được sau 96 giờ nuôi dòng số 11 đạt 1.000 mg% (dịch chiết Botrytis) và 999,81 mg% (dịch chiết Sclerotinia), trong khi dòng số 13 đạt 1051,65 mg% (Botrytis)

dịch chiết A niger Hypersoid, quercitin và rutin cũng tăng lên nhiều trong các

công thức thử nghiệm [20]

Nuôi cấy rễ tơ cây rau sam (Portulaca oleracea) cũng đã được Pirian và

cs (2013) thực hiện YE ở các nồng độ 125, 250, 500 và 1.000 mg/L được sử dụng để cải thiện khả năng tích lũy noradrenaline với thời gian xử lý 2 ngày

Các tác giả nhận thấy YE ở nồng độ 250 và 500 mg/L là thích hợp nhất, hàm lượng noradrenaline đã tăng 3-4 lần so với đối chứng [117]

Admeh và cs (2014) đã dùng dịch chiết của A niger, P notatum, YE và chitosan để kích thích sản xuất psoralen trong nuôi cấy tế bào cây Psoralea

corylifolia Bổ sung dịch chiết A niger đã tăng lượng psoralen lên 9 lần so với

đối chứng Trong khi dùng P notatum, YE và chitosan lượng psoralen thu được

ít hơn 4-7 lần Nói chung, dịch chiết A niger 1% cho hiệu quả cao nhất, hàm

lượng psoralen đạt 9.850 μg/g sinh khối khô [12]

Nghiên cứu của Hasanloo (2014) cho thấy, chitosan có khả năng kích thích

tổng hợp silymarin trong nuôi cấy rễ tơ của loài Silybum marianum Rễ tơ sau

30 ngày nuôi cấy được xử lý với chitosan có khối lượng phân tử trung bình Hàm lượng silymarin tổng số tăng lên 5,26 lần và khối lượng khô của rễ tơ đạt cao nhất là 0,535 g sau 96 giờ xử lý với 30 mg/50 mL chitosan [57]

Hiệu quả của các elicitor sinh học cũng được Ebrahimi (2015) thử nghiệm

trong nuôi cấy tế bào Peganum harmala để tăng sinh tổng hợp hai loại alkaloid

β-carboline là harmaline và harmine Nuôi cấy đã được xử lý với dịch chiết của

các loại nấm (Alternaria alternate, A flavus, Coriolus versicolor, F

oxysporum, Mucor sp., P notatum và Rhizopus stonifer), dịch thủy phân casein

và YE ở các nồng độ khác nhau Lượng harmine thu được cao nhất khi bổ sung

YE 1.000 mg/L là 91,2 μg/g dw, gấp 1,68 lần đối chứng Khi bổ sung dịch thủy phân casein từ 75-100 mg/L vào nuôi cấy, sinh khối tế bào đã tăng mạnh, lượng harmaline và harmine cũng tăng lần lượt gấp 1,61 và 1,46 lần đối chứng [43]

Silene vulgaris là một loài thực vật được phân bố rộng rãi ở Bắc Mỹ chứa

các saponin loại oleanane có hoạt tính sinh học Khả năng sản xuất saponin bằng nuôi cấy rễ tơ của loài này đã được Kim và cs (2015) nghiên cứu thành

công Rễ tơ của S vulgaris được hình thành bằng cách lây nhiễm các mẫu lá với năm chủng Agrobacterium rhizogenes khác nhau (LBA9402, R1000, A4,

13333 và 15834) Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy, khả năng tích

lũy saponin triterpenoid trong rễ tơ có sự thay đổi đáng kể Lượng segetalic acid và gypsogenic acid cao gấp 5 và 2 lần tương ứng so với đối chứng [71] Arican (2016) nghiên cứu ảnh hưởng của các loại elicitor sinh học đến khả

năng tổng hợp triterpene trong nuôi cấy tế bào Alstonia scholaris Nuôi cấy được xử lý dịch chiết các loại nấm Candida albicans, F oxysporum, P

avelanium và YE Các elicitor gây ra sự kích thích nhanh chóng quá trình trao

đổi chất thứ cấp của các tế bào A scholaris dẫn đến tăng tổng hợp triterpenoid

Khi tiếp xúc trong thời gian dài, một số dòng tế bào có khả năng tăng gấp đôi sản lượng của triterpene YE là elicitor tốt nhất cho tất cả các dòng tế bào được khảo sát với lượng ursolic acid và oleanolic acid tích được tương ứng là 5 và 7 mg/g dw [18]

Hyoscyamine và scopolamine là hai loại alkaloid tropane rất có giá trị, thường được sử dụng để làm chất chống đông máu, chống co thắt, chống dị ứng, giảm đau và làm thuốc an thần Các chất này được phát hiện có nhiều

trong loài Hyoscyamus reticulatus Để tìm phương pháp sản xuất hyoscyamine

và scopolamine tốt nhất, Moharrami (2017) đã thử nghiệm nuôi cấy rễ tơ của

cây nảy mầm từ hạt được biến nạp chủng A rhizogenes A7 có xử lý elicitor

sinh học ở các nồng độ và thời điểm khác nhau Kết quả thu được cho thấy, YE ở 500 và 250 mg/L sau 48 giờ xử lý là tốt nhất, hàm lượng hyoscyamine và scopolamine đã tăng gấp 2 và 2,5 lần tương ứng so với đối chứng [103]

Năm 2018, Lee và cs đã nghiên cứu phương thức tăng khả năng tổng hợp

saponin trong nuôi cấy tế bào Kalopanax septemlobus bằng cách sử dụng

elicitor Khi không bổ sung elicitor, hàm lượng saponin tổng số thu được là 1,56 mg/60 mL sau 15 ngày nuôi cấy Khi bổ sung coronatine 1 μM, lượng saponin được tích lũy tăng lên 160% Ngoài ra, các tác giả nhận thấy coronatine còn làm tăng biểu hiện sinh tổng hợp β-amyrin từ đó dẫn đến tích lũy oleanolic acid (tiền thân của oleanan-một loại saponin triterpene) [75]

1.3.2.2 Elicitor phi sinh học

Các elicitor phi sinh học thường được dùng phổ biến hơn elicitor sinh học, nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành theo hướng này Rezaei và cs (2011) đã nghiên cứu sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào của cây thủy tùng

(Taxus baccata) bằng cách bổ sung SA từ 25-50 mg/L kết hợp với sóng siêu

âm có tần số 40 kHz trong 2 phút Hàm lượng taxol thu được ở môi trường có

SA 50 mg/L cao gấp 8 lần đối chứng [126]

MeJA đã được Wang và cs (2015) sử dụng để tăng sản xuất flavonoid

trong nuôi cấy tế bào Hypericum perforatum Khi bổ sung MeJA 100 μmol/L

vào môi trường trong 15 ngày đã thu được lượng flavonoid cao nhất là 280 mg/L, gấp 2,7 lần đối chứng Nguyên nhân có thể do MeJA ức chế hoạt tính catalase nhưng lại tăng hoạt tính phenylalanine ammonia lyase (PAL), những enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp flavonoid, từ đó tăng tổng hợp chất này trong quá trình nuôi cấy [159]

Năm 2016, Khojasteh và cs đã sản xuất thành công rosmarinic acid bằng

nuôi cấy tế bào Satureja khuzistanica trong nồi phản ứng sinh học (bioreactor)

Hai elicitor là MeJA (100 μM) và cyclodextrin (40 mM) đã được thử nghiệm riêng rẻ hoặc kết hợp Kết quả cho thấy chỉ có MeJA khi dùng riêng rẻ đã tăng tích lũy rosmarinic acid gấp 3 lần đối chứng, đạt 3,9 g/L Khi chuyển sang nuôi cấy trong các bioreactor, lượng rosmarinic acid tích lũy tối đa đạt 3,1 g/L [69] Manivannan và cs (2016) nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA, SA và SNP lên khả năng sinh tổng hợp các chất chống oxy hóa và các chất chuyển hóa thứ

cấp trong nuôi cấy tế bào Scrophularia kakudensis Tất cả các elicitor đều có

ảnh hưởng tích cực đến khả năng tích lũy các chất này trong tế bào Trong đó, MeJA từ 150-200 μM cho hiệu quả tổng hợp các chất nhóm phenol và flavonoid cao nhất [91]

Saeed (2017) khi nuôi cấy tế bào của rễ cây Ajuga bracteosa đã bổ sung

thêm MeJA và PAA Kết quả cho thấy sinh khối tế bào đã tăng đáng kể, đạt tối

đa 8,88 g/L dw ở ngày thứ 32 khi bổ sung MeJA 0,6 mg/L, và 8,24 g/L dw ở ngày thứ 40 khi bổ sung PAA 1,2 mg/L Ngoài ra, khả năng tích lũy các hợp chất phenol, flavonoid và hoạt tính chống oxy hóa cũng tăng lên nhiều lần khi

sử dụng hai loại elicitor nói trên [131]

Estrada-Soto và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA và SA

trong nuôi cấy callus lá của Leptochinia caulescens để sản xuất ursolic và

oleanolic acid Nhìn chung, cả hai loại elicitor nói trên đều có ảnh hưởng tích cực lên quá trình sản xuất ursolic và oleanolic acid Bổ sung MeJA trong 8 giờ

đã cho kết quả tốt nhất, hàm lượng các triterpen tăng gấp 5 lần đối chứng [45] Bên cạnh việc sử dụng riêng lẻ các loại elicitor sinh học và phi sinh học, rất nhiều công trình nghiên cứu đã sử dụng kết hợp các elicitor để mang lại hiệu quả cao hơn Artemisinin là chất thường được sử dụng để sản xuất thuốc chống sốt rét ở các nước châu Á và châu Phi Ahlawat và cs (2014) đã thiết lập nuôi

cấy rễ tơ cây Artemisia annua để sản xuất bằng cách bổ sung MeJA, dịch chiết nấm (A alternate, Curvularia limata, F solani và Piriformospora indica),

farnesyl pyrophosphate và miconazole vào môi trường nuôi cấy Kết quả xử lý riêng rẽ các elicitor cho thấy hiệu quả cao nhất thu được khi sử dụng dịch chiết

P indica, hàm lượng artemisinin cao gấp 1,97 lần đối chứng Tuy nhiên, khi

kết hợp xử lý MeJA và P indica, hàm lượng artemisinin đã tăng lên cao hơn,

đạt 2,44 lần [11]

1.4 CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID

1.4.1 Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid

Năm 1973, Roughly và Whiting đưa ra hai con đường sinh tổng hợp curcumin ở thực vật dựa trên các dữ liệu phân tích 14C Ở con đường thứ nhất, cinnamic acid kết hợp với malonyl-CoA (có nguồn gốc từ malonic acid) trong một chuỗi phản ứng mà cuối cùng được aryl hóa thành một curcuminoid Trong con đường thứ hai, hai đơn vị muối cinnamate được kết hợp với nhau bằng

malonyl-CoA Cả hai cơ chế cùng sử dụng cinnamic acid có nguồn gốc từ phenylalanine như điểm khởi đầu của chúng [72], [130]

Bằng cách sử dụng những chất đánh dấu đồng vị phóng xạ, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất nhóm curcuminoid có nguồn gốc từ các chất trung gian trong con đường phenylpropanoid kết hợp với các phân tử khác từ con đường tổng hợp acetate hay chuỗi ngắn và vừa của acid béo Dựa trên kết quả này, Schröder (1997) cho rằng các enzyme tương tự như polyketide synthase đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các cấu trúc khung của curcuminoid

và sử dụng các CoA có nguồn gốc từ các hợp chất trung gian Từ đó, hai con đường sinh tổng hợp curcuminoid đã được đưa ra Curcuminoid có thể được

hình thành từ sự kết hợp của hai phân tử p-coumaroyl-CoA với một phân tử

malonyl-CoA nhờ hoạt động của polyketide synthase (hoặc tương tự), có thể

do bổ sung diketide trung gian (Berbd và Schneider 2006) Kết quả, bisdemethoxycurcumin được chuyển thành demethoxycurcumin, rồi thành curcumin theo hai vòng liên tục của sự hydro hóa và methyl hóa Mặt khác, có khả năng enzyme tổng hợp curcuminoid sử dụng các dạng ester CoA của 2

phân tử p-coumaric acid và ferulic acid làm cơ chất Trong tường hợp này, sự

hydro hóa và methyl hóa dẫn tới sự hình thành các nhóm chức methoxyl trong phân tử curcumin tương tự như các phản ứng phát hiện trong con đường phenylpropanoid (Hình 1.2) [124]

Để tìm hiểu quá trình sinh tổng hợp curcuminoid ở cây nghệ vàng (C

longa), Kita và cs (2008) đã thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro cho loài dược

liệu này với các tiền chất bổ sung vào môi trường chứa 13C Kết quả phân tích hàm lượng demethoxycurcumin và các dạng curcuminoid khác bằng phân tích cộng hưởng từ hạt nhân 13C cho thấy một phân tử acetic acid hoặc malonic acid

và hai phân tử phenylalanine hoặc phenylpropanoid (không phải tyrosine) kết hợp tạo thành demethoxycurcumin Sự kết hợp với các cơ chất giống nhau để tạo thành demethoxycurcumin hay curcumin là tương tự nhau, theo thứ tự

malonic acid > acetic acid, và cinnamic acid > p-coumaric acid > ferulic acid

Kết quả này cho thấy có thể hai phân tử cinnamoyl-CoA và một phân tử malonyl-CoA đã tạo nên curcuminoid, các gốc hydroxy và methoxy trên vòng thơm được gắn vào sau khi hình thành cấu trúc khung của curcuminoid [72]

Xie và cs (2009) đã nghiên cứu các cơ chế điều hòa biểu hiện gen tổng hợp các hợp chất thứ cấp ở cây nghệ vàng và nhận thấy có một cơ chế điều hòa sinh tổng hợp ba dạng curcuminoid Sự tồn tại của cơ chế điều hòa này đã chứng minh cho giả thuyết rằng nhóm 3-methoxyl trên vòng thơm của phân tử curcuminoid được hình thành trước sự hình thành của khung heptanoid trong quá trình sinh tổng hợp curcumin cũng như sự tồn tại của nhiều gen mã hóa enzyme thuộc nhóm polyketide synthases với nhiều cơ chất khác nhau, hình thành nhiều diarylheptanoid trong cây nghệ vàng [163]