Nghiên cứu cố định urease và ứng dụng trong xét nghiệm phân tích urea máu

Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện cố định enzyme urease trên một số chất mang tự nhiên như alginate, chitosan, celite.. Sản phẩm enzyme urease cố định trên chitosan được

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

(Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học h m, học vị v chữ ký) Luận văn th c sĩ ư c b o vệ t i Trường Đ i Học ách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ng y 22 tháng 7 năm 2013 Th nh ph n Hội ồng ánh giá Luận văn th c sĩ gồm: (ghi rõ họ, tên, học h m, học vị của Hội ồng chấm b o vệ luận văn th c sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội ồng ánh giá LV v Trưởng khoa qu n lý chuyên ng nh sau khi luận văn ã ư c sửa chữa (nếu c ) CHỦ TỊCH H I ĐỒNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM C NG HÒA XÃ H I CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - H nh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: LÊ THỊ MỸ NGỌC MSHV: 10310944

Ng y, tháng, năm sinh: 31.10.1982 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60 42 80

I TÊN ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH UREASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG XÉT

NGHIỆM PHÂN TÍCH UREA MÁU”

NHIỆM VỤ VÀ N I DUNG:

- Tách chiết enzyme urease từ ậu nành

- Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease trên các chất mang có nguồn gốc

tự nhiên: alginate, chitosan, celite

- Lựa chọn chất mang với iều kiện cố ịnh tối ưu v kh năng tái sử dụng

nhiều nhất

- Ứng dụng trong xét nghiệm xác ịnh nồng ộ urea trong huyết thanh bệnh

nhân

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/11/2012

Tô x n tỏ lòn b ết ơn sâu sắ đến T ến sĩ Huỳn N ọ O n ùn toàn

t ể quý T ầy Cô, b n bè làm v ệ và ọ tập t Bộ môn Côn n ệ S n ọ - Trườn Đ ọ B k o T àn p ố Hồ C í M n đã t o đ ều k ện o tô oàn t àn luận văn này Đồn t ờ x n ử lờ ảm ơn quý đồn n ệp nơ tô

ôn t và đìn đã ỗ trợ về mặt t n t ần và t ờ n để tô ó đ ều k ện

ọ tập t trườn

TÓM TẮT

Urease là một enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y học Enzyme urease được dùng trong các kit thử định lượng urea máu và nước tiểu để chẩn đoán và theo dõi chức năng thận Tuy nhiên enzyme này thường được nhập khẩu với giá thành khá cao Trong khi đó, ở Việt Nam đa số các nghiên cứu chỉtập trung tách chiết enzyme urease từ đậu nành nhưng để tăng khả năng tái sử dụng sản phẩm này thì còn hạn chế Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện cố định enzyme urease trên một số chất mang tự nhiên như alginate, chitosan, celite

Các khảo sát đạt kết quả tối ưu với tỉ lệ enzyme/chất mang đối với alginate 3% là 0,86 mg/ 5ml gel, chitosan là 2,46 mg/1g hạt, celite là 136,15 mg/1g hạt với

tỉ lệ celite so với alginate là 6% (w/v) Hoạt tính enzyme urease cố định trên celite bọc alginate so với dạng tự do là 79,97% cao nhất, cao hơn chitosan (65%) và alginate (55,23%) Tuy nhiên số lần tái sử dụng của enzyme cố định trên hạt chitosan là 14 lần với hoạt tính enzyme duy trì trên 50% so với ban đầu, cao hơn alginate (9 lần) và celite bọc alginate (5 lần) Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme urease dạng cố định trên hạt chitosan là 70 0 C và 7,5, dạng tự do là 60 0 C và 7,0 Các thông số động học V max , K m của enzyme cố định và tự do cũng được xác định, lần lượt là 0,663 (µmol/mg.phút), 225 mmol (enzyme cố định trên hạt chitosan) và 1,202 (µmol/mg.phút), 92,5 mmol

Sản phẩm enzyme urease cố định trên chitosan được ứng dụng phân tích urea trong huyết thanh bệnh nhân với kết quả tương đương với kết quả đo được

từ máy sinh hóa tự động

ABSTRACT

Urease is an enzyme which applied in lots of fields, especially in medicine Urease is used in many reagent kits to determine blood and urine urea concentration for diagnostic and monitoring kidneys function However, this enzyme is usually inported with high cost In Vietnam, most of researches only focus on extracting urease from soya bean, but researches to increase reusable capicity of this product still limited Consequently, we carried out a research about some immobilzing urease conditions onto some natural supports such as : alginate, chitosan, celite

The investigations obtained optimum results with enzyme/support rate that were 0,86 mg / 5ml gel alginate 3%; 2,46 mg / 1g of activated-chitosan beads; 136,15 mg /1g of activated-celite beads; and rate of celite with alginate were 6% (w/v) The total activity of alginate coated celite-immobilized ureases comparing with solube ureases was the highest value (79,97%), higher than chitosan (65%) and alginate (55,2%) However, the chitosan-immobilized ureases could reuse for

14 times with their acivity maintained above 50%, higher than alginate (9 times), alginate coated-celite (5 lần) The optimum temperature and pH of chitosan- immobilized ureases were 70 0 C and 7,5; solube ureases were 60 0 C and 7,0 The kinetic parameters (V max , k m ) of non immobilized and immobilized enzyme were determined, respectively, 0,663 (µmol/mg.min) and 225 mmol (chitosan- immobilized ureases); 1,202 (µmol/mg.min) and 92,5 mmol (solube ureases)

Chitosan-immobilized ureases were applied to analyzeserum urea concentration of patients with the similar results measuring from the automaticaly biochemistry machine

LỜI CAM ĐOAN

Tô x n m đo n đây là ôn trìn n ên ứu ủ r ên tô , ƣ đƣợ

ôn bố ở bất ứ nơ nào C số l ệu t í n ệm là trun t ự và mỗ t í

n ệm đƣợ t ự ện ít n ất 3 lần

Tác gi luận văn

Lê T ị Mỹ N ọ

DANH MỤC BẢNG

Bản 3.1: Ảnh hưởng của thời gian tách béo ến hiệu suất thunhận enzyme 48

Bản 3.2: Kết qu kh o sát chế phẩm enzyme urease thu nhận từ ậu n nh tách béo 49 Bản 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/alginate ến hiệu suất cố ịnh protein 50

Bản 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/alginate ến hiệu suất cố ịnh enzyme 50

Bản 3.5: Ảnh hưởng của nồng ộ alginate ến hiệu suất cố ịnh enzyme 51

Bản 3.6: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh protein 52

Bản 3.7: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh enzyme 52

Bản 3.8: Ảnh hưởng của nồng ộ alginate ến ho t tính enzyme cố ịnh 54

Bản 3.9: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/celite ến hiệu suất cố ịnh protein 55

Bản 3.10: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme/celite ến ho t tính enzyme cố ịnh 55

Bản 3.11: Ảnh hưởng của tỉ lệ celite ến kh năng cố ịnh enzyme 57

Bản 3.12: Ảnh hưởng của lo i chất mang ến hiệu suất cố ịnh enzyme 58

Bản 3.13: Ho t tính enzyme urease cố ịnh trên alginate ở các l n sử dụng 59

Bản 3.14: Ho t tính enzyme urease cố ịnh trên chitosan ở các l n sử dụng 61

Bản 3.15: Ho t tính enzyme urease cố ịnh trên celite bọc alginate ở các l n sử dụng 62

Bản 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt ộ ến ho t tính enzyme urease tự do 65

Bản 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt ộ ến ho t tính enzyme urease cố ịnh 65

Bản 3.18: Ảnh hưởng của pH ến ho t tính enzyme urease tự do 66

Bản 3.19: Ảnh hưởng của pH ến ho t tính enzyme urease cố ịnh 67

Bản 3.20: Các th ng số ộng học của enzyme tự do v cố ịnh 70

Bản 3.21:Tương quan giữa giá trị ∆OD v nồng ộ urea chuẩn 71

Bản 3.22: So sánh kết qu urea máu khi dùng urease cố ịnh với kết qu từ máy sinhh a tự ộng Hitachi 917 73

DANH MỤC HÌNH

H nh 1.1: Giáo sư James atcheller Sumner* 4

Hình 1.2: Cấu trúc d ng tinh thể của enzymeurease 5

Hình 1.3:Cấu t o của enzymeurease từ các nguồn gốc khác nhau 6

Hình 1.4:Cấu t o trung tâm ho t ộng của enzymeurease 7

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác của enzyme urease 8

H nh 1.6: Alginate v h nh nh t o gel trong CaCl2 18

Hình 1.7: Cấu t o d ng ồng trùng h p của alginate 18

Hình 1.8: Cấu t o của chitosan v chitin 19

Hình 2.1: Sơ ồ nghiên cứu 37

Hình 2.2: Quy tr nh thu nhận enzyme urease từ h t ậu n nh 38

H nh 3.1: Đường chuẩn Nessler 46

H nh 3.2: Đường chuẩn Bradford 47

Hình 3.3: Ảnh hưởng của thời gian tách béo ến hiệu suất thu nhận enzyme 48

Hình 3.4:Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh protein 53

Hình 3.5:Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/chitosan ến hiệu suất cố ịnh enzyme 53

Hình 3.6: Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme-celite ến hiệu suất cố ịnh protein 56

Hình 3.7: Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme-celite ến hiệu suất cố ịnh enzyme 56

H nh 3.8: So sánh ho t tính của enzyme cố ịnh trên các chất mang khác nhau 58

Hình 3.9: Kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh trên alginate 60

Hình 3.10: Kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh trên chitosan 62

Hình 3.11: Kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh trên celite bọc alginate 63

H nh 3.12: Kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh trên các lo i chất mang 64

Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt ộ ến ho t tính enzyme tự do và cố ịnh 65

Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH ến ho t tính của enzyme tự do v cố ịnh 68

Hình 3.15: iểu ồ Lineweaver- urk biểu diễn mối quan hệ giữa [1/V] v [1/S] của enzyme tự do v cố ịnh 69

Hình 3.16: Đường chuẩn urea 72

DANH MỤC VIẾT TẮT

- Ap : ho t tính riêng của chế phẩm enzyme

- P Đ, PCĐ : lư ng protein ban u, cố ịnh

- Pcòn l i : lư ng protein kh ng ư c cố ịnh

- cel-E : enzyme cố ịnh trên celite

- cel-E-algi : enzyme cố ịnh trên celite bọc alginate

- chi-E : enzyme cố ịnh trên chitosan

- chi-E-algi : enzyme cố ịnh trên chitosan bọc alginate

- ECĐ : enzyme cố ịnh

- H : hiệu suất so với giá trị cực i

- HCĐ : hiệu suất cố ịnh protein

- He : hiệu suất cố ịnh enzyme

- ΣA Đ : tổng ho t tính của enzyme ban u trước cố ịnh

- ΣACĐ : tổng ho t tính của enzyme cố ịnh

- ΣATD : tổng ho t tính của chế phẩm enzyme tự do

- ΣATL : tổng ho t tính của dịch trích ly

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn ề 1

2 Mục ích nghiên cứu 1

3 Đối tư ng nghiên cứu 2

4 Ph m vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học v thực tiễn của ề t i nghiên cứu 2

CHƯƠNG1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE 3

1.1.1 Lịch sử phát triển 3

1.1.2 Đặc iểm của enzyme urease 4

1.1.3 Cấu trúc ặc trưng của enzyme urease 5

1.1.4 Cơ chế xúc tác của enzyme urease 8

1.1.5 Cơ chất của enzymeurease 9

1.1.6 Các yếu tố nh hưởng ho t tính enzyme urease 9

1.1.7 Vai trò của enzyme urease 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ THU NHẬN, TINH SẠCH ENZYME UREASE 13

1.2.1 Nguồn thu nhận enzyme urease 13

1.2.2 Các phương pháp tách chiết, tinh s ch enzyme urease 14

1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH 15

1.3.1 Enzyme cố ịnh 15

1.3.2 Enzyme urease cố ịnh 23

1.4 TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM UREA MÁU 27

1.4.1 Sự thành lập urea trong cơ thể 27

1.4.2 Ý nghĩa xét nghiệm urea máu 27

1.4.3 Các phương pháp xét nghiệm urea máu 27

1.4.4 Ứng dụng enzymeurease cố ịnh trong xét nghiệm urea máu 28

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 30

2.1.1 Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 30

2.1.2 Vật liệu cố ịnh 30

2.1.3 Hóa chất 31

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Các phương pháp phân tích 31

2.2.2 Các công thức tính toán 35

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37

2.3.1 Quy trình thu nhận urease thô từ h t ậu nành 38

2.3.2 Kh o sát nh hưởng của thời gian tách béo ến ho t tính enzyme urease 39

2.3.3 Kh o sát một số vật liệu cố ịnh enzyme urease 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46

3.1 KẾT QUẢ THIẾT LẬP ĐƯỜNG CHUẨN 46

3.1.1 Thiết lập ường chuẩn Nessler 46

3.1.2 Thiết lập ường chuẩn Bradford 46

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NGUỒN NGUYÊN LIỆU 47

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian tách béo ến kh năng thu nhận enzyme urease 47 3.2.2 H m lư ng protein và ho t tính chế phẩm enzyme urease 49

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ VẬT LIỆU CỐ ĐỊNH ENZYMEUREASE 49

3.3.1 Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease trên alginate 49

3.3.2 Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease trên chitosan 52

3.3.3 Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme urease trên chitosan kết h p alginate 54 3.3.4 Kh o sát iều kiện cố ịnh enzyme ureasetrên celite kết h p alginate 54

3.4 HIỆU QUẢ CỦA CÁC LOẠI CHẤT MANG 58

3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH 59

3.5.1 Kh năng tái sử dụng của enzyme urease cố ịnh trên alginate 59

3.5.2 Kh năng tái sử dụng của urease cố ịnh trên chitosan 60

3.5.3 Kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh trên celite-alginate 62

3.5.4 Lựa chọn chất mang sử dụng cho nghiên cứu 63

3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH TRÊN CHITOSAN 64

3.6.1 Kh o sát nh hưởng của nhiệt ộ ếnho t tính enzyme urease cố ịnh 64

3.6.2 Kh o sát nh hưởng của pH ến ho t tính enzyme urease cố ịnh 66

3.6.3 Kh o sát tính chất ộng học của enzyme urease cố ịnh 68

3.7 ỨNG DỤNG ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH TRONG XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ UREA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN 71

3.7.1 Kết qu xây dựng ồ thị chuẩn dùng xác ịnh nồng ộ urea trong huyết thanh 71

3.7.2 Kết qu phân tích urea trong máu 72

3.7.3 Phân tích kết qu 74

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

4.1 KẾT LUẬN 76

4.2 KIẾN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 102

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay ngành công nghệ enzyme ngày càng phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như c ng nghiệp, nông nghiệp, m i trường v ặc biệt là trong y học Urease (EC 3.5.1.5) là một trong những enzyme ư c ứng dụng nhiều trong các phân tích y học Đây l enzyme thủy phân cơ chất urea, s n phẩm của quá trình khử

ộc từ NH3 trong cơ thể v ư c o th i ra nước tiểu Trong lĩnh vực xét nghiệm, giá trị nồng ộ urea máu v nước tiểu có vai trò rất lớn trong chẩn oán v theo dõi các bệnh lý về thanh lọc ở thận Enzyme urease thường ư c dùng trong các bộ kit thử ịnh lư ng urea máu v nước tiểu hay dưới d ng enzyme không tan trong máy

ch y thận nhân t o ể lọc máu

Ở Việt Nam, nguồn thu nhận enzyme urease rất dồi dào, có thể từ ộng vật, thực vật, vi sinh vật ều có kh năng s n xuất enzyme với kh năng ứng dụng rất lớn Tuy nhiên h u hết các s n phẩm enzyme tinh chế, các bộ kit hóa chất ịnh lư ng urea

ư c sử dụng ở Việt Nam ều ph i nhập khẩu với giá thành khá cao Trên thế giới hiện có nhiều nghiên cứu về tách chiết, cố ịnh enzyme urease trên các vật liệu v cơ, hữu cơ, c i tiến ư c ộ bền của vật liệu v ã cho kết qu rất tốt khi ứng dụng trong

y học Trong khi , các nghiên cứu trong nước vềenzyme urease chỉ tập trung vào tách chiết và tinh s ch từ nguồn ậu nành hay cố ịnh enzyme urease ứng dụng trong ngành thực phẩm, còn ứng dụng trong y học thì rất ít Với nguồn nguyên liệu là h t

ậu nành ở Việt Nam cho năng suất ổn ịnh, giá c h p lý, việc nghiên cứu thu nhận, tinh s ch, tăng kh năng tái sử dụng của enzyme urease và ứng dụng trong xét nghiệm phân tích urea trong máu là c n thiết

2 Mụ đí n ên ứu

Ở nước ta, enzyme urease từ ậu n nh ã ư c nhiều tác gi nghiên cứu các phương pháp thu nhận, tinh s ch nhưng chưa c nghiên cứu nào cho việc cố ịnh s n phẩm enzyme này Do quá trình tách chiết và tinh s ch enzyme thường mất nhiều thời gian và chi phí nên việc nghiên cứu, kh o sát một số chất mang dùng cho cố ịnh enzyme ể tăng kh năng tái sử dụng mà vẫn duy tr ư c ho t tính của enzyme sẽ

em l i nhiều l i ích áng kể

Ngoài ra trong lĩnh vực y học, enzyme urease thường ư c dùng trong các bộ kit thử xét nghiệm ịnh lư ng urea máu, nước tiểu dưới d ng hòa tan; hay d ng không tan trên các biosensor của hệ thống máy sinh hóa, miễn dịch tự ộng, máy lọc thận Với tính chất giúp cho ph n ứng x y ra nhanh hơn, enzyme ã giúp cho việc phân tích, xác ịnh nồng ộ các chất trong bệnh phẩm rất nhiều Do ể tăng hiệu qu tái

sử dụng, chúng tôi tiến hành cố ịnh enzyme urease sau khi tách chiết, tinh s ch từ

h t ậu nành Việt Nam trên một số vật liệu nhằm chọn ra vật liệu tối ưu, ồng thời

kh o sát một số iều kiện nh hưởng ến ho t tính urease Từ chúng t i sẽ so sánh giá trị urea o ư c với kết qu urea khi sử dụng bộ kit d ng thương m i ể ịnh

lư ng urea trong huyết thanh bệnh nhân Kết qu của nghiên cứu có thể làm tiền ề cho những nghiên cứu t o bộ kit thử urea máu với giá thành phù h p

3 Đố tượn n ên ứu

- Enzyme urease thu nhận từ ậu n nh, sau ư c cố ịnh với chất mang hữu

cơ, chất mang d ng phức hữu cơ kết h p hữu cơ, hữu cơ kết h p v cơ

- S n phẩm enzyme urease cố ịnh với các iều kiện tốt nhất sẽ ư c dùng ể xúc tác ph n ứng thủy phân urea trong huyết thanh bệnh nhân nhằm xác ịnh nồng ộ urea máu

4 P m v n ên ứu

Nghiên cứu cố ịnh enzyme urease thu nhận từ ậu n nh ư c thực hiện trên các chất mang alginate, chitosan, alginate kết h p chitosan, alginate kết h p với celite Lựa chọn chất mang phù h p, ồng thời kh o sát các yếu tố nh hưởng (pH, nhiệt ộ, nồng ộ cơ chất) ến ho t tính của enzyme cố ịnh ể c thể sử dụng s n phẩm một cách tốt nhất Từ ứng dụng trong xét nghiệm urea máu của bệnh nhân c so sánh với kết qu ịnh lư ng trên máy sinh h a tự ộng

5 Ý n ĩ k o ọ và t ự t ễn ủ đề tà n ên ứu

Với nguồn nguyên liệu c sẵn trong nước, enzyme urease tách chiết từ ậu n nh khi ư c cố ịnh sẽ bền vững hơn trong m i trường ph n ứng v c kh năng tái sử dụng nhiều l n Do sẽ mang l i l i ích áng kể như tiết kiệm thời gian v chi phí của xét nghiệm urea trong máu Ngo i ra nghiên cứu cũng c thể l m tiền ề cho những nghiên cứu t o bộ kit thử urea máu với giá th nh phù h p

CHƯƠNG1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE

Urease (EC 3.5.1.5) thuộc nh m enzyme thủy phân, trong số 3 chỉ nh m chính

l hydrolase, số 5 chỉ nh m phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N (kh ng ph i liên kết peptid), số 1 chỉ phân nh m phụ cắt các amid thẳng, số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nh m phụ Enzyme urease c thể t m thấy trong nhiều lo i thực vật, vi

khuẩn (Lactobacillusruminis, Lactobacillusfermentum, Helicobacter pylori,

Campylobacterpylori…) , nấm Rhizopusoryzae và trongnhiều lo im củangườinhư

niêm m c d d y, gan, thận,hồng c u Trọng lư ng phân tử của enzyme urease có nguồn gốc khác nhau th khác nhau tùy thuộc v o th nh ph n cấu t o Enzyme urease

chiếm tỉ lệ cao trong các lo i cây họ ậu : trong ậu n nh (Glycine max) chiếm

kho ng 0,012% trọng lư ng kh v trong ậu rựa (jack bean) l 0,07 – 0,14 % [1,2,3]

1.1.1 Lịch sử phát triển

- Năm 1773, Hillaire M Rouelle ã phát hiện urea hiện diện trong nước tiểu

người [4]

- Năm 1798, nghiên cứu dẫn xuất amoniac trong nước tiểu do quá trình lên men

urea của Fourcroy and Vauquelin ã ư c công nhận [4]

- Năm 1864, Tieghem ã phân lập ư c chủng vi khuẩn Micrococcus ureae có

kh năng phân gi i urea trong nước tiểu [4]

- Năm 1874, Musculus ã thu nhận ư c một lo i enzyme phân gi i urea trong

nước tiểu ã phân hủy, ến năm 1890 theo ề xuất của Miquel thì enzyme này

ư c ặt tên là urease [4]

- Năm 1909, Takeuchi phát hiện ra enzyme urease hiện diện trong h t ậu nành

(Glycin max) [5]

- Năm 1913, nhiều nghiên cứu cho rằng enzyme urease có thể ư c ứng dụng

xác ịnh sự hiện diện của urea Sau khi phát hiện enzyme urease có mặt trong

h t ậu nành, các thử nghiệm cũng ã cho thấy enzyme này cũng tồn t i trong

h t th u d u tuy nhiên kh năng thủy phân lư ng urea ít hơn trong ậu nành [6]

- Năm 1926, giáo sư James .Sumner, nh khoa học người Đức, l người u

tiên ã chứng minh enzyme này là một lo i protein Ông ã th nh c ng trong việc tách chiết và kết tinh enzyme urease thành d ng tinh thể trong suốt từ

Canavalia ensiformis ( ậu rựa) [6]

- Năm 1946 phát minh của James B.Sumner mới ư c công nhận v ng ã

ư c trao gi i Nobel Hóa học Đây chính l bước ngoặc cho các nghiên cứu về enzyme urease sau này

Hìn 1.1: G o sư J mes B t heller Sumner*

* : người đầu tiên đã thành công trong tách chiết và kết tinh urease từ đậu rựa

Ng y nay ã c rất nhiều tác gi ã nghiên cứu kh o sát, c i tiến ể tăng hiệu qu thu nhận, tăng kh năng tái sử dụng enzyme urease ể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, m i trường…

1.1.2 Đặ đ ểm của enzyme urease

- Tên hệ thống: urea aminohydrolase

1.1.3 Cấu trú đặ trưn của enzyme urease

Enzyme urease c nguồn gốc từ thực vật v nấm ư c cấu t o từ các tiểu ơn vị giống nhau, c trọng lư ng phân tử kho ng 90 kDa, phổ biến nhất l d ng trimer gồm

3 chuỗi α v hexamer gồm 6 chuỗi α Trong khi enzyme urease c nguồn gốc từ vi khuẩn th ư c cấu t o từ 3 tiểu ơn vị riêng biệt: 1 chuỗi α (60 – 76 kDa), 1 chuỗi β (8 – 21 kDa), 1 chuỗi γ (6 – 14 kDa), thường sẽ t o th nh d ng trimer α3 β3 γ3 Một số

vi sinh vật khác enzyme urease c thể gồm α4 β4 γ4, α5 β5 γ5…(hình 1.3)

Trước ây khi chưa c kỹ thuật sử dụng tia X trong phân tích cấu trúc tinh thể nên chưa thể gi i thích ư c d ng tinh thể của enzyme urease Đến năm 1995, Karplus ã thành công khi dùng kỹ thuật n y v ã khẳng ịnh rằng ây l một protein có cấu trúc d ng tinh thể Cấu trúc d ng tinh thể của enzyme urease (hình 1.2) gồm có 8

c nh, không màu, trong suốt, c ường kính 4 – 30 µm

Hình 1.2: Cấu trúc d ng tinh thể của enzym eurease

Hình 1.3:Cấu t o của enzyme urease từ các nguồn gốc khác nhau [4]

Enzyme urease có 2 vùng ho t tính v ặc hiệu với cơ chất là urea hoặc các chất

có cấu trúc tương tự urea Năm 1975, Dixon ã chứng minh ư c urease là một enzyme u tiên có chứa ion Nikel [7] Urease là một trong rất ít enzyme òi hỏi ph i

có Nikel cho ho t ộng xúc tác Ở vùng ho t tính của enzyme urease, 2 ion Ni2+ nối nhau bởi c u nối carbamate của Lysin thông qua 2 nguyên tử Oxy Nikel thứ nhất sẽ liên kết với 2 nhóm imidazol của Histidin thông qua nguyên tử Nitơ, trong khi Nikel thứ 2 sẽ liên kết với 2 nhóm imidazol của Histidin thông qua nguyên tử Nitơ v nhóm carboxyl của acid aspartic thông qua nguyên tử Oxy Ngoài ra, hai ion Nikel còn liên kết nhau thông qua nhóm hydroxyl mà dọc theo nó sẽ là 2 phân tử H2O (W1, W2) và có 1 phân tử H2O (W3) ở phía mở của trung tâm ho t ộng ể t o thành một cụm gồm có 4 mặt t o liên kết H với H2O lấp y kho ng không của trung tâm ho t ộng Đây chính l nơi m phân tử urea sẽ bị thay ổi khi t o liên kết với trung tâm

ho t ộng trong quá trình xúc tác [8]

Hình 1.4:Cấu t o trung tâm ho t ộng của enzyme urease

Các nh m chức năng của amino acid c liên quan trực tiếp ến cấu trúc của trung tâm ho t ộng v chức năng xúc tác của enzyme urease Trong ho t ộng xúc tác các

nh m chức năng n y t o th nh “mobile flap” (nắp ng mở) ở vị trí trung tâm ho t ộng Th ng qua liên kết hydro, các nh m n y sẽ t o liên kết với cơ chất, t o phức enzyme-cơ chất ổn ịnh v gia tăng tốc ộ ph n ứng Trong số các nh m chức năng của amino acid còn c nh m sulfuhydryl (-SH) của cystein Nh m n y cũng ng vai trò quan trọng trong ho t ộng xúc tác của enzyme urease Một số nghiên cứu cũng

ã cho thấy ho t tính của enzyme urease bị gi m nhiều nếu như nh m –SH bị v ho t

[9]

1.1.4 Cơ ế xúc tác của enzyme urease

Enzyme urease xúc tác ph n ứng thủy phân urea th nh CO2 và NH3 Khi 2 liên kết C-N bị phá vỡ th hiển nhiên sẽ t o 2 th nh ph n ph n ứng

Hình 1.5: Cơ chế xúc tác của enzyme urease

(Nguồn: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja3043239?mi=0&af=R&pr)

Hiện nay cơ chế ho t ộng xúc tác của enzyme urease vẫn còn nhiều tranh cãi

Nh m nghiên cứu của Zerner ã cho rằng cơ chế ph n ứng xúc tác thủy phân urea

x y ra t i trung tâm ho t ộng của enzyme urease Urea liên kết ion Nikel thứ nhất c

ái lực cao với nguyên tử oxy của nh m carbonyl, do carbon của nh m carbonyl

n y trở nên ƣa iện tử hơn, v vậy n dễ bị tác nhân nh m ƣa nhân (nucleophile) tấn

c ng Khi thay thế 2 phân tử H2O (W1, W3), urea sẽ liên kết với Nikel thứ hai th ng qua nguyên tử nitơ của một trong các nh m amino acid t o th nh d ng răng cƣa Kiểu liên kết n y t o iều kiện thuận l i cho H2O tấn c ng lên carbon của nh m carbonyl Kết qu l sự hình th nh một khối tứ diện trung gian, gi i ph ng NH3 và carbamate [10] Trong khi enini và cs l i cho rằng [11] sự tấn c ng của nh m nucleophile

n y ƣ c thực hiện l do c u nối hydroxide, ho t ộng n y x y ra cùng lúc khi c chất xúc tác acid cung cấp H+ ể lo i bỏ phân tử NH3 Tuy nhiên các giai o n chính xác trong quá tr nh xúc tác vẫn chƣa rõ r ng Karplus v cs th lập luận rằng ó là do

urease

His320 ở vùng “mobile flap” ngay trung tâm ho t ộng c nhiệm vụ như chất xúc tác acid, phù h p với cơ chế của quá tr nh cho nhận proton Hơn nữa, Karplus v cs

kh ng bác bỏ kiểu liên kết c h nh d ng răng cưa của urea với Nikel 1, 2 gi i ph ng một phân tử H2O như tác nhân nucleophile về phía nguyên tử carbon ở nh m carbonyl của urea

1.1.5 Cơ ất của enzymeurease

Theo quan niệm trước ây, urease l một enzyme c tính chất ặc hiệu tuyệt ối

ối với cơ chất urea Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay cho thấy rằng enzyme urease còn c thể tham gia ph n ứng biến ổi nhiều cơ chất khác như hydroxyurea [12,13], dihydroxyurea [14], semicarbazide [15], formamide [16,17], acetamide [16,18], thioacetamide [19], thiourea [12,20,21], methylurea [12,16,22], ethyl urea [22], methyl carbamate và ethyl carbamate [22] … nhưng với tỉ lệ thấp hơn urea Tuy nhiên ph n ứng xúc tác các cơ chất gồm hai th nh ph n như hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea, methylurea, ethylurea, các amide v ester của acid phosphoric th phức t p hơn so với cơ chất urea v chúng vừa ng vai trò vừa l cơ chất vừa l chất ức chế c nh tranh

1.1.6 Các yếu tố ản ưởng ho t tính enzyme urease

1.1.6.1 Ản ưởng củ ơ ất

Ho t tính của enzyme urease phụ thuộc v o sự c mặt của cơ chất Enzyme kết

h p sớm với cơ chất, ngay lập tức xúc tác ph n ứng thủy phân urea th nh NH4+ và carbamate Tốc ộ ph n ứng phụ thuộc rất nhiều v o nồng ộ cơ chất Khi tăng nồng

ộ cơ chất th tốc ộ ph n ứng tăng nhưng chỉ trong một giai o n nhất ịnh Sau

dù c tăng thêm th tốc ộ ph n ứng cũng kh ng tăng lên ư c nữa

1.1.6.2 Ảnh ưởng của pH

n chất của enzyme l protein nên rất dễ bị nh hưởng bởi sự thay ổi của pH

m i trường pH của m i trường thường nh hưởng ến mức ộ ion h a cơ chất, enzyme v ặc biệt nh hưởng ến ộ bền enzyme Theo một số t i liệu th pH tối thích cho ho t ộng của enzyme urease thường từ 6,4 – 7,6

1.1.6.3 Ản ưởng của nhiệt độ

Enzyme urease c ho t ộng tốt ở nhiệt ộ 40 – 500C Hofstee [18] ã chứng minh khi kết tinh enzyme urease hay dịch chiết chứa enzyme urease ậu rựa bằng cách ể ở nhiệt ộ l nh hoặc ng á th ho t tính sẽ rất thấp, còn nếu trữ ở nhiệt ộ thấp nhưng sau ủ ở 60oC trong 5 phút th ho t tính sẽ tăng

Na2 t ến một ngưỡng n o n sẽ hấp thụ lu n c ion Nikel ở trung tâm ho t ộng, vốn rất quan trọng trong ho t ộng xúc tác của enzyme urease Do EDTA-

Na2 nếu sử dụng ở nồng ộ cao hơn c thể trở th nh chất ức chế [23]

b Ản ưởng của chất ức chế

Nghiên cứu ho t ộng chất ức chế sẽ giúp chúng ta c thể kiểm soát ư c ho t ộng xúc tác của enzyme urease

- Chất ức chế cạnh tranh: gồm các chất có cấu trúc tương ồng với urea như

hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea, methylurea, ethylurea Do chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm ho t ộng của enzyme, dẫn ến urea

kh ng c cơ hội tiếp xúc với trung tâm này làm cho ho t ộng của enzyme sẽ

gi m Tuy nhiên nếu nồng ộ cơ chất ủ lớn sẽ lo i ư c hiện tư ng c nh tranh này Ngoài ra còn có các chất c nh tranh khác như: β-mercaptoethanol, các amide

và ester của acid phosphoric, acid boric… [24]

- Chất ức chế không cạnh tranh: các ion kim lo i nặng Hg2+, Cu2+, Pb2+ cùng hóa trị Ni2+ Các ion này có thứ tự ức chế gi m d n như sau:

1.1.7 Vai trò của enzyme urease

1.1.7.1 Đối với ngành nông nghiệp

Nitơ l một trong những nguồn dinh dưỡng chính ể thúc ẩy quá tr nh tăng trưởng ở thực vật Quá trình quang h p sinh ra glucose, sau glucose ph n ứng với nitơ ể t o amino acid và protein Thiếu nitơ ở thực vật sẽ nh hưởng tr m trọng ến

sự phát triển của các cơ quan như rễ, thân v ặc biệt là ở lá Trong urea l một trong những nguồn cung cấp nitơ quan trọng nhất

Enzyme urease có mặt ở nhiều loài vi khuẩn, nấm và thực vật giúp cơ thể chúng tăng tốc ộ sử dụng nitơ Tuy nhiên enzyme urease ở các vi khuẩn trong ất sẽ làm cho urea trong phân bón bị thủy phân dẫn ến mất lư ng nitơ cung cấp cho cây trồng

Do , các nh khoa học ã thêm những chất ức chế enzyme urease trong phân bón

ể l m tăng hiệu qu sử dụng nitơ cho cây trồng

Hiện nay, vai trò của enzyme urease trong ậu nành vẫn chưa ư c biết một cách

y ủ Lá của cây ậu n nh cũng c chứa enzyme urease, nhưng ít hơn ở h t rất nhiều Enzyme ở lá giúp cho quá trình tái sử dụng nguồn nitơ từ sự thoái hóa protein Trong khi enzyme urease ở h t cũng c chức năng tương tự khi h t n y m m Kết

qu là amoniac t o thành có thể b o vệ tế bào thực vật khỏi bị côn trùng gây bệnh tấn công

1.1.7.2 Đối với ngành công nghiệp thực phẩm

Enzyme urease kh ng c h i ối với con người Tuy nhiên ở h t ậu n nh chưa nấu chín th c chứa các h p chất kh ng tốt cho sức khỏe, chẳng h n như chất ức chế protein ngăn c n ho t ộng của trypsin l m cho kh tiêu h a Sự c mặt của chất ức chế thường th kh ng dễ phát hiện nhưng nếu h t ậu n nh ư c nấu chín th enzyme urease sẽ bị mất ho t tính

Enzyme urease thường ư c sử dụng ể xác ịnh h m lư ng urea vốn kh ng ư c phép có mặt trong thực phẩm, nhất là các mặt h ng như nước mắm và sữa Ph n ứng

ư c thực hiện nhờ vào sự thay ổi pH khi t o thành NH3 từ quá trình thủy phân urea

v ư c phát hiện nhờ vào chỉ thị màu Dùng enzyme urease có thể dưới d ng tự do hay cố ịnh cho phép xác ịnh các mẫu bị nhiễm urea một cách nhanh chóng và

chính xác Tác gi Tr n Bích Lam và cs [25] ã th nh c ng trong việc chế t o dụng

cụ c m biến urea (urea biosensor) ư c chế t o trên cơ sở máy o pH ư c gắn cố ịnh enzyme urease nhằm phân tích nhanh urea trong thực phẩm Dụng cụ này không giới h n thời gian và số l n sử dụng Do sẽ tiết kiệm ư c áng kể nguồn chi phí

do trước ây a số các dụng cụ ều ph i nhập từ nước ngoài với giá thành rất cao

1.1.7.3 Đối với phân tích y học

Enzyme urease ư c dùng trong việc chẩn oán các bệnh lý d dày, ruột gây ra

bởi vi khuẩn Helicobacter pylori Vi khuẩn H.pylori có thể tiết enzyme urease và xúc

tác ph n ứng thủy phân urea th nh amonium v bicarbonate Người ta xác ịnh sự

hiện diện của vi khuẩn H.pylori trong d dày bằng cách lấy mẫu sinh thiết niêm m c

d d y v ặt v o m i trường chứa urea và một lo i chỉ thị màu Nếu có H.pylori

trong mẫu niêm m c, vi khuẩn sẽ s n xuất enzyme urease thủy phân urea, thay ổi pH

dựa v o ường chuẩn suy ra nồng ộ urea có trong mẫu thử

Ngoài ra, trên các hệ thống máy sinh hóa tự ộng, người ta ã cố ịnh một số enzyme lên m ng bao các iện cực ể có thể kéo dài thời gian sử dụng v tăng ộ bền enzyme trong các ph n ứng ư c thực hiện liên tục cho nhiều mẫu thử khác nhau

1.2 TỔNG QUAN VỀ THU NHẬN, TINH SẠCH ENZYME UREASE

1.2.1 Nguồn thu nhận enzyme urease

Các nghiên cứu trước ây ã cho thấy có nhiều cơ thể sinh vật có kh năng tổng

h p enzyme urease như thực vật, một số loài vi khuẩn, nấm và t o… Enzyme urease

có nguồn gốc thực vật có thể thu nhận từ h t, lá hay nuôi cấy mô Enzyme urease

thường chiếm tỉ lệ nhiều ở h t các loài thực vật như ậu rựa (Canavalia ensiformis )

[1,2], ậu Hà Lan [26], ậu nành [27], h t cotton [16], h t dưa hấu [28] ã ư c các tác gi nghiên cứu ể ứng dụng trong phân tích Ngoài ra enzyme urease còn ư c tách chiết từ mô lá cây dâu tằm [29], m lá cây ậu nành [30] Ở người v ộng vật

có thể thu ư c enzyme urease từ các mẫu mô hay dịch d dày do chủng

Helicobacter pylori [31], từ d cỏ của bò [32], từ chủng vi khuẩn Klebsiella aerogenes [33] hay từ t o Spirulina maxima [34] [64]…

Nhìn chung nguồn thu nhận enzyme urease rất a d ng Tuy nhiên h u hết các

s n phẩm enzyme urease thương m i nhập khẩu trên thị trường nước ta hiện nay là

ư c chiết tách từ ậu rựa (jack bean, Canavalia ensiformis) hay ậu nành (Glycin

max) Đậu nành ở nước ta ư c trồng khắp nơi trên c nước Theo số liệu thống kê

chính thức của chính phủ, ậu tương ( ậu n nh) ư c trồng ở 28 tỉnh trên khắp c nước, trong 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam Kho ng 65% ậu tương nước

ta ư c trồng ở vùng cao, những nơi ất không c n màu mỡ; v 35% ư c trồng ở những vùng ất thấp ở khu vực ồng bằng sông Hồng Chúng ư c trồng ở nhiều ịa phương trên khắp c nước vào từng thời iểm khác nhau

Đậu nành là cây thực phẩm có giá trị rất lớn về nhiều mặt Trong h t ậu nành có các thành ph n hóa học sau: protein (quan trọng, chiếm 40%), lipid (12-25%), glucid (10-15%); có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, sáp, nhựa, cellulose Trong ậu n nh c ủ các acid amin cơ b n isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Đậu n nh ư c coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lư ng áng kể các amino acid không thay thế c n thiết cho cơ thể

Ngo i ra trong ậu nành còn chứa nhiều enzyme, ặc trưng nhất là enzyme urease H m lư ng enzyme urease có ở tất c các mô của cây ậu nành [30] Do

ây l nguồn nguyên liệu có thể ư c dùng ể tách chiết enzyme urease với số lư ng lớn ể có thể sử dụng trong nhiều lĩnh vực như n ng nghiệp, công nghiệp thực phẩm

v ặc biệt là trong y học

1.2.2 C p ươn p p t ết, tinh s ch enzyme urease

Đối với enzyme urease có nguồn gốc từ thực vật, phương pháp thường ư c sử dụng ể tách enzyme từ nguồn nguyên liệu l phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học (nghiền, xay), trích ly, lọc hoặc ly tâm l nh ể thu ư c dịch chiết enzyme thô Enzyme urease có nguồn gốc vi sinh vật và nấm có thể ư c thu nhận dưới d ng ngo i bào hay nội bào Chế phẩm enzyme th thường chứa nhiều t p chất, c n ph i tinh s ch qua nhiều giai o n nên khối lư ng s n phẩm gi m rất nhiều Hiệu suất thu

nhận enzyme urease từ ậu n nh thường chỉ kho ng 20% [35,36] Ngoài ra trong h t

ậu nành enzyme urease chiếm kho ng 0,01% thì lipid chiếm 12 – 25% nên c n ph i

lo i bỏ ể có thể b o qu n ư c enzyme lâu hơn, ồng thời giúp cho quá trình tinh

s ch ư c tốt nhất Người ta thường sử dụng các dung môi như diethyl ether, ether

d u hỏa ể chiết rút lipid ra khỏi ậu nành Sau tiến h nh các giai o n c ặc, tinh s ch ể thu s n phẩm enzyme Các dung m i dùng ể kết tủa enzyme urease thường ư c sử dụng nhất là muối amonium sulfate, acetone ở iều kiện nhiệt ộ

l nh hay polyethylene glycol Tùy theo ặc tính, nguồn gốc enzyme urease mà các phương pháp sẽ ư c thực hiện ể ít nh hưởng ến ho t tính của enzyme cũng như tăng hiệu suất thu nhận

Qua kh o sát một số phương pháp tách chiết enzyme urease từ ậu nành, các tác

gi trong nước ã xác ịnh ư c phân tử lư ng của enzyme urease ậu nành Việt

Nam là 440.000 Da [36], có ho t tính 2588 U/1g chế phẩm, t 74,5% so với enzyme

urease d ng thương m i [35] S n phẩm n y ã ư c các tác gi ứng dụng trong phân tích urea trong thực phẩm (nước mắm, sữa) hay trong huyết thanh với ộ tin cậy rất cao (95%)

Trên thế giới các nghiên cứu về tách chiết enzyme urease c nguồn gốc khác nhau

ã rất th nh c ng Năm 1926, Jame Sumner ã tách chiết v kết tinh ư c enzyme urease từ ậu rựa (jack bean) với acetone 32% (v/v) Đây l một phương pháp tách chiết rất hiệu qu , tuy nhiên s n phẩm enzyme urease thu ư c vẫn còn chứa nhiều

protein khác Cũng với acetone 32% giữ trong buồng l nh, Stanley Kirk [37] ã tách chiết ư c enzyme urease từ ậu n nh Dịch lọc sau ư c tinh s ch bằng cách bổ sung antiurease c ư c khi gây miễn dịch ở thỏ với tinh thể enzyme urease từ ậu rựa Enzyme urease ậu n nh v ậu rựa cho ph n ứng miễn dịch giống nhau khi tiêm

ở thỏ nên ư c sử dụng ể tinh s chenzyme urease ậu n nh Kết qu sau 850 l n tái kết tinh với antiurease ã cho s n phẩm enzyme urease dưới tinh khiết c ho t tính 20 U/mg [37]

Ngo i ra nguồn enzyme urease từ h t dưa hấu, h t bí cũng c thể sử dụng ể xác ịnh lư ng urea trong mẫu máu v ã cho kết qu khá tốt [38] Quy tr nh tinh s ch enzyme urease từ nhiều nguồn khác nhau c thể kết h p nhiều phương pháp ể enzyme thu ư c c hiệu qu xúc tác tốt nhất nhằm ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Chẳng h n nghiên cứu c i tiến phương pháp truyền thống [39] kết h p tái kết tinh

[40] của tác gi Reithel và Robbins [41], Bailey và Boulter [20] ã l m tăng ộ tinh

s ch của urease; sử dụng phương pháp sắc ký ái lực [42], sắc ký cột DEAE-cellulose [26], Sung và cs [43] ã xây dựng ư c quy tr nh tinh s ch enzyme urease chiết tách

từ ậu rựa ể ứng dụng trong phân tích rất hiệu qu bằng cách dùng aceton 20%, xử

lý nhiệt v cho tủa với acid, sau chỉnh pH dung dịch v tiến h nh ng kh , kết

qu cho thấy ộ tinh khiết của enzyme tăng gấp 14,7 l n, phục hồi ư c 63% ho t tính v hiệu qu thu nhận khá cao (1 kg ậu nành thu ư c 6,75 g enzyme) Enzyme thu ư c c ho t tính 411 U/mg protein Trong khi Nilanjana Das v cs [12] khi tách chiết enzyme urease từ ậu Hà Lan ã sử dụng tủa phân o n bằng acetone 2

l n L n thứ nhất ở nồng ộ acetone 25 – 40% (v/v) và l n thứ 2 với acetone 67% (v/v) ều ở -150C Tủa ư c tinh s ch bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-

200, sắc ký trao ổi ion với nhựa DEAE-cellulose v ch y iện di Kết qu thu ư c enzyme urease c ho t tính 6,24x103U / mg protein

1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH

1.3.1 Enzyme cố định

Enzyme không hòa tan hay enzyme cố ịnh thường là những enzyme tự do ư c gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ tr ng thái hòa tan chuyển sang tr ng thái không hòa tan

1.3.1.1 Ưu đ ểm và n ượ đ ểm của enzyme cố định

a Ưu đ ểm

- Enzyme cố ịnh có thể ư c sử dụng l i nhiều l n, quá trình xúc tác có thể x y ra liên tục và có thể ư c kiểm soát nên khi sử dụng enzyme cố ịnh kinh tế hơn so với enzyme tự do

- S n phẩm của quá trình chuyển hóa do enzyme cố ịnh xúc tác có thể ư c tách

ra dễ dàng mà vẫn giữ ư c các ặc tính của enzyme

- Tùy theo phương pháp cố ịnh enzyme m các ặc tính của enzyme có thể thay

ổi như ộ bền, nhiệt ộ và pH tối ưu, ộ ặc hiệu…

- Enzyme cố ịnh có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do cùng lo i v chúng ư c b o

vệ bởi chất mang

- Có thể ngừng ph n ứng nhanh chóng khi c n thiết bằng cách tách enzyme ra khỏi

cơ chất

- Enzyme cố ịnh có kh năng b o qu n tốt hơn enzyme tự do cùng lo i

- Đư c sử dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, tự ộng hóa

b N ượ đ ểm

- Độ hòa tan thấp hơn enzyme tự do

- Ho t tính có thể thấp hơn enzyme tự do và gi m d n theo các l n sử dụng, có thể

do nh hưởng của iện tích chất mang hay do enzyme bị nhốt vào gel nên h n chế

kh năng tiếp xúc giữa enzyme v cơ chất

1.3.1.2 Chất mang trong cố định enzyme

Việc chọn vật liệu cố ịnh phù h p có thể l m tăng hiệu suất cố ịnh enzyme Người ta nhận thấy không có chất mang nào dùng chung cho tất c enzyme và các ứng dụng của chúng Đối với những ứng dụng trong thực phẩm, dư c phẩm, y học, nông nghiệp th tính kh ng gây ộc v tính tương thích về mặt sinh học của các vật liệu là vô cùng c n thiết Hơn nữa, ể áp ứng với sự phát triển về mặt sức khỏe cộng ồng v tăng sự nhận thức trong b o vệ m i trường, các vật liệu cố ịnh ư c chọn nên có kh năng phân hủy sinh học, chứng tỏ ư c tính kinh tế khi sử dụng, chẳng

h n như giá th nh rẻ, phù h p

- Yêu c u ối với chất mang lý tưởng dùng trong cố ịnh enzyme:

o Có tính chất cơ lý bền vững, ổn ịnh, ộ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn

o Có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở d ng h t, màng, phim mỏng ể enzyme gắn chặt vào

o Chất mang ph i kh ng tan trong m i trường ho t ộng của enzyme, kh ng ộc, trơ với vi sinh vật và hóa chất (không bị phân hủy), không làm mất ho t tính của enzyme và ph i có nhiều vị trí ể liên kết với enzyme

o Có tính kháng khuẩn cao, bền với vi sinh vật

o Giá thành rẻ, tùy theo nhu c u v phương pháp cố ịnh mà chất mang sẽ ư c chọn phù h p

- Chất mang dùng trong cố ịnh enzyme gồm các lo i sau:

o Chất mang hữu cơ tự nhiên: có b n chất polysaccharide như agarose, alginate, chitin, chitosan, CMC (carboxymethy cellulose), BC (cellulose vi khuẩn), carrageenan, tinh bột…; hay b n chất protein như gelatin, keratin, albumin…

o Chất mang hữu cơ tổng h p: polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polystyrene, polyester…

o Chất mang v cơ: thủy tinh, silic oxide, nh m oxide, celite…

o Chất mang copolymer: polymer của hai hay nhiều lo i monomer như ethylene, styrene…

Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng chất mang có nguồn gốc tự nhiên là alginate, chitosan và celite

a Alginate

Acid alginic l một acid polyuronic ư c chiết tách từ t o biển, gồm tỉ lệ khác nhau của β-D- mannuronic (M) v α-L-guluronic nối nhau bằng liên kết 1-4 Thông thường alginate chiếm 40% trọng lư ng kh của sinh khối t o Tuy nhiên h m lư ng

v tính chất của alginate phụ thuộc v o từng lo i t o Các lo i t o gi u gốc guluronic thường cứng hơn lo i chứa nhiều D-mannuronic

Alginate l một vật liệu thường dùng trong cố ịnh enzyme v tế b o Phương pháp cố ịnh thường ơn gi n nhất so với các phương pháp khác Alginate dưới d ng

thương m i thường l sodium alginate hay calcium alginate dễ tan trong nước v ã

ư c dùng hơn 65 năm trong ng nh c ng nghiệp thực phẩm v c ng nghiệp dư c Dùng alginate cho cố ịnh enzyme thường nhanh, ít tốn kém, kh ng ộc

Hình 1.6: Alginate v h nh nh t o gel trong CaCl2

Alginate thường ở d ng ồng trùng h p, gồm các khối MM hoặc GG xen kẽ với khối MG Liên kết của các ion dương c h a trị 2 v chất t o gel phụ thuộc v o

th nh ph n v sự sắp xếp của các khối Độ bền của gel c liên quan ến lư ng G, thay ổi 20-75% tùythuộcv o nguồnrong biển Khối GG c vùng liên kết ưu tiên cho các ion dương h a trị 2, chẳng h n như Ca2+, những ion c thể ph n ứng với các khối

GG khác ể t o các liên kết h nh th nh nên h t gel Khi cho dung dịch sodium alginate v o dung dịch c chứa calcium th quá tr nh trùng h p an xen nhau x y ra ngay lập tức với d ng tủa calcium alginate ư c sinh ra bởi sự gel h a từ từ bên trong khi ion Ca2+ ngấm v o alginate Gel tổng h p ư c c tính chất trơ v ộ bền cơ học với kho ng kh ng gian còn trống rất phù h p cho cố ịnh enzyme v tế b o [44]

Hình 1.7: Cấu t o d ng ồng trùng h p của alginate

(Nguồn : http://www.lsbu.ac.uk/water/hyalg.html)

b Chitosan

Chitin v chitosan l các polyaminosaccharide tự nhiên, chitin l một trong những nguồn chất hữu cơ c thể tái chế v dồi d o nhất trên thế giới Đây là thành

ph n chính của vỏ các lo i giáp xác, bộ xương ngo i của c n trùng ể t o ộ bền v

ổn ịnh cấu trúc của chúng Chitin bao gồm các ơn vị 2-acetamido-2-deoxy- glucose liên kết nhau bằng liên kết cộng h a trị β-1,4 t o th nh một chuỗi polymer

β-D-d i, m ch thẳng Chitosan l β-D-dẫn xuất quan trọng của chitin, thu ư c bằng cách deacetyl h a ể t o th nh một d ng c kích thước khác ư c ặc trưng bởi mức ộ deacetyl h a, cho nên n l một copolymer của N-acetyl-D-glucosamine và D-glucosamine Chitosan kh ng tan trong nước, nhưng nhờ c các nh m amin hiện diện

N-l m cho n hòa tan ư c trong dung dịch acid c pH &N-lt; 6,5 Mức ộ ề acetyN-l h a c n thiết ể t ư c s n phẩm c ộ hòa tan là 80 – 85% hoặc cao hơn [24]

Hình 1.8: Cấu t o của chitosan v chitin

Chitosan c ặc iểm h a học v sinh học khác biệt Trong các chuỗi polyglucosamine m ch thẳng c trọng lư ng phân tử cao, chitosan c ph n ứng nh m amin và nhóm –OH theo các thay ổi h a học Ngo i ra, các nh m amin l m cho

chitosan c tính chất của chất a ion dương (cationic polyelectrolyte ) (pKa ≈ 6,5),

một trong một v i cấu trúc ư c t m thấy trong tự nhiên Tính kiềm n y em l i các

ặc tính nổi bật của chitosan như chitosan tan trong m i trường dung dịch c tính acid ở pH < 6,5 v khi bị tan ra sẽ c iện tích dương m nh do các nh m NH3, nó

bám chặt v o bề mặt tích iện âm, t o khối với các h p chất a ion âm, v t o chelate (liên kết c ng cua) với ion kim lo i nặng C hai tính chất tan trong dung dịch acid v

sự t o th nh khối với các h p chất a ion l m cho chitosan c ặc tính t o gel rất tuyệt vời

Ưu iểm của chitosan l c ái lực với các protein, c tính chất c m máu, kháng nấm, chống t o khối u, chống tăng cholesterol Đồng thời chitosan cũng l chất c

kh năng phân rã sinh học t o th nh các s n phẩm kh ng gây h i, kh ng ộc, an to n cho con người v m i trường sống [24]

Do các ặc tính sinh học tuyệt vời m chitosan ư c ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: xử lý nước th i, ng nh c ng nghiệp thực phẩm, ng nh n ng nghiệp, ng nh c ng nghiệp giấy v bột giấy, ặc biệt l trong y học v c ng nghệ sinh học Trong y học chúng c thể ư c dùng như những chất kháng khuẩn v kháng nấm, chất phân phối thuốc, hệ thống kiểm soát phân phối thuốc, các tế b o nhân t o, thuốc mỡ chữa l nh vết thương hoặc băng b vết thương, m ng thẩm tách máu, kính sát tròng, da nhân t o, chỉ phẫu thuật v kỹ thuật m Mặt khác, trong c ng nghệ sinh học, chúng c thể ư c sử dụng trong các m ng trên sắc ký, m ng dùng ể phân tách,

ặc biệt l chất cố ịnh enzyme hoặc tế b o

Ngo i ra chitosan c thể dùng cố ịnh enzyme dưới d ng h t gel hay m ng

Th ng thường người ta dùng chất ho t h a l glutaraldehye ể t o tay gắn vững chắc khi cố ịnh enzyme [45]

ư c sử dụng như chất tr lọc, chất m i mòn, thuốc trừ sâu cơ học, hấp thụ chất lỏng, chất ệm bao phủ, chất ộn trong chất dẻo v cao su, chất mang c tính xốp hỗ tr cho các chất xúc tác h a học, các nghiên cứu kích ho t quá tr nh ng máu, ổn ịnh

các th nh ph n của thuốc nổ… Ngo i ra, n còn ư c sử dụng như một tấm cách nhiệt nhờ kh năng chịu nhiệt cao

Trong công nghệ enzyme, celite ư c dùng cố ịnh rất nhiều enzyme, làm tăng ộ bền chất mang v cũng như kéo d i thời gian tái sử dụng Celite có thể sử dụng làm chất mang cố ịnh dưới d ng riêng lẻ hay d ng phức với chất mang hữu cơ Celite có các tính chất vật lý mong muốn, kh ng ắt tiền và phù h p cho cố ịnh c enzyme tinh khiết và tinh s ch một ph n Chất mang n y ã ư c dùng cố ịnh nhiều

lo i enzyme khác nhau.Nhiều tác gi ã nghiên cứu cố ịnh celite ã em l i kết qu rất kh quan Chẳng h n như nghiên cứu của Ki-Teak Lee và C.C.Akoh (2008) ã cho thấy khi cố ịnh enzyme lipase ư c tách chiết từ 2 loài vi sinh vật khác nhau của

chủng Pseudomonas sp trên celite 545 thì có ho t tính cao hơn trên CM-Sephadex và DEAE-Sephadex [3] Nghiên cứu cố ịnh enzyme lipase tách chiết từ Saccharomyces

cerevisiae trên celite của tác gi Esam H Mansour và Fathy M Dawoud (2003) cũng

ã cho thấy hiệu suất cố ịnh lên ến 92% Đồng thời enzyme invertase cố ịnh c ộ

ổn ịnh và ho t tính cao sau 20 l n tái sử dụng [46]

1.3.1.3 C p ươn p p cố định enzyme

Khi cố ịnh enzyme lên một vật liệu n o , iều quan trọng là chọn phương pháp liên kết nhằm h n chế làm mất ho t tính enzyme bằng cách kh ng l m thay ổi cấu trúc hóa học hoặc những nhóm ph n ứng ở vị trí liên kết với enzyme

Các phương pháp cố ịnh enzyme gồm:

a P ươn p p liên kết với chất mang

- Enzyme liên kết với chất mang và ho t tính enzyme sau cố ịnh phụ thuộc vào cấu trúc tự nhiên của chất mang.Một số chất mang th ng thường ư c sử dụng như cellulose, dextran, agarose, gel polyacrylamide…

- Phương pháp n y có thể chia thành các d ng như: hấp phụ vật lý, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị Trong phương pháp hấp phụ là dễ thực hiện nhất, ít nh hưởng ến ho t tính enzyme nhưng ộ bền enzyme không cao, dễ x y ra hiện tư ng

nh enzyme Ngư c l i, phương pháp liên kết cộng hóa trị thì enzyme cố ịnh sẽ có

ộ bền cao, ồng thời enzyme gắn trên bề mặt chất mang nên dễ dàng tiếp xúc với cơ chất Th ng thường ể tăng kh năng xúc tác, ồng thời quá trình cố ịnh ư c chắc

chắn mà enzyme vẫn giữ ho t tính sinh học thì có thể tr i qua giai o n ho t hóa trước khi cố ịnh Chất ho t hóa (hay còn gọi là tay gắn) sẽ gắn vào enzyme và chất mang t o d ng phức enzyme-chất ho t hóa-chất mang bền vững trong quá trình xúc tác ph n ứng Chất ho t hóa có thể có nhiều vị trí liên kết, nhiều nhóm chức Các chất

ho t h a thường sử dụng là glutaraldehyde, cyanogen bromide

- Cố ịnh urease với chất mang chitosan bằng phương pháp cộng hóa trị ã

ư c các tác gi thực hiện rất thành công Chất mang tr i qua giai o n ho t hóa với glutaraldehyde Kết qu enzyme cố ịnh c ộ bền nhiệt cao (770C), ho t tính còn l i sau mỗi l n tái sử dụng là 80 - 100% [47,48] S n phẩm urease cố ịnh bằng phương pháp n y cũng ã ư c nhiều tác gi ứng dụng trong xét nghiệm xác ịnh nồng ộ urea máu, t ộ tin cậy cao [47,49]

b P ươn p p l ên kết n n (l ên kết éo)

Sự cố ịnh enzyme ư c h nh th nh bởi liên kết ngang trong nội phân tử của protein, hoặc l các phân tử protein khác hoặc các nh m chức năng lên một chất mang cố ịnh kh ng tan… Phương pháp n y vừa ắt tiền vừa kh ng ủ số lư ng enzyme ể t o liên kết dẫn ến ho t tính enzyme thấp Ưu iểm của phương pháp n y

l rất ít khi x y ra sự nh enzyme Ngo i ra phương pháp ư c thực hiện dưới những iều kiện tương ối khắt khe c thể l m thay ổi h nh d ng trung tâm ho t ộng của enzyme dẫn ến mất ho t tính áng kể

c P ươn p p bẫy enzyme

Phương pháp n y ư c chia th nh d ng m ng lưới v vi g i t o th nh viên nang

* Dạng mạng lưới:

- Các enzyme ư c bẫy trong kho ng kh ng gian còn trống của một polymer

kh ng tan t o liên kết ngang với nhau

- Các polymer thường ư c dùng: polymer tổng h p (polyarylamide, polyvinylalcohol…), polymer tự nhiên (tinh bột, alginate, chitosan…)

- Ưu iểm của phương pháp l enzyme ư c nhốt trong m ng lưới của gel nên cấu trúc kh ng bị biến ổi nhiều

- Enzyme urease c thể bẫy trong gel alginate hay ở d ng kết h p như alginate [50], phức carboxymethylcellulose/alginate bọc chitosan [51] c ộ ổn ịnh

chitosan-ho t tính cao Ngo i ra, Swati và cs (2007) [52] ã nghiên cứu cố ịnh enzyme urease trên agar bằng phương pháp bẫy v ứng dụng trong phân tích urea máu cho kết qu khá tương ồng với phương pháp ở phòng xét nghiệm Điều n y ã cho chúng ta thấy

c thể sử dụng các chất mang c giá th nh kh ng cao nhưng mang l i nhiều l i ích về

ộ an to n sinh học cũng như hiệu qu kinh tế

* Dạng vi gói tạo viên nang:

Phương pháp n y òi hỏi các iều kiện ph i ư c kiểm soát v cùng chặt chẽ, quy

tr nh vi g i enzyme c thể gồm các cách như: trùng h p giữa hai bề mặt, làm khô dịch lỏng hay tách phase

1.3.2 Enzyme ure se ố địn

Urea l một h p chất c kh năng hòa tan cao v bền vững trong nước, ồng thời

c ái lực với các chất hấp phụ, do việc lo i bỏ urea l vấn ề trong nhiều lĩnh vực:

c ng nghiệp, n ng nghiệp, thực phẩm v y học gặp ph i Các b i toán từ thực tế cho thấy urea ư c th i ra lên ến 108 tấn mỗi năm trên thế giới, trong hơn 90% l

ư c sử dụng l m nguồn phân b n Trong s n xuất, các chất th i chứa urea (0,2 -2%) chủ yếu l kết qu của quá tr nh l m s ch v tái chế urea sau giai o n tổng h p Các chất th i ra m i trường c n ph i ư c lo i bỏ urea ến mức thấp nhất (<0,006%) [53] Mặc dù urea trong sinh thái c ộc tính thấp nhưng quá tr nh thủy phân sẽ sinh NH3

c ộc tính, nếu tác ộng lâu d i sẽ nh hưởng ến sức khỏe con người V vậy việc dùng enzyme urease ể thủy phân urea l một cách v cùng thiết thực Tuy nhiên nếu

sử dụng urease d ng hòa tan th chi phí xử lý sẽ rất lớn, ồng thời sẽ kh ng c kh năng tái sử dụng Do việc cố ịnh enzyme urease sẽ mang l i nhiều l i ích kinh tế Urease l một trong những enzyme ư c cố ịnh v ứng dụng rộng rãi trong thực

tế Enzyme urease c thể cố ịnh trên nhiều lo i chất mang khác nhau v rất a d ng,

c thể từ nguồn gốc hữu cơ, v cơ hay dưới d ng polymer tổng h p Tuy nhiên ể c thể sử dụng với hiệu qu tốt nhất th các phương pháp cố ịnh cũng c n ư c kh o sát

và so sánh

1.3.2.1 Tín ất enzyme ure se ố địn

Enzyme urease c nguồn gốc khác nhau khi cố ịnh trên nhiều lo i chất mang với phương pháp khác nhau th tính chất cũng sẽ khác nhau

a Khả năn xú t p ản ứng của enzyme urease cố định

Enzyme urease cố ịnh cũng mang các tính chất chung của enzyme cố ịnh Ho t tính enzyme cố ịnh thường thấp hơn enzyme tự do l do khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới h n trong một ph m vi m i trường xác ịnh, cấu t o kh ng gian của phân tử c thể bị thay ổi, do l m biến ổi một số tính chất của enzyme ban u

Ho t tính của enzyme cố ịnh phụ thuộc v o b n chất, tính chất h a học của chất mang v sự khuếch tán của cơ chất, s n phẩm v các phân tử khác Các enzyme cố ịnh vẫn giữ ư c tính ặc hiệu của m nh Thêm v o nhờ liên kết với chất mang

m chúng c ộ bền vững lớn ối với các tác ộng khác nhau Như vậy, ứng trên quan iểm thực tế, sự gi m ho t ộ ho n to n c thể bù l i ư c bằng tính chất này

[54]

Do c n ph i kh o sát cố ịnh trên nhiều lo i chất mang bằng các phương pháp khác nhau sẽ lựa chọn ư c chất mang tốt nhất nhằm tăng hiệu qu sử dụng enzyme urease cố ịnh

b Các yếu tố ản ưởn đến ho t tính enzyme urease cố định

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Enzyme urease cố ịnh thường c ộ bền nhiệt cao hơn tự do Nhiệt ộ tối ưu của enzyme urease cố ịnh thay ổi thùy thuộc nguồn gốc enzyme, chất mang v phương pháp sử dụng Enzyme urease cố ịnh trên chitosan sẽ c nhiệt ộ tối ưu dao ộng từ

65 – 77oC [24] Enzyme urease c nguồn gốc ậu n nh khi cố ịnh trên chitosan bằng phương pháp liên kết cộng h a trị th c nhiệt ộ tối ưu l 750C, trong khi cố ịnh trên alginate bằng phương pháp nhốt trong gel th nhiệt ộ tối ưu lên ến 800

C, cao hơn d ng tự do 650C [50]

 Ảnh hưởng của pH

Theo nghiên cứu của Chen, Chiu và cs (1999) th ho t tính tối a enzyme urease

cố ịnh trên chitosan so với tự do ở pH 7,5 th kh ng c sự khác biệt, tuy nhiên enzyme cố ịnh ở vùng pH acid v bazơ c ộ ổn ịnh hơn v ít nh y c m bởi sự thay

ổi pH hơn enzyme tự do

Đối với enzyme urease từ ậu n nh th giá trị pH tối thích l 7,0 nhưng khi cố ịnh trên chất mang l alginate hay chitosan th giá trị n y l n lư t l 6,2 và 7,9 Còn khi kết h p chitosan v alginate th pH tối thích l 7,5 [55]

c Tính chất động học của enzyme urease cố định

Tốc ộ của ph n ứng phụ thuộc v o sự c mặt của cơ chất trong m i trường Ở một giới h n n o khi tăng nồng ộ cơ chất th tốc ộ ph n ứng tăng nhưng khi t

ộ bão hòa giữa enzyme v cơ chất th tốc ộ ph n ứng sẽ kh ng tăng nữa H u hết các nghiên cứu ều cho thấy giá trị Km của enzyme cố ịnh ều cao hơn enzyme tự

do [24] Điều n y l do sự khuếch tán của cơ chất v s n phẩm ph n ứng sẽ bị c n trở

do chất mang cố ịnh Đồng thời chất mang cố ịnh sẽ l m h n chế kh năng tiếp xúc giữa cơ chất với trung tâm ho t ộng của enzyme Do tốc ộ ph n ứng sẽ gi m Tuy nhiên enzyme cố ịnh ho n to n tuân theo ịnh luật Michaelis-Menten [54] Như vậy ối với mỗi chất mang sử dụng cho cố ịnh enzyme urease c n ph i

ư c kh o sát các th ng số ộng học ể c thể sử dụng ư c s n phẩm enzyme cố ịnh một cách tốt nhất

1.3.2.2 Một số nghiên cứu về enzyme urease cố định

Mỗi lo i chất mang dùng trong cố ịnh enzyme urease sẽ c những ưu, khuyết iểm khác nhau Chất mang sử dụng c thể l m nh hưởng ến ho t tính, ộ bền cũng như kh năng tái sử dụng của enzyme cố ịnh Do c n c những phương pháp

kh o sát ể lựa chọn chất mang h p lí Các nghiên cứu ã cho thấy cố ịnh enzyme urease bằng Sepharose CL 6 gel c thể giữ l i ư c ến 74% ho t tính enzyme, hơn hẳn cố ịnh trên màng gelatin (66%)v cố ịnh trên m ng nylon th ho t tính của enzyme ư c duy tr trong suốt 30 ng y với iều kiện b o qu n l dung dịch ệm phosphate 50 mM, pH 8 ở 40C, cao hơn với chất mang l sepharose v silica gel th

chỉ ư c 10 ng y [56] Trong khi với chất mang chitosan th ho t tính giữ ư c

77% v ộ bền cũng cao hơn hẳn so với cố ịnh bằng alginate (54%) Ngo i ra, enzyme cố ịnh trên chitosan c số l n tái sử dụng lên ến 14 l n v chỉ gi m 20% so với ho t tính ban u, hơn hẳn so với cố ịnh trên alginate Các s n phẩm cố ịnh ã

ư c ứng dụng trong ịnh lư ng urea máu v kết qu kh ng c sự khác biệt so với kết qu o ư c từ máy sinh h a tự ộng [55] Hơn nữa, so với chất mang alginate thì

ủ enzyme rease cố ịnh trên m ng paraffin c ho t tính ở mỗi l n tái sử dụng cao hơn khi cố ịnh bằng phương pháp bẫy Đồng thời khi b o qu n m ng paraffin dưới d ng

kh th ho t tính enzyme urease còn l i l 88%, cao hơn khi giữ trong nước cất chỉ còn 70% [57]

Ng y nay, các chất mang c thể kết h p nhau t o d ng phức ể tăng ộ bền của enzyme cố ịnh như khi cố ịnh enzyme urease trên phức poly(acrylamide-co-acrylic acid) kết h p với κ-carrageenan th s n phẩm c ộ bền 70 ng y, ho t tính enzyme cố ịnh giữ ư c 70% so với enzyme tự do, ồng thời sau 20 l n sử dụng enzyme cố ịnh vẫn duy tr ư c 89% ho t tính, cao hơn khi cố ịnh dưới d ng phức polyelectrolyte chitosan-alginate [50]; hay cố ịnh enzyme trên phức gelatin-poly (HEMA) copolymer [58], alginate bọc chitosan [59] cũng ã rất th nh c ng, enzyme thu ư c c ho t tính v ộ bền cao

Ngoài ra enzyme urease còn ư c cố ịnh trên các iện cực chọn lọc như NH4+,

m ng trao ổi ion trên hệ thống máy sinh h a tự ộng hay máy ch y thận nhân t o Theo kết qu nghiên cứu của Bahar Dindar và cs [60] th khi cố ịnh enzyme urease lên màng poly(vinylchloride) (PVC) của iện cực chọn lọc NH4+ th ộ nh y khá cao

v ho t tính ổn ịnh trên 2 tháng Còn khi cố ịnh enzyme urease trên kính arylamine bằng phương pháp cộng h a trị với hiệu suất cố ịnh kho ng 90% v enzyme cố ịnh

c ộ ổn ịnh cao, ộ bền nhiệt v c kho ng pH rộng [61]

Các s n phẩm enzyme cố ịnh cũng ã ư c một số tác gi ứng dụng trong xét nghiệm xác ịnh nồng ộ urea trong bệnh phẩm [47,55,52], thực phẩm [25,62]…

1.3.2.3 C p ươn p p ố địn enzyme urease

Hiện nay enzyme urease ư c cố ịnh bằng rất nhiều phương pháp ã cho kết qu rất th nh c ng Hiệu qu cố ịnh tùy thuộc v o lo i chất mang v phương pháp sử dụng Chẳng h n phương pháp liên kết cộng h a trị giữa enzyme với chất mang chitosan [63,64,65], gelatin [66]; phương pháp hấp phụ enzyme trên chất mang silicagel [67], celite [68]; phương pháp bẫy enzyme trong chất mang alginate [55, 69], chitosan [70], chitosan kết h p alginate [50,59] hay với một số chất mang tổng

h p như polyacrylamide, polyester, polystyrene…

1.4 TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM UREA MÁU

1.4.1 Sự thành lập ure tron ơ t ể

Urea l s n phẩm cuối cùng của quá tr nh chuyển h a chất m trong cơ thể người

v ộng vật c vú Urea ư c t o th nh từ amoniac, ây l s n phẩm của ph n ứng khử amin oxy h a trong con ường thoái h a protid

Amoniac l chất ộc h i ối với cơ thể, c thể nh hưởng ến não bộ Nhiều nghiên cứu ã cho thấy hiệu ứng ộc nhất của amoniac(dưới d ng NH4+) là làm thay

ổi pH tế b o v l m c n kiệt cơ chất của chu tr nh citric [71] Do amoniac c n

ph i ư c khử ộc v lo i bỏ ra khỏi cơ thể S n phẩm của quá tr nh khử ộc n y chính l urea Quá tr nh n y x y ra ở gan, urea ư c t o th nh sẽ theo dòng máu ến thận v o th i một ph n theo nước tiểu, một ph n sẽ ư c tái hấp thu trở l i

1.4.2 Ý n ĩ xét n ệm urea máu

Urea ư c tổng h p chủ yếu ở gan rồi v o máu ến thận ể o th i ra ngo i Nồng ộ urea máu ở người b nh thường từ 15 – 45 mg/dL Lư ng urea b i xuất theo nước tiểu h ng ng y phụ thuộc v o chế ộ ăn c protein Khi c rối lo n chức năng tái hấp thu, b i tiết của thận hay kh năng chuyển h a NH3 thành urea của gan gi m

ều dẫn ến thay ổi h m lư ng urea trong máu v nước tiểu Tuy nhiên kh năng tổng h p urea của gan rất lớn nên chỉ trong trường h p gan bị tổn thương nặng th

h m lư ng urea trong máu mới gi m Do th ng thường kh ng dùng xét nghiệm urea ể ánh giá chức năng gan Như vậy nồng ộ urea máu v nước tiểu rất c ý nghĩa quan trọng trong chẩn oán v iều trị các trường h p bệnh lý ở thận

1.4.3 C p ươn p p xét n ệm urea máu

1.4.3.1 P ươn p p ó ọc

a P ươn p p d et ylmonox me (DAM)

Nguyên tắc phương pháp: trong m i trường acid c un n ng, dưới sự hiện diện của ion Fe3+, urea ph n ứng với DAM t o phức chất m u hồng M u c ng ậm th nồng ộ urea trong mẫu thử c ng cao

Kết qu urea của mẫu ư c so sánh ối chiếu với ường chuẩn