Cải tiến quy trình ly trích dna từ niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

TÊN ĐỀ TÀI: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng - Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống” II.. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất được quy trình ly trích phù hợp cho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 26 tháng 05 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

2 Thư ký: TS Huỳnh Ngọc Oanh

3 Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

4 Phản biện 2: TS.Hoàng Anh Hoàng

5 Ủy viên: Võ Đình Lệ Tâm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TĂNG NGỌC KIỀU VY MSHV: 7140301

Ngày, tháng, năm sinh: 29/06/1989 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng -

Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Đề xuất được quy trình ly trích phù hợp cho

niêm mạc miệng ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống Nội dung đề tài bao gồm:

- Khảo sát hiệu quả ly trích của một số quy trình ly trích DNA, lựa chọn quy trình

ly trích phù hợp

- Cải tiến quy trình được chọn

- Ly trích so sánh với bộ ly trích thương mại trên 10 mẫu và ly trích thử nghiệm

trên 200 mẫu, từ đó đánh giá tính khả thi của quy trình đề xuất

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/09/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2018

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

PGS.TS Nguyễn Thúy Hương PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của Quý Thầy Cô, cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến cô Nguyễn Thúy Hương - PGS.TS

tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu, hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành luận văn này Cảm ơn sự kiên nhẫn và sự động viên của

cô dành cho em trong suốt thời gian dài thực hiện đề tài

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến ThS Huỳnh Viết Lộc và các anh chị nhân viên Viện Sinh Học Phân Tử LOCI đã cung cấp, hỗ trợ trang thiết bị vật tư cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

Để có được nguồn kiến thức cho phép em thực hiện được nghiên cứu này, em xin cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Bách Khoa – nơi em gắn bó trong suốt những năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình, các anh chị và các bạn đồng nghiệp đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh

TP.HCM, tháng 4 năm 2018

Học viên thực hiện Tăng Ngọc Kiều Vy

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác cho thấy nhiều tiền năng ứng dụng trong thực tiễn Thêm vào đó sự ra đời của các thế hệ Taq polymerase kháng ức chế cho phép thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng mẫu DNA chứa nhiều tạp chất là điều kiện cho phép chúng tôi xây dựng quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng trên cơ sở cải tiến quy trình ly trích thô DNA bằng NaOH-SDS (có nồng độ SDS 0.025%) mà kết quả thử nghiệm cho thấy rằng phù hợp nhất cho phản ứng PCR -STR Tiếp tục khảo sát hiệu quả ly trích ở các nồng độ SDS khác nhau, đề tài tìm được nồng độ SDS phù hợp cho ly trích niêm mạc miệng

là 0.01%

Để đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích cải tiến đã đưa ra, đề tài thực hiện ly trích so sánh quy trình này với bộ kit ly trích thương mại trên 10 mẫu và ứng dụng

ly trích trên 200 mẫu So sánh trên 10 mẫu, quy trình ly trích cải tiến tuy cho cường

độ huỳnh quang trung bình thấp hơn bộ kit thương mại nhưng kết quả phân tích vẫn chính xác và trùng khớp Trên 200 mẫu, kết quả cho thấy không có mẫu nào bị ức chế, hơn 90% mẫu cho sản phẩm PCR có cường độ huỳnh quang trên 100 RFU và 100% cho tín hiệu cao trên 50 RFU Đối các cặp mẫu đã biết mối quan hệ huyết thống, kết quả trả về trùng khớp Ngoài ra, quy trình còn cho thấy nhiều ưu thế là thao tác chỉ gồm hai bước đơn giản, giảm rủi ro, rút ngắn thời gian ly trích chỉ còn

15 phút, giảm giá thành 1/10 so với các bộ kit ly trích đang thương mai hóa trên thị trường hiện nay Đề tài sau khi thực hiện đã đề xuất được quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng, ứng dụng được trong xét nghiệm quan hệ huyết thống trên bộ kit PowerPlex ®Fusion System

SUMMARY

The crude DNA extraction process in one or two steps demonstrates many of the potential applications in practice In addition, Taq polymerase’s inhibitors resistance enables PCR amplification without any prior DNA purification, that is a reason for us to construct DNA extraction procedures from buccal swabs on the basis of improved crude DNA extraction procedure by NaOH-SDS Screening of SDS concentrations, we found that 0.01% is appropriate concentration for crude DNA extraction procedure

To evaluate the effectiveness of the improved extracting procedure, we compared the PCR performance of the improved procedure with a commercially available kit (E.Z.N.A Forensic DNA kit) on 10 samples and applicated to extract DNA on 200 samples Compared to the 10 samples, the improved extraction procedure had a lower average fluorescence than the commercial kit, but the results were accurate and consistent On 200 samples, the results showed no samples were inhibited, more than 90% of samples for PCR product had fluorescence intensity above 100 RFU and 100% for signal above 50 RFU For pairs of samples that know the parentage relationship, the result is match It also shows that the ability to apply with many advantages (two simple steps, reduce the risk, shorten time - only 15 minutes, reduce the price to 10 time when compared to the commercial kit) These results suggest that, the DNA extraction procedure had built is suitable for DNA testing on Power Plex ®Fusion System kit

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Tăng Ngọc Kiều Vy

MỤC LỤC

Trang

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ iv

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ LUẬN VĂN vi

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .3

1.1 Xét nghiệm quan hệ huyết thống 3

1.1.1 Xét nghiệm dựa trên nhóm máu 3

1.1.2 Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA) .3

1.1.3 Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình 4

1.1.3.1 Khái niệm đoạn lặp đa hình 4

1.1.3.2 Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ HT bằng đoạn lặp đa hình 6

1.2 Kỹ thuật PCR-STR 7

1.2.1 Giới thiệu 7

1.2.2 Phương pháp thực hiện 7

1.3 Các cải tiến trong DNA polymerase 12

1.4 Các phương pháp ly trích DNA 13

1.4.1 Phương pháp Phenol 13

1.4.2 Phương pháp Boom 14

1.4.3 Ly trích bằng cột lọc 15

1.4.4 Phương pháp ly giải kiềm (alkaline) 15

1.5 Ly trích thô DNA bằng các chất biến tính protein 16

1.5.1 Ưu thế của quy trình ly trích thô 16

1.5.2 Một số chất biến tính protein 16

1.5.2.1 Chất chaotropic 16

1.5.2.2 Chất tẩy rửa 17

1.6.Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế trong xét nghiệm huyết thống 19

1.6.1 Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng 19

1.6.2 Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ưu thế cho xét nghiệm 19

1.6.3 Các nghiên cứu ly trích thô DNA .20

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu 24

2.2.1 Máy móc- Thiết bị 24

2.2.2 Vật tư- hóa chất 24

2.3 Thu nhận mẫu 24

2.4 Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp 25

2.4.1 Ly trích mẫu 26

2.4.2 Chạy PCR – Phân tích kết quả 28

2.4.3 Phân tích kết quả - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp 28

2.5 Cải tiến quy trình ly trích phù hợp 29

2.6 Đánh giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến 29

2.6.1.So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại 29

2.6.2 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .32

3.1 Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm DNA 32

3.2 Kết quả cải tiến quy trình ly trích NaOH- SDS 40

3.3 Đáng giá hiệu quả của quy trình ly trích đã cải tiến 43

3.3.1 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình thương mại 43

3.3.2 Ứng dụng ly trích thử nghiệm 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard 8

Hình 1.2: Kết quả hiển thị cho Allelic ladder với 4 màu huỳnh quang .10

Hình 1.3: Kết quả điện di STR bằng bộ kit PowerPlex ®Fusion System 11

Hình 1.4: Ly trích bằng silica 14

Hình 1.5: Cấu tạo hóa học chất tẩy rửa 17

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS 18

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 .18

Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng dưới kính hiển vi 19

Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu 23

Hình 2.2: Mẫu niêm mạc miệng trong TE1X 25

Hình 3.1: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit 33

Hình 3.2: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng triton X100 34

Hình 3.3: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH 35

Hình 3.4: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH + SDS 36

Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu quả ly trích của các phương pháp 38

Hình 3.6: So sánh hiệu quả ly trích ở các nồng độ SDS 41

Hình 3.7: So sánh chiều cao peak trung bình ở hai phương pháp ly trích 45

Hình 3.8: Kết quả điện di STR trên mẫu ly trích bằng NaOH+ SDS đã cải tiến 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các locus STR được phân tích trong bộ kit PowerPlex ®Fusion System 9

Bảng 2.1: Danh sách đối tượng thu mẫu 25

Bảng 2.2: Quy trình ly trích bằng Triton X100 26

Bảng 2.3: Quy trình ly trích bằng NaOH 26

Bảng 2.4 : Quy trình ly trích bằng NaOH - SDS 27

Bảng 2.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng bộ ly trích cột E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit .27

Bảng 2.6: Công phức pha mix PCR-STR 28

Bảng 2.7: Công thức pha đệm ly giải ở các nồng độ SDS khác nhau 30

Bảng 3.1: Kết quả so sánh hiệu quả ly trích 37

Bảng 3.2: Kết quả điều chỉnh nồng độ SDS 42

Bảng 3.3: So sánh hiệu quả ly trích quy trình đã cải tiến và quy trình đối chứng 45

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá hiệu quả ly trích trên 200 mẫu 48

Bảng 3.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng đã cải tiến 49

Bảng 3.6: So sánh giữa quy trình ly trích thương mại và quy trình ly trích cải tiến 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

MỞ ĐẦU

Xét nghiệm quan hệ huyết thống hay còn gọi đơn giản là xét nghiệm DNA không còn quá xa lạ trong xã hội hiện nay Xét nghiệm này phục vụ một lượng lớn nhu cầu dân sự là kiểm tra quan hệ huyết thống giữa hai hay nhiều cá thể, tìm thân nhân, giải quyết các thủ tục pháp lý, điều tra pháp y Công nghệ xét nghiệm DNA liên tục được cải tiến, từ những cơ sở ban đầu là dựa trên nhóm máu, hệ kháng nguyên bạch cầu, hiện nay xét nghiệm này được thực hiện trên cơ sở chạy phản ứng PCR multiplex khuếch đại và tiến hành so sánh từ 16 đến 24 vị trí đoạn lặp đa hình STR cho độ chính xác của xét nghiệm gần như là tuyệt đối [1]

Nguồn DNA đầu vào là yếu tố quyết định đến kết quả của phản ứng PCR DNA không tinh sạch làm giảm hiệu suất hoạt động của taq polymerase hoặc ức chế phản ứng PCR Các quy trình ly trích DNA truyền thống như quy trình ly trích bằng phenol, Boom và cả các bộ ly trích đã được thương mại hiện nay phục vụ riêng cho xét nghiệm DNA của Qiagen (QIAamp DNA investigator kit), Promega (DNA IQ system), Omega (E.Z.N.A Forensic DNA kit) đều có nhiều bước thực hiện phức tạp nhằm giúp sản phẩm DNA thu được cuối cùng có độ tinh sạch đủ để tham gia phản ứng PCR

Tuy nhiên các quy trình trên đều có nhược điểm lớn là quá trình ly trích càng nhiều bước thực hiện càng làm người kỹ thuật viên dễ gây sai sót, nhầm lẫn, kéo dài thời gian xét nghiệm Trong khi đó với xét nghiệm DNA chúng tôi yêu cầu một quy trình ly trích mẫu đơn giản (một đến hai bước thao tác) giúp kết quả xét nghiệm cuối cùng là chính xác nhất [2] Đã có các quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác được báo cáo trước đây Tuy nhiên sản phẩm DNA thu được từ các quy trình này chỉ tham gia được một số phản ứng PCR đơn giản [3] Vì vậy, vào thời điểm đó, các báo cáo này không được ứng dụng trong thực tiễn

Hiện nay công nghệ sinh học đã có những bước tiến đáng kể trong kỹ thuật enzyme tái tổ hợp, các nhà sản xuất như Qiagen, Promega lần lượt cho ra các sản phẩm taq polymerase kháng ức chế Nghĩa là phản ứng PCR phức tạp nhất vẫn có

PowerPlex ®Fusion System là bộ kit được sử dụng trong hầu hết các phòng xét nghiệm huyết thống hiện nay cho phép kiểm tra 24 vị trí STR trong một phản ứng multiplex PCR Bộ kit được nhà sản xuất khuyến cáo hoạt tính kháng ức chế của taq polymerase tốt hơn so với các thế hệ taq polymerase cũ Tận dụng ưu điểm này, ta hoàn toàn có thể thay thế quy trình ly trích nhiều bước phức tạp bằng quy trình ly trích thô DNA trong một đến hai bước thao tác đơn giản giúp tiết kiệm thời gian, chủ động về mặt kỹ thuật, giảm chi phí và giảm thiểu tối đa rủi ro, nhầm lẫn có thể xảy ra trong quá trình xử lý mẫu [4]

Đối tượng mẫu mà chúng tôi cân nhắc cho quy trình ly trích thô DNA là niêm mạc miệng vì đây là dạng mẫu được ưu tiên thu nhận tại cái phòng xét nghiệm do đặc tính dễ thu nhận, dễ bảo quản, không xâm lấn, lượng DNA dồi dào Thêm vào

đó, cũng đã có một số ly trình ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng được công bố

trước đây bởi Daniel (1995), Brenda (1992) [5]

Dựa trên các quy trình ly trích đã có, tính năng kháng ức chế của bộ kit đang sử

dụng, đề tài: “Cải tiến quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng - Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống” được thực hiện nhằm đạt được mục tiêu

và các nội dung sau:

Mục tiêu đề tài:

- Đề xuất được quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống, rút ngắn thời gian ly trích, giảm rủi ro, giảm giá thành xét nghiệm

Nội dung đề tài:

- Khảo sát hiệu quả của một số quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng đã được công bố, lựa chọn quy trình ly trích phù hợp cho xét nghiệm quan hệ huyết thống

- Cải tiến quy trình được chọn

- Ly trích so sánh với bộ kit ly trích thương mại

- Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu đại diện, từ đó đánh giá tính khả thi của quy trình đề xuất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Xét nghiệm quan hệ huyết thống

Trong xã hội ngày nay, nhu cầu tìm hiểu, xác nhận mối quan hệ huyết thống giữa các cá thể người ngày càng tăng cao Không chỉ phục vụ cho giải đáp nghi vấn của cá nhân, xét nghiệm này còn phục vụ cho các mục tiêu pháp lý như làm giấy khai sinh, nhập quốc tịch, bảo lãnh, định cư Ngoài ra, trong điều tra hình sự, xét nghiệm này là công cụ hỗ trợ đắc lực giúp nhận diện cá thể truy lùng dấu vết

Để giải quyết cho các nhu cầu trên, phương pháp xác định quan hệ huyết thống

đã sớm ra đời từ đầu những năm 1920 dựa trên các hiểu biết về di truyền Một số chỉ thị sinh học được sử dụng trong nhận dạng và xác định mối quan hệ huyết thống bao gồm: Nhóm máu; Kháng nguyên bạch cầu- HLA; Các đoạn lặp đa hình

1.1.1 Xét nghiệm dựa trên nhóm máu

Đầu những năm 1900 các nhà khoa học đã xác định được 4 nhóm máu cơ bản của con người là A, B, AB và O dựa trên một số chất cacbohydrat và protein đặc

thù trên hồng cầu

Đến những năm 1920, các nghiên cứu cho thấy nhóm máu được quyết định do gen Gen này quy định bởi 2 alen trội là IA, IB và 1 alen lặn iO, di truyền theo quy luật của Mendel [6] Do đó các nhà khoa học có thể dự đoán được nhóm máu của đứa trẻ dựa trên nhóm máu của cha mẹ Tuy nhiên việc sử dụng nhóm máu có những hạn chế nhất định do nó chỉ chính xác 30% và nó không phải là một công cụ hữu hiệu cho việc xác định mối quan hệ huyết thống Dựa trên nhóm máu này ta chỉ

có thể khẳng định được một số trường hợp chắc chắn không phải là cha con

Ví dụ: Cha giả định có nhóm máu O (có cấu trúc gen iO iO), mẹ ruột nhóm máu

O (có cấu trúc gen iO iO) nếu con có nhóm máu A, B thì chắc chắn không phải là con của người cha giả định Tuy nhiên nếu con có nhóm máu O thì vẫn chưa đủ cơ

sở để kết luận cha con vì vẫn có rất nhiều người đàn ông máu O

1.1.2 Xét nghiệm dựa trên hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA)

Năm 1970, các nhà khoa học khám phá ra các kháng nguyên bạch cầu (Human

nguyên bạch cầu là các protein kháng nguyên hiện diện trên bề mặt tế bào, đóng vai trò quan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như những cơ chế giao tiếp giữa các tế bào HLA được xác định bằng cách sử dụng các test huyết thanh và kháng thể đơn dòng (anticorps monoclonaux) có mặt trên các tế bào bạch cầu lympho [7]

Có nhiều dạng HLA khác nhau và có sự hiện diện khác nhau ở từng người, tuy các gen quy định cho HLA cũng di truyền theo quy luật Menden Đứa trẻ khi được sinh ra sẽ có một nửa kháng nguyên bạch cầu di truyền từ bố và một nửa từ mẹ Do

đó xét nghiệm HLA trở thành một công cụ cho phép xác định mối quan hệ huyết thống cha con Nếu chỉ sử dụng riêng xét nghiệm HLA có thể xác định được mối quan hệ cha con với độ chính xác là 80%, nếu kết hơp với xét nghiệm nhóm máu và xét nghiệm huyết thanh thì kết quả có độ chính xác lên tới 90% [8]

Tuy nhiên xét nghiệm HLA cũng không phải là một công cụ lý tưởng để xác định mối quan hệ huyết thống do xét nghiệm đòi hỏi lượng máu thu ban đầu khá lớn, quá trình lấy máu gây khó chịu và nguy hiểm cho các trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi Một số yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm như: mẫu máu bị vỡ hồng cầu, người làm xét nghiệm được truyền máu trước đó Do đó, hiện nay xét nghiệm HLA chủ yếu sử dụng để xác định tính tương hợp mô trước khi ghép tạng, tìm kiếm các HLA liên quan đến một số bệnh lý

1.1.3 Xét nghiệm dựa trên đoạn lặp đa hình

1.1.3.1 Khái niệm đoạn lặp đa hình

DNA được tạo thành từ 4 loại nucleotide, chính sự sắp xếp đa dạng của các nucleotide này làm cho DNA mỗi người trở nên độc nhất vô nhị Cơ thể mỗi người

có tới 3.2 tỉ cặp base, việc xác định, tìm thấy sự khác biệt về trình tự base giữa các

cá nhân là không hề đơn giản Năm 1984, Alec Jeffeya và các cộng sự trong khi nghiên cứu DNA mã hóa cho hemoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp lại 10-15 base, các đoạn lặp lại này được gọi là các Tandem Repeat Sequence – đoạn lặp lại đa hình [9] Các Tandem Repeat Sequence có tính đa hình về số lượng rất lớn, chúng khác nhau về

số base trong một đơn vị, số lượng đơn vị lặp Chính sự đa hình này giúp cho sự phân biệt giữa các cá thể trong loài cũng như phân biệt giữa các loài với nhau [10] Dựa vào số lượng base trong một đơn vị lặp, Tandem Repeat Sequence được chia làm 3 nhóm:

- DNA vệ tinh (DNA satellite): đơn vị lặp lại từ một đến vài trăm base Độ dài vùng lặp lại có thể lên tới vài Mb DNA satellite thường được tìm thấy ở xung quanh vùng tâm động nhiễm sắc thể Sự phân bố của chúng đóng vai trò nhất định trong sự phân chia tế bào, được biết chúng liên quan đến sự liên kết các protein điều khiển, kiểm soát quá trình di chuyển của nhiễm sắc thể về cực của

tế bào DNA satellite ít khi được sử dụng làm chỉ thị phân tử nhận dạng cá thể,

mà thường dùng làm chỉ thị cho lập bản đồ gen vùng gần tâm động

- DNA tiểu vệ tinh (DNA minisatellite): còn gọi là DNA lặp lại ngẫu nhiên, đa hình (variable number tandem repeat-VNTR) Số lượng base trong một đơn vị dao động từ 10-100 base, lặp lại từ 1-30 lần, chiếm đoạn DNA từ 1- 5kb, thậm chí có thể lên tới 20 kb [11][12] VNTR phân bố tập trung hoặc rải rác trên nhiễm sắc thể Dựa vào sự phân bố đó người ta chia DNA minisatellite thành 2 loại:

 DNA tiểu vệ tinh đa vị trí (multi–locus mini satellite): Hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen Các tiểu vệ tinh đa vị trí được phát hiện vào năm 1985

 DNA tiểu vệ tinh đơn vị trí (single –locus mini satellite): chỉ có tại một vị trí trên bộ gen Nhiều tiểu vệ tinh đơn vị trí có giá trị dấu ấn DNA

- DNA vi vệ tinh (DNA microsatellite): còn gọi là single sequence repeat (SSRs) hay Short Tandem Repeat (STRs) có số lượng base rất ít, từ 1-6 base, được lặp lại nhiều lần thành đoạn khoản 200 base DNA microsatellite phân

bố tập trung hay rải rác trên nhiễm sắc thể, genome, và chúng có tính đa hình

về số lượng rất cao giữa các cá thể Chính vì thế chúng được dùng làm các chỉ thị phân tử rất thông dụng Một lý do khác là so với các DNA tiểu vệ tinh

Giống như các protein trên tế bào máu hay HLA, con cái có bộ nhiễm sắc thể một nửa nhận từ cha và một nửa nhận từ mẹ nghĩa là các đoạn lặp đa hình cũng được di truyền theo Các đoạn lặp đa hình này đa dạng hơn HLA hay protein trong máu, nó hiện diện trong tất cả các tế bào của cơ thể Với những đặc tính như vậy nên chúng trở thành chỉ thị phân tử lý tưởng cho xét nghiệm quan hệ huyết thống

1.1.3.2 Các kỹ thuật xét nghiệm quan hệ huyết thống bằng đoạn lặp đa hình

- Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật RFLP

Các DNA lặp lại đa hình được dùng như là các chỉ thị phân tử phục vụ các nghiên cứu quan trọng về gen và di truyền Công nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên được phát triển bởi Jeffereys vào năm 1985, được gọi là RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật cho phép phát hiện các tiểu vệ tinh đa vị trí dựa trên sự đa hình về chiều dài các đoạn DNA Trong phân tích RFLP, DNA mẫu được cắt thành các đoạn nhỏ bằng các enzyme cắt giới hạn, và sau đó các đoạn DNA nhỏ tạo thành được phân tách dựa theo kích thước bằng kỹ thuật lai Southern Blot Hai cá thể có cùng quan hệ huyết thống khi họ có chiều dài đoạn DNA sau khi

xử lý bằng enzyme cắt giới hạn giống nhau ít nhất một nửa [14]

Phương pháp này cho kết quả chính xác trên 99,99% Tuy nhiên, ngày nay, kỹ thuật này không được sử dụng do RFLP đòi hỏi phải có một lượng mẫu máu lớn, mất nhiều thời gian để thực hiện phân tích, kết quả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng DNA ly trích, thao tác kỹ thuật, chất lượng enzyme cắt và nguy cơ ngoại nhiễm là rất lớn

- Xét nghiệm quan hệ huyết thống sử dụng kỹ thuật PCR-STR

Các vị trí vi vệ tinh (STRs) sẽ được nhân bản bằng kỹ thuật PCR Sản phẩm PCR đem phân tích trên hệ thống điện di mao quản để biết được chiều dài sản phẩm khuếch đại từ đó xác định số lần lặp lại của trình tự STR Xét nghiệm DNA hiện nay được thực hiện dựa trên so sánh 16 - 24 vị trí STR, từ đó xác suất để 2 cá thể khác nhau có cùng toàn bộ vị trí STR là cực thấp, dưới 10-10 [1]

Các vị trí STR sử dụng trong nhận diện cá thể ở người thông thường là các trình

tự dài 4 base vì chúng mang bốn đặc tính tiêu biểu sau:

- Tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau

- Dễ dàng thực hiện khuếch đại nhiều vị trí STR trong cùng một phản ứng PCR

4 vùng RFLP hoặc trên 13 vị trí loci này Nếu tất cả 13 vị trí loci được phân tích, khả năng hai người sẽ có cùng một bảng DNA là 1/1010, làm cho nó trở thành một phương tiện hiệu quả để nhận diện cá thể [15] Hai hãng sản xuất các sản phẩm sinh học phân tử là PERKIN ELMER và PROMEGA (Mỹ) đã cho xuất xưởng nhiều bộ kit STR khác nhau; các bộ kit STR trên 3 loci, 9 loci , 12 loci, 16 loci và 24 loci đã lần lượt ra đời

Trong xét nghiệm quan hệ huyết thống hiện nay, phản ứng PCR STR được thiết

kế là một phản ứng multiplex PCR khuếch đại cùng lúc 16- 24 vị trí STR 16-24 cặp primer tham gia phản ứng được gắn nhóm màu huỳnh quang khác nhau

 Sau quá trình PCR, ta có hỗn hợp đoạn DNA khuếch đại các vị trí STR có màu huỳnh quang của primer tương ứng

 Tiến hành điện di mao quản sản phẩm PCR cùng với allelic ladder Allelic

được phân tích cùng nhau cùng với ladder Số lần lặp lại của trình tự STR được xác định dựa trên allelic ladder được điện di cùng (hình 1.2)

 Cả mẫu và ladder trước khi điện di sẽ được trộn với một lane standard mang một màu huỳnh quang riêng biệt Phần mềm đọc kết quả dựa trên màu huỳnh quang này để loại ra các tín hiệu nhiễu, so sánh sản phẩm PCR với allelic ladder cho biết số lần lặp lại của vị trí STR (hình 1.1)[18]

 PowerPlex ®Fusion System là bộ mix PCR STR khuếch đại 24 vị trí STR bằng 4 nhóm primer có gắn màu huỳnh quang lần lượt là: Fluorescein, JOE, TMR-ET và CXR-ET và màu huỳnh quang thứ năm của WEN Internal Lane Standard 500 (bảng 1.1)

 Ưu điểm: Là kỹ thuật PCR tiên tiến phát triển từ multiplex PCR kết với tín hiệu huỳnh quang trên trình tự primer khuếch đại và phân biệt được một lượng lớn các sản phẩm PCR đích khác nhau

 Nhược điểm: Kết quả đọc dựa trên cường độ màu huỳnh quang RFU (relative fluorescence units) và kích thước sản phẩm đòi hỏi cao ở chất lượng phản ứng PCR Trang thiết bị cho phản ứng PCR đắt tiền, khó sử dụng rộng rãi

Hình 1.1: Kết quả hiển thị Liz scan -WEN Internal Lane Standard 500 [4]

Bảng 1.1: Các locus STR được phân tích trong bộ kit PowerPlex ®Fusion System [4]

STT STR locus Màu huỳnh quang Khoảng kích thước

trên allelic ladder

Hình 1.2: Kết quả hiển thị cho Allelic ladder với 4 màu huỳnh quang [4]

Hình 1.3: Kết quả điện di STR bằng bộ kit PowerPlex ®Fusion System [4]

1.3 Các cải tiến trong DNA polymerase

Ngoài các bước tiến trong quy trình chạy PCR, kỹ thuật PCR còn được cải tiến không ngừng ở DNA polymerase tham gia phản ứng Từ năm 1976, việc cô lập

thành công Taq polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus, một enzyme chịu nhiệt

cho phép tham gia vào chu kỳ luân nghiệt đã giúp cải thiện đáng kể hiệu quả của PCR 1988 Kary Mullis và Tổng công ty Cetus đã thương mại hoá Taq Polymerase

để sử dụng rộng rãi và sau đó là sự đời của hệ thống máy PCR

Taq polymearse thế hệ đầu không hoàn hảo, nó cho thấy những khuyết điểm như hiệu suất không cao, dễ ức chế, xảy ra lỗi trong quá trình tổng hợp DNA đặc biệt là đối với các trình tự giàu GC, cấu trúc thứ cấp PCR ngày càng phát triển và tham gia vào hầu hết nghiên cứu sinh học và đặc biệt lĩnh vực xét nghiệm y học, do

đó đòi hỏi sự ra đời DNA polymerase thế hệ sau ưu tú hơn

Năm 1994, kỹ thuật sử dụng kháng thể khóa enzyme polymerase cho phép tránh tình trạng taq tổng hợp trình tự DNA không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp Năm 2005, sản phẩm thương mại High-Fidelity DNA Polymerases tạo thành trên công nghệ protein tái tổ hợp, giúp polymerase có hoạt tính polymerase 5´→ 3´, exonuclease 3´→ 5´ cho hiệu suất tổng hợp cao gấp 50 lần taq thông thường và độ chính xác cao nhờ hoạt tính sửa sai

Theo sau đó là sự ra đời của hàng loạt các DNA polymerase cho phép chạy phản ứng PCR trên mẫu DNA nhiều tạp chất Năm 2009, nghiên cứu thành công việc tạo đột biến trên Taq DNA polymerase cho phép kháng lại các chất ức chế hiện diện trong máu [19] Năm 2013 Miura và cộng sự đã tiến hành khảo sát hiệu quả khuếch đại DNA của 6 loại direct DNA polymerase đã được thương mại hóa Kết quả cho thấy cả 6 loại taq trên đều cho phép chạy phản ứng PCR trên đối tượng mẫu DNA thô mang nhiều chất ức chế [3]

Một số direct DNA polymerase trên thị thường hiện nay:

- KOD FX - Hãng Toyobo Life Science Deparment

- Mighty Amp - Hãng Takara Bio

- Hemo KlenTaq - Hãng New England Biolabs (NEB)

- Phusion Blood direct PCR kit – Hãng Thermo Fisher Scientific

- KAPA Blood PCR kit - Hãng Kapa Biosystems

- BƯỚC 2: Loại bỏ thành phần không phải DNA, chủ yếu là protein

- BƯỚC 3: Thu acid nucleic

Do DNA là nguồn nguyên liệu đầu vào cho phản ứng sinh học phân tử, tiêu chí hướng đến của quy trình ly trích là dễ thao tác, tránh ngoại nhiễm, ly trích được nhiều DNA, độ tinh sạch cao, giá thành rẻ, an toàn Tuy nhiên có được quy trình ly trích đạt được tất cả các yêu cầu đó là rất khó Vì vậy tùy vào nguồn mẫu, yêu cầu

về độ tinh sạch, lượng DNA cần cho phản ứng, ta lựa chọn phương pháp ly trích phù hợp

1.4.1 Phương pháp Phenol

Năm 1953, Grassmann và Deffner phát hiện rằng phenol là chất thích hợp để chiết xuất protein từ dung dịch nước [21] Kirby (1956), báo cáo phenol ở các điều kiện pH khác nhau cho phép phân tách DNA và RNA ra khỏi protein Ngay sau đó,

1957, Kirby tìm thấy rằng sự có mặt của muối anion (ví dụ p-aminosalicylate và natri benzoate) giúp tăng lượng DNA và RNA trong quá trình ly trích [20][22] Ngày nay, phương pháp Kirby tiếp tục được sử dụng với sự bổ sung một số chất hỗ trợ khác như chất tẩy rửa anion SDS, chloroform và isoamyl alcohol

Ly trích bằng phenol là phương pháp ly trích ra đời sớm nhất, vẫn được sử dụng trong các phòng thí nghiệm và được xem là phương pháp ly trích cơ bản thích hợp cho nhiều đối tượng mẫu

Nguyên tắc: Phenol là chất biến tính protein mạnh đóng vai trò phá hủy các

bào: DNA, RNA, protein… Sau khi ly tâm, mẫu xử lý sẽ phân tách thành hai lớp: Lớp dưới là phenol, lớp trên là nước chứa DNA, phần protein bị biến tính sẽ nằm ở

bề mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ DNA trong phần dịch nổi ở trên sẽ được thu nhận bằng cách tủa với isopropanol có bổ sung chất trợ tủa (sodium acetat) Muối dư thừa được rửa sạch với ethanol 70% Ly tâm, hong khô bằng nhiệt để loại

bỏ ethanol Sau đó DNA được hòa tan với đệm TE hoặc nước cất vô trùng

- Ưu điểm: Ly trích được DNA có kích thước lớn trên nhiều loại mẫu

- Nhược điểm: Mất nhiều thời gian, dễ gây ức chế phản ứng PCR do đó đòi hỏi cao ở tay nghề kỹ thuật viên, hóa chất sử dụng độc hại [22]

Silica tồn tại ở dạng tinh thể SiO2 và một số dạng hóa học khác như oxit silic vô định hình và bột thủy tinh, alkylsilica, silicat nhôm (zeolit) hoặc silica gắn nhóm -

NH2 Quy trình hydrat hóa silica tạo hạt silica ngậm nước tích điện dương sử dụng cho ly trích DNA được đăng ký patent vào năm 1994 bởi Woodard và cộng sự [25]

Hình 1.4: Ly trích bằng silica [26]

- Ưu điểm: Là phương pháp được sử dụng phổ biến Nhiều phương pháp ly trích

ra đời trên cơ sở cải tiến từ phương pháp Boom Khắc phục được một số hạn chế của ly trích pha lỏng, hạn chế ức chế

- Nhược điểm: 4 giai đoạn thao tác ly giải, hấp thu, rửa và rửa giải dẫn đến quy trình ly trích nhiều bước, kỹ thuật viên thao tác dễ có nhầm lẫn, sai sót

1.4.3 Ly trích bằng cột lọc

Cột ly tâm chứa chất bám silica (silica resin) cho phép gắn chọn lọc DNA/ ARN/ plasmid Trong các đều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica giữ lại DNA/RNA, các thành phần không mong muống được loại bỏ bằng lực quay ly tâm

- Ưu điểm: Phần lớn các bộ kit ly trích tay thương mại hiện nay đều dùng phương pháp ly trích cột lọc Hạn chế tối đa trường hợp ức chế so với phương pháp phenol hay Boom Bộ ly trích cột không đòi hỏi đầu tư cao ở trang thiết bị, phù hợp cho số lượng mẫu ly trích nhỏ, do đó được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xét nghiệm

- Nhược điểm: Thao tác nhiều bước, sử dụng cột lọc và lực ly tâm, do đó không phù hợp cho số lượng mẫu ly trích lớn ( mẫu mô, mẫu bùn đất ) [27]

1.4.4 Phương pháp ly giải kiềm (alkaline)

Phương pháp Alkaline được mô tả lần đầu tiên bởi Birnboim và Doly năm 1979 [28] Phương pháp chuyên dùng để tách DNA plasmid từ vi khuẩn

Nguyên tắc: Sử dụng chất tẩy rửa có tính kiềm hóa như SDS – NaOH phá màng

tế bào, giải phóng DNA Trong điều kiện môi trường kiềm, DNA bị biến tính trở thành dạng sợi đơn Sau đó, kali axetat được bổ sung làm giảm độ kiềm của hỗn hợp Dưới những điều kiện này, liên kết hydro của các DNA chuỗi đơn có thể được thiết lập lại, vì vậy các DNA sợi đơn trở về dạng DNA sợi đôi DNA plasmid tròn nhỏ nhanh chóng trở về dạng vòng đôi hơn so với DNA genome kích thước lớn Trong khi các plasmid sợi đôi có thể hòa tan dễ dàng trong dung dịch, các sợi DNA đơn, SDS và các protein biến tính ở trạng thái kị nước tạo kết tủa trắng Kết tủa có

- Nhược điểm: Môi trường kiềm nếu không được trung hòa tốt, ảnh hưởng đến chất lượng DNA DNA ly trích không bảo quản được lâu [28][29]

1.5 Ly trích thô DNA bằng các chất biến tính protein

1.5.1 Ƣu thế của quy trình ly trích thô

Các quy trình ly trích DNA truyền thống cho thấy nhiều hạn chế về mặt ứng dụng như: Quy trình phức tạp dẫn đến dễ sai sót, nhầm lẫn trong quá trình ly trích của người kỹ thuật viên; Ly trích pha lỏng đòi hỏi yêu cầu cao ở tay nghề để tránh ngoại nhiễm và ức chế mẫu; Hóa chất độc hại; Hệ thống ly trích tự động khó thiết

kế, giá thành cao

Để nâng cao chất lượng quy trình xét nghiệm, yêu cầu xây dựng một quy trình

ly trích nhanh với các ưu thế:

- Thực hiện đơn giản, từ một đến hai bước thao tác giúp tránh sai sót, nhầm lẫn

trong ly trích

- Giảm vật tư tiêu hao, giảm giá thành ly trích

- Mở ra tiềm năng thiết kế hệ thống ly trích tự động chi phí thấp

1.5.2 Một số chất biến tính protein

Nhu cầu xây dựng quy trình ly trích nhanh DNA luôn tồn tại, tuy nhiên tại thời điểm trước, trình độ phát triển công nghệ sinh học chưa tạo ra tiền đề cho phép áp dụng quy trình ly trích nhanh DNA trong thực tế [2] Hiện nay dựa trên cơ sở là sự phát triển của công nghệ polymerase tái tổ hợp, ta có thể cân nhắc đến một số quy trình ly trích nhanh DNA bằng một số chất biến tính protein Có nhiều chất biến tính protein theo nhiều cơ chế khác nhau: Chất chaotropic (Phenol, chloroform), chất tẩy rửa (SDS, Triton, NaOH)

Butanol, Ethanol, Guanidinium chloride, Magnesium chloride, Phenol, Propanol, Sodiumperchlorat (NaClO4), Sodium iodide(NaI)…

- Phenol

Công thức hóa học: C6H5OH

Tính chất hóa học: Chất biến tính protein mạnh, phenol tan vô hạn ở 660C, là chất không phân cực Trong khi acid nucleic là chất phân cực, do đó không bị hòa tan trong sự hiện diện của phenol Phenol tách pha trong nước Pha hữu cơ dưới cùng có chứa các protein biến tính và các thành phần khác của tế bào Pha nước ở trên chứa acid nucleic [11]

Phenol thường được sử dụng kết hợp với chloroform Mục đích của việc thêm cloroform cùng với phenol là để đảm bảo sự tách biệt rõ ràng giữa pha nước

và pha hữu cơ

1.5.2.2 Chất tẩy rửa

Chất tẩy rửa là phân tử hóa học có cấu trúc gồm đuôi không phân cực kị nước (hydrophob) và đầu phân cực ưa nước (hydrophyl) Phân loại chất tẩy rửa dựa trên

tính chất của đầu ưa nước:

 Chất hoạt hóa ion: Đầu phân cực bị ion hóa, tích điện dương, âm, hoặc cả hai

 Chất hoạt hóa phi ion: đầu phân cực không bị ion hóa

Chất tẩy rửa tác động làm gián đoạn các liên kết ưa nước, kỵ nước trên màng sinh học do đó được sử dụng trong ly giải tế bào, bước đầu của quá trình ly trích DNA Một số chất tẩy rửa thường được sử dụng: SDS, Triton X 100 [31]

- Sodium dodecyl sulfate- SDS

Thuộc nhóm chất hoạt hóa ion có đầu phân cực tích điện âm SDS xen đuôi

kỵ nước vào cấu trúc protein = > thay đổi cấu trúc không gian của protein => bất hoạt protein

Hình 1.6: Cấu trúc hóa học SDS [32]

- Triton X100

Chất tẩy rửa phi ion có đuôi kỵ nước cứng nhắc và cồng kềnh do đó không thâm nhập và làm biến tính các protein hòa tan trong nước Triton được sử dụng trong ly trích protein và trong phạm vi đề tài chúng tôi khảo sát quy trình ly trích thô bằng triton bởi lượng triton còn thừa trong dịch ly trích không tác động đến cấu trúc enzyme DNA polymerase [33]

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học triton X100 [33]

- NaOH: Chất hóa học có tính kiềm mạnh thường được sử dụng phá màng tế bào, biến tính sợi DNA Trong phương pháp alkaline, NaOH sử dụng kết hợp với SDS trong ly trích plasmid [34]

1.6 Tế bào niêm mạc miệng- nguồn mẫu DNA ƣu thế trong xét nghiệm huyết thống

1.6.1 Đặc điểm tế bào niêm mạc miệng

Khoang miệng được giới hạn bởi môi (phía trước), má (hai bên), lưỡi (phía dưới) và vòm hầu (phía sau) Niêm mạc miệng là lớp tế bào bao phủ khoang miệng

và lưỡi, là một tế bào hoàn thiện nghĩa là tế bào niêm mạc miệng mang DNA đại diện cho cá thể Ưu điểm của tế bào niêm mạc miệng:

- Dễ bong tróc do đó dễ dàng thu nhận để làm xét nghiệm DNA

- Thao tác thu mẫu đơn giản, không xâm lấn

- Các tế bào niêm mạc miệng là những tế bào bong tróc rời rạc => dễ ly trích DNA [24]

Hình 1.8: Tế bào niêm mạc miệng dưới kính hiển vi [24]

1.6.2 Tế bào niêm mạc miệng - nguồn mẫu DNA ƣu thế cho xét nghiệm huyết

thống

Nhiều nghiên cứu khảo sát tiềm năng cung cấp DNA của niêm mạc miệng đã được thực hiện Lee Moore và cộng sự (2001) đã khảo sát các phương thức thu nhận

ứng PCR, mẫu có thể được bảo quản tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp [5] Sau thời gian bảo quản lên tới 6 tháng, lượng DNA mẫu niêm mạc miệng vẫn được bảo toàn [35] Heath và cộng sự (1992) cũng có kết luận tương tự là niêm mạc miệng cung cấp DNA phù hợp cho các xét nghiệm lâm sàng và nghiên cứu [36]

Với các ưu điểm nêu trên, niêm mạc miệng trở thành nguồn mẫu đầu vào cho không chỉ cho xét nghiệm nhận dạng cá thể STR mà nó còn được sử dụng cho nhiều xét nghiệm khác Trên thị trường hiện nay đã có một số bộ kit cho phép ly trích nhanh DNA từ mẫu niêm mạc miệng như: BodeElute™ DNA Elution Reagent kit, QuickExtract™ DNA Extraction Solution, BuccalAmp™ DNA Extraction Kits Điểm chung của các sản phẩm này là thời gian ly trích ngắn, thao tác đơn giản, hiệu quả Giá thành của các bột kit ly trích nhanh khá cao nhưng vẫn được sử dụng vì yêu cầu quan trọng nhất trong các xét nghiệm, đặc biệt trong xét nghiệm STR, là độ chính xác Thao tác càng đơn giản thì các rủi ro nhầm lẫn, sai sót trong ly trích càng thấp

1.6.3 Các nghiên cứu ly trích thô DNA

Xét nghiệm nhận diện cá thể có tính chất nhạy cảm do đó yêu cầu cao ở độ chính xác Xây dựng quy trình xét nghiệm STR đòi hỏi giảm thấp nhất các rủi ro trong quá trình ly trích Ngoài ra bộ kit xét nghiệm STR trên thị trường hiện nay đều

có khuyến cáo là enzyme DNA polymerase sử dụng trong bộ kit có tính kháng ức chế, cho phép chạy PCR trên đối tượng DNA nhiều tạp chất Qua đó thấy được đã

có đủ các tiền đề cho phép áp dụng quy trình ly trích thô DNA trên mẫu niêm mạc miệng cho xét nghiệm STR [4]

Nhiều quy trình ly trích nhanh niêm mạc miệng đã được đề xuất, tuy nhiên chúng tôi quan tâm đến quy trình ly trích nhanh có thành phần chất ly giải là NaOH

và Triton X 100 do tính chất phù hợp với yêu cầu ly trích nhanh Phenol không phù hợp cho ly trích nhanh bởi ở nhiệt độ 66oC, phenol tan trong nước vì vậy dịch ly trích DNA sẽ mang một lượng phenol gây ức chế phản ứng [11] NaOH và Triton X100 (triton có đuôi kỵ nước cồng kềnh không xen vào được cấu trúc protein) có

ưu điểm đó là lượng chất ly giải nếu còn sót lại trong dịch ly trích cũng không làm ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme polymerase [33]

- Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH

Brenda Richards đã tiến hành ly trích niêm mạc miệng bằng NaOH [36] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho tăm bông lấy mẫu niêm mạc miệng

 Vortex mạnh mẫu tăm bông trong 600μL dung dịch NaOH 50mM

Ngoài ra tác giả Amy H Walker và công sự (1999) cũng đã chứng minh DNA

từ mẫu niêm mạc miệng ly trích theo quy trình trên có thể tham gia vào phản ứng PCR với tỉ lệ thành công trên 92% [38]

- Quy trình ly trích nhanh bằng Triton X100

Trong nghiên cứu Daniel và cộng sự (1995), tác giả tiến hành ly trích nhanh bằng quy trình sử dụng Triton X 100 [37] Quy trình thực hiện như sau:

 Cho mẫu vào dung dịch biến tính protein (1% triton X100, 10mM Tris-HC1 pH8, EDTA 0.1mM)

- Quy trình ly trích nhanh bằng NaOH và SDS

Trong báo cáo của cKlintschar M và cộng sự (2000), tác giả sử dụng quy trình alkalin (NaOH và SDS) ứng dụng trong ly trích DNA sử dụng trong phản ứng PCR STR [39] Quy trình thực hiện như sau:

 Ủ 95oC/15 phút

 Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

 Ly tâm mạnh, hút dịch nổi chạy PCR

Các nghiên cứu trên cho thấy, ly trích thô DNA từ niêm mạc miệng có thể thực hiện, chất lượng DNA thu được phù hợp cho một số các phản ứng PCR

Cải tiến vượt bậc của taq polymerase với hoạt tính kháng ức chế đã mở ra hướng ứng dụng của các quy trình ly trích thô DNA trong thực tiễn Trong xét nghiệm DNA, một quy trình ly trích niêm mạc miệng đơn giản trong một đến hai bước thao tác sẽ giúp giảm thiểu tối đa các sai sót, đồng thời giúp tiết kiệm chi phí , thời gian Vì vậy, đề tài được thực hiện nhằm khảo sát lại một số quy trình ly trích thô DNA trên đối tượng niêm mạc miệng đã công bố, lựa chọn và tiến hành cải tiến quy trình để có thể ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ huyết thống

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

- Trên cơ sở hiểu biết cơ bản về chất ly giải, lựa chọn nguồn hóa chất phổ biến

(SDS, NaOH, triton X100,…), chúng tôi lựa chọn 3 quy trình ly trích thô DNA

đã được báo cáo [36][37][39] Tiến hành ly trích song song 3 quy trình này, so

sánh với quy trình ly trích đối chứng là bộ ly trích cột OMEGA trên đối tượng

mẫu là niêm mạc miệng Từ đó lựa chọn quy trình phù hợp cho xét nghiệm

DNA trên cơ sở thỏa mãn yêu cầu sau:

 Rút ngắn được thời gian ly trích, thao tác đơn giản so với bộ ly trích đối

chứng

 Sản phẩm DNA thu được phù hợp cho phản ứng PCR multiplex trên bộ kit

PowerPlex ®Fusion System

- Cải tiến quy trình được chọn

- Đánh giá hiệu quả của quy trình đã cải tiến:

 So sánh quy trình đã cải tiến với quy trình ly trích thương mại trên 10 mẫu

 Ly trích thử nghiệm trên 200 mẫu

Quy trình B: NaOH

Ly trích so sánh với bộ ly trích thương mại- 10 mẫu

Đánh giá hiệu quả của quy

2.2 Vật liệu

2.2.1 Máy móc thiết bị

- Máy ủ nhiệt Benchmark: Xuất xứ Mỹ

- Máy ly tâm

- Máy PCR ASTEC: Xuất xứ Nhật Bản

- Hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer: Xuất xứ Mỹ

2.2.2 Vật tƣ - hóa chất

- Găng tay

- Đầu cone vô trùng

- Tăm bông y tế 5mm - Bạch Tuyết: Xuất xứ Việt Nam

- Bộ kit ly trích cột E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit: Hãng sản xuất – OMEGA, xuất

xứ -Mỹ

- Bộ kit PowerPlex ®Fusion System: Hãng sản xuất Promega, xuất xứ -Mỹ

- Hi-Di™ Formamide: Hãng sản xuất ABI, xuất xứ - Mỹ

- Các hóa chất ly trích:

 Tris-HCl (pH8, 1M) – hãng Sigma Aldrich

 EDTA solution (0.5 M) – hãng Promega

 Triton X100 – hãng Sigma Aldrich

(Tris- Vortex mạnh, đặt vào máy lắc, lắc 10 phút ở tốc độ 900 vòng / phút để phóng thích các tế bào biểu mô

 Hút cạn dịch lỏng sang tube mới

 Mẫu lấy nhiều tăm bông thực hiện tương tự cho mỗi tăm bông Hút toàn bộ dịch lỏng dồn vào 1 tube lớn

 Bảo quản ở -20oC

- Số lượng mẫu thu nhận: 211 mẫu Lựa chọn đối tượng thu mẫu theo bảng 2.1

- Thời gian thu mẫu: 1 tháng

Bảng 2.1: Danh sách đối tượng thu mẫu

Nhóm Đối tƣợng thu mẫu Số lƣợng mẫu cần Số tăm bông

thu/ 1 mẫu

Hình 2.2: Mẫu niêm mạc miệng trong TE1X

2.4 Ly trích khảo sát - Lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Dựa trên 3 quy trình ly trích bằng Triton, NaOH, và NaOH kết hợp SDS của các nhóm tác giả, chúng tôi tiến hành ly trích khảo sát so sánh với bộ ly trích thương mại E.Z.N.A.®

Forensic DNA Kit (bộ ly trích cột) Từ đó xác định quy trình

Quy trình A: Ly trích bằng Triton X100 theo Daniel (1995) [37]

Công thức pha đệm ly giải:

Quy trình B: Ly trích bằng NaOH theo Brenda (1992) [36]

Công thức pha đệm ly giải:

- NaOH : 60 mM

Quy trình ly trích:

- 500μl NaOH (60mM) + 100 μl mẫu => Tạo hỗn hợp có nồng độ NaOH là 50mM

- Ủ 95oC/5 phút

- Trung hòa bằng 60 μl 1M Tris HCl pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

- Ủ ở 95oC/15 phút

- Trung hòa bằng 60 μl 1M TrisCl H pH8

- Pha loãng 5 lần trong TE1X

Bảng 2.5: Quy trình ly trích DNA từ niêm mạc miệng bằng bộ ly trích cột

E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit

Quy trình đối chứng: Ly trích bằng bộ E.Z.N.A ® Forensic DNA Kit

Tài liệu tham khảo: Hướng dẫn sử dụng cung cấp bởi nhà sản xuất

 Cho 225 μl BL buffer vào mẫu => ủ 60oC/10 phút

 Bổ sung 300 μl isopropanol => vortex

 Chuyển cột vào tube sạch

 Cho 200 μl elution buffer vào tube

 Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng

 Ly tâm 13000 RPM/1phút => thu dịch

2.4.2 Chạy PCR – phân tích kết quả

- Mix PCR STR được pha theo hướng dẫn của tài liệu Technical manual- Powerplex Fusion của Promera Bộ hóa chất sử dụng PowerPlex®Fusion System (bảng 2.6)

Bảng 2.6: Công phức pha mix PCR-STR [4]

PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix 5μl

- Điện di trên hệ thống điện di mao quản ABI 3130 Genetic Analyzer:

 Cho vào plate chạy mẫu điện di hỗn hợp: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi +

1 μl sản phẩm PCR

 Điện di kèm với một ladder: 0.5μl WEN ILS 500 + 9.5 μl Hidi + 1 μl PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix

 Biến tính mẫu ở 95oC/ 3 phút, chuyển ngay vào đá lạnh trong 3 phút

 Đặt vào máy ABI 3130 Genetic Analyzer, tiến hành điện di [4]

2.4.3 Phân tích kết quả lựa chọn quy trình ly trích phù hợp

Kết quả được phân tích trên phần mềm GeneMapper ID V3.2, so sánh với bộ đối chứng (OMEGA) ghi nhận số mẫu bị ức chế ( không có sản phẩm PCR), phần