Nghiên cứu tạo hoạt chất mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa trên động vật thực nghiệm

Luận văn nghiên cứu tách chiết được hoạt chất mangostin sạch. Nghiên cứu công nghệ tạo hoạt chất mangostin phytosome. Từ đó đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất mangostin phytosome trên động vật thực nghiệm. Luận văn nghiên cứu tách chiết được hoạt chất mangostin sạch. Nghiên cứu công nghệ tạo hoạt chất mangostin phytosome. Từ đó đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất mangostin phytosome trên động vật thực nghiệm.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG MAI LINH

NGHIÊN CỨU TẠO HOẠT CHẤT MANGOSTIN PHYTOSOME VÀ

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HÓA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ THỊ TUYÊN

PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2020

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm và lòng biết ơn chân thành tới

TS Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên cứu hướng dẫn, cũng như tạo mọi điều kiện về trang thiết bị, hóa chất để tôi

có thể hoàn thành đề tài

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã cho tôi cơ hội thực hiện luận văn này tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Bộ quốc phòng

“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa phytosome của mangostin chiết xuất từ vỏ quả măng cụt dùng cho bộ đội làm việc trong điều kiện độc hại” do Thiếu tá, Ths Đoàn Thanh Huyền chủ nhiệm

Tôi xin cảm ơn tập thể phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ và chia sẻ tận tình cho tôi những kinh nghiệm chuyên môn trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn tới các thầy cô trong Khoa sinh học, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên tinh thần để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2020

Học viên

Hoàng Mai Linh

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hoạt chất α- mangostin 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Cấu trúc hóa học 3

1.1.3 Hoạt tính sinh học 4

1.2 Phytosome 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Thành phần của phytosome 8

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome 9

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome 10

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome 11

1.2.6 Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome 11

1.3 Peroxidase 12

1.4 Peroxy hóa lipid 13

1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở người 14

1.5.1 Staphylococcus aureus 14

1.5.2 Candida albicans 15

1.6 Tình hình nghiên cứu phytosome 15

1.6.1 Trên thế giới 15

1.6.2 Ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 19

iii

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Hóa chất 19

2.2 Các thiết bị thí nghiệm 21

Các thiết bị sử dụng chính trong các thí nghiệm được liệt kê trong bảng 21

2.3 Động vật thí nghiệm 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Tách chiết và tinh sạch α-mangostin 23

2.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC) 24

2.4.3 Sắc ký bản mỏng 25

2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 25

2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome 26

2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid 27

2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 28

2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase 29

2.4.9 Xác định làm lượng malondialdehyde 30

2.4.10 Xác định hàm lượng protein 31

2.4.11 Xác định hàm lượng -SH tự do 31

2.4.12 Xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 33

3.2 Điều chế mangostin phytosome 37

3.3 Đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome 39

3.3.1 Phân tích phổ hồng ngoại IR 39

3.3.2 Phân tích quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 41

3.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phytosome mangostin 42

3.5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên động vật thực nghiệm 43

3.5.1 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hoạt độ peroxidase trong gan 43

iv

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng MDA trong gan

chuột 45

3.5.2 Ảnh hưởng của mangostin phytosome lên hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của một Chromono 3

Hình 1.2 Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone 4

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của α- mangostin 4

Hình 1.4 Cấu tạo của phytosome 8

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin 10

Hình 1.6 Cấu trúc nhân hem của peroxidase 13

Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus 14

Hình 1.8 Hình dạng nấm Candida albicans 15

Hình 2.1 Quy trình tinh sạch α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia mangostana L 23

Hình 2.2 Sơ đồ bào chế mangostin phytosome 27

Hình 2.3 Đường chuẩn peroxidase có sử dụng chuẩn peroxidase horce 30

Hình 2.4 Đường chuẩn Bradford sử dụng BSA làm chuẩn 31

Hình 3.1 Tách chiết thu nhận hoạt chất α-mangostin 33

Hình 3.2 Ảnh chạy sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch α-mangostin 34

Hình 3.3 Hoạt chất α-mangostin dạng tinh thể 36

Hình 3.4 Phổ HPLC của hoạt chất - mangostin 36

Hình 3.5 Quá trình bào chế mangostin phytosome 39

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại của mẫu - mangostin 40

Hình 3.7 Hấp thụ huỳnh quang của phức mangostin phytosome 41

Hình 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn của α-mangostin và mangostin phytosome đối với nấm Candida albicans (A) và vi khuẩn Staphylococcus aureus (B) 42

Hình 3.9 Hoạt độ peroxidase trong gan chuột dưới tác dụng của mangostin phytosome 44

Hình 3.10 Sự thay đổi hàm lượng MDA trong gan dưới tác dụng của mangostin phytosome 46

Hình 3.11 Sự thay đổi hàm lượng nhóm -SH trong gan dưới tác dụng của mangostin phytosome 48

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm 20

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch 20

Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21

Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm 21

Bảng 2.5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất 22

Bảng 3.1 Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô 35

Bảng 3.2 Số liệu phân tích phổ HPLC của mẫu - mangostin tinh sạch 37

Bảng 3.3 Hiệu suất của quá trình điều chế mangostin phytosome 38

Bảng 3.4 Hoạt độ peroxidase trong gan chuột 44

Bảng 3.5 Hàm lượng MDA trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome mangostin 46

Bảng 3.6 Hàm lượng nhóm -SH trong gan chuột dưới tác dụng của phytosome mangostin 48

vii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1

HPLC High-performance liquid chromatography HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)

MỞ ĐẦU

Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) được

biết đến là “nữ hoàng trái cây” ngoài hương vị thơm ngon còn là một dược liệu quý giá, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học dân gian để chữa bệnh tiêu chảy, kiết lị…Nghiên cứu hóa thực vật cho thấy măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau như tannin, chất nhựa (resin), pectin và đặc biệt là các dẫn xuất xanthone, những chất thuộc nhóm chất phenolic Các chất xanthone của vỏ quả măng cụt đã được xác định là: -mangostin, -mangostin, -mangostin, isomangostin, normangostin, trong đó hoạt chất -mangostin có hàm lượng cao nhất, chiếm khoảng 0,02- 0,2% Các mangostin có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng nấm, hoạt tính chống viêm, hoạt tính chống oxi hóa nên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Hiện nay cùng với việc sử dụng công nghệ phytosome đang dần được ứng dụng rộng rãi do khả năng tăng sinh khả dụng rất lớn các hoạt chất có nguồn gốc từ

tự nhiên, có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ và liều sử dụng nhỏ Phytosome

có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và thuận lợi hơn

để được vận chuyển vào nội bào Công nghệ phytosome là công nghệ nghiên cứu bào chế và ứng dụng phức hợp của các hợp chất tự nhiên với phospholipid có cấu trúc tương tự màng tế bào nhằm tăng khả năng vận chuyển các hoạt chất từ môi trường thân nước sang môi trường thân lipid để tăng hấp thu cho các hoạt chất tự nhiên Sử dụng các hợp chất mangostin kết hợp với công nghệ phytosome sẽ tạo ra một dòng sản phẩm mới có nguồn gốc tự nhiên phục vụ trong chăm sóc sức khoẻ ngày càng phổ biến do tính tự nhiên, sự phong phú, tương hợp sinh học cao Sử dụng các phospholipid có nguồn gốc tự nhiên, phát triển thành công dạng bào chế phytosome cho các sản phẩm tự nhiên đã tạo ra một hướng đột phá mới cho xu hướng phát triển này

Các nghiên cứu về tinh sạch và tác dụng sinh học của các mangostin, và đặc biệt là công nghệ phytosome ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Hơn nữa, cũng vẫn còn thiếu vắng những nghiên cứu sâu về tính kháng khuẩn, tác dụng chống oxi hóa của hoạt chất mangostin phytosome trên động vật thực nghiệm làm cơ sở khoa học

cho các nghiên cứu tạo sản phẩm ứng dụng các hoạt chất mangostin phytosome trong việc chăm sóc sức khỏe con người từ nguồn dược liệu quý trong nước Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo hoạt chất

mangostin phytosome và đánh giá khả năng chống oxi hóa của hoạt chất trên động vật thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

động vật thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hoạt chất α- mangostin

1.1.1 Giới thiệu chung

Hoạt chất α- mangostin là một chất được tách chiết từ vỏ quả măng cụt, chiếm hàm lượng rất cao trong vỏ quả này khoảng 0,02 % đến 0,2 % trọng lượng khô Chất được biết đến với danh pháp quốc tế là: 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis (3-methylbut-2-enyl) xanthen-9-one, có công thức phân tử là C24H26O6 và khối lượng phân tử 410,46 g /mol Là tinh thể có màu vàng, có nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 205-206 0C, chất được coi là gần như không tan trong nước do nồng độ tan rất thấp chỉ khoảng 2,03x10-4 mg/L ở 250C [58], tuy nhiên lại có thể tan trong các chất như: ancol, aceton, chloroform, ethyl acetat [4]

lý, hóa học, sinh học khác nhau Ngày nay, người ta đã tìm được hơn 200 loại dẫn xuất xanthone khác nhau, với 60 loại xanthone có trong vỏ quả măng cụt [5]

Hình 1.1 Cấu trúc của một Chromono [56]

Hình 1.2 Cấu trúc khung xương của phân tử xanthone (PubChem CID:7020) [60]

Dựa trên cấu trúc khung xương của hợp chất xanthone, cấu trúc α-mangostin có

thêm một nhóm methoxyl (- O - CH3), hai nhóm isoprenyl (C5H8) và ba nhóm chức hydroxyl (- OH ) được mô tả trên hình 1.3 Trong đó nhóm isoprenyl đóng vai trò quan trọng trong việc giúp α- mangostin có hoạt tính kháng khuẩn [28,45]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

Đã từ lâu, vỏ quả măng cụt được sử dụng trong y học cổ truyền không chỉ tại Việt Nam mà còn nhiều nước Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ với tác dụng chữa trị kiết lỵ, tiêu chảy, chữa đau bụng, làm khô vết thương, chống nhiễm trùng da [6] Một số nghiên cứu còn cho thấy các hợp chất xanthone có trong vỏ quả măng cụt còn có khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u ung thư, chống oxi hóa, kháng

viêm, kháng khuẩn…

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của α- mangostin (PubChem CID: 5281650) [58]

1.1.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt chất α-mangostin cùng với các dẫn xuất xanthone được biết đến có khả năng kháng khuẩn mạnh Theo nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2009) cho thấy α-mangostin có khả năng kháng lại vi khuẩn gram dương Propionibacterium

acnes, một loại vi khuẩn có trên bề mặt da của con người gây nên các bệnh như

mụn trứng cá với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1,95 µg/ml [41] Ngoài ra α- mangostin còn chống lại các vi khuẩn kháng lại kháng sinh, những vi khuẩn này có nguy cơ gây bệnh không thể kiểm soát với người đã được điều trị bằng kháng sinh trong dài hạn, Iinuna và cộng sự (1996) đã đề cập đến khả năng hạn chế sự phát

triển của Staphylococcus aureus kháng methicillin của α- mangostin, khả năng này

tăng lên khi kết hợp với hoạt động của kháng sinh vancomynine [25] Ở một nghiên cứu khác Sakagami và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng α-mangostin có khả năng

chống lại các vi khuẩn Enterococci kháng vancomycine ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 6,25 µg/ml và kháng lại S.aureus kháng methicillin ở nồng độ ức chế tối

thiểu (MIC) 6,25-12,5 µg/ml [42] Nhờ hoạt tính này mà mà α- mangostin góp phần

kiểm soát sự nhiễm trùng do vi khuẩn Enterococci và S.aureus gây ra

Jun và cộng sự (2013) đã dùng năm hoạt chất xanthone khác nhau thử nghiệm

kháng lại vi khuẩn S.aureus kháng methicillin, kết quả cho thấy α- mangostin có

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tốt nhất 0,78-1,56 µg/ml, đồng thời nhóm ông cho

rằng α-mangostin có khả năng diệt S.aureus kháng methicillin nhanh là do sự tương

tác trực tiếp của nhóm isoprenyl trong α- mangostin với lớp lipid kép của màng tế bào vi khuẩn dẫn đến màng này bị vỡ và làm tăng tính thẩm thấu của màng [28] Như vậy, α-mangostin và các dẫn xuất xanthone từ quả măng cụt có khả năng giúp kháng lại một số loại bệnh do vi khuẩn gây nên, đồng thời cũng có thể ngăn chặn nguy cơ bùng phát dịch bệnh do các vi khuẩn kháng kháng sinh gây ra

Pimchan và cộng sự (2017) đã nghiên cứu kết hợp α- mangostin và kháng sinh

ceftazidime chống lại vi khuẩn Acinetobacter baumannii kháng ceftazidime kết quả

cho thấy sự kết hợp này có hiệu quả tốt khi làm mỏng các màng peptidoglycan, tăng

tính thấm của màng tế bào của khuẩn A.baumannii đồng thời α- mangostin cho thấy

khả năng ức chế enzyme β-lactamase loại IV của khuẩn này gây ra kìm hãm và tiêu

diệt chúng Từ nghiên cứu này, cho thấy có thể phát triển sử dụng α- mangostin như một dược phẩm bổ sung, có thể phối hợp với kháng sinh ceftazidime để tăng cường

khả năng tiêu diệt A.baumannii kháng kháng ceftazidime [39] Một nghiên cứu

khác, Sivaranjani và cộng sự (2017) đã sử dụng α- mangostin để tiêu diệt khuẩn

Staphylococcus epidermidis RP62A, thu được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của α-mangostin với khuẩn S.epidermidis

RP62A lần lượt là 1,25 và 5 μg / mL Trong đó α- mangostin thể hiện khả năng diệt

khuẩn rất tốt khi nhanh chóng làm giảm lượng vi khuẩn S.epidermidis RP62A chỉ trong vòng năm phút Cơ chế diệt khuẩn S.epidermidis của α-mangostin được giải

thích do nó có thể ức chế và diệt trừ màng sinh học (biofilm) của loài khuẩn này Từ

đó, cho thấy tiềm năng của α-mangostin có thể sử dụng hỗ trợ điều trị nhiễm trùng

do vi khuẩn S.epidermidis gây ra [47]

1.1.3.2 Hoạt tính kháng nấm

Các hợp chất xanthone nói chung và α- mangostin được tách chiết từ vỏ quả măng cụt có khả năng kháng một số loại nấm gây bệnh ở thực vật, là nguyên nhân gây thiệt hại mùa màng như Fusarium oxysporum, Aliciella tenuis, Aspergillus oryzae [22] Ngoài ra α- mangostin còn có khả năng chống lại nấm Candida

albicans, một loại nấm gây bệnh nhiễm trùng đường sinh dục, miệng da và máu

Người ta dự đoán rằng cơ chế kháng nấm của α- mangostin và các dẫn xuất xanthone là do chúng tấn công vào cấu trúc và chức năng của tế bào nấm, đặc biệt

là ergosterol, một loại lipid qua trọng trong màng tế bào nấm, mà không có ở tế bào động vật [16] Vậy nên điều này có ý nghĩa sử dụng α- mangostin như chất diệt

bệnh nấm trên động vật, mà không sợ ảnh hưởng đến tế bào của chúng

1.1.3.3 Hoạt tính kháng viêm

Trong nghiên cứu của mình Nakatani và cộng sự (2002), đã chứng minh rằng cao chiết xanthone từ vỏ quả măng cụt có khả năng ức chế quá trình giải phóng histamine và tổng hợp prostaglandin E2 Do đó, các chất tách chiết từ vỏ quả măng cụt chống dị ứng và kháng viêm [37] Ngoài ra năm 2010, Bumrungpert và cộng sự

đã chứng minh được rằng α- mangostin và γ-mangostin có thể ức chế hoạt động của LPS (lipopolisaccharide có trong plasma ở người béo phì) lên sự biểu hiện của các

gen quy định protein-enzyme liên quan đến phản ứng viêm và kháng insulin ở đại thực bào Hai dẫn xuất xanthone có từ vỏ quả măng cụt này có thể làm suy giảm khả năng cảm ứng biểu hiện interleukin-6, yếu tố gây lên hoại tử (TFNα) [17]

1.1.3.4 Hoạt tính chống oxi hóa

Các gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý hóa trong cơ thể Sự tăng quá mức các gốc tự do làm cho hệ thống chống oxi hóa của các tế bào không đáp ứng được gây ra sự phá hủy Protein, DNA, chất béo, gây tổn thương tế bào

và quá trình trao đổi chất đẩy nhanh quá trình lão hóa [5] Williams và cộng sự (1995)

đã chứng minh rằng mangostin có khả năng hoạt động như một chất thu dọn các gốc tự

do để ngăn chặn sự phá của các gốc tự do lên LDL (Low density lipoprotein) [53] Trong một nghiên cứu khác, Sun và các cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng mangostin có thể trung hòa được các gốc hydroxyl tự do, superoxin anion, ức chế sự hình thành MDA (malondialdehyde) trong quá trình nuôi cấy tế bào bạch cầu [48]

1.1.3.5 Hoạt tính chống ung thư

Đặc biệt hoạt chất α- mangostin còn được vẫn được nghiên cứu ứng dụng chữa nhiều bệnh cho đến ngày nay tiêu biểu là ung thư Shibata cùng cộng sự (2011) đã chứng minh rằng mangostin từ quả măng cụt có thể gây chết một số dạng tế bào ung thư trong cơ thể Nhóm ông đã cho thử nghiệm hoạt tính diệt ung thư của α- mangostin trên chuột được gây ung thư vú Sau khi điều trị bằng α- mangostin cho thấy số chuột có khả năng sống sót cao hơn so với chuột không được điều trị, đồng thời khối u ung thư trên chuột cũng được ức chế đáng kể [44] Tiếp đó, Han và cộng

sự (2017) đã chỉ ra rằng α-mangostin có thể ức chế LSD1 (Lysine-specific demethylase 1) chống lại sự di căn của các khối u ung thư [23] Cùng năm này, Wang và cộng sự (2017) đã chứng minh rằng α-mangostin có thể chống lại ung thư

da gây ra bởi anthracene 9,10-dimetylbenzan (DMBA) / TPA thử nghiệm trên chuột Trong đó, ung thư da được biết là dạng ung thư phổ biến có thể gây ra tử vong ở người, tuy nhiên cho đến ngày nay tiến trình điều trị bệnh này vẫn còn chưa được hiệu quả Nhóm ông cho rằng sở dĩ α- mangostin ức chế sự hình thành ung thư

da thử nghiệm trên chuột gây ra bởi DMBA / TPA là do chúng có thể ức chế sự viêm, đồng thời ức chế thúc đẩy sự tự phát và quá trình apoptosis [51] Tóm lại,

hoạt chất α- mangostin có thể diệt được ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau, theo

đó chúng chủ yếu tác động lên tế bào ung thư và gây ra quá trình chết theo chu trình của các tế bào này

1.2 Phytosome

1.2.1 Khái niệm

Hình 1.4 Cấu tạo của phytosome

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [33] Thuật ngữ "Phyto" nghĩa là “thực vật” trong khi “some” có nghĩa là “giống như tế bào”, thường được gọi là herbosome trong nhiều tài liệu khác Thế hệ phytosome đầu tiên được ra đời bằng việc kết hợp giữa hợp chất polyphenol với phospholipid trong dung môi không phân cực [18]

1.2.2 Thành phần của phytosome

Phytosome là phức hợp được tổng hợp bởi một phân tử phospholipid tự nhiên hay tổng hợp (phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin hay phosphatidyiserin) phản ứng với một hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết từ dược liệu [14] Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan q nước và phospholipid Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [18]

Phospholipid là các phân tử lipid nhỏ cấu tạo bởi một glycerol trong đó, hai gốc rượu gắn với hai acid béo, gốc còn lại gắn với nhóm phosphat [14]

Dược chất: Hoạt chất được gắn vào đầu phân cực của phospholipid, trở thành

bộ phận cấu tạo của màng và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và nhóm phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome

1.2.3.1 Phân loại

Phospholipid gồm 3 loại:

Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin từ lecithin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin, phosphatidylserin, phosphatidylglycerol…

Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa, disteroyl phosphatidylcholin, dioleyl phosphatidylcholin, dioleyl phosphatidylethanolamin…ngoài ra còn có một số loạiphospholipid khác như: sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin…)

Phospholipid được sử dụng chủ yếu là từ đậu nành và trứng, đặc biệt là phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào

1.2.3.2 Vai trò của phospholipid trong phytosome

Do phospholipid là hợp chất hai chức có chứa một nửa phosphatidyl ưa dầu

và một nửa cholin ưa nước nên có khả năng cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất tự nhiên Phần nửa ưa nước (nhóm cholin) gắn với hợp chất tự nhiên, trong khi nửa phần phosphatidyl tan trong lipid dạng đuôi và bao bọc các thành phần liên kết cholin [11] Ngoài vai trò là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein

và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế bào trong cơ thể

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của phosphatidylcholin [11]

Đồng thời, phospholipid còn làm giảm sức căng bề mặt của hệ phân tán với dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô, thành tế bào trong cơ thể [14,38,40]

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome

1.2.4.1 Ưu điểm

Phytosome dễ tan trong dung môi dầu và nước nên tăng khả năng hấp thụ dược chất, gia tăng sinh khả dụng, dẫn đến giảm liều dùng và tăng được hiệu quả điều trị Phospholipid vừa là chất mang, vừa có tác dụng bảo vệ gan Cholin có trong phospholipid giúp bổ sung cholin cho gan, bảo vệ gan khỏi nhiễm mỡ Do phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng của thuốc tại gan Giữa các phân tử phosphatidylcholin và các hoạt chất có hình thành các liên kết hóa học nên dạng bào chế phytosome có ổn định cao Hướng hoạt chất đến mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào

Bên cạnh đó, phytosome giúp tăng tính thấm, hấp thu qua da nên được dùng nhiều trong mỹ phẩm Đặc biệt, do phytosome có đặc tính thân dầu nên hoạt chất dễ vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid Phytosome giúp tăng thời gian bán hủy của một số hoạt chất nên tăng thời gian tác dụng của hoạt chất trong cơ thể, tăng tác dụng sinh học của hợp chất [33]

1.2.4.2 Nhược điểm

Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu

cơ độc hại như: dichlomethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn

có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu

áp suất cao 3000-4500 psi [20]

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome

Các phương pháp bào chế phytosome là:

(1) Phương pháp bốc hơi dung môi

(2) Phương pháp kết tủa trong dung môi

(3) Phương pháp siêu tới hạn

Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi được

sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có

mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay; tiến hành khuấy trộn, cách thủy hồi lưu trong một khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để hình thành liên kết trong phức hợp Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome Từ lớp màng phytosome này, có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo hỗn dịch phytosome thô hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay

1.2.6 Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa hoạt chất và phospholipid trong phytosome

Để xác định cấu trúc của phytosome cũng như đánh giá tương tác phân tử giữa hoạt chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phương pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS

1.3 Peroxidase

Gốc tự do nội sinh là một sản phẩm tất yếu của quá trình sinh lý và sinh hóa

tế bào Gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể Tuy nhiên, số lượng gốc tự do nội sinh tăng lên một cách bất thường, vượt qua sự kiểm soát của hệ thống chống oxi hóa của cơ thể sẽ dẫn đến một số bệnh nghiêm trọng Khi đó, các gốc tự do nội sinh sẽ tấn công, gây phá vỡ cấu trúc các protein, DNA của tế bào, làm rối loạn sự kiểm soát quá trình phiên mã, dịch mã, và chết theo chu trình tế bào, có thể dẫn đến căn bệnh ung thư Đối với gốc O2 được sinh ra từ O2trong chuỗi vận chuyển điện tử sẽ bị SOD phân hủy, tuy nhiên quá trình phân giải này lại tạo ra nhiều phân tử H2O2 mà nó cũng là chất độc đối với tế bào Vì vậy, việc loại bỏ H2O2 là rất cần thiết, đảm bảo các hoạt động nội bào diễn ra bình thường Peroxidase sử dụng H2O2 như là một chất nhận điện tử xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hóa khử khác nhau trong đó H2O2 bị khử thành H2O Peroxidase là một nhóm enzyme xúc tác các phản ứng oxy hóa khử :

AH2 + H2O2 A + H2O Hầu hết các peroxidase có cùng cơ chế xúc tác phản ứng phân giải H2O2 Peroxidase bị oxi hóa bởi các peroxide (H2O2) tạo thành phức hợp PorFe4+=O (Phức hợp I), giải phóng ra một phân tử H2O Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme trong sự tạo thành phức hợp I rất cao Các peroxide như H2O2, methyl hydrogen peroxide, ethyl hydrogen peroxide chỉ có thể tương tác với peroxidase mới tạo thành phức hợp hoạt động (phức hợp I) Tính đặc hiệu của các phức hợp cơ chất-enzyme này đối với chất cho hydrogen ở giai đoạn 2 và 3 là khá thấp nên chúng có thể phản ứng với nhiều cơ chất hữu cơ (AH2) khác như ferrocyanide, indophenol, aminophenol, 4-aminoantipyrine, leucodye, cytochrome C và một số amino acid tạo thành phức hợp II, sau đó giải phóng enzyme về dạng ban đầu [43] Những peroxidase khác nhau có mức độ oligomer khác nhau, như myeloperoxidase (MPO), lactoperoxidase (LPO) là homodimer, horseradish peroxidase (HRP) là homoheptamer Tuy nhiên hầu hết các monomer của peroxidase có 10 dải xoắn 

đối song và chứa một nhân hem nằm giữa đầu N và đầu C tận cùng Đầu C tận cùng mang phối tử thứ 5 liên kết với ion Fe là gốc histidine chứa vòng imidazol

nằm vuông góc với mặt phẳng porphyrin heme, vòng này còn có một nguyên tử N khác tham gia hình thành liên kết hydrogen với nhóm cacboxyl của gốc aspartate (Hình 1.5)

Hình 1.6 Cấu trúc nhân hem của peroxidase

Cũng như catalase và superoxide dismutase, peroxidase là enzyme chống oxy hóa quan trọng trong hệ thống sinh học Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằng cách chuyển hóa H2O2 thành H2O Peroxidase còn tham gia vào những phản ứng sinh hóa quan trọng khác trong cơ thể như chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh tổng hợp thành tế bào và một số hormone như PG (prostaglandin), thyroxine, ethylene, tham gia vào quá trình trao đổi IAA (indole-3-acetic acid), quá trình phân hủy auxin Ngoài ra, peroxidase còn có vai trò chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm vào tế bào và mô, đáp ứng bảo vệ những tổn thương [3]

1.4 Peroxy hóa lipid

Peroxy hóa lipid là quá trình oxy hóa các phân tử lipid có chứa nối đôi trong mạch carbon Lipid peroxide là những sản phẩm không chứa gốc tự do được dẫn xuất từ acid béo, phospholipid, glycolipid, cholesterol có chứa nối đôi trong mạch carbon Sự hình thành các sản phẩm này xảy ra trong các phản ứng oxy hóa do enzyme xúc tác hoặc phản ứng quang oxy hóa và tự oxy hóa mà không cần enzyme xúc tác, nhưng đều có liên quan đến các gốc tự do Sản phẩm peroxy hóa sơ cấp là những phân tử peroxide chứa nối đôi có thể chuyển thành dạng liên hợp Các sản phẩm này có thể bị biến đổi thành phân tử lớn hơn nhờ quá trình dimer hóa Quá

trình peroxy hóa lipid bị ức chế bởi các chất chống oxy hóa: -tocopherol, ascorbate, formate, β-caroten, manitol, vitamin E, cấu trúc phân tử sẽ chuyển hóa thành sản phẩm peroxy hóa thứ cấp, hoặc là những phân tử nhỏ hơn bởi sự phân cắt liên kết C-C (hydrocarbon, aldehyde, epoxide)

MDA cũng có thể được tạo ra từ tiền chất PG (prostaglandin) bằng phản ứng xúc tác enzyme như thromboxane synthetase tổng hợp MDA từ PG endoperoxide MDA có thể tham gia phản ứng tạo thành sản phẩm cộng với amino acid tự do hay với protein để hình thành những liên kết ngang trong những phân tử protein này, khi

đó có thể cảm ứng gây biến đổi mạnh mẽ những đặc tính hóa sinh của chúng Hiện nay MDA được coi là chất chỉ thị quan trọng để đánh giá mức độ ảnh hưởng và tốc

độ phản ứng peroxy hóa lipid diễn ra trong tế bào, cũng như có thể xác định được hàm lượng các gốc tự do, từ đó cho thấy mức độ, tính chất nguy hại của những tác nhân lạ được đưa vào cơ thể sinh vật

1.5 Giới thiệu một số vi sinh vật gây bệnh ở người

1.5.1 Staphylococcus aureus

Hình 1.7 Hình dạng vi khuẩn Staphylococcus aureus

(http://en.wikipedia.org)

Staphylococcus aureus hay tụ cầu vàng là chủng vi khuẩn bắt màu gram (+),

đứng thành đám như chùm nho, không sinh bào tử, thường không có vỏ (Hình 1.7)

Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở 10-45C và nồng độ muối cao tới 10% Sinh trưởng được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng phát triển thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn Sau 24 giờ ở 37C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh S aureus thường gây ra

mưng mủ ở da và nhiễm trùng mô mềm Sự nhiễm trùng mô mềm do loài vi khuẩn

này gây ra có thể dẫn đến sự xâm nhiễm và gây bệnh nhiễm trùng huyết Sự nhiễm trùng của loài này đối với người và động vật không kích thích sự đáp ứng miễn dịch

của hệ thống miễn dịch [36] Hội chứng nhiễm trùng do S aureus gây ra là một vấn

đề đáng lo ngại trong bệnh viện, đặc biệt là nhiễm trùng hậu phẫu, khi xuất hiện một

số chủng có hiện tượng kháng lại kháng sinh

1.5.2 Candida albicans

Hình 1.8 Hình dạng nấm C albicans

(http://www.mycology.adelaide.edu.au; http://www.sciencephoto.com)

Chủng C albicans là loại nấm lưỡng bội, sinh trưởng chủ yếu ở 37-40C, pH 7

(Hình 1.8) Kiểu hình nảy chồi chiếm ưu thế ở nhiệt độ hoặc pH thấp, trong khi đó

kiểu hình dạng sợi chiếm ưu thế ở nhiệt độ và pH cao Nấm C albicans có thể sinh

trưởng và gây nhiễm trùng trên bền mặt của khoang miệng, âm đạo và đường tiêu

hóa Dạng nhiễm trùng do C albicans gây ra có hai dạng: nhiễm trùng bề mặt như

bệnh tưa miệng, nhiễm nấm ở bề mặt âm đạo; nhiễm trùng sâu như bệnh viêm cơ

tim và nhiễm trùng huyết [28] Cũng như S aureus và P aeruginosa, C albicans là một trong những nguyên nhân chính gây ra chứng nhiễm trùng, đặc biệt và nhiễm

rutin bào chế được sau đó sẽ đem đi đánh giá các thông số hóa lý bằng các phương pháp khác nhau như: độ tan, kích thước hạt, quét nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X (XRPD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phổ hồng ngoại (FT-IR), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi rời rạc, hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức hợp phyto-phospholipid, phổ nhiễu xạ tia X cho thấy rutin khi tạo phức với phopsholipid đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang dạng vô định hình Nghiên cứu chỉ ra rằng, tỷ lệ mol rutin: phospholipid là 1:1 có độ tan, kích thước phân tử tốt hơn các tỷ lệ khác Nghiên cứu đã so sánh khả năng thấm thuốc qua da giữa rutin và phức hợp phytosome (tỷ lệ mol rutin:phospholipid là 1:1) Kết quả cho thấy sau 20 giờ, rutin nguyên liệu chỉ hấp thu được 13± 0,87% trong khi của phytosome hấp thu được 33±1,33% [33]

Năm 2014, Solmaz và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế quercetin phytosome bằng phương pháp hydrat hóa màng film Phospholipid sử dụng trong nghiên cứu này là phosphatidylcholin (PC) và cholesterol (CH) Phytosome sau khi bào chế được làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm Kết quả cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệ mol quercetin:phosphatidylcholin: cholesterol là 1:2:0,2 cho kích thước tiểu phân nhỏ (80 nm) và hiệu suất phytosome hóa cao (98 %) Sự kết hợp hai phospholipid phosphatidylcholin và cholesterol đã cải thiện một cách đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome trong thời gian 3 tuần

Từ biểu đồ DSC cho thấy pic hấp thụ nhiệt của phytosome giảm, góp phần kết luận

có tương tác giữa dược chất và phospholipid, đồng thời cải thiện độ tan cũng như tăng sinh khả dụng [46]

Vào năm 2010, Semalty và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome naringenin với dung môi là diclomethan với tỷ lệ là 1:1 phospholipid là phosphatidylcholin Phức hợp tạo thành đem đi đánh giá 1 số đặc tính vật lý khác

nhau qua phổ nhiễu xạ tia X, DSC, SEM, độ tan và so sánh với 1 số thuốc in vitro

được phát hành Kết quả là có tương tác giữa dược chất và phospholipid Hiệu suất phytosome hóa cao 91,7% Độ tan trong nước của naringenin được cải thiện từ 43,83 đến 79,31 μg/mL Sau 10 giờ naringenin ở dạng tự do chỉ giải phóng đươc

27% trong khi ở phức hợp Naringenin đã giải phóng tới 99,80% Từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng phức hợp phospholipid của naringenin có SKD rất cao, có thể thay thế naringenin [49] Qua tham khảo các tài liệu trên thế giới cho thấy còn rất ít ác công trình nghiên cứu khoa học về việc sử dụng công nghệ phytosome dối với hoạt chất mangostin mà hủ yếu là nghiên cứu về các hoạt chất quercetin, rutin, naringenin

1.6.2 Ở Việt Nam

Năm 2016, Đào Hoàng Bá Tùng đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi Phospholipid là lecthin và HSPC Quy trình và công thức bào chế được lựa chọn như sau: thời gian phối hợp dược chất:phospholipid kéo dài 5 giờ, nhiệt độ hydrat hóa 50oC với nguyên liệu lecithin

và 60oC với nguyên liệu HSPC, thời gian hydrat hóa là 1 giờ, tốc độ quay 150 vòng/phút, tỷ lệ mol quercetin:phospholipid là 1:1 Với quy trình trên, nguyên liệu HSPC sản phẩm thu được phytosome thu được có kích thước tiểu phân 357,1 ± 2,7 nm; PDI: 0,303 ± 0,006, hiệu suất phytosome hóa 41,01 %, cải thiện độ tan 11-12 lần so với dược chất ban đầu, khả năng giải phóng quercetin nhanh hơn so với bột nguyên liệu quercetin dihydrat Đồng thời, nghiên cứu sử dụng các phương pháp FTIR, 1H-NMR, XRD và DSC để chỉ ra tương tác giữa phospholipid và dược chất [13]

Năm 2016, Vũ Thị Thu Hà tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi Nguyên liệu phospholipid được lựa chọn

là HSPC, tỷ lệ lựa chọn là 1:1 Nghiên cứu đã khảo sát và lựa chọn được các yếu tố thuộc về quy trình như sau: trong giai đoạn hình thành phức hợp tốc độ khấy từ là

400 vòng/phút, nhiệt độ là 80°C, thời gian khuấy từ 16 giờ; tốc độ nhỏ dung dịch hexan là 5ml/phút; tốc độ khuấy từ giai đoạn kết tủa là 100 vòng/phút Các phương pháp FTIR, XRD và DSC được sử dụng để chứng minh sự tương tác giữa dược chất

n-và phospholipid Kết quả cho thấy được phytosome quecertin vừa bào chế được có kích thước tiểu phân 203,5 nm; PDI là 0,239; giá trị tuyệt đối thế zeta >30; hiệu suất phytosome hóa 79,92% [12]

Năm 2015, Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, với dung môi hòa tan là ethanol, phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC) Phức hợp curcumin-phospholipid sau bào chế được đánh giá một số đặc tính vật lý như kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta, độ tan Kết quả nghiên cứu cho thấy dạng bào chế phytosome làm tăng độ tan của curcumin trong

cả pha nước và pha dầu, đây là một đặc điểm nổi bật của phytosome nhằm tăng SKD của dược chất đặc biệt là những dược chất được chiết xuất từ dược liệu Kích thước phytosome dưới 500 nm cũng là một trong các lợi thế về SKD khi dùng qua đường uống và ngoài da Bằng phương pháp DSC, bước đầu nghiên cứu đã chứng minh có phản ứng liên kết hoá học giữa curcumin và HSPC [11]

Năm 2010, Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tách được α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký cột, hoạt chất -

mangostin tinh sạch có khả năng ức chế vi khuẩn B subtilis XL62 [10] Năm 2010,

Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự thử nghiệm α-mangostin ức chế sự hình thành

biofilm của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159, kết quả cho thấy

α-mangostin là chất kháng biofilm tiềm năng thông qua việc làm giảm khả năng sinh biofilm, ức chế các enzyme glycosyltransferase B và C tham gia vào quá trình

tạo biofilm cũng như làm thay đổi cấu trúc biofilm của vi khuẩn S mutans [7] Và

gần đây, Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2018) tiếp tục nghiên cứu và đánh giá hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 của hạt nano polymer bọc α-mangostin cho kết quả chứng tỏ dạng hạt nano mangostin đã cải tạo được tính tan của -mangostin mà vẫn duy trì được hoạt tính kháng tế bào ung thư [8]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sử dụng công nghệ phytosome theo phương pháp bốc hơi trong dung môi để tạo hoạt chất mangostin phytosome, sau đó đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cũn như khả năng chống oxi hóa của hoạt chất

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng S aureus được cung cấp bởi Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Chủng nấm C albicans ATCC 10231 được mua từ bảo tàng giống chuẩn Mỹ,

10801 University Boulevard Manassas, VA 20110, USA

2.1.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 92) được cung cấp từ Ban chăn nuôi Học viện Quân Y

2.1.1.3 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu thập từ các khu vực ở Hà Nội Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở 60C, nghiền thành bột mịn Bảo quản ở điều kiện khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết, được mua từ các hãng hóa chất có uy tín Một số hóa chất chính được liệt kê ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm

Cao nấm men, peptone, Tris-base ICN (Mỹ)

5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) Sigma (Mỹ)

Dichlomethane, methanol, ethanol, ethyl

petroleum, n-butanol, pyridin

n-hexane, silica gel (70-230 mesh) , EDTA Scharlau Chemie S.A

(Châu Âu) Peroxidase chuẩn, 3,3´-5,5´-tetramethyl

Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm được pha theo các bài thực hành chuẩn có thành phần và nồng độ được tóm tắt ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg serva

blue G, 200 ml 88% phosphoric acid Dung dịch cơ chất H2O2 250 M hydrogen peroxide

Dung dịch sulfuric acid 2 N sulfuric acid

Dung dịch thiobarbituric acid 0,8% thiobarbituric acid

Dung dịch TMB 0,6% 3,3’-5,5’tetramethyl benzidin

trong DMSO Đệm sodium acetate pH 3,5 20% sodium acetate; pH 3,5

Đệm sodium acetate pH 5,5 100 mM sodium acetate, 100 mM

acetic acid; pH 5,5

Thành phần một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường SDA 1% peptone, 4% glucose

Môitrường SDA đặc 1% peptone, 4% glucose; 2% agar

2.2 Các thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị sử dụng chính trong các thí nghiệm được liệt kê trong bảng

Bảng 2.4 Các thiết bị thí nghiệm

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench TCV.02-1 Trung tâm chuyển giao công nghệ Box cấy vi sinh vật Laminar LB-1234 (Việt Nam)

Máy lắc rung ProvocellTM Esco (Mỹ)

Máy li tâm lạnh CF16RXII Hitachi (Nhật)

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R Hettich (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)

2.3 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  2 g (n = 92) được chia ngẫu nhiên thành chia thành 7 nhóm (Bảng 2.5)

Bảng 2.5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất

ĐC 11 Uống dung dịch 0,9% NaCl

ĐC (+) 11 Uống dung dịch silymarin phytosome

TN1 16 Gây độc bằng cho uống CCl4

TN2 16 Gây độc bằng cho uống CCl4 + mangostin phytosome

liều 0,1 mg/10 g TT TN3 11 Gây độc bằng cho uống CCl4 + mangostin phytosome

liều 0,2 mg/10 g TT TN4 16 Uống mangostin phytosome liều 0,1 mg/10 g TT

TN5 11 Uống mangostin phytosome liều 0,2 mg/10 g TT

n: Số cá thể thí nghiệm

Nhóm ĐC: Nhóm chuột đối chứng uống 0,9% NaCl trong 14 ngày với liều lượng 0,1 ml/10 g thể trọng/ngày

Nhóm ĐC (+): Nhóm chuột đối chứng uống silymarin phytosome

Nhóm TN1: Nhóm gây độc được uống CCl4 trong 14 ngày : hai ngày đầu uống hỗn hợp CCl4 : dầu ăn với tỷ lệ 1:7; mười ba ngày sau với tỷ lệ 1:5 Liều lượng 0,1

ml hỗn hợp/10 g thể trọng/ngày

Nhóm TN2: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với mangostin phytosome liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày Nhóm TN3: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với mangostin phytosome liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày Nhóm TN4: Nhóm chuột chỉ uống mangostin phytosome liều lượng 0,1 mg/10

g thể trọng/ngày trong 14 ngày

Nhóm TN5: Nhóm chuột chỉ uống mangostin phytosome liều lượng 0,2 mg/10

g thể trọng/ngày trong 14 ngày

Trong quá trình thí nghiệm nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu đều được nuôi dưỡng cùng một điều kiện như nhau, hàng ngày được theo dõi, ghi chép diễn biến, cân trọng lượng Động vật thí nghiệm được uống hoạt chất vào một thời gian nhất định buổi sáng

Phương pháp cho chuột uống thuốc: dùng kim cong đầu tày chuyên dụng đưa thuốc vào thẳng dạ dày

Phương pháp lấy mẫu gan: Cho chuột nhịn ăn 24 giờ trước khi lấy mẫu thử Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh Mổ nhanh lấy gan và cân trọng lượng Cân 0,3

g gan rửa trong đệm lạnh (100 mM Tris-HCl; 250 mM sucrose, pH 7,4) để loại bỏ máu và catalase Sau đó được nghiền đồng thể trong cối chày sứ có cát thủy tinh và

300 l đệm lạnh, với tỷ lệ 1:10 Dịch nghiền được ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4C Bỏ tủa, dịch trong được dùng làm các thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme peroxidase và định lượng protein cũng như hàm lượng MDA và nhóm -SH

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết và tinh sạch α-mangostin

Hoạt chất α-mangostin được tách chiết theo quy trình như hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình tinh sạch α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Garcinia

mangostana L

Vỏ quả măng cụt được rửa sạch, sấy khô trong tủ ấm 600C, sau đó được nghiền thành bột mịn Bột măng cụt được bổ sung ethanol 96% (tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:3) ủ ở 600C trong 4 giờ Dịch chiết được sấy khô chân không đến khối lượng không đổi, thu cặn, xác định hàm lượng cao chiết ethanol thu được Cao chiết được sử dụng để tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp chiết phân đoạn nhằm loại bớt các hợp chất tan trong nước, sau đó được tinh sạch bằng sắc kí cột silica gel Cuối cùng độ tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp sắc kí bản mỏng [5]

Sau khi thu pha trên và cất cô quay, hoạt chất được hòa tan trở lại n-hexan và được tinh sạch trên sắc kí cột hạt sillica gel với kích thước 70-230 mesh (Merck Kiselgel) Cột được cân bằng một giờ với n-hexan Sau đó mẫu được đẩy với hệ dung môi chloroform: acetone theo các tỉ lệ lần lượt là 10:1, 5:1 và 0:1 Độ tinh sạch của các phân đoạn được kiểm tra qua sắc kí bản mỏng sử dụng hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỉ lệ 96:4 Sau đó các phân đoạn có thể hiện mangostin trên băng sẽ được tinh sạch trên cột silica gel lần hai sử dụng hệ dung môi n-hexan : ethyl acetate với tỉ lệ 6:1 và 12:1 Mẫu thu được lại được chạy sắc kí bản mỏng lần nữa để kiểm tra độ tinh sạch, những phân đoạn được tinh sạch xuất hiện vạch ngang băng so với băng chuẩn α-mangostin được thu lại, cô quay đến kết tinh, cân xác định khối lượng, hòa trở lại dung môi theo nồng độ xác định và được đưa thử hoạt tính [5]

2.4.2 Sắc ký cột (Column chromatography - CC)

Sắc ký cột là phương pháp thường được sử dụng để phân tách các chất dựa vào độ phân cực của chất cần phân tách Sắc kí cột có pha tĩnh là chất rắn được nhồi trong cột, pha động là hệ dung môi được đổ vào nên có thể triển khai với các dung môi có phân cực khác nhau Việc tinh sạch các chất được thực hiện bằng sắc ký cột với chất mang là silica gel thường, nên các hợp chất không hoặc kém phân cực sẽ ra khỏi cột trước còn các hợp chất phân cực cao sẽ ra khỏi cột sau Do bởi trong các hạt silica gel có các nhóm silanol những nhóm này dễ tạo liên kết hydro mạnh với các hợp chất phân cực mang các nhóm: OH, NH2, COOH…và giữ chúng ở lại, trong khi các hợp chất kém và không phân cực sẽ bị giữ lại bởi lực liên kết hydro yếu hơn hoặc không bị giữ lại bởi nhóm silanol, nên chúng sẽ bị hệ đẩy ra trước

Cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ đến 2/3 thể tích Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc Mẫu được nạp lên cột, thôi mẫu bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : acetone với tỷ lệ 10:1, 5:1, 0:1 Các phân đoạn thu được với tỷ lệ dung môi 5:1 được tinh sạch lần 2 bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ 6:1 [22, 25] Các phân đoạn được kiểm tra độ sạch bằng sắc kí bản mỏng

2.4.3 Sắc ký bản mỏng

Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography - TLC) hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ là pha tĩnh như silicagel hoặc aluminium oxit (nhôm oxit), chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, và đều được phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic Loại sắc ký lớp mỏng này có thể dùng trong cả phân tích định tính và phân tích định lượng Trong quá trình di chuyển pha động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với các tốc độ khác nhau phụ thuộc vào độ phân cực của chúng Trong nghiên cứu này, bản sắc kí silica gel làm pha tĩnh được phủ trên bản nhôm Pha động là hỗn hợp hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỉ lệ 96:4 Sắc kí đồ được thể hiện màu bằng phương pháp nhuộm xông hơi iôt [29]

2.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ

số phân bố của nó

Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách Chúng tôi dựa vào thời gian lưu này để định tính được chất đó thông qua mẫu chuẩn Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng độ chất phụ thuộc vào chiều cao pic hoặc diện tích [27]

H = k.Cb S = k.Cb

Trong đó:

H - chiều cao pic sắc ký của chất

S - diện tích pic sắc ký của chất

k - hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký

b - hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b ≤ 1

2.4.5 Phương pháp điều chế mangostin phytosome

Điều chế phytosome mangostin dựa trên phương pháp bốc hơi dung môi theo nghiên cứu của các nhóm tác giả [11,13]

Cân 1 lượng khối lượng magostin và 1 lượng tương ứng phosphatidylcholin với tỉ lệ 1:1 Hòa tan α-mangostin sạch trong 80 ml methanol khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt ở nhiệt độ 50oC, phosphatidylcholine cũng được hòa vào 80 ml diclomethan khuấy nhẹ trên máy gia nhiệt Trộn hai dung dịch trên vào bình cầu rồi đun cách thủy hồi lưu trong các thời gian 3h và ở nhiệt độ 400C, tốc độ quay khuấy từ 150 vòng/phút Sau đó cô quay dung dịch (loại hết dung môi) đến hỗn hợp đậm đặc, tủa sản phẩm bằng việc bổ sung 50 ml n-hexan vào bình cô quay rồi đem ly tâm thu cặn Rửa sản phẩm bằng n-hexan lạnh (2 lần), để khô ở nhiệt độ phòng Sản phấm thu được sấy ở 4000C trong 2 giờ, thu được mangostin phytosome, bảo quản ở 40C

Hình 2.2 Sơ đồ bào chế mangostin phytosome

2.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa hoạt chất và phospholipid 2.4.5.1 Phương pháp đo quang phổ hồng ngoại IR

Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó

sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó

Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất

2.4.5.2 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ Bước sóng được sử dụng từ

200 đến 800 nm Hiện tượng bức xạ điện từ tuân theo định luật Lamber-Beer

Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự tạo phức mầu của các ion với thuốc thử Nồng độ của các ion trong phức thay đổi sẽ tạo ra màu khác nhau, dẫn đến độ hấp thụ quang khác nhau Độ hấp thụ quang được xác định theo phương trình :

A = Ɛ.l.C Trong đó:

Ɛ: Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bản chất màu và bước sóng của ánh sáng tới l: Chiều dày cu vet

C: Nồng độ chất phân tích

Khi l và Ɛ không đổi, độ hấp thụ quang phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

Vì vậy, khi xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ C trong từng trường hợp cụ thể sẽ dễ dàng xác định được nồng độ chưa biết của một chất thông qua độ hấp thụ quang Giới hạn phát hiện của phương pháp cỡ 10-5M – 10-6M

Sau khi đo UV-VIS của phytosome, phân tích sự thay đổi của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi,

từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất

2.4.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Nguyên lý: Phương pháp khuếch tán quá giếng thạch được sử dụng để xác

định hoạt tính kháng khuẩn, cụ thể phương pháp dựa trên khả năng đối kháng của hoạt chất đối với vi khuẩn cần ức chế Những hoạt chất này cho vào trong các giếng

đã đục trên môi trường đã trải sẵn vi khuẩn cần ức chế Sau khi để hoạt chất khuếch tán đều trong giếng, đĩa này sẽ được nuôi trong tủ ấm sau khoảng một ngày Đường kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng thể hiện khả năng kháng vi khuẩn của hoạt chất Đường kính này càng lớn chứng tỏ khả năng ức chế của hoạt chất đối với vi sinh vật càng mạnh và ngược lại

Tiến hành: Vi khuẩn S aureus nuôi trong môi trường LB lỏng sau 24 giờ sau

đó được trải đều trên đĩa thạch LB, mỗi lần trải cho 150 µl dịch nuôi Sau đó đục

giếng thạch, có một giếng đối chứng âm là methanol - chất để hòa tan α-mangostin

và mangostin phytosome, các giếng còn lại là các tỉ lệ của hoạt chất α-mangostin và

phytosome mangostin lần lượt là 200 µg, 400 µg Các đĩa sau khi cho chất thử hoạt tính kháng khuẩn vào trong các giếng, sẽ được để trong tủ lạnh 2 giờ nhằm khuếch tán đều hoạt chất trong giếng Rồi được nuôi trong tủ ấm 37oC sau 24 giờ đem ra quan sát

vòng vô khuẩn Đối với chủng nấm C.albicans 150 µl dịch nuôi cấy được trải đều lên

đĩa petri Khi ráo mặt thạch, sử dụng que đục để đục lỗ thạch, bổ sung 100 µl hoạt chất α-mangostin và mangostin phytosome đã được hòa tan với methanol ở các nồng độ khác nhau vào các giếng để hàm lượng đạt được trong các giếng lần lượt là 200 µg,

400 µg Đối chứng sử dụng là 100 µl methanol, riêng với chủng S aureus đối chứng

dương sử dụng là 100 µl chloramphenicol 0,2% Tiếp đó, để đĩa thử hoạt tính này vào tủ lạnh khoảng 2 giờ để cho hoạt chất được khuếch tán sau đó chuyển sang tủ 37ºC, ủ sau 24 giờ, quan sát vòng vô khuẩn quanh giếng

2.4.8 Xác định hoạt độ peroxidase

Nguyên lý: Hoạt độ peroxidase được xác định bằng phương pháp sử dụng

3,3-5,5-tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy

và cộng sự [26] Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp có hydrogen peroxide (H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo thành hợp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 492 nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể suy ra được hoạt độ peroxidase có trong mẫu cần phân tích (Hình 2.3)

Tiến hành: Thành phần phản ứng xác định hoạt độ peroxidase: 40 µl 0,6%

TMB; 250 µl đệm 100 mM natri acetate pH 5,5; 50 µl dung dịch enzyme (50 µl nước cất cho đối chứng); 2 ml nước cất; 10 µl dung dịch 0,5% H2O2 Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 25C trong 15 phút Dừng phản ứng bằng 100 µl dung dịch 2 N

H2SO4 Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm Hoạt độ peroxidase được biểu thị bằng đơn vị g/mg protein