Thiết lập chủng bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm

Có nhiều chủng chuẩn vi sinh vật khác nhau cần thiết cho công tác kiểm nghiệm dược phẩm, Bacillus subtilis được sử dụng trong phép thử giới hạn nhiễm khuẩn, phép thử xác định hoạt lực k

HOÀNG THỊ KIM THOA

THIẾT LẬP CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỐI CHIẾU

SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2013

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA…………

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Hoàng Thị Kim Thoa MSHV: 11310627 Ngày, tháng, năm sinh: 08/03/1988 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 604280

I TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm

nghiệm dược phẩm

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập Bacillus subtilis từ các mẫu thuốc bị

nhiễm, đất, không khí Định danh bằng phương pháp sinh hóa (sử dụng kit) và sinh học phân tử (PCR và giải trình tự 16S rADN) Kiểm tra đặc tính sinh học của chủng phân lập phù hợp với yêu cầu của chủng đối chiếu trong kiểm nghiệm dược phẩm Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô và theo dõi tính ổn định di truyền sau bảo quản

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/07/2012

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 21/06/2013

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

của rất nhiều người Người đầu tiên tôi muốn cám ơn đó là ông xã – người đã luôn

ở bên cạnh chăm sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để em được học tập và làm việc Cám ơn ông xã và gia đình 2 bên đã luôn yêu thương, chăm sóc và giúp đỡ con

Một người thầy nhưng cũng gần gũi như một người bạn đã hướng dẫn, động viên và tạo cho tôi niềm say mê nghiên cứu từ khi tôi còn là một cô sinh viên chưa biết gì,

đó chính là Cô Nguyễn Thúy Hương Em rất biết ơn và luôn kính trọng cô Hi vọng

em sẽ còn được đồng hành cùng cô, được nghe những lời giáo huấn đầy tâm huyết của cô

Lời cám ơn nữa tôi muốn gửi tới các đồng nghiệp ở phòng Khoa học và Đào tạo, đặc biệt là Tổ nghiên cứu và Khoa Vi sinh – Viện kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh Cám ơn các anh chị đã đồng hành, giúp đỡ và luôn quan tâm tới em trong những ngày tháng khó khăn

Cám ơn các anh chị Phòng Vi sinh – Khoa dược TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ rất tận tình

Cuối cùng xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến tất cả những người bạn, những người thân thương đã sát cánh cùng tôi trong suốt chặng đường vừa qua

nghiệm dược phẩm, chúng tôi tiến hành phân lập từ nhiều nguồn khác nhau: đất, không khí, các mẫu dược phẩm bị nhiễm Sau quá trình sàng lọc, kiểm tra các đặc tính sinh hóa, định danh bằng kit API 50CHB, API 20E và kit Vitek thu được 2

chủng Bacillus subtilis PL1, VT1 với mức độ tương đồng là 97% và 99.5% đối với

kit API và 98%, 99% đối với kit Vitek Tiến hành chạy PCR, giải trình tự đoạn 16S rADN, so sánh với các trình tự trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI), chương trình

BLAST cho thấy chủng Bacillus VT1 tương đồng với chủng Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 chromosome, chủng Bacillus PL1 tương đồng với chủng Bacillus

subtilis BSn5 chromosome với tỉ lệ tương đồng đều là 99% Sau đó kiểm tra các đặc

tính sinh học đáp ứng yêu cầu trong kiểm nghiệm dược phẩm bằng phương pháp kháng sinh đồ và kiểm tra trên các mẫu thuốc thực tế tại Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy cả 2 chủng VT1 và PL1 đều nhạy cảm với các loại kháng sinh Erythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat, Erythromycin estolat và Spiramycin Các chủng sau khi đã kiểm tra đáp ứng được yêu cầu sẽ tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình bảo quản bằng phương pháp đông khô Đối với cả hai chủng VT1 và PL1, môi trường bảo vệ tối ưu là Skim milk 12% + Trehalose 7% + Na glutamate 5%, thời gian đông lạnh 2 giờ, nhiệt độ đông

đối với chủng PL1

ABSTRACT: To establish reference strain of Bacillus subtilis using in quality

control of drugs, ten of Bacillus subtilis strains were isolated from soil, air and

contaminated pharmaceutical products Identification of the bacteria was performed

by biochemical tests and molecular techniques Two isolated strains were identified

as Bacillus subtilis PL1, VT1 with identification 97%, 99.5% based on the results of

physiological and biochemical tests using kit API 50CHB, API 20E and 98%, 99% when using Vitek kit PCR amplification and 16S rDNA sequence analysis were

testing and compared with Bacillus subtilis ATCC 6633 Analysis of DNA

sequences and homology was completed with the BLAST server of the National Center for Biotechnology Information This molecular analysis showed that: the

strain of Bacillus VT1 is homogolous with Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 chromosome, the strain of PL1 is homogolous with Bacillus subtilis BSn5

chromosome with identification 99% Then, test the sensitivity of the isolated strains to a variety of antibiotics with drugs at Institute of drug quality control Ho Chi Minh city The results that two isolated strains so sensitivity with Erythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat, Erythromycin estolat và Spiramycin Then preservation of two strains by freeze drying With 2 strains VT1 and PL1, media preservation optimize is Skim milk 12 % + Trehalose 7% + Na glutamate 5%, freeze 2 hours at -80oC, survival rate 108 cfu/ml When drying at -

strain

bất kì sự sao chép kết quả nào tôi sẽ hoàn toàn chịu trách nhiệm

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC ĐỒ THỊ v

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis 3

1.1.1 Lịch sử phát triển 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm phân bố 3

1.1.4 Đặc điểm hình thái 4

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa 4

1.2 Các phương pháp định danh vi sinh vật 5

1.2.1 Phương pháp truyền thống 5

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 7

1.2.3 Phương pháp PCR – Giải trình tự gen 10

1.3 Một số phương pháp bảo quản vi sinh vật 14

1.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 14

1.3.2 Giữ giống dưới lớp dầu khoáng 15

1.3.3 Giữ giống trong cát 15

1.3.4 Giữ giống trên silicagen 15

1.3.5 Giữ giống trên gelatin 15

1.3.6 Phương pháp đông khô 16

1.3.7 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 20

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 21

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Vật liệu thí nghiệm 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp thực hiện đề tài 27

2.3.1 Phân lập Bacillus subtilis 27

2.3.2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóa 28

2.3.3 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử 30

2.3.4 Kiểm tra đặc tính sinh học đáp ứng yêu cầu trong kiểm nghiệm dược phẩm……… 33

2.3.4.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh bằng phương pháp kháng sinh đồ 34

2.3.4.2 Thử nghiệm trên một số mẫu thuốc kháng sinh 35

2.3.5 Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô 35

2.3.5.1 Khảo sát môi trường chất bảo vệ……….36

2.3.5.2 Khảo sát thời gian đông lạnh……… 36

2.3.5.3 Khảo sát quá trình đông khô………37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 Phân lập Bacillus subtilis 38

3.2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóa 39

3.3 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử 44

3.4 Kiểm tra đặc tính sinh học đáp ứng yêu cầu trong kiểm nghiệm dược phẩm……… 49

3.4.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh 49

3.4.2 Thử nghiệm trên một số mẫu thuốc kháng sinh 51

3.5 Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô 53

3.5.1 Xây dựng đường chuẩn và đường cong sinh trưởng của 2 chủng phân lập 53

3.5.1.1 Đường cong sinh trưởng 53

3.5.1.2 Đường chuẩn 54

3.5.2 Khảo sát môi trường chất bảo vệ 55

3.5.3 Khảo sát thời gian đông lạnh 57

3.5.4 Khảo sát quá trình đông khô 58

3.6 Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm đông khô 59

3.7 Kiểm tra đặc tính chủng sau quá trình đông khô 60

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1 Kết luận 63

4.2 Kiến nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis 5

Bảng 1 2 Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 7

Bảng 1 3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử 9

Bảng 1 4 Thành phần phản ứng PCR 12

Bảng 1 5 Quy mô một số bộ sưu tập giống trên thế giới 23

Bảng 2 1 Thành phần phản ứng PCR……… 32

Bảng 2 2 Danh mục các loại kháng sinh và phương pháp thực hiện……… 34

Bảng 2 3 Môi trường chất bảo vệ của Bacillus subtilis……… 36

Bảng 3 1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng VT1 và PL1 41

Bảng 3 2 Kết quả định danh bằng kit Api 20E chủng VT1 và PL1 41

Bảng 3 3 Kết quả định danh bằng kit Api 50 CHB chủng VT1 và PL1 42

Bảng 3 4 Kết quả định danh bằng kit Vitek chủng VT1 và PL1 43

Bảng 3 5 Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho16S rARN của 2 chủng VT1 và PL1 45

Bảng 3 6 Kết quả định danh 48

Bảng 3 7 Các đặc tính sinh học của chủng Bacillus subtilis trong kiểm nghiệm dược phẩm 49

Bảng 3 8 Đường kính vòng vô khuẩn của các chủng vi khuẩn 50

Bảng 3 9 Kết quả kháng sinh đồ của chủng B subtilis VT1 và PL1 51

Bảng 3 10 Đường kính vòng vô khuẩn chủng Bacillus subtilis với kháng sinh Erythromycin 52

Bảng 3 11 Đường kính vòng vô khuẩn chủng Bacillus subtilis với kháng sinh Spiramycin 53

Bảng 3 12 Nồng độ vi khuẩn chủng VT1, PL1 trước và sau đông lạnh 55

Bảng 3 13 Nồng độ vi khuẩn trước và sau đông lạnh trong 2 giờ và 16 giờ 57

Bảng 3 14 Nồng độ vi khuẩn VT1 và PL1 sau đông khô 58

Bảng 3 15 Nồng độ vi khuẩn VT1 và PL1 sau thời gian bảo quản 1 tháng ở các nhiệt độ khác nhau 59

Bảng 3 16 Đặc tính sinh hóa của chủng VT1 và PL1 sau đông khô 61

DANH MỤC HÌNH Hình 1 1 Các bước trong phản ứng PCR……… 11

Hình 1 2 Bản đồ primer cho gen 16S rARN………12

Hình 1 3 Các bước của quá trình đông khô……….18

Hình 2 1 Chạy PCR……… 32

Hình 2 2 Điện di trên gel agarose……… 33

Hình 3 1 Chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường lỏng TSB và môi trường thạch TSA 38

Hình 3 2 Hình thái khuẩn lạc VT1 và PL1 trên môi trường MYP 38

Hình 3 3 Chủng VT1 và PL1 dưới kính hiển vi 38

Hình 3 4 Chủng VT1 và PL1 dưới kính hiển vi điện tử quét 39

Hình 3 5 Phản ứng Catalase của chủng VT1 và chủng PL1 39

Hình 3 6 Kit Api 50 CHB và Api 20 E trước và sau khi ủ 24 giờ 39

Hình 3 7 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PL1 44

Hình 3 10 Cây phân loại của chủng VT1 46

Hình 3 11 Cây phân loại của chủng PL1 47

Hình 3 12 Vòng vô khuẩn của các chủng B subtilis ATCC 6633, PL1, VT1 50

Hình 3 13 Vòng vô khuẩn của chủng Bacillus subtilis VT1 với kháng sinh Spiramycin và chủng Bacillus subtilis PL1 với Erythromycin 52

Hình 3 14 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PL1 sau đông khô 61

DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3 1 Đường cong sinh trưởng của chủng VT1 và PL1 54

Đồ thị 3 2 Đường chuẩn của chủng PL1 54

Đồ thị 3 3 Đường chuẩn của chủng VT1 55

Đồ thị 3 4 Nồng độ vi khuẩn sau đông lạnh 56

Đồ thị 3 5 Nồng độ vi khuẩn sau đông lạnh theo thời gian 58

PHẦN MỞ ĐẦU

Thuốc là một loại hàng hóa đặc biệt có quan hệ, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, thậm chí đến cả tính mạng của người bệnh hoặc người sử dụng thuốc Bên cạnh nhiệm vụ hàng đầu của ngành y tế là tìm ra những phương thức mới để phòng

và chữa bệnh thì một trong những mục tiêu hiện nay là tạo ra được những sản phẩm thuốc có chất lượng cao, ổn định, giá cả hợp lý cho người sử dụng Do đó, đảm bảo chất lượng thuốc là công việc rất quan trọng Chất chuẩn, chất đối chiếu là một trong những yếu tố không thể thiếu trong công tác kiểm nghiệm dược phẩm Do là loại hàng hóa đặc biệt nên quy trình kiểm nghiệm cũng được quy định nghiêm ngặt Chủng vi sinh vật chuẩn sử dụng phải theo quy định của Dược điển hoặc các chủng

có đặc tính tương đương với chủng chuẩn trong Dược điển Việc mua bán khó khăn

vì thủ tục nhập khẩu (do là một mặt hàng đặc biệt nhạy cảm), lại rất đắt tiền Mặt khác, theo quy định thì việc cấy truyền chủng vi sinh vật nhiều lần là không được phép Chính vì vậy mà các cơ sở y tế trên thế giới cũng phải tự xây dựng bộ sưu tập

vi sinh vật đối chiếu để đáp ứng nhu cầu của chính mình Hiện nay, trong nước chưa

có cơ quan nào chuyên cung cấp nguồn chủng chuẩn vi sinh vật cho ngành dược

Đa số chủng vi sinh vật chuẩn đang sử dụng trong ngành dược được lấy từ các nguồn xin - cho thiếu rõ ràng hoặc được mua về từ các ngân hàng chủng quốc tế có

uy tín Do đó, chúng ta chưa thể chủ động nguồn chủng chuẩn này Nắm được nhu cầu này, xuất phát từ công việc thực tế tại Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để phân lập, định danh và xây dựng nguồn chủng chuẩn vi sinh vật tương đương với ATCC để phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược phẩm Có nhiều chủng chuẩn vi sinh vật khác nhau cần thiết cho

công tác kiểm nghiệm dược phẩm, Bacillus subtilis được sử dụng trong phép thử

giới hạn nhiễm khuẩn, phép thử xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử

vi sinh vật, kiểm nghiệm sản phẩm probiotic, kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy

- Trong phép thử giới hạn nhiễm khuẩn: chủng chuẩn được dùng làm đối chứng dương trong các phản ứng sinh hóa phát hiện vi sinh vật gây bệnh,

kiểm tra tính có giá trị của phương pháp đếm trong định lượng vi sinh vật

- Trong phép thử xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương pháp thử

vi sinh vật và xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản: được đánh giá dựa trên khả năng ức chế hoặc tiêu diệt chủng vi sinh vật ở điều kiện thích hợp

- Trong kiểm nghiệm sản phẩm probiotic, chủng chuẩn được làm chứng dương trong định danh loài

- Ngoài ra, chủng chuẩn còn được sử dụng để kiểm tra chất lượng của các loại môi trường nuôi cấy

Với những ứng dụng trên thì chủng Bacillus subtilis chuẩn là một trong những

điều kiện bắt buộc của phép thử vi sinh

Với tình hình kinh tế chung của nước ta, việc mua chủng vi sinh vật từ nước ngoài đồng thời tuân thủ đúng quy định quốc tế khi sử dụng là thiếu khả thi Vì thế,

tự nghiên cứu và xây dựng một bộ sưu tập chủng vi sinh vật có đặc tính tương đương với các chủng chuẩn quốc tế để phục vụ cho ngành là một nhu cầu thực tiễn

và cấp thiết Việc xây dựng này không chỉ phục vụ cho công tác kiểm nghiệm mà còn cho cả công tác nghiên cứu sâu về chuyên môn Do đó, Bộ Y tế đã giao cho Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh thực hiện dự án khoa học công nghệ mang tên “Xây dựng một số chủng vi sinh vật đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm”

Với cơ sở vật chất hiện tại và yêu cầu cấp thiết của Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh và thời gian thực hiện luận văn, tôi đặt ra mục tiêu nghiên

cứu bước đầu chủng Bacillus subtilis để có kinh nghiệm thực tiễn về cách thức xây dựng bộ sưu tập chủng vi sinh đối chiếu với đề tài “Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis

1.1.1 Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ

chức y học Nazi của Đức Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 – 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết

của Bacillus subtilis Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilin ra đời trị

các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá Ngày

nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong chăn

Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể phân lập được ở khắp nơi trong không khí, cả

trong đất lẫn trong môi trường nước Chúng thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, thường có trong những môi trường thiếu hụt dinh dưỡng, được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước….Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g Đất nghèo dinh

dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis

[1]

1.1.4 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ (3 –

5) × 0.6µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, có khả năng di động, gồm 8 – 12 lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0.8 – 1.8 µm Vị trí của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào,

có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm Bacillus subtilis là loài sinh

vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện [2]

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào

tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra 1 bào tử Bacillus

subtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi

khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ, pH…) Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành

phần và có thêm một số thành phần mới B subtilis phát triển bằng cách nảy mầm

do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…[3]

1.1.5 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi

C, pH = 7.0 – 7.4, tối ưu ở pH 7.2

Vi khuẩn lên men không sinh khí các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose, arabinosse và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động

của hemolysine Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm

protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase

Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp, đặc biệt

là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase…

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L

của acid glutamic Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi

khuẩn Gram dương và Gram âm Tuy nhiên, đa số các chủng Bacillus subtilis

không gây bệnh

Bảng 1 1 Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis

tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có

ý nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn Gram âm)

Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị

cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái Các phương pháp định danh truyền thống:

- Kit sinh hóa: dựa vào các phản ứng sinh hóa khác nhau của vi sinh vật

Phương pháp này đơn giản, nhanh và dễ thực hiện Tuy nhiên có nhược điểm là phản ứng còn nhiều sai số trong các trường hợp gen quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả Hiện nay, trên thị trường có 2 bộ kit thương mại thường dùng để định danh nhanh vi sinh vật, đó là bộ kit của Api và Vitek

- Phân biệt bằng thực khuẩn thể: Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực

khuẩn thể khác nhau Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một

số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn

và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính, do

đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ

- Phân biệt theo tuýp huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâu

nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ) Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất và tính ổn định giữa các lần lặp lại

- Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin): Bacteriocin

bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật

Bảng 1 2 Một số phương pháp phân loại vi sinh vật

ADN nhiễm sắc thể

Các phần ADN được cắt bằng enzyme giới hạn

Loài và dưới loài

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của ARN riboxom

Thành tế bào

Cấu trúc peptidoglycan

Loài và chi Polysacherid

Axit teichoic

[4]

Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu sau:

- Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếu

đến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid nucleic thông qua giải trình tự ADN và lai ADN Kỹ thuật phân tích acid nucleic bao gồm: kỹ thuật phân tích ADN plasmid và kỹ thuật phân tích ADN nhiễm sắc thể

Phương pháp phân tích plasmid là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật Việc kết hợp giữa phân tích plasmid với

sử dụng enzym cắt hạn chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông tin đáng tin cậy đối với các mẫu phân tích Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trên plasmid thì cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu Khi thực hiện phép phân tích điện di trong trường xung điện (PFGE) với các plasmid lớn sẽ khắc phục được hạn chế của các phép phân tích hiện tại với plasmid nhỏ như trên Phương pháp PFGE hiện đang được dùng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tượng dễ nuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhưng hạn chế về giá thành thiết bị cũng như yêu cầu cao về kỹ thuật và kinh nghiệm Mặt khác khi sử dụng các enzym cắt

sẽ khó phát hiện được mức độ sai khác Như vậy sự kết hợp giữa các phép phân tích plasmid, PFGE và lai ADN sẽ cho kết quả tin cậy hơn

- Phân tích protein: bao gồm các kỹ thuật sau đây:

protein có ý nghĩa quyết định đối với việc tìm hiểu được chức năng của chúng Do

đó, các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù của nó

về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là chức năng của chúng

sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột Ngoài ra còn có phương pháp sắc ký trao đổi ion, sắc lý lọc gel…

của từng loại protein có thể được tận dụng để giúp tinh sạch loại protein tương ứng

được thuận tiện và hiệu quả hơn Một dạng phổ biến thường hay sử dụng là sắc ký

ái lực miễn dịch

trên gel polyacrylamid

miễn dịch gần giống với phương pháp thẩm tách (lai) đối với ADN và ARN nhưng dựa trên nguyên tắc miễn dịch đặc thù của protein nên được gọi là thẩm tách miễn dịch

 Giải trình tự trực tiếp protein: Mặc dù có cấu trúc phức tạp hơn ADN và ARN nhưng các phân tử protein cũng có thể giải trình tự trực tiếp, tức là việc xác định thành phần và thứ tự các acid amin trong chuỗi polypeptide Có 2 phương pháp được sử dụng phổ biến là phương pháp biến tính Dman và phương pháp khối phổ kế tiếp [5]

Bảng 1.3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử

- Thời gian lâu

- Giảm rủi ro khi tiến hành trên các vi sinh vật độc hại Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (ADN, ARN) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

1.2.3 Phương pháp PCR – Giải trình tự gen

Đề tài định danh chủng Bacillus subtilis bằng kỹ thuật phân tích acid nucleic,

cụ thể là phản ứng PCR và giải trình tự gen Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới PCR

là phương pháp dùng enzym khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ

Nguyên tắc

Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh PCR là một chuỗi nhiều chu

kì nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 bước (hình 1.1):

- Bước 1 là giai đoạn biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi

- Bước 2 là giai đoạn lai, hai mồi bắt cặp vào hai sợi đơn của khuôn, thường xảy ra ở nhiệt độ 40 – 70oC trong 30 giây – 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi

- Bước 3 là giai đoạn kéo dài chuỗi theo mồi, nhiệt độ được tăng lên dến

thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ

Hình 1 1 Các bước trong phản ứng PCR [6]

Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

- ADN mẫu: mức độ tinh sạch, chiều dài của ADN mẫu

- Enzyme: sử dụng enzyme có khả năng chịu nhiệt tốt, không bị phá hủy ở

nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng

- Mồi và nhiệt độ lai: việc chọn mồi đặc hiệu là giai đoạn quyết định hiệu

quả của phản ứng PCR Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, không có cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa và mồi phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại

Giải trình tự: Giải trình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại

nucleotide A (adenine), C (cytocine), G (guanine), T (thymine) trên phân tử ADN Trình tự rADN của vi khuẩn 0.3 – 0.4 % bộ gen Các chủng vi khuẩn đều mang đoạn gen 16S có độ bảo thủ cao, không có sự trao đổi giữa các loài và nó mang tính đặc trưng cho loài Ngoài ra, chỉ có gen 16S rARN với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu Theo Stackebrandt và cộng sự (2002) trình tự 16S

rADN chỉ có giá trị trong phân loại và định danh một loài mới khi được giải mã từ 1

300 nucleotide trở lên và không quá 5% nucleotide không thể xác định Sau khi so sánh kết quả phân tích độ tương đồng ADN bộ gen và trình tự 16S rADN, Stackerbrandt cùng Goebel (1994) đã xác định các chủng thuộc về cùng 1 giống có

độ tương đồng về trình tự 16S rADN lớn hơn hay bằng 97% [7] Các chủng thuộc

về cùng một loài có độ tương đồng về trình tự 16S rADN từ 99% trở lên [8] Do đó,

nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rARN đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn chúng bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rARN

Hình 1 2 Bản đồ primer cho gen 16S rARN [9]

Ưu điểm:

- Độ nhạy rất cao, phân loại, xác định loài chính xác

- Thời gian thực hiện nhanh (chỉ cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự ADN được quan tâm)

- Là cơ sở cho sự phát triển nghiên cứu về sự tiến hóa của giống, loài

- Thao tác đơn giản, ít tốn kém

- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao

- Độ chính xác của Tag polymerase không cao

- Không phân biệt được ADN của tế bào sống và tế bào chết trong mẫu ban đầu

Ứng dụng: Các ứng dụng của phương pháp PCR bao trùm nhiều lĩnh vực

quan trọng của nghiên cứu và đời sống Chủ yếu gồm có: sản xuất mẫu dò dùng trong phương pháp lai phân tử, nhân bản một trình tự ARN, định lượng so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau Cụ thể trong từng ngành như sau:

- Y khoa: dùng để chuẩn đoán bệnh với tác nhân là virut, vi khuẩn, chẩn đoán viêm não, viêm màng não Xét nghiệm trong chuẩn đoán virut gây viêm gan siêu vi

B và C Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh trong dịch não tủy Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (HIV, HBV, HCV, M.tuberculosis, leptospira, H.pylory ) có trong các loại bệnh phẩm lâm sàng khác nhau, chẩn đoán các bệnh ung thư: vú, leukeumia và các loại ung thư khác Phát hiện định danh về huyết thống, dấu vân tay, định tuýp mô học, pháp y

- Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định yếu tố gây bệnh trong cây trồng Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống Dùng phát hiện

ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo như việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin

- Thực phẩm: xác định tác nhân gây bệnh do vi khuẩn, virut có trong mẫu thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm Dùng để chuẩn đoán thực phẩm có nguồn gốc tự

nhiên hay sản phẩm chuyển đổi gen Shigella spp là một loại vi khuẩn gây bệnh

nguy hiểm có mặt trong thực phẩm, có thể gây bệnh với một lượng nhỏ từ 10 đến

20 tế bào Phương pháp truyền thống hiện nay để phát hiện Shigella từ thực phẩm

dựa vào các kỹ thuật nuôi cấy, phân lập vi sinh, các thử nghiệm sinh hóa, mất nhiều

ngày để cho kết quả Do vậy, một quy trình PCR để pháy hiện Shigella có tính đặc

hiệu cao và cho kết quả nhanh hơn đã được phát triển Quy trình này được tiến hành với cặp mồi SHIG khuếch đại cho một trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc

hiệu cho cho Shigella spp Và cặp mồi 16S rARN hiện diện trong mọi vi khuẩn Phương pháp này cho phép phát hiện Shigella spp ở mức 10 cfu/25g thực phẩm sau

12 – 24 giờ tăng sinh, cho kết quả sau 24 giờ, ngắn hơn rất nhiều lần so với việc phát hiện bằng phương pháp truyền thống

Như vậy: Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân loại vi sinh vật nhưng không có phương pháp nào là tối ưu thích hợp cho mọi đối tượng vi sinh vật, tính chính xác chỉ có thể đạt được khi ta phối hợp các phương pháp với nhau

1.3 Một số phương pháp bảo quản vi sinh vật

Có nhiều phương pháp bảo quản giống khác nhau, tùy theo từng loại vi sinh vật, điều kiện trang thiết bị mà ta có cách bảo quản riêng

1.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác

và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích

hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform có thể sống được

vài năm theo cách này Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các

chủng đang dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc

- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản

- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản

- Tốn nhiều công sức để cấy truyền

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền

1.3.2 Giữ giống dưới lớp dầu khoáng

Phương pháp này được A.Lumière và J.Chevotier đề nghị đầu tiên năm 1914

và hiện nay đang được sử dụng để bảo quản 73% nấm mốc, 100% xạ khuẩn, 80% nấm men và 73% vi khuẩn Tuy nhiên có một số vi sinh vật không thích hợp với

cách bảo quản dưới lớp dầu khoáng như Aerobacter, Alcaligens, Leuconostoc,

Pseudomonas, Streptococus, Vibriio Phương pháp thực hiện là phủ lên môi trường

agar đã có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng Phương pháp này có thể bảo quản giống khoảng 12 tháng, đỡ tốn công cấy truyền như phương pháp thạch nghiêng và ít có nguy cơ bị thoái hoá hoặc nhiễm tạp

1.3.3 Giữ giống trong cát

Phương pháp này thường để giữ các vi sinh vật có bào tử Bảo quản trong

cấy ria lên môi trường agar, chọn các khuẩn lạc điển hình

1.3.4 Giữ giống trên silicagen

Cách làm: Silicagen nghiền mịn 1 mm, xử lý và tiến hành như phương pháp giữ giống trên cát

1.3.5 Giữ giống trên gelatin

Rất nhiều vi sinh vật được giữ giống trên gelatin, đây là phương pháp dễ làm

và an toàn được công bố năm 1947 và ngày càng phổ biến rất rộng rãi Có 2 cách:

trước vào gelatin

Nuôi vi sinh vật trên môi

/ ml Phân làm các

miếng nhỏ

gelatin

Cho môi trường gelatin đã có

vi sinh vật từng giọt lên đĩa

petri vô trùng

Dùng micropipet nhỏ từng giọt lên miếng giấy nến trên

môi trường agar, chọn khuẩn

lạc điển hình

Lấy gelatin cho vào 1ml môi trường lỏng thích hợp nuôi ở

môi trường agar, chọn khuẩn

lạc điển hình [11]

1.3.6 Phương pháp đông khô

Đông khô là phương pháp được sử dụng để bảo quản vi sinh vật trong nhiều thập kỉ và ngày càng được dùng phổ biến trong các ngân hàng chủng chuẩn trên thế giới như American Type Culture Collection (ATCC), National Collection of Type Cultures (NCTC) Sản phẩm đông khô dễ dàng bảo quản và vận chuyển [8]

Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một

số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật

Quy trình đông khô gồm có 3 giai đoạn:

- Tiền đông lạnh: đông lạnh mẫu hoàn toàn

- Làm khô sơ cấp: khoảng 90% tổng lượng nước trong mẫu được loại bỏ bằng thăng hoa (tất cả những nước tự do và một số nước ở vùng ngoại biên)

- Làm khô thứ cấp: nước ngoại biên và bước bên trong sản phẩm tiếp tục được giải phóng ra ngoài, kết quả là sản phẩm chỉ có độ ẩm dưới 1 – 3 % Bước này đòi hỏi 1/3 – 1/2 thời gian của quá trình làm khô sơ cấp

Tùy thuộc vào cấu hình của máy mà giai đoạn tiền đông lạnh và làm khô có thể thực hiện chung trong cùng một máy hoặc ở hai máy riêng biệt, máy đông lạnh

và máy đông khô (hình 1.3)

Các phương pháp đông khô: có 3 phương pháp:

- Phương pháp manifold: các bánh làm khô được nối kết với các lỗ riêng biệt trên một manifold trung tâm Mẫu được đựng trong những lọ nhỏ và thường được làm đông lạnh bằng phương pháp shell và đặt vào các bình làm khô để nối kết nhanh tới manifold và đặt dưới chân không để tránh hiện tượng bị tan chảy lại Phương pháp này thường hiệu quả cho những thể tích tương đối nhỏ

- Phương pháp batch được sử dụng với số lượng lớn các vật chứa có kích cỡ tương tự được làm đông khô đồng thời, ví dụ các ống huyết thanh Một hệ thống khay được sử dụng thay thế cho manifold Yếu tố nhiệt trong các khay sẽ cung cấp nhiệt Hầu hết các hệ thống lô có một cơ chế để hàn kín các ống trước khi chúng được đưa ra phơi nhiễm ngoài không khí

- Phương pháp bulk được sử dụng cho những thể tích lớn của một mẫu đơn

lẻ Mẫu thường được đổ vào trong một cái khay đặc biệt, được làm đông lạnh và sau

đó làm khô trong máy đông khô Các mẫu làm khô bulk không thể hàn kín trong thiết bị Việc phơi nhiễm ngoài không khí có thể ảnh hưởng tới tuổi thọ sản phẩm Thông thường theo phương pháp đông khô vi sinh vật được bảo quản từ 10 –

20 năm Nói chung phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức, sai sót nhãn mác và tạp

nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị

Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học

Hình 1 3 Các bước của quá trình đông khô [8]

Vai trò của các chất bảo vệ:

- Đường: đường đôi (lactose, maltose, trehalose, sucrose), đường đơn

(glucose, galactose), đường ba (raffinose) Cơ chế bảo vệ do: thay thế liên kết hydro trong phân tử nước giữa lớp màng kép, hạ thấp sự chuyển pha màng và bảo vệ trạng thái protein của tế bào vi khuẩn, tạo tinh thể hỗ trợ cấu trúc khối của sản phẩm khi đông đá, ổn định màng tế bào Với những vi khuẩn không chịu được lạnh có thể sẽ

bị sụt giảm số lượng ngay ở giai đoạn đông đá, các đường giúp tăng điểm nhiệt độ

Cấy vi khuẩn

Đông lạnh các vial

Chuyển các vial vào máy đông khô

Chuyển các vial vào máy đông lạnh

Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn trong môi trường

chất bảo vệ Phân phối vào các vial

Ủ Thu hoạch

Tc hay Tg, hạn chế sự chết của vi khuẩn Các đường thường sử dụng với nồng độ từ

5 - 15% phụ thuộc các thành phần kết hợp khác (thông thường sử dụng ở nồng độ 7.5% và 12.5%) [8,10,13]

Trong đó, trehalose và sucrose đã được sử dụng rộng rãi với các loại vi sinh vật trên 20 năm qua nhờ các tác dụng bảo vệ như: giúp ổn định màng và protein của

vi sinh vật bằng cách thay thế nước xung quanh các phần phân cực của cấu trúc đại phân tử, bảo vệ cấu trúc và chức năng của protein bằng cách hình thành liên kết hydro bảo vệ cấu trúc bậc 3 của protein khi mất phân tử nước Trehalose còn được

bền ở nhiệt độ cao hơn mà có thể là do dạng cấu trúc vô định hình của trehalose duy trì tính ổn định tương đối khi tăng nhiệt độ, có khả năng hình thành tinh thể ngậm hai nước vì vậy giúp hấp phụ một lượng nước nhỏ thiết yếu để giúp khối matrix kết

- Protein: như sữa gầy, huyết thanh, pepton, cao nấm men, albumin huyết

tương bò, trypton, trypsin, cao thịt… có tác dụng là nguồn cung cấp đạm, acid amin, vitamin và khả năng đệm

Các protein có thể cải thiện đáng kể đặc tính kết tinh so với các đường nhờ sự bền vững hơn khi nhiệt độ trên điểm Tg của chúng Điều này gợi ý rằng các protein

có thể đóng vai trò quan trọng hơn trong việc hình thành tinh thể Đó là lí do mà skimmed milk và huyết thanh được sử dụng trong đông khô Vì thế, kết hợp protein

Tuy nhiên huyết thanh ngựa không được dùng cho đông khô vi khuẩn thuộc

nhóm Enterobacteria do làm thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn [16]

- Amino acid: như sodium glutamat, proline, glutamat có tác dụng nhờ phản

ứng với nhóm carboxyl của vi sinh vật và ổn định protein, là chất bảo vệ thẩm thấu, chất ổn định sản phẩm

- Các chất chống oxi hóa: như sodium thisulfat, than hoạt, acid ascorbic, tác

dụng là chống oxy hóa, làm mất các gốc tự do, ổn định sản phẩm

Than hoạt còn có tác dụng hấp phụ oxi và các chất độc hại sinh ra trong môi trường Một số trường hợp nhạy cảm, do nồng độ các chất bảo vệ trong quá trình

đông khô quá cao khiến ức chế khả năng phục hồi vi khuẩn đã đông khô trong môi trường dinh dưỡng, thì than hoạt còn giúp cải thiện tỷ lệ này.

- Các polymer: như gôm xanthum, gelatin, maltodextran, tinh bột,

polyethylen glycol có tác dụng giảm khả năng bám nước vào mẫu, giảm độ ẩm trong mẫu, giúp nhanh cân bằng nước, ngăn hình thành đá nội bào

- Các polyol và alcohol: như butanol, mannitol, glycerol, sorbitol, inositol có

tác dụng thay thế phân tử nước khi bị loại khỏi lớp lipid màng, giảm khả năng bám nước trên bề mặt protein, tăng thoát hơi nước ngay trong quá trình đông lạnh

- Các chất khác như mật ong là nguồn hỗn hợp các đường, thay thế liên kết

hydro của phân tử nước khi nước bị loại bỏ, sodium acetat, myo - inositol bảo vệ hoạt tính enzym màng, whey có khả năng đệm…

Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm đông khô:

- Đặc tính của mẫu: đặc tính lý hóa của các thành phần hóa học và những tương tác có thể có của dung dịch hoặc hỗn hợp được đông khô Điểm nhiệt độ eutectic, nồng độ dung dịch

- Kích cỡ mẫu, bề mặt tiếp xúc của mẫu, bề dày của mẫu

- Điều kiện thực hiện quy trình đông khô: cách thực hiện tiền đông lạnh, áp suất, nhiệt độ kiểm soát trong quá trình làm khô, thời gian làm khô

- Đặc tính lý hóa của các vật chứa trong quá trình đông khô và bảo quản về sau

- Độ sạch cũng như ngoại nhiễm, trang thiết bị

1.3.7 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C – -80 °C)

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương

pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20oC, -30oC,

quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut [11]

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí

mà không thích hợp với phương pháp đông khô

Tóm lại, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài

Tình hình thế giới

Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là một tập hợp các loài vi sinh vật đã được định danh rõ ràng và xác định những đặc điểm sinh lý, sinh hóa, được bảo quản trong điều kiện thích hợp và đặt mã số riêng, có hồ sơ riêng Trên thế giới, đã có khá nhiều các ngân hàng chủng chuẩn có uy tín như: American Type Culture Collection (ATCC), National Collection of Type Cultures (NCTC), NITE Biological Resource Center (NBRC), National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), German Collection of Microorganisms and Cell cultures (DSMZ )… ATCC được thành lập vào năm 1925 nhằm đáp ứng nhu cầu về giống vi sinh vật của các nhà khoa học trên toàn thế giới Kể từ lúc ra đời đến nay, ngân hàng không ngừng phát triển cả về số lượng lẫn chất lượng và đóng vai trò ngày càng

quan trọng trên thế giới Đây là trung tâm lưu trữ nguyên vật liệu sinh học dành cho nghiên cứu, bao gồm tế bào, bộ gen, vi sinh vật chuẩn và những sản phẩm probiotic Ngân hàng gồm hơn 3 400 dòng tế bào của người, động vật, thực vật Bộ sưu tập vi sinh vật với hơn 18 000 chủng vi khuẩn, 2 000 loại vi rút động vật và 1 000 loại vi rút thực vật khác nhau Ngoài ra, ATCC cũng lưu trữ hơn 2 000 loại nguyên sinh động vật và hơn 49 000 loại nấm men, nấm mốc Đây là trung tâm lưu trữ giống lớn nhất trên thế giới, các chủng chuẩn tại đây được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước khác nhau [17]

Hiện nay, DSMZ là một trong những trung tâm chủng sinh học lớn trên thế giới với bộ sưu tập hơn 40 000 loại khác nhau Trong đó có hơn 20 000 chủng vi khuẩn, 5 000 chủng vi nấm, 700 dòng tế bào của người và động vật, 800 dòng tế bào thực vật, 1 000 loại vi rút và hơn 4 800 bộ gen ADN vi khuẩn khác nhau Ngoài

ra, DSMZ là nơi cung cấp các tài liệu và thông tin chẩn đoán chi tiết về các vật liệu sinh học Các nghiên cứu xuyên ngành của DSMZ tập trung vào: sự đa dạng vi sinh vật và cơ chế tiến hóa cơ bản (tiến hóa bộ gen, di truyền học dân số), phương pháp cải thiện cho việc tiếp cận và tiền bảo quản đa dạng sinh học, cơ chế phân tử của sự tương tác sinh học (cộng sinh, cơ chế của các loại bệnh, ung thư) Chính sự đa dạng

về chủng loại và cách quản lý chất lượng đã làm cho DSMZ trở thành một nhà cung cấp sản phẩm sinh học nổi tiếng trong nghiên cứu khoa học, phòng thí nghiệm, là tài liệu tham khảo cho quốc gia cũng như các đối tác công nghiệp [18]

NCTC (National Collection of Type Cultures) được thành lập năm 1920, là một trong bốn trung tâm thuộc tổ chức HPA Culture Collections Trung tâm lưu trữ

Mặc dù đã có nhiều ngân hàng chủng lớn nhưng các nhà khoa học trên thế giới vẫn không ngừng nghiên cứu phân lập và ứng dụng chủng này trong nhiều lĩnh vực khác nhau Một nghiên cứu của Yu – Kyoung Kim và cộng sự năm 2006, nhóm tác

giả đã phân lập được 3 chủng Bacillus subtilis SL9 – 9, C5 – 16, và S52 – 2 từ nông

nghiệp có enzyme cellulolytic để chuyển hóa cellulose và hemicellulose Tỉ lệ sống của vi sinh vật rất quan trọng trong quá trình bảo quản Vì vậy, năm 2007, Yikie Miyamoto – Shinohara và cộng sự đã khảo sát tỉ lệ sống của một số chủng vi khuẩn

trong quá trình bảo quản và sau bảo quản bằng phương pháp đông khô Kết quả cho thấy tỉ lệ sống của vi khuẩn Gram dương cao hơn vi khuẩn Gram âm Đồng thời khi

đông khô một số chủng Bacillus subtilis với chất bảo vệ là 10% skim milk, 1%

sodium glutamate thì tỉ lệ sống có thể đạt được 100%, thông thường là 62.8 – 92.4% ngay sau đông khô và tỉ lệ sống này sẽ giảm mỗi năm theo hàm số log Nhóm tác giả cũng đưa ra 3 cách để tăng tỉ lệ sống của vi khuẩn Một là giảm các phân tử nước trong các ống mẫu bằng cách chuẩn bị vi khuẩn ở điều kiện khô và đóng gói dưới điều kiện chân không Hai là giảm hoạt động của phân tử nước bằng cách bảo

mẫu Năm 2010, một nhóm tác giả gồm Chun – lei Wang và cộng sự đã phân lập và

được chủng Bacillus subtilis từ đất rừng, chủng này có khả năng ức chế hoạt động

của laccase, sau đó nhóm tác giả tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa, sinh học phân tử, giải trình tự 16S rADN…

Chủng Bacillus subtilis đã được phân lập và định danh, có hồ sơ chủng tại

ngân hàng lưu trữ giống của Mỹ (ATCC) và một số ngân hàng chủng trên thế giới

Bảng 1 5 Quy mô một số bộ sưu tập giống trên thế giới

Tên Bảo tàng vi sinh

Tại Việt Nam, để cung cấp và phục vụ cho công tác kiểm nghiệm Dược phẩm, các chất chuẩn hóa học đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nhiều Trong khi

đó, nguồn chủng chuẩn vi sinh vật lại chưa đáp ứng được nhu cầu thực tiễn đang đòi hỏi rất lớn Từ năm 1995 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại học

Quốc gia Hà Nội đã xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn VTCC (Vietnam Type Culture

Collection) Bộ sưu tập VTCC hiện nay có hơn 9 000 chủng vi khuẩn đang được

bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu, nitơ lỏng và đông khô Tuy nhiên chỉ có hơn

2 300 chủng đã nghiên cứu được đặc tính sinh hóa, sinh lý và sinh học phân tử, còn lại rất nhiều chủng chỉ được xác định đến giống, hoặc có nhiều vi khuẩn có cùng

giống chẳng hạn như giống Lactobacillus có đến 25 chủng vi khuẩn nên số lượng

loài vi khuẩn không được phong phú Năm 2010, Phạm Hùng Vân cùng cộng sự đã xây dựng ngân hàng vi khuẩn để huấn luyện và đào tạo về vi sinh, kiểm tra chất lượng của các phòng thí nghiệm và để hỗ trợ nhiều nghiên cứu khác Các chủng được định danh rõ ràng với các dữ liệu về nguồn gốc chủng, tính chất vi thể, sinh hóa học, trình tự 16S rADN và tính chất đề kháng kháng sinh Nhóm tác giả đã xây dựng được ngân hàng vi khuẩn với 155 chủng vi khuẩn thuộc 152 loài khác nhau Một số nơi khác như Bộ môn xét nghiệm, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng có bộ sưu tập dùng trong giảng dạy về xét nghiệm vi sinh lâm sàng nhưng số lượng rất hạn chế, chỉ khoảng 20 chủng và đa phần các chủng vi khuẩn này không có nguồn gốc rõ ràng và được định danh dựa trên vài tính chất sinh hóa học nên kết quả không thể chuẩn xác được Nguồn chủng chuẩn hạn hẹp, đặc biệt là những chủng chuẩn dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu Do vậy mà các công ty cũng như cơ quan kiểm nghiệm dược phẩm phải mua chủng chuẩn từ các ngân hàng chủng chuẩn có uy tín trên thế giới Chính vì vậy, xây dựng một ngân hàng chủng chuẩn dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm là một điều hết sức cần thiết và cấp bách Do đó, chúng tôi thực hiện đề

tài “Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược

phẩm” nhằm đáp ứng nhu cầu nói trên

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

2.1 Vật liệu thí nghiệm

2.1.1 Giống vi sinh vật:

- Chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất, không khí, mẫu thuốc

- Chủng Bacillus subtilis ATCC 6633

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Trypticasein soy agar (TSA) (Merck)

- Môi trường Trypticasein soy broth (TSB) (Merck)

- Môi trường Mannitol Egg yolk Polymyxine Agar (MYP) (Merck)

- Môi trường Mueller Hinter agar (MHA) (Oxoid)

- Môi trường Api (Bio Merieux)

- Thiết bị phân tích: kính hiển vi, cân kỹ thuật, cân phân tích, micro pipet, pH

kế, máy đo quang phổ, máy vortex, máy đo đường kính vòng kháng khuẩn, máy PCR, máy điện di ngang HU10, máy định lượng ADN…

- Dụng cụ thủy tinh dùng trong phân tích: erlen, becher, đĩa petri, ống nghiệm, bình định mức, phễu, pipette…

- Máy đông khô Christ

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được thể hiện bằng sơ đồ bố trí thí nghiệm sau:

Kiểm tra đặc tính sinh học phù hợp yêu cầu chủng đối chiếu trong kiểm nghiệm

và giải trình tự 16S rADN)

Khảo sát đông khô

Khảo sát tiền đông khô

Theo dõi tính ổn định di truyền sau bảo quản

Kiểm tra một số đặc tính sinh học Định danh

2.3 Phương pháp thực hiện đề tài

2.3.1 Phân lập Bacillus

Nguyên tắc

Dựa vào nguyên tắc Kock, tiến hành phân lập các vi sinh vật từ các khuẩn lạc riêng lẻ Tiếp tục cấy ria các khuẩn lạc này trên các đĩa môi trường đến khi thu được chủng thuần có độ đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc trên môi trường

Tiến hành

Mục đích của đề tài là xây dựng chủng chuẩn dùng trong công tác kiểm

nghiệm dược phẩm Do đó, tôi tiến hành phân lập Bacillus bị nhiễm từ trong các

mẫu dược phẩm, đất, không khí

Phân lập trong các mẫu thuốc bị nhiễm: Trong quá trình kiểm nghiệm dược

phẩm, phát hiện trong mẫu có nhiễm Bacillus Do đó chúng tôi tiến hành phân lập

Cân 10g thuốc vào 90ml dung dịch đệm phosphat pH 7, lắc cho kỹ để thuốc tan

, 10-2, 10-3, hút 1ml mẫu cho vào đĩa, cho môi trường TSA vào lắc đều, để đông Đồng thời, hút 10ml dung dịch pha loãng ban đầu vào bình chứa sẵn 90ml môi trường TSB đã được hấp

TSA, nếu có vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi Tiến hành cấy ria từ môi trường TSB sang môi trường thạch đĩa TSA rồi tiếp tục ủ ở 37oC trong 24 giờ, nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng

Bacillus Lấy các khuẩn lạc nghi ngờ đem nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển

vi Tiếp tục phân lập đến khi thu được các khuẩn lạc thuần, cấy sang ống thạch nghiêng để giữ giống

Tương tự như trên ta cũng tiến hành phân lập chủng trên một số loại thuốc khác

Phân lập trong môi trường không khí: Đặt đĩa petri có chứa sẵn môi trường

lạc nghi ngờ đem nhuộm Gram, tiếp tục cấy ria sang môi trường TSA rồi thực hiện các phản ứng sinh hóa khác

Phân lập trong đất trồng: 10g đất vườn + 90ml nước cất, lắc đều, tạo huyền

phút để diệt các vi sinh vật khác, chỉ giữ lại bào tử Bacillus Đậy miệng bình để giữ

C trong khoảng 48 giờ

Lấy lớp màng nhầy trên bề mặt đem pha loãng và nuôi cấy ở nhiệt độ 30 –

2.3.2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóa

Sau khi phân lập được các chủng thuần, tiến hành định danh bằng phương pháp sinh hóa

a Quan sát đặc điểm đại thể và vi thể

Nguyên tắc

Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng phân lập được Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi các chủng vi khuẩn phân lập được để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram Đồng thời gửi mẫu đến Viện hóa học để chụp hình tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)

b Khảo sát nhu cầu oxy

sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy Nếu khuẩn lạc chỉ mọc trên bề mặt thạch thì đó là vi khuẩn hiếu khí, khuẩn lạc mọc dọc theo đường cấy từ trên xuống thì đó là chủng vi hiếu khí và nếu khuẩn lạc chỉ mọc ở đáy môi trường thì đó là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc