Khảo sát hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn quế (perionyx excavatus)

HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ------ TRƯƠNG THỊ THÙY LIÊN KHẢO SÁT HOẠT ĐỘNG VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN CỦA TRÙN QUẾ PERIONYX EXCAVATUS Chuyên ngành: Công

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

- -

TRƯƠNG THỊ THÙY LIÊN

KHẢO SÁT HOẠT ĐỘNG VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE

TRONG QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN

CỦA TRÙN QUẾ (PERIONYX EXCAVATUS)

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Công trình được hoàn thành tại:

- Phòng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS HUỲNH NGỌC OANH

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Lương Thị Mỹ Ngân

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS.Phan Thị Huyền

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM, ngày tháng năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS.TS.Lê Thị Thủy Tiên

2 Phản biện 1: TS Lương Thị Mỹ Ngân

3 Phản biện 2: TS.Phan Thị Huyền

4 Ủy viên: PGS.TS.Lê Phi Nga

5 Thư ký: TS.Hoàng Mỹ Dung

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS.TS.LÊ THỊ THỦY TIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trương Thị Thùy Liên MSHV: 13310304

Ngày, tháng, năm sinh: 11/09/1986 Nơi sinh: TP Hồ chí Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 604280

I TÊN ĐỀ TÀI:

“ Khảo sát hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn quế (Perionyx excavatus)”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trùn quế trong quá trình tự phân

- Tối ưu hóa điều kiện thu nhận protease

- Khảo sát một số tính chất protease thu nhận từ trùn quế

- Bước đầu ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón cho cây trà

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 16/01/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Huỳnh Ngọc Oanh

Tp HCM, ngày tháng 08 năm 2017

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba Mẹ, người đã nuôi dưỡng, chăm sóc và dạy dỗ con nên người Cảm ơn Ba Mẹ và những người thân yêu đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện cho con học tập và luôn bên cạnh con trong suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Huỳnh Ngọc Oanh đã hết lòng hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em về chuyên môn cũng như tinh thần, người luôn tạo cho em những cảm hứng, cũng như ý tưởng để làm việc và thực hiện đề tài một cách hiệu quả nhất

Hơn thế nữa, sự thành công của đề tài không thể thiếu sự giúp sức của các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về trang thiết bị và giờ làm việc phù hợp nhất cho chúng em Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô chủ nhiệm PGS TS Nguyễn Thuý Hương Qua những kiến thức cô truyền đạt, những lời góp ý chân tình cùng tâm huyết của một người thầy đã giúp em nói riêng, tập thể lớp Cao học khoá 2013 nói chung trưởng thành hơn và có được thành công như ngày hôm nay

Trân trọng

TP Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017

ii

TÓM TẮT

Đề tài khảo sát một số tính chất và hoạt động của protease trong quá trình tự

phân của trùn quế Perionyx excavatus, thu được kết quả sau:

Tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 8.0.5.2, xác định protease từ trùn quế trong hoạt động tự phân với tỷ lệ dịch trùn là 13%, thời gian tự phân là 6 ngày cho hoạt tính cao nhất

Một số tính chất của protease trùn quế:

Dung môi acetone là tác nhân thích hợp nhất để thu protease với tỷ lệ mẫu : dung môi (v/v) là 1:2, thời gian tủa là 90 phút, hoạt tính riêng tăng 2.5 lần Nhiệt độ tối ưu hoạt động của protease từ trùn quế là 55oC, pH tối ưu hoạt động của protease từ trùn quế là 6

Phân tích hệ protease bằng sắc ký lọc gel và điện di SDS-Page: Thu được 3 loại protein và trong đó xác định có 2 loại protease dự đoán kích thước tương ứng là 35 KDa, 40 KDa

Bước đầu ứng dụng dịch trùn bón cây trà: Lá trà thu hoạch có chỉ số tăng trưởng về chiều dài lá, số lượng đọt ở mẫu lá trà bón dịch trùn tăng 12%, hàm lượng acid amin tăng (11%) Tổng acid amin của lá có bón dịch trùn cao hơn không bón 12%, acid glutamic tăng 17%, EGCG tăng 20% so với đối chứng GABA tăng 9 lần so với lá trà không bón

ABSTRACT

Activity and characteristic about protease from Perionyx excavatus decomposition:

Optimized by Design Expert 8.0.5.2 software, during self- autolysis, the highest protease activity was 6 days, the dilution ratio is 13%, 0.549 U / ml Some properties of earthworm protease:

Solvent acetone is the most suitable agent for obtaining protease with sample ratio: solvent (v / v) is 1:2, the precipitation time was 90 minutes, the activity was 2.5 times

The optimum temperature protease was 55 ° C and the optimum pH was 6 Analysis of the protease system by gel and electrophoresis chromatography: three protein, obtained two enzymes with a molecular weight of 35 KDa,

40 KDa

Using liquid Perionyx excavatus as fertilizer tea: harvested tea leaves had

growth index of leaf length, number of sprouts in tea leaf application worm increased 12%, amino acid increased (11%), EGCG 20% increase compared

to the control GABA increase 9 times

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Trương Thị Thùy Liên, học viên cao học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học, khóa 2013, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan:

Công trình nghiên cứu này do chính tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Huỳnh Ngọc Oanh

Các số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố ở các nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận án tốt nghiệp của mình

Học viên

Trương Thị Thùy Liên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

TỪ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU 1

Phần 1: Tổng quan 1.1 Trùn quế 2

1.2 Tổng quan về protease 7

1.3 Các nghiên cứu về protease của trùn quế 8

1.4 Phân bón 11

1.5 GABA (Gamma Aminobutyric Acid) 13

1.6 EGCG (Epigallocatechin–3 – gallate) 14

Phần 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu 15

2.2 Hóa chất 15

2.3 Thiết bị 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.5 Nội dung nghiên cứu 17

Phần 3: Kết quả 3.1 Khảo sát quá trình tự phân của trùn quế 22

3.1.1 Khảo sát đơn yếu tố hoạt động protease trong quá trình tự phân 22

3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện hoạt động protease trong quá trình tự phân 27

3.2 Khảo sát protease từ trùn quế 30

3.2.1 Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protease 30 3.2.2 Tối ưu hóa quá trình tách chiết protease 34

3.3 Phân tích chế phẩm protease 37

vi

3.3.1 Phân tích bằng sắc ký lọc gel 37

3.3.2 Điện di SDS-Page 38

3.4 Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH đến protease trùn quế 39

3.5 Khảo sát dịch trùn tự phân 42

3.6 Bước đầu ứng dụng dịch trùn tự phân làm phân bón 44

Phần 4: Kết luận, kiến nghị 4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 52

Tài liệu tham khảo 53

Phụ lục 57

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần acid amin trong trùn 4

Bảng 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Nồng độ của các chất ức chế bổ sung vào 20

Bảng 2.3 Quy trình bón trà 21

Bảng 2.4 Cách thức thu hoạch trà 21

Bảng 3.1 Đánh giá màu, mùi của các chất ức chế vi sinh vật 22

Bảng 3.2 Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình tự phân 28

Bảng 3.3 Kết quả hoạt tính protease theo thực nghiệm và phương trình hồi quy 30 Bảng 3.4 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa bằng ethanol 31

Bảng 3.5 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa bằng isopropanol 31

Bảng 3.6 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa bằng acetone 32

Bảng 3.7 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng protease khi kết tủa bằng acetone (1:3) ở thời gian khác nhau 34

Bảng 3.8 Ma trận và kết quả qui hoạch thực nghiệm quá trình tách chiết protease 35

Bảng 3.9 Kết quả hoạt tính protease theo thực nghiệm và phương trình hồi quy 37 Bảng 3.10 Kết quả tinh sạch enzyme qua các công đoạn kết tủa và lọc gel 38

Bảng 3.11 Hàm lượng protein và acid amin khi bổ sung PMSF và không PMSF 43 Bảng 3.12 Thành phần acid amin của dịch trùn 44

Bảng 3.13 Chỉ số tăng trưởng của lá trà thu hoạch trong 3 thực nghiệm 45

Bảng 3.14 So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mẫu lá trà bón lô 1-5 trong thực nghiệm 1 và 2,3 46

Bảng 3.15 Hàm lượng acid amin mẫu lá trà bón dịch trùn quế và bón dịch trùn quế kết hợp lân và kali ở thực nghiệm 2 sau 3 lần thu hoạch 47

Bảng 3.16 Hàm lượng EGCG trong lá trà bón dịch trùn quế ở thực nghiệm 2 48

Bảng 3.17 Thành phần acid amin lá trà bón dịch trùn quế ở thực nghiệm 2 49

Bảng 3.18 Thành phần GABA trong lá trà bón dịch trùn quế ở thực nghiệm 2 50

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Trùn quế 2

Hình 1.2 Trại nuôi trùn quế An Phú 4

Hình 1.3 Chuồng nuôi trùn quế 5

Hình 1.4 Các loại thuốc Lumbrokinase trên thị trường 10

Hình 1.5 Promin bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho heo,gà 10

Hình 1.6 Đồi chè tại Bảo Lộc 12

Hình 2.1 Trùn quế từ trại chăn nuôi An Phú ở Củ Chi 15

Hình 2.2 Trà xanh TB14 tại Lâm Đồng 15

Hình 2.3 Các loại phân bón trong thực nghiệm 15

Hình 3.1 Các mẫu dịch trùn có chất ức chế vi sinh vật 23

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế độ lắc và hàm lượng trùn lên quá trình tự phân 24

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình tự phân 25

Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hoạt tính protease 26

Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hàm lượng protein 26

Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian tự phân lên hàm lượng acid amin 27

Hình 3.7 Đường cong biểu thị mối tương quan giữa thời gian- hàm lượng trùn 28 Hình 3.8 Mô hình đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-hàm lượng trùn 29

Hình 3.9 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là ethanol 31

Hình 3.10 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là isopropanol 32

Hình 3.11 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tác nhân tủa là acetone 33

Hình 3.12 Hiệu suất thu enzyme và hoạt tính riêng khi tủa với acetone (1:3) ở thời gian khác nhau 34

Hình 3.13 Đường cong biểu thị mối tương quan giữa thời gian- tỷ lệ dịch trùn- dung môi 35

Hình 3.14 Mô hình đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-tỷ lệ dịch trùn-dung môi 36

Hình 3.15 Sắc ký đồ lọc gel của chế phẩm protease 37

Hình 3.16 Điện di đồ SDS-Page 38

Hình 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease 39

Hình 3.18 Khảo sát nhiệt độ đến độ bền protease 40

Hình 3.19 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease 41

Hình 3.20 Khảo sát pH đến độ bền protease 42

Hình 3.21 Khảo sát các chất ức chế đến hoạt tính protease 43

Hình 3.22 So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mẫu lá trà bón lô 1-5 trong thực nghiệm 1,2,3 46

Hình 3.23 So sánh hàm lượng acid amin (% chất khô) giữa các mẫu lá trà bón bón dịch trùn quế và bón dịch trùn quế kết hợp lân và kali trong thực nghiệm 2 sau 3 lần thu hoạch 48

x

TỪ VIẾT TẮT

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride

SBTI: Soybean trypsine inhibitor

TLCK: N-Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride

TPCK: N–Tosyl-L- phenylalanyl chloromethyl ketone hydrochloride

Lời m ầu

Trong nông nghiệp, trùn quế được xem là thức ăn giàu đạm cung cấp cho vật nuôi Trùn làm tăng độ phì nhiêu của đất Phân trùn góp phần làm giảm mức sử dụng phân hoá học, giúp cây trồng phát triển tốt, tăng khả năng chống sâu bệnh, giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu, nhờ đó bảo vệ môi trường

Các nguồn cung cấp trùn tươi và sản phẩm từ trùn là những cơ sở nhỏ, chi phí đầu tư thấp nên sản phẩm của cơ sở này thường không ổn định Hiện nay, các sản phẩm từ trùn quế được thủy phân bằng tác nhân hóa học, không an toàn cho môi trường và cây trồng

Từ đó chúng tôi nghiên cứu khả năng tự phân đặc biệt của trùn quế, bằng cách đánh giá hoạt động của hệ protease tự phân và tiến hành nghiên cứu “ Khảo sát

hoạt động và tính chất của protease trong quá trình tự phân của trùn quế (Perionyx

excavatus)”

Nội dung nghiên cứu gồm:

- Khảo sát hoạt động của protease trong quá trình tự phân trùn quế

- Khảo sát điều kiện thu nhận protease

- Khảo sát một số tính chất của protease

- Ứng dụng dịch trùn tự phân bón cây trà

Phần 1:

TỔNG QUAN

1.1 Trùn quế

Trùn quế có hàm lượng đạm cao, sống và ẩn náu dưới các thảm thực vật dày, dưới viên gạch, hòn đá, các miếng gỗ hoặc ngay dưới lớp phân, rãnh nước cạnh chuồng gia súc, gia cầm

• Loài: Perionyx excavatus

Trùn quế là một trong những giống trùn đã được thuần hóa, nhập nội và đưa vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ, dễ sinh sản, dễ thu hoạch

Tuyến sinh dục

(đực)

Tim Mạch máu

Miệng

Ruột Tuyến sinh dục (cái)

Mạch máu lưng

Mạch máu bụng

Chuỗi thần kinh

Ruột Thực quản

Họng

- Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên

độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khô hạn Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn quế nằm trong khoảng từ 20 – 30oC, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh

- Trùn quế rất thích sống trong môi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định, thích hợp nhất vào khoảng 7.0 – 7.5

- Trùn quế có phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia cầm…) [26]

1.1.3 Sự sinh sản và phát triển

- Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam Từ một cặp ban đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 –1.500 cá thể trong một năm

- Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con, kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng, mỗi kén có thể nở từ 2 – 10 con [26]

- Khi mới nở trùn con như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3mm, sau 5 –

7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một vằn đỏ thẫm trên lưng Khoảng từ 15 –30 ngày sau, chúng trưởng thành và bắt đầu xuất hiện đai sinh dục và chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh sản [26,27]

-

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng của trùn quế

Chất khô trong trùn phơi khô chiếm 93,7%, protein thô chiếm 59%, chất béo 7,3% ( Theo phân tích tại Trung tâm dịch vụ và Thí nghiệm của Sở Khoa Học

Công Nghệ TP Hồ Chí Minh.) [37]

Trùn tươi tỷ lệ nước chiếm chủ yếu là 80%, protein thô chiếm 12 % và chất béo chiếm 1,3%

Bảng 1.1: Thành phần acid amin trong trùn [37]

1.1.5 Quy mô nuôi trùn và ứng dụng

Hình 1.2 Trại nuôi trùn quế An Phú [39]

5

Hình 1.3 Chuồng nuôi trùn quế [39]

Trùn quế tại trang trại An Phú tại Củ Chi có các sản phẩm dịch trùn quế ở dạng lỏng bổ sung các acid amin cho tôm, cá Ngoài ra công ty còn sản xuất dịch trùn cho gà có một mùi vị rất đặc trưng kích thích sự thèm ăn, giúp gà ăn nhiều, tăng trọng nhanh, tăng sức đề kháng

Tại Võng La, Đông Anh, trùn quế được nuôi theo hộ gia đình để làm thức ăn tươi và thu hoạch phân trùn bón cây

Tại Cần Thơ, trùn được nuôi theo mô hình kinh tế sinh thái, có khả năng đáp ứng 300 - 500kg trùn quế giống sinh khối, tận dụng nguồnnhân công dồi dào, xử lý toàn bộ chất thải trong chăn nuôi, sản xuất phân bón vi sinh sạch và nhất là tận dụng được nguyên liệu sẵn có là phân của động vật ăn cỏ ở địa phương [21]

Sự hợp tác công ty ANFA và nông dân, người nuôi sẽ được tư vấn thiết kế

mô hình chuồng trại, cung cấp con giống, chuyển giao công nghệ nuôi, hỗ trợ vốn theo quy mô từng dự án và đặc biệt là thỏa ước mua lại sản phẩm với giá sàn bảo

hộ Người nuôi phải hội đủ các điều kiện về vốn để mua trùn giống, làm chuồng trại, nhân công, nguyên liệu nuôi và có nhân lực biết ứng dụng công nghệ chuyển giao [21]

Phòng thí nghiệm sinh học của trường Đại học Tây Đô (Cần Thơ) nghiên cứu thử nghiệm sử dụng dịch trùn quế trong nuôi ấu trùng tôm càng xanh năm

2010, góp phần phát triển bền vững nghề nuôi tôm ở vùng đồng bằng sông Cửu

Long Hiện nay các tỉnh phía Nam và đồng bằng sông Cửu Long tiến hành nuôi trên quy mô lớn để cung cấp sinh khối trùn cho chăn nuôi và dịch trùn để bón cây Ngoài ra các tỉnh miền Tây sử dụng nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn tươi cho tôm ở giai đoạn ấu trùng, tăng sản lượng chăn nuôi

Theo W.T.Mason (Đại học Phlorida – Mỹ): trùn tươi, là thức ăn lý tưởng để nuôi thủy sản, cho sản xuất con giống ba ba, rùa, lươn, tôm, cá Chình, đặc biệt là nuôi cá Tầm - một loại cá quý để ăn và sản xuất món trứng cá muối rất đắt tiền Nếu cho chúng ăn trùn tươi hàng ngày bằng 10 % - 15 % trọng lượng cơ thể sẽ tốt hơn bất cứ loại thức ăn nào khác, tốc độ sinh trưởng sẽ tăng 15 % đến 40 %, năng suất trứng tăng trên 10 % [27]

Ở Úc, nghiên cứu sử dụng đạm từ trùn thay thế thịt cá để nuôi tôm hùm nhỏ, kết quả không làm giảm sự tăng trưởng của tôm Còn ở Nigeria đã nghiên cứu sử dụng 25% protein trùn thay thế vào thức ăn nuôi cá hồi nhỏ Ngày nay, nhiều nghiên cứu về thức ăn cho trùn như bổ sung protein, acid béo nhằm thu được hiệu suất sinh khối và phân trùn có hàm lượng dinh dưỡng cao là một trong những nghiên cứu trong dự án lớn của Chính phủ Úc [22]

Phân trùn dễ hòa tan trong nước, chứa hơn 50 % chất mùn; kích thích tăng trưởng cây trồng, mà còn tăng khả năng cải tạo đất Phân trùn còn chứa các khoáng chất được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp, không như những loại phân hữu

cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây hấp thụ

Hiện tại phân trùn quế thường được sử dụng cho mục đích như: kích thích sự nẩy mầm và phát triển của cây trồng, điều hòa dinh dưỡng và cải tạo đất, làm cho đất luôn màu mỡ và tơi xốp; dùng làm phân bón lót cho cây và rau quả, tạo ra sản phẩm có chất lượng và năng suất cao Vì vậy, phân trùn là loại phân sạch thiên nhiên quí giá để bón cho hoa, cây cảnh, rau quả trong nông nghiệp sạch, được thị trường rất ưa chuộng [27]

7

1.2 Tổng quan về protease

1.2.1 Giới thiệu chung

Enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein thành các acid amin tự

do hoặc các peptide phân tử thấp Quá trình tự phân của trùn quế thực chất là quá trình thủy phân protein trùn quế dưới tác động của hệ enzyme protease nội sinh

Protease là nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng Nguồn thu nhận protease vô cùng phong phú như thực vật, động vật và vi sinh vật [8]

1.2.2 Phân loại protease

Có một số cách phân loại như sau:

1.2.2.1 Protease được phân thành hai loại theo vị trí cắt:

- Endopeptidase và exopeptidase

Theo vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase chia thành hai loại:

- Aminopeptidase

- Carcboxypeptidase

Theo động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase chia thành bốn loại:

(a) Serin protease: chứa nhóm –OH của gốc serin trung tâm hoạt động Là nhóm

peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật

(b) Cysteine protease: chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động Nhóm này bao gồm

các protease từ thực vật; một vài enzyme từ động vật và ký sinh trùng Các enzyme này thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

(c) Metallo protease: được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc, thường hoạt động ở

pH trung tính và hoạt động giảm mạnh khi có sự hiện diện của EDTA, có ion kim loại ở tâm hoạt động

(d) Aspartic protease: thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như

pepsin, chymotrypsin, renin [2]

1.2.2.2 Protease được phân loại theo pH hoạt động

- Protease acid tính: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, ít ở vi khuẩn

- Protease trung tính: pH 7-8 có ở tế bào động vật và thực vật, vi khuẩn

Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào điện tích phân bổ của enzyme lên cơ chất,

có thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở những môi trường có pH xác định, gọi là pH tối ưu pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzyme vào khoảng 7 pH quá cao hay quá thấp có thể làm enzyme bị biến tính [14]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu enzyme khoảng 40 - 50°C Nhiệt độ trên 70oC thì các phân tử enzyme bị mất hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của mỗi enzyme không cố định mà thay đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng [14]

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất

Trong trường hợp cơ chất đầy đủ, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng Nếu tăng nồng độ enzyme cao quá sẽ không có hiệu quả kinh tế, ngược lại nếu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme Vì vậy cần nghiên cứu nồng độ enzyme phù hợp với lượng cơ chất nhất định Trong quá trình

tự phân, sản phẩm sinh ra cũng có thể ức chế hoạt động của enzyme, làm cho phản ứng xảy ra chậm và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm [14]

1.3 Một số nghiên cứu về protease của trùn quế

Protease của trùn quế đa số thuộc nhóm serine protease, là những protease có

nhóm hydroxyl (–OH) của serin trong trung tâm hoạt động Nhóm -OH của serine tác động lên nhóm –CO của liên kết peptide tạo hợp chất trung gian acyl-enzyme Các enzyme thuộc nhóm này thông dụng nhất là trypsin và chymotrypsin

9

Trong các nhóm protease ứng dụng rộng rãi nhiều nhất là nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng khoảng pH khá rộng từ trung tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng nhóm enzyme này so với các nhóm protease khác

Phan Thị Bích Trâm và cộng sự tiến hành đề tài “ Tinh sạch và khảo sát các đặc tính của serin protease từ Trùn Quế (2007)” và bước đầu tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ 30-80% [19]

Theo nghiên cứu tại đại học Huế (2012) về tạo dòng và phân tích trình tự serin protease của trùn quế, đoạn cDNA có kích thước 726 bp được tạo dòng với vector pCR®2.1 Trình tự nucleotide của cDNA được so sánh với trình tự của gen

lumbrokinase của các loài giun đất Eisenia fetida, Lumbricus bimastus và

Lumbricus rubellus có độ tương đồng lần lượt là 52,02%; 50,06% và 48,03% [4]

Qua nghiên cứu trên 9 loài trùn, Nguyễn Thị Ngọc Dao chú ý đến

loài Peryonix escavatus - tên khoa học của trùn quế, chứa protease hoạt độ cao hơn

các loài khác Protease trong trùn quế có khả năng thủy phân mạnh mẽ, làm đứt các sợi fibrin - một loại protein trong máu vốn có tác dụng làm đông máu, giúp liền vết thương, nhưng đồng thời nó cũng là nguyên nhân gây nên xơ vữa thành mạch của bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ máu, gây tắc mạch máu [4]

Hiện nay protease dùng trong điều trị bệnh tim mạch, rất đa dạng và có nguồn gốc khác nhau: từ động vật, thực vật và vi sinh vật, thường thuộc nhóm serine protease có khả năng thủy phân fibrin, fibrinogen

Lumbrokinase làm từ trùn đất sẽ giúp ngăn ngừa tai biến mạch máu não, xơ vữa động mạch và mỡ máu ở người cao tuổi Thành phần protein trong chiết suất của giun, có tác dụng giãn nở khí quản, trị bệnh hen xuyễn ]17]

Trong các tác dụng chữa bệnh của giun thì tác dụng cấp cứu những trường hợp đột quỵ do tai biến mạch máu não là được quan tâm nhiều nhất Từ năm 1911 các nhà khoa học Nhật Bản đã tìm thấy trong trùn đất có hoạt chất Lumbritin có tác dụng phá huyết ứ, làm tan nhanh các cục máu đông gây nghẽn mạch không có tác dụng phụ về xuất huyết, dễ sử dụng, giá rẻ [29,30]

Hình 1.4 Các loại thuốc Lumbrokinase trên thị trường Nguyễn Thị Ngọc Dao cùng các cộng sự thuộc Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã bước đầu nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm viên nang Lumbrokinase từ trùn đất, có tác dụng làm tan cục máu đông làm nghẽn động mạch, những vết thương bị tụ máu Việc điều trị cho các bệnh nhân bị tai biến mạch mãu não do viêm tắc và xơ vữa động mạch đã cho kết quả tốt

Ứng dụng trong nông nghiệp

Protease trùn quế bổ sung trực tiếp vào thức

ăn cho vật nuôi nhằm tăng khả năng tiêu hóa, xử

lý sơ bộ thức ăn trước khi sử dụng

Hiện nay, các chế phẩm vi sinh chứa hỗn hợp protease trùn và các enzyme thủy phân khác, được sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy sản làm tăng hệ số tiêu hóa, làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước nuôi

Nghiên cứu mới nhất về trùn quế vào đầu năm 2016, “ Nghiên cứu bổ sung

protease từ Bacillus subtilis vào quá trình tự phân của trùn quế để nâng cao hiệu quả

thu nhận đạm hòa tan” của trường đại học Thủ Dầu Một giúp tăng cường lượng đạm, acid amin cung cấp cho chăn nuôi, thủy sản, tạo chế phẩm dịch trùn có chất lượng cao, giảm thời gian tự phân, dịch trùn thu được không có mùi hôi [6]

Hình 1.5 Promin bổ sung trực tiếp vào thức ăn cho heo, gà [38]

11

Từ các ứng dụng của hệ protease trùn quế ở trên cho thấy việc nghiên cứu ứng dụng hệ protease vào lĩnh vực nông nghiệp, tạo chế phẩm trùn một cách chủ động làm tăng giá trị thương phẩm khi đưa vào sản xuất

1.4 Phân bón

Định nghĩa: Phân bón là thức ăn của cây trồng, thiếu phân cây không thể

sinh trưởng và cho năng suất, phẩm chất cao Phân bón có vai trò rất quan trọng trong việc thâm canh tăng năng suất, bảo vệ cây trồng và nâng cao độ phì nhiêu của đất [20]

Phân bón hóa học (phân vô cơ)

Loại phân này chứa các yếu tố dinh dưỡng dưới dạng muối khoáng giúp cây khỏe và tăng năng suất Các loại phân bón hóa học phổ biến là phân đạm, phân lân, phân kali, phân NPK, phân SA… Phân bón hữu cơ cũng cung cấp cho cây các khoáng chất tương tự tuy nhiên phân bón hóa học có tính đậm đặc hơn nên có tác dụng rõ rệt và nhanh chóng hơn [20]

Phân bón hữu cơ

Phân xanh là nguồn dinh dưỡng tự nhiên nhất mà chúng ta có thể cung cấp cho cây Do được làm từ xác cây cỏ chết, rơm rạ… phân xanh chứa những loại chất

cơ bản nhất cho cây với liều lượng vừa đủ

Phân bón hữu cơ truyền thống còn có phân chuồng (phân, nước tiểu của vật nuôi), chiết xuất từ rong biển, phế phẩm trong nông nghiệp… Bên cạnh đó còn có các loại phân hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, phân hữu cơ khoáng… được sản xuất thông qua quy trình công nghiệp

Trùn còn chứa các khoáng chất được cây trồng hấp thụ một cách trực tiếp, không như những loại phân hữu cơ khác phải được phân hủy trong đất trước khi cây hấp thụ, dễ hòa tan trong nước [20]

Hàm lượng N-P-K, Ca và các chất khoáng vi lượng trong trùn, cao hơn so với các loại phân động vật khác đồng thời phân trùn không có mùi hôi thối như các loại phân gia súc, gia cầm, lại có thể lưu giữ lâu ngày trong túi nilon mà không bị mốc, rất thuận lợi cho việc bảo quản và vận chuyển

Dịch trùn có thể kích thích sự nảy mầm, phát triển cây trồng, ngăn ngừa các bệnh về rễ, giúp chống sự xói mòn và tăng khả năng giữ nước trong đất Cây trồng

khi bón phân giun sẽ khống chế được các kim loại nặng xâm nhập cây gây đột biến làm phát sinh tế bào lạ có hại, gây hoại tử rễ Chất mùn trong dịch trùn loại trừ được những độc tố, nấm và vi khuẩn có hại trong đất, có thể ngăn ngừa các bệnh về

rễ và đẩy lùi nhiều bệnh của cây trồng [20]

 Giống chè thực hiện – Trà xanh TB14

Hình 1.6 Đồi chè tại Bảo Lộc

Ngày 16/10/2012, Hội đồng Khoa học công nghệ cấp Quốc gia của Bộ PTNT đã nhóm họp tại Đà Lạt để đánh giá và công nhận đặc cách giống chè TB14

NN-do Phạm S - Phó Chủ tịch UBND tỉnh, nguyên Phó Giám đốc Sở NN-PTNT chủ trì cùng với cộng sự là tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao kỹ thuật cây công nghiệp - cây ăn quả Lâm Đồng (Sở NN-PTNT) nghiên cứu, chọn tạo và khảo nghiệm trong thời gian 20 năm qua tại các địa bàn trọng điểm canh tác chè của tỉnh Lâm Đồng và khu vực Tây Nguyên [36]

TB14 là một trong ít giống chè có thể dùng làm nguyên liệu sản xuất chè đen, chè xanh và chè hương thương phẩm - trong đó chè đen là một loại nông sản hiện có thị trường tiêu thụ lớn trên thế giới Tiến sỹ Phạm S cho biết, sau thời gian chọn tạo và nhân rộng, trên địa bàn tỉnh trong diện tích 23.529 ha chè đang canh tác chủ yếu tại Bảo Lộc, Bảo Lâm, Di Linh và Lâm Hà (ngành chè của Lâm Đồng hiện chiếm khoảng 17% về diện tích và 22% về sản lượng chè búp tươi - đứng đầu cả nước) [10,36]

13

Giống chè TB 14 đã cho năng suất bình quân khoảng 18- 20 tấn/ha/năm, có hàm lượng chất đạm và chất hòa tan cao, hàm lượng cafein thấp, hàm lượng tamin ở mức trung bình, khả năng nhân giống bằng biện pháp giâm cành có tỷ lệ sống 96,2%, khả năng chống chịu sâu bệnh khá, có thể thu hoạch búp dễ dàng bằng máy, doanh thu hàng năm đạt trên 140 triệu đồng/ha

Giống chè này đã được Hội đồng KH-CN cấp quốc gia của Bộ NN-PTNT công nhận đặc cách và đặt tên là giống chè TB14 để đưa vào “Danh mục giống cây trồng được phép sản xuất kinh doanh tại Việt Nam” Lê Văn Đức, Ủy viên Hội đồng còn cho biết thêm là hiện đang có nhiều doanh nghiệp chế biến chè trên thế giới tới Việt Nam đặt hàng mua chè búp tươi giống TB14 với khối lượng “không hạn chế” để chế biến chè đen cao cấp, và đây là thông tin vui đối với vùng chè nguyên liệu tỉnh Lâm Đồng [36]

1.5 GABA (Gamma Aminobutyric Acid)

Được sản sinh ra từ các acid amin – acid glutamic trong não bộ GABA có nhiều trong cà chua chín, thịt lợn, gạo lức, lúa mì, ngũ cốc còn nguyên hạt, trứng

gà tươi ( lòng đỏ), cá ngừ, cá hồi, tôm hùm, mực [33]

Vai trò của GABA:

- GABA có tác dụng không thể thiếu đối với cơ thể để đảm bảo duy trì sự hoạt động bình thường của não bộ đặc biệt là các neuron thần kinh

- Duy trì hoạt động của não có vai trò chính trong việc ức chế sự lan truyền của các tế bào dẫn truyền, giảm hoạt động của các tế bào thần kinh căng thẳng đến trung khu thần kinh

- Cân bằng huyết áp, giảm cholesterol

- Giảm stress, căng thẳng

- Tăng cường chức năng thận, an thần, giảm stress và chứng mất ngủ

- Đau mãn tính [33]

1.6 EGCG (Epigallocatechin–3 – gallate)

Là một trong bốn loại polyphenol được tìm thấy nhiều trong trà xanh, bao gồm epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin –3 – gallate (ECG) và epigallocatechin–3 – gallate (EGCG)

EGCG là este của epigallocatechin và axit gallic, là hoạt chất chống ôxy hóa

có nhiều trong trà xanh nhưng không có trong trà đen vì khi lên men EGCG chuyển thành thearubigin [40]

Chức năng:

− Chất chống oxi hóa, khử các gốc tự do, kháng viêm, kháng khuẩn, chống

dị ứng và chống lão hóa cho con người

− Ngăn ngừa bệnh ung thư

− Ngăn ngừa nguy cơ bệnh tiểu đường

− Giúp xương chắc khỏe, giảm các chứng viêm khớp

− Giảm thiểu tăng huyết áp

− Giúp cải thiện trí nhớ và bệnh Alzheimer [40]

Phần 2:

NGUYÊN VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Ngu ên liệu

Hình 2.1 Trùn quế từ trại chăn nuôi An Phú ở Củ Chi

Hình 2.2 Trà xanh TB14 tại Lâm Đồng

Phân bón N-P-K loại 20-20-15 của

Đất Mỹ

Phân đạm Phú Mỹ

Phân lân Con Rồng Xanh

Phân Kali Phú Mỹ

Hình 2.3 Các loại phân bón trong thực nghiệm

2.2 Hóa chất

- Sodium potassium tartrate

- Potassium iodide

16

- Na2HPO4.12H2O, KH2PO4

- Casein, TCA, citrat acid

- NaOH, HCl

- Acetone, ethanol, isopropanol

- Gel Biorad, acrylamide SDS, APS

2.3 Thiết bị

- Máy đo quang phổ UV – Vis (CT – 2200)

- Máy khuấy từ (Stuart SB 162 – 3)

- Máy ly tâm (Rotofix 32A)

- Máy đo pH (Hanna HI 8424)

- Hệ thống sắc ký cột hãng Biorad

- Máy HPLC:

Đầu dò DAD

Cột pha đảo ZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hiệu suất thu enzyme (%) =

Hoạt tính riêng (U/mg protein)=

d) Xác ịnh hàm lượng acid amin bằng phương pháp Ninh drin [5]

(phụ lục 4.a)

e) Xác ịnh thành phần acid amin bằng phương pháp CASE.SK

Nơi thực hiện: Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.HCM

Hoạt tính protease (chế phẩm) Hoạt tính protease (ban đầu)

*100%

Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính protease (U/ml)

f) Xác ịnh hàm lượng EGCG bằng phương pháp HPLC

(phụ lục 4.a)

Nơi thực hiện: Phòng thí nghiệm Trọng điểm Khoa Kỹ thuật Hoá học

g) Phương pháp lọc gel

Cột lọc gel đường kính 2cm, chiều cao 25cm (Bio Rad, Mỹ)

Gel sử dụng: Bio Gel P-30

h) Phương pháp iện di

Thực hiện bằng hệ thống điện di OSP-300

i) Thực hiện tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 8.0.5.2

j) Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel, SPSS 16.0 ( xem phụ lục B) 2.5 Nội dung nghiên cứu

Bảng 2.1 Tóm tắt nội dung nghiên cứu

STT Nội dung nghiên cứu Các yếu tố khảo sát

TN1 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng

đến hoạt động của protease trong

quá trình tự phân

- Chất ức chế vi sinh vật gây thối

- Đơn yếu tố

- Tối ưu hóa

TN2 Khảo sát các điều kiện tách chiết

protease

- Đơn yếu tố

- Tối ưu hóa

TN3 Phân tích protease trùn quế - Lọc gel

+ Khảo sát các chất ức chế vi sinh vật gây thối:

Để thực hiện quá trình tự phân kéo dài không bị ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong trùn; chúng tôi khảo sát các chất ức chế vi sinh vật tránh hiện tượng thối rữa như:

- NaN3 (0,02%), HCl 1N(2%), acid lactic (2%), Kali sorbate (2%)

+ Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

- Trùn quế được xay mịn, xác định hàm lượng chất khô

- Dịch trùn tự phân bằng nước cất (hàm lượng trùn từ 7% - 15%), 24 giờ

- Khảo sát nhiệt độ tự phân (từ 30oC – 55oC)

- Khảo sát thời gian tự phân (từ ngày 1- 12)

+ Khảo sát tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease

Hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:

+ Nhiệt độ tự phân theo khảo sát đơn yếu tố

+ Tốc độ lắc 60 vòng/phút

Thí nghiệm 2: Khảo sát các điều kiện tách chiết protease

Thông số đánh giá: Hoạt tính protease (U/ml) và hoạt tính riêng (U/mg)

+ Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết của protease

- Khảo sát dung môi: acetone, ethanol, isopropanol

- Khảo sát tỷ lệ giữa dịch trùn và dung môi (1:1 – 1:5)

- Khảo sát thời gian thu tủa (từ 30-150 phút)

+ Khảo sát tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết của protease

( xem phụ lục 3b)

- Hai yếu tố tỷ lệ dịch trùn và aceton, thời gian được chọn để thực hiện qui hoạch thực nghiệm

- Áp dụng phần mềm tối ưu hoá Design Expert 8.0.5.2

- Hai yếu tố không thay đổi trong quá trình khảo sát là:

+ Nhiệt độ tủa: 4oC

+ Tác nhân tủa: dung môi tối ưu

Thí nghiệm 3: Phân tích protease trùn quế

+ Mẫu tủa của dung môi tối ưu, làm tan trong đệm Sorensen, ly tâm 12000

Thí nghiệm 4: Khảo sát tính chất protease trùn quế

Thông số đánh giá là hoạt tính tương đối (%): hoạt tính protease so với hoạt tính protease cao nhất trong dãy thông số khảo sát

+ ác định nhiệt độ tối ưu

Khảo sát ở các nhiệt độ 37, 45, 50, 60, 80oC trong 10 phút

20

inhibitor) Xác định chất ức chế bằng cách ủ chất ức chế với protease, ở 25oC trong

15 phút, sau đó xác định hoạt tính protease còn lại

Bảng 2.2 Nồng độ của các chất ức chế bổ sung vào

− Khảo sát thời gian bảo quản dịch trùn tự phân

− Sau khi khảo sát hoạt động protease tối ưu và các chất ức chế vi sinh vật cho quá trình tự phân trùn, chúng tôi thu nhận dịch trùn tự phân và bước đầu dùng bón cho cây trà

Địa điểm: vườn trà của ông Trần Văn Tuấn, số 59 Châu Văn Liêm, Bảo

Bảng 2.3 Quy trình bón trà

STT Hình thức

bón

Thực nghiệm 1 (bón 1 lần trong

15 ngày)

Thực nghiệm 2 (bón 2 lần trong 15 ngày)

Thực nghiệm 3 (bón 3 lần trong 15 ngày)

Thu hoạch lá trà sau 30 ngày bón

Thu hoạch lá trà sau 45 ngày bón Thực nghiệm

2: Bón 2 lần

trong 15 ngày

Thu hoạch lá trà sau 15 ngày bón

Thu hoạch lá trà sau 30 ngày bón

Thu hoạch lá trà sau 45 ngày bón Thực nghiệm

3: Bón 3 lần

trong 15 ngày

Thu hoạch lá trà sau 15 ngày bón

Thu hoạch lá trà sau 30 ngày bón

Thu hoạch lá trà sau 45 ngày bón

− Lá trà sau khi thu hoạch xác định một số chỉ tiêu nhƣ sau:

+ Hàm lƣợng acid amin, các loại acid amin

+ EGCG

− Các kết quả đƣợc xử lý số liệu và thống kê bằng phần mềm Excel, SPSS 16.0 Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

PHẦN 3:

KẾT QUẢ

3.1 Khảo sát quá trình tự phân của trùn quế

3.1.1 Khảo sát ơn ếu tố hoạt ộng protease trong quá trình tự phân

3.1.1.1 Khảo sát các chất ức chế vi sinh vật gây thối

Chúng tôi thực hiện thực nghiệm trên các chất ức chế vi sinh vật của dịch trùn nhƣ NaN3, HCl, acid lactic, Kali sorbate Kết quả đánh giá cảm quan thu đƣợc dịch trùn tự phân suốt thời gian đến 12 ngày, nhận thấy khi sử dụng NaN3 dịch trùn không mùi thối NaN3 là một chất ức chế vi khuẩn và còn đƣợc dùng trong nông nghiệp để trừ dịch hại

Bảng 3.1 Đánh giá màu, mùi của các chất ức chế vi sinh vật

Nâu sậm

Tanh nhẹ, không thối

Nâu nhạt Tanh nhẹ, không thối

Nâu sậm

Tanh nhẹ, không thối

Tanh nhẹ, không thối

Thối, sủi bọt

Nâu nhạt Thối, sủi bọt

Thối

Tanh nhẹ, không thối

Nâu Thối, sủi bọt

Nâu nhạt Thối, sủi bọt

Thối, sủi bọt

23

Dịch trùn thủy phân chứa NaN3 Dịch trùn thủy phân chứa HCl

Dịch trùn thủy phân chứa

acid lactid

Dịch trùn thủy phân chứa Kali sorbate

Dịch trùn thủy phân không bổ sung chất ức chế Hình 3.1 Các mẫu dịch trùn có chất ức chế vi sinh vật

3.1.1.2 Khảo sát hàm lượng trùn (% hàm lượng chất khô) trong quá trình tự phân

Khảo sát quá trình tự phân theo hàm lượng dịch trùn từ 7% đến 15%, dung môi là nước cất, đồng thời cũng khảo sát qua hai chế độ ủ có và không có lắc, thời gian tự phân trong vòng 24 giờ ảnh hưởng đến hoạt động protease Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.2 sau:

Acid lactid

NaN 3

Các giá trị có chữ cái khác nhau cho thấy sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy 95 % (Duncan)

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế độ lắc và hàm lượng trùn trong quá trình tự phân

Nhận xét: việc lắc trong quá trình tự phân làm protease hoạt động cao hơn trong quá trình tự phân tĩnh Kết quả thu được phù hợp với khảo sát của Trần Ngọc Hùng ở Đại học Thủ Dầu Một (2016) [6] Tuy nhiên protease hoạt động chế độ ủ

có lắc ở quy mô phòng thí nghiệm chênh lệch 10% so với chế độ ủ không lắc, theo yêu cầu của nhà sản xuất tiết kiệm năng lượng và thiết bị, nên chúng tôi thực hiện các nghiệm thức trong quá trình tự phân ở chế độ ủ không lắc

Hoạt tính protease gia tăng khi hàm lượng trùn tăng đến 13%, đạt mức giá trị cao nhất của hệ protease hoạt động, sau đó hoạt tính giảm ở 15% Kết quá đạt được ở giá trị 13% phù hợp với kết quả nghiên cứu và khảo sát trùn quế của Phan Thị Bích Trâm (2006) [19] Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt rõ ràng giữa các nghiệm thức hàm lượng trùn, do đó chúng tôi sẽ sử dụng hàm lượng trùn là 13% để thực hiện nghiên cứu tiếp theo của quá trình tự phân trùn quế (Xem kết quả phụ lục 5.b)