Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời chlamydia trachomatis và neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real time pcr

Phản ứng multiplex real-time PCR được xây dựng có giới hạn phát hiện LOD50 là 4 bản sao/phản ứng, với độ đặc hiệu c o cho CT và NG.. Chính vì vậy các phư ng pháp nhân bản gene PCR, Real-

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

-

ĐỖ TRUNG HẬU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI

Chlamydia trachomatis VÀ Neisseria gonorrhoeae BẰNG

PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CH MINH, TH NG 06 NĂM 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG Tp HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dư ng

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Trần Trung Hiếu

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Hoàng Anh Hoàng

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 28 tháng 07 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS Nguy n Đức Lượng

2 Thư k hội đồng: TS Hu nh Ngọc O nh

3 Ủy viên Phản biện 1: TS Trần Trung Hiếu

4 Ủy viên Phản biện 2: TS Hoàng Anh Hoàng

5 Ủy viên Hội đồng: PGS.TS Ph n Ngọc H

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản l chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA K THUẬT H A HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Đỗ Trung Hậu MSHV: 1570255

Ngày, tháng, năm sinh: 01/10/1985 N i sinh: TP HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis

và Neisseria gonorrhoeae bằng phư ng pháp multiplex re l-time PCR

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria

gonorrhoeae (NG) bằng phư ng pháp multiplex re l-time PCR với các nội dung

chính s u:

1 Thiết lập quy trình multiplex re l-time PCR phát hiện CT và NG

2 Xác định các thông số kỹ thuật củ phản ứng multiplex re l-time PCR

3 Đánh giá hiệu quả củ quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dư ng

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA K THUẬT H A HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm n chân thành đến:

B n Giám hiệu trường Đại học Bách Kho , B n chủ nhiệm Kho Kỹ Thuật Hó Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học c ng tất cả qu thầy cô đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức qu báu cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

B n Giám Đốc Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Kho Thư ng đã tạo điều kiện cho tôi làm việc và thực hiện đề tài tại công ty

PGS.TS Hồ Hu nh Th y Dư ng, Bộ môn Di truyền – Đại học Kho Học Tự Nhiên TP HCM, người hướng dẫn kho học cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

ThS Nguy n Thị Minh Tâm, các em ph ng nghiên cứu, ph ng Kiểm định Chất lượng c ng toàn thể các đồng nghiệp làm việc tại công ty TNHH CNSH Khoa Thư ng đã hỗ trợ và đồng hành c ng tôi trong suốt thời gi n qua

Những người thân yêu củ tôi: B m , Bà xã, con tr i và các nh chị em tôi mến thư ng nhất Cảm n Bà xã và con tr i đã tạo động lực cho tôi hoàn thành luận văn này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

T M TẮT

Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là h i tác nhân

vi khuẩn gây bệnh lây truyền qu đường tình dục phổ biến trên thế giới và thường

đi kèm với nhau Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ, phát hiện nh nh và chính xác CT

và NG trong bệnh phẩm, chúng tôi xây dựng quy trình multiplex re l-time PCR phát hiện đồng thời h i tác nhân gây bệnh này Phản ứng multiplex real-time PCR được xây dựng có giới hạn phát hiện LOD50 là 4 bản sao/phản ứng, với độ đặc hiệu

c o cho CT và NG Quy trình có độ lặp lại tốt với hệ số biến thiên nội phản ứng nhỏ

h n 1% và hệ số biến thiên liên phản ứng nhỏ h n 2%

Chúng tôi thực hiện trên 100 mẫu dịch phết tế bào, kết quả cho thấy có 20% trường hợp nhi m CT, 15% trường hợp nhi m NG và 8% trường hợp đồng nhi m CT/NG Đồng thời quy trình củ chúng tôi có kết quả đúng với kết quả giải trình tự Nghiên cứu này là tiền đề cho sự phát triển kit phát hiện đồng thời CT và NG

ABSTRACT

Chlamydia trachomatis (CT) and Neisseria gonorrhoeae (NG) are the most

common pathogens which cause sexually transmitted diseases in the world In order

to create a toolkit used for a rapid and accurate detection of CT and NG in clinical samples, we developed a multiplex real-time PCR test that can simultaneously detect both pathogens The limit of detection (LOD50) of the real-time PCR was 4 copies per reaction The protocol had good repeatability, with intra-assay and inter-assay coefficients of variability inferior to 1% and 2%, respectively

We tested 100 clinical samples for CT and NG The infection rates were 20 % for NG and 15% for CT, co-infection of CT/NG accounted for 8% in total Our results were confirmed by Sanger sequencing The study constituted the base for further development of diagnostic kit simultaneously detecting CT and NG in clinical samples

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin c m đo n đây là công trình nghiên cứu củ riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, nếu có gì s i sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 06 năm 2017

Đỗ Trung Hậu

MỤC LỤC

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC C C BẢNG viii

DANH MỤC C C HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng qu n về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) 3

1.1.1 Giới thiệu về CT 3

1.1.2 Giới thiệu về NG 7

1.2 Một số phư ng pháp phát hiện CT và NG 11

1.2.1 Phư ng pháp nuôi cấy truyền thống 11

1.2.2 Phư ng pháp kháng thể hu nh quang trực tiếp 12

1.2.3 Phư ng pháp mi n dịch liên kết enzyme 12

1.2.4 Phư ng pháp PCR và multiplex PCR 13

1.2.5 Phư ng pháp re l-time PCR và multiplex re l-time PCR 13

1.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam 16

1.3.1 Trên thế giới 16

1.3.2 Tại Việt Nam 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PH P NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đị điểm và thời gi n nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu 19

2.2.1 Mẫu thực nghiệm 19

2.2.2 Mồi, mẫu d và mplicon 19

2.2.3 Hó chất 19

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ 20

2.3 S đồ nghiên cứu tổng quát 20

2.4.1 Thiết lập quy trình multiplex re l-time PCR phát hiện CT và NG 22

2.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR 25

2.4.3 Đánh giá hiệu quả củ quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng 26

2.5 Phư ng pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Phư ng pháp kiểm tra mồi và mẫu d 27

2.5.2 Thu mẫu lâm sàng 27

2.5.3 Phư ng pháp tách chiết DNA 27

2.5.4 Phư ng pháp multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG 31

2.5.5 Xử l số liệu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN 34

3.1 Kết quả thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG 34

3.1.1 Kết quả thiết lập phản ứng real-time PCR 34

3.1.2 Kết quả tối ưu hó các phản ứng monoplex real-time PCR 36

3.1.3 Kết quả đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hó phản ứng multilex real-time PCR 45

3.1.4 Kết quả so sánh các phư ng pháp tách chiết DNA 47

3.2 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR49 3.2.1 Độ nhạy phân tích 49

3.2.2 Độ đặc hiệu phân tích 51

3.2.3 Độ lặp lại 53

3.3 Kết quả đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC a

NG: Neisseria gonorrhoeae

Taq: Thermus aquaticus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ nam nhi m NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân 7

Bảng 1.2 Các chất phát và hấp thu hu nh qu ng thường sử dụng 16

Bảng 2.1 D nh sách hó chất sử dụng 20

Bảng 2.2 D nh sách thiết bị và dụng cụ 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng monoplex real-time PCR CT, NG và IC 22

Bảng 2.4 Thành phần hó chất và phân bố trong đĩ /tube tách chiết TANBead DNA Auto Kit 30

Bảng 2.5 Di n giải phân tích kết quả multiplex real-time PCR 33

Bảng 3.1 Đặc tính củ các cặp mồi và mẫu d 34

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá hoạt động của mồi và mẫu d CT, NG và IC 35

Bảng 3.3 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nhiệt độ l i khác nh u 37

Bảng 3.4 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ MgCl2 38

Bảng 3.5 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mồi 39

Bảng 3.6 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ mẫu d 40

Bảng 3.7 Giá trị Ct của phản ứng CT, NG và IC ở các nồng độ enzyme Taq DNA polymerase 42

Bảng 3.8 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT, NG, IC 43

Bảng 3.9 Thành phần phản ứng multiplex real-time PCR 45

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR 46

Bảng 3.11 Bảng kết quả so sánh 3 phư ng pháp tách chiết DNA 48

Bảng 3.12 Bảng thống kê hệ số tư ng qu n r giữ 3 phư ng pháp tách chiết DNA 49

Bảng 3.13 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện CT (HEX) 50

Bảng 3.14 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện NG (FAM) 50

Bảng 3.15 Độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex phát hiện IC (CY5) 50

Bảng 3.16 Kết quả độ đặc hiệu phân tích của phản ứng multiplex real-time PCR 52 Bảng 3.17 Kết quả phát hiện CT và NG bằng phư ng pháp multiplex re l-time PCR trên 100 mẫu lâm sàng 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT 5

Hình 1.2 Tế bào bị nhi m vi khuẩn CT 5

Hình 1.3 Cấu trúc pl smid LGV440 củ CT 6

Hình 1.4 Chu k v ng đời của vi khuẩn CT 6

Hình 1.5 Viêm kết mạc ở mắt và trẻ m mắt do NG 9

Hình 1.6 Vi khuẩn NG 10

Hình 1.7 Cấu trúc bề mặt của NG 11

Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR 14

Hình 1.9 Nguyên l hoạt động củ mẫu d T qM n® 15

Hình 2.1 Máy re l-time PCR CFX96, Str t gene Mx3005P và Ari Mx 20

Hình 2.2 S đồ nghiên cứu tổng quát 21

Hình 2.3 Máy tách chiết bán tự động Smart LabAssist 30

Hình 2.4 Bố trí đĩ tách chiết (trái) và kh y tách chiết dạng tube (phải) 31

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra hoạt động của mồi và mẫu d CT, NG và IC 35

Hình 3.2 Kết quả khảo sát nồng độ mẫu d củ phản ứng CT, NG và IC 41

Hình 3.3 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng CT 43

Hình 3.4 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng NG 44

Hình 3.5 Hiệu quả nhân bản và ngưỡng phát hiện của phản ứng IC 44

Hình 3.6 Kết quả đánh giá tính hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR 46

Hình 3.7 Biểu đồ đường cong chuẩn màu HEX (phải) và màu FAM (trái) 48

Hình 3.8 Biểu đồ kết quả so sánh 3 phư ng pháp tách chiết DNA 49

Hình 3.9 Kết quả kiểm tr độ đặc hiệu phân tích 51

Hình 3.10 Hệ số biến thiên nội phản ứng 53

Hình 3.11 Hệ số biến thiên liên phản ứng 54

Hình 3.12 Kết quả phát hiện CT và NG một số mẫu lâm sàng 55

MỞ ĐẦU

Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG) là h i tác nhân vi

khuẩn gây bệnh lây truyền qu đường tình dục phổ biến trên thế giới đặc biệt là ở các nước đ ng phát triển [27], [31] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm

có thêm khoảng 131 triệu người nhi m CT (36,7%) và 71 triệu người nhi m NG

(19,9%) trong tổng số 357 triệu người nhi m bệnh lây truyền qu đường tình dục

[59] Một nghiên cứu tại 5 tỉnh biên giới của Việt N m vào năm 2003 cho thấy tỷ lệ nhi m CT là 11,9%; NG là 10,7%; đồng nhi m CT/NG là 19,9% [57] Một nghiên cứu khác công bố tỷ lệ nhi m CT ở phụ nữ đến khám vô sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung Ư ng năm 2012 là 25,2% [8] Tỷ lệ nhi m CT khoảng 16,7% và NG khoảng 14,7% trong tổng số 314 n m bán dâm đồng giới tại Hà Nội năm 2014 – 2015 [9]

Trong những năm gần đây, tỷ lệ người mắc bệnh do CT và NG gây r ngày càng

tăng c o nhưng ít được thống kê đầy đủ và chính xác [21]

Người mắc bệnh Chlamydia do CT và bệnh lậu do NG gây r nếu không được

phát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến những di chứng lâu dài ở cả n m và nữ như vô sinh, viêm hậu môn, trực tràng Đối với phụ nữ đ ng m ng th i, việc mắc bệnh có nguy c dẫn đến viêm v ng chậu, thai chậm phát triển, chết thai, sinh non, sinh con

nh cân và đặc biệt có thể gây m l ở trẻ s sinh do CT và NG lây truyền từ m

sang con [22]

Mặc d d điều trị nhưng bệnh lây l n rất nhanh trong cộng đồng và gây r những hậu quả khó lường do bệnh ít có triệu chứng hoặc được phát hiện ở gi i đoạn muộn Một số phư ng pháp truyền thống như nuôi cấy, nhuộm, soi tư i, mi n dịch

hu nh quang thường được sử dụng để phát hiện CT và NG, tuy nhiên các phư ng

pháp này có độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian [54], [56] Chính vì vậy các phư ng pháp nhân bản gene (PCR, Real-time PCR) đã được sử dụng rộng rãi trong thời

gian gần đây vì có độ nhạy cao so với các phư ng pháp nuôi cấy định danh [17],

[19] và được Trung tâm Kiểm soát và Ph ng chống Dịch bệnh Hoa K (Centers for Disease Control and Prevention – CDC) khuyến cáo sử dụng trong các chư ng trình giám sát CT và NG [20]

Hiện nay, việc xây dựng phư ng pháp multiplex real-time PCR để chẩn đoán CT

và NG vẫn chư phổ biến tại Việt N m Chính vì vậy, việc xây dựng một phư ng

pháp phát hiện nh nh và chính xác CT và NG tại Việt Nam với chi phí thấp là vấn

đề cấp thiết nhằm ngăn ngừa, kiểm soát và hướng đến việc điều trị kịp thời các bệnh lây truyền qu đường tình dục do hai vi khuẩn này gây r Xuất phát từ thực ti n đó,

chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia

trachomatis và Neisseria gonorrhoeae bằng phương pháp multiplex real-time

PCR” với các nội dung chính s u:

1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG

2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR

3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

Sự thành công củ đề tài sẽ là tiền đề cho sự phát triển kit chẩn đoán multiplex real-time PCR có khả năng phát hiện nh nh, chính xác CT và NG, tác nhân gây bệnh l n truyền qu đường tình dục Đây là c sở thuận lợi cho công tác nghiên cứu dịch t học và chẩn đoán bệnh trong lĩnh vực y tế cộng đồng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Chlamydia trachomatis (CT) và Neisseria gonorrhoeae (NG)

1.1.1 Giới thiệu về CT

1.1.1.1 Dịch tễ học bệnh Chlamydia

Theo ước tính củ WHO, mỗi năm có khoảng 130,9 triệu người nhi m CT [58]

Tỷ lệ nhi m CT c o nhất ở th nh thiếu niên trong độ tuổi từ 15-24 [22] Hầu hết

phụ nữ và n m giới nhi m CT đều không có triệu chứng Tỷ lệ nhi m CT không có

triệu chứng ở nữ (80%) thường c o h n so với n m (50%) [49]

Theo báo cáo củ CDC, năm 2015, tại Mỹ, có khoảng 1.526.658 trường hợp nhi m CT, tăng 5,9% so với năm 2014 Trong đó, tỷ lệ nhi m CT ở nữ tăng 3,8% và

ở n m tăng 10,5% [21]

Tỷ lệ nhi m CT ngày càng gi tăng nhưng chư được thống kê đầy đủ và chính xác Các nghiên cứu gần đây tại Ấn Độ cho thấy tỷ lệ nhi m CT chiếm khoảng 23% tại các ph ng khám phụ kho và chiếm 19,9% ở các bệnh nhân nhi m tr ng qu đường tình dục Một nghiên cứu khác ở Anh, trong v ng 20 năm qu , ước tính tỷ lệ nhi m CT ở các ph ng khám tiết niệu là 17,3%, ở các ph ng khám th i là 12,6%, tại các c sở phá th i là 12,3%, tại các ph ng khám dành cho th nh thiếu niên chiếm 10,7% và 10% ở các ph ng khám kế hoạch hó gi đình [41]

Tại Việt N m, theo số liệu các đị phư ng báo cáo về Viện D li u Quốc gi , số

c nhi m CT có xu hướng tăng lên do bệnh này thường di n biến âm thầm và ít triệu chứng [10] Nghiên cứu củ Lê Hồng Cẩm trên 415 phụ nữ viêm cổ tử cung trong độ tuổi từ 15 đến 45 trong thời gi n từ 2/1998 đến 3/1999 tại huyện Hóc Môn, Thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ nhi m CT trên đối tượng này là 18,07% [5] Nghiên cứu khác củ Phạm Văn Đức và cộng sự về tỷ lệ nhi m CT ở phụ nữ hút

th i 3 tháng đầu và các yếu tố liên qu n tại kho Kế hoạch hó gi đình – Bệnh viện

Từ Dũ từ 01/08/2007 đến 30/01/2008 cho thấy trong 1003 trường hợp nghiên cứu,

tỷ lệ nhi m CT ở phụ nữ hút th i là 9,2% với độ tuổi dưới 30 và có thu nhập trung bình [12] Theo một báo cáo đánh giá hoạt động ph ng chống bệnh lây truyền qu đường tình dục năm 2014 củ bệnh viện Phong – D li u Trung ư ng Quy H ở 15

tỉnh khu vực miền Trung – Tây Nguyên từ Quảng Bình đến Bình Thuận và 5 tỉnh Tây Nguyên (Kon Tum, Gi L i, Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng), tỷ lệ người mắc bệnh CT trong tổng số người đến khám chữ bệnh d li u ở các ph ng khám tuyến tỉnh là 288.950 người chiếm 0,07% [7].Việc tầm soát CT là một trong những biện pháp ngăn ngừ và điều trị CT hiệu quả nhất

1.1.1.2 Triệu chứng lâm sàng [2], [49]

CT có khả năng gây r nhiều bệnh khác nh u do 15 serov rs (t p huyết th nh)

gây r

a Bệnh mắt hột: do CT serovars A-C gây r

Khởi đầu nh : ngứ , nóng rát, chảy nước mắt

Nhi m tr ng cấp tính: viêm kết mạc thể nang, xung huyết, ph kết mạc và dẫn đến viêm giác mạc Chu trình tái di n với những tổn thư ng lặp lại, đặc biệt là ở giác mạc dẫn đến hậu quả là m Các nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng cho thấy những biến chứng thường hay gặp ở các nhi m tr ng mạn tính, đặc biệt là khi nhi m tr ng lần thứ h i vì c thể đã được mẫn cảm do nhi m tr ng lần thứ nhất

b Viêm kết mạc thể vùi: do CT serovars D-K gây r , thường gặp ở trẻ s sinh do

mắt tiếp xúc với dịch đường sinh dục có vi khuẩn của m

c Nhiễm trùng ở đường sinh dục: do CT serovars D-K gây r

Ở nam giới: chủ yếu gây viêm niệu đạo nhưng có 40% n m giới bị nhi m không

có triệu chứng Viêm mào tinh hoàn và viêm tuyến tiền liệt là biến chứng sau khi

nam giới bị nhi m CT, có tới 50% trường hợp viêm mào tinh hoàn dưới 35 tuổi

Ở nữ giới: Thường gặp nhất là viêm niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung Khoảng 70% phụ nữ nhi m tr ng sinh dục không có triệu chứng, nếu không điều trị sẽ để lại di chứng nặng nề và dẫn đến viêm v ng chậu (Pelvic Infection Disease - PID), tắc v i

trứng, th i ngoài tử cung, vô sinh [2], [49] Các chư ng trình sàng lọc CT được

chứng minh là làm giảm tỷ lệ viêm v ng chậu ở phụ nữ [49]

Hình 1.1 Viêm cổ tử cung ở nữ và viêm niệu đạo ở nam do CT [62]

d Viêm khớp do bệnh truyền qu đường tình dục (SARA – sexually bacquired

re ctive rthritis): ảnh hưởng đến các khớp lớn, đặc biệt là khớp chân N m giới bị ảnh hưởng nhiều h n nữ giới với tỷ lệ 10:1

e Nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ: tỷ lệ truyền từ m s ng trẻ s sinh là

55%, trong đó 45% là viêm kết mạc và 30% viêm phổi [2], [49]

f Lymphogranuloma Venereum (LGV - hoa liễu): là bệnh lây truyền qu đường

tình dục do CT serovars L1 - L3 gây r [2]

1.1.1.3 Đặc điểm sinh học của CT

Qu n sát dưới kính hiển vi qu ng học, CT là vi khuẩn Gr m âm có màng là lipopolysaccharide, hình cầu hoặc bầu dục, kích thước th y đổi Vi khuẩn thường

th y đổi hình dạng trong chu k s o chép Vỏ vi khuẩn gồm màng trong và màng ngoài, không có lớp peptidoglyc n giữ các màng [3]

Hình 1.2 Tế bào bị nhiễm vi khuẩn CT [66]

1.1.1.4 Đặc điểm bộ máy di truyền CT

CT là vi khuẩn k sinh nội bào bắt buộc, bộ gene có khoảng 600 gene CT chứa 7

đến 10 bản sao củ pl smid trong mỗi tế bào, cryptic pl smid có kích thước khoảng 7,5 kb được phát hiện trong tất cả các chủng củ CT [47], [48] Cryptic plasmid

chứ 8 khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) mã hoá cho một số protein kháng nguyên đặc trưng Mặc d chức năng của 8 gene trên cryptic plasmid c n chư xác định hoàn toàn, nhưng trình tự nucleotide và sự có mặt của plasmid trong

tế bào cho thấy nó có v i tr qu n trọng đối với vi khuẩn CT [53]

CT có kháng nguyên lipopolys cch ride chung và kháng nguyên protein vỏ riêng

dự vào đó được chi r 15 loại t p huyết th nh khác nhau bao gồm: T p huyết thanh A - C, D - K và L1 - L3 Trong đó t p A, B, B và C gây bệnh ở mắt T p D -

K gây bệnh ở đường sinh dục và ở mắt T p L1 gây bệnh ho li u viêm hạch hạt [1], [2], [36]

Dị biệt kháng nguyên củ CT là protein chủ yếu ở màng ngoài (m jor outer membrane protein - MOMP), chiếm đến 50% cấu tạo màng MOMP là một protein xuyên màng chứ các quyết định kháng nguyên đặc hiệu loài và đặc hiệu t p

Những hội chứng do CT gây r có liên hệ đặc hiệu với các t p huyết th nh khác

niên trong độ tuổi từ 15 - 24 tuổi chiếm 39% các trường hợp nhi m NG và tỷ lệ

nhi m ở nam giới nhiều gấp 3 lần so với nữ giới [30]

Theo báo cáo khác củ WHO ở 53 quốc gi vào năm 2014, tỷ lệ nhi m NG ở

n m là 25,5/100.000 n m giới trưởng thành Tây Thái Bình Dư ng là n i được báo cáo có tỷ lệ n m nhi m c o nhất và Đông Đị Trung Hải là n i có tỷ lệ n m nhi m thấp nhất thế giới (3,2 trường hợp/100.000 nam) [58]

Bảng 1.1 Tỷ lệ nam nhiễm NG tại 53 nước vào năm 2014/100.000 dân [58]

Theo một báo cáo gần đây của CDC, tỷ lệ nhi m NG tại Mỹ tăng dần qu các năm Năm 2009, tỷ lệ nhi m NG là 98,1/100.000 người, đến gi i đoạn 2009 - 2012 tăng nh (106,7/100.000 người) và năm 2015 bắt đầu tăng nh nh (129,9/100.000 người) so với năm 2014 Năm 2015, có khoảng 395,216 triệu người nhi m NG, tăng 12,8% so với năm 2014, trong đó, tỷ lệ nhi m ở n m tăng 18,3% và ở nữ là 6,8%

Tỷ lệ nhi m tăng c o nhất ở miền N m và miền Tây nước Mỹ [21]

Tại khu vực Đông N m nói chung và Việt N m nói riêng, tỷ lệ bệnh lậu chư được thống kê đầy đủ nên việc kiểm soát bệnh gặp nhiều khó khăn đặc biệt là các đối tượng có nguy c lây nhi m cao Một nghiên cứu củ B i Thị Mậu và Lê Thị Kim nh về bệnh lây truyền qu đường tình dục ở gái mại dâm tại Trung tâm Chữa bệnh – Giáo dục – L o động Xã hội tỉnh H Bình năm 2009 cho thấy tỷ lệ gái mại dâm nhi m lậu chiếm 24,1% trong tổng số 162 đối tượng được khảo sát với độ tuổi dưới 29, trình độ học vấn thấp và thiếu hiểu biết về bệnh lây truyền qu đường tình dục [6] Một nghiên cứu khảo sát về kiến thức, thái độ và niềm tin củ học sinh từ 2 trường dạy nghề tại Thành phố Hồ Chí Minh về các bệnh lây l n do qu n hệ tình dục cho thấy chỉ 55% hiểu biết về bệnh lậu [28] Tỷ lệ nhi m lậu ở nhóm mại dâm

n m cũng là một điều đáng báo động Công trình nghiên cứu củ Nguy n Văn H ng

và cộng sự về tỷ lệ nhi m HIV/STI và một số yếu tố liên qu n ở nhóm n m bán dâm đồng giới 16 - 29 tuổi tại Hà Nội năm 2014 - 2015 cho thấy bệnh lậu chiếm khoảng 14,7% trong tổng số 314 n m bán dâm đồng giới [9]

1.1.2.2 Triệu chứng lâm sàng [1], [2], [3]

a Ở nam giới: Các triệu chứng thường gặp là viêm niệu đạo nhưng cũng có

khoảng 3 - 10% n m nhi m lậu nhưng không có triệu chứng Nếu không được phát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến các biến chứng như viêm ống dẫn tinh, mào tinh

hoàn, tuyến tiền liệt, túi tinh

b Ở nữ giới: Triệu chứng thường gặp là viêm cổ tử cung, âm đạo, niệu đạo,

tuyến Bartholine,… nhưng đ số là không có triệu chứng hoặc triệu chứng không rõ ràng Nếu không được phát hiện và điều trị sớm sẽ dẫn đến viêm tử cung, viêm v i

trứng, đặc biệt ở phụ nữ m ng th i sẽ dẫn đến vô sinh hoặc th i ngoài tử cung

c Ở trẻ sơ sinh: Lậu mắt ở trẻ s sinh do nhi m NG từ m Triệu chứng phổ biến

nhất là kết mạc đỏ, xuất huyết và chảy mủ kết mạc Nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến m l a

Ngoài r , bệnh lậu c n gây r một số hệ quả thứ cấp khác như:

- Viêm họng do lậu cầu gặp ở người đồng tính ở cả h i giới hoặc khác giới do

não

Hình 1.5 Viêm kết mạc ở mắt và trẻ mù mắt do NG [67]

1.1.2.3 Đặc điểm sinh học của NG

Vi khuẩn NG là những song cầu khuẩn Gr m âm hình hạt cà phê, h i mặt d t vào nhau Kích thước tế bào khoảng 0,6 µm × 0,8 µm, khoảng cách giữ 2 cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng củ tế bào Vi khuẩn lậu không sinh nh bào, không có lông, một số chủng có pili [2] Màng ngoài b o gồm các protein, phospholipid và lipopolysaccharide (LPS) Đặc tính d ng để phân biệt LPS lậu là cấu trúc oligos cch ride c bản phân nhánh và không có sự lặp lại củ kháng nguyên O Do

đó, LPS củ NG được gọi là lipooligos cch ride (LOS) [45]

Trong môi trường nuôi cấy, NG có kích thước th y đổi và kiểu sắp xếp không điển hình: có thể xếp thành đôi hoặc thành bốn Pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợp

sợi và hầu như che phủ toàn bộ bề mặt bên ngoài tế bào vi khuẩn [2]

Hình 1.6 Vi khuẩn NG [68]

1.1.2.4 Đặc điểm bộ máy di truyền NG

Có 3 dạng plasmid trong NG:

- Loại 1: Pl smid 24,5 Md có khả năng hoạt hó các pl smid khác

- Loại 2: Pl smid 2,6 Md chư rõ chức năng

- Loại 3: Pl smid quy định sinh β – l ct m se, đây là pl smid quy định tính kháng sinh củ NG Có nhiều pl smid β – lactamase trong NG gây bệnh ở các nước trên thế giới, chúng có trọng lượng phân tử th y đổi: 4,4 Md; 3,2 Md; 2,9

Md [2]

NG có cấu trúc kháng nguyên không đồng nhất và có thể th y đổi cấu trúc bề mặt trong điều kiện in vitro Đây là tính chất được xem như nhằm tránh sự đề kháng củ

k chủ trong điều kiện in vivo [3]:

- Pili: dài khoảng vài µm, giúp vi khuẩn bám vào k chủ tốt h n và chống lại hiện tượng thực bào

- Protein I (Por): tạo những lỗ nhỏ ở bề mặt, qu đó một số chất dinh dưỡng vào

được bên trong tế bào vi khuẩn Mỗi chủng Gonorrhoeae có một loại protein I

khác nh u

- Protein II (Opa): gây kết dính các tế bào gonococci thành một khối và gắn gonococci vào tế bào k chủ Một chủng có từ 0 đến 3 kiểu protein II Protein

II hiện diện ở khối đục, có thể có h y không có ở khối trong

- Protein III (Rmp): có ở tất cả gonococci, kết hợp với protein I tạo thành lỗ nhỏ trên bề mặt tế bào

- Lipopolysaccharide (LPS): có ở màng ngoài củ gonococci, trọng lượng phân

tử từ 3000 - 7000 Độc tính trong nhi m khuẩn gonococci phần lớn do LPS, có tác dụng như nội độc tố

- Protein khác: có tính kháng nguyên, nhưng v i tr gây bệnh chư rõ [3]

Hình 1.7 C u trúc bề mặt của NG [63]

1.2 Một số phương pháp phát hiện CT và NG

1.2.1 Phương pháp nuôi c y truyền thống

1.2.1.1 Nuôi c y CT

CT không nuôi cấy được trong môi trường nhân tạo, mà phải được nuôi trong

d ng tế bào McCoy, Hela 229 hoặc tế bào thận khỉ Thể v i có thể được thấy sau

48 - 72 giờ bằng phư ng pháp nhuộm Giemsa, Iodine hoặc nhuộm kháng thể gắn

hu nh qu ng đặc hiệu cho kháng nguyên của Chlamydia (LPS và MOMP) Khi sử

dụng các kháng thể đặc hiệu MOMP thì sự phát hiện CT có độ đặc hiệu cao Phư ng pháp nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện CT vì có độ đặc hiệu c o (100%) nhưng có độ nhạy thấp (75 - 85%) ngay cả khi thực hiện trong

ph ng thí nghiệm chuyên nghiệp [24], [29]

Độ nhạy phụ thuộc vào điều kiện thu, vận chuyển và bảo quản mẫu do đó ít được

sử dụng trong ph ng thí nghiệm Phư ng pháp này d ng để giám sát sự nhạy cảm

kháng sinh và sự th y đổi độc tính hoặc khi cần các xét nghiệm với độ đặc hiệu cao [44]

1.2.1.2 Nuôi c y NG

Vi khuẩn NG khó nuôi cấy, rất d chết, chúng không thể phát triển trong môi trường thông thường mà đ i hỏi môi trường phải giàu chất dinh dưỡng như máu và các yếu tố dinh dưỡng khác Các môi trường thường được sử dụng là thạch chocol te và các môi trường chọn lọc khác có chứ kháng sinh (Thayer-Martin, Martin Lewis) để ức chế các vi khuẩn khác và nấm nhưng không ảnh hưởng đến sự phát triển củ vi khuẩn NG Tế bào NG phát triển tốt khi ủ môi trường với 5 - 10%

CO2 ở nhiệt độ 35 – 37oC trong thời gian 18 - 24 giờ, độ ẩm ≥ 70% và pH = 7,3 [2], [29]

Nếu NG được nuôi cấy trong môi trường nghiêm ngặt cộng với sự đảm bảo các điều kiện khi lấy mẫu, vận chuyển mẫu và trữ mẫu thì độ nhạy củ NG là 60 - 70%

và độ đặc hiệu là 100% [17], [29]

1.2.2 Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp

Nguyên tắc: Phư ng pháp kháng thể hu nh quang trực tiếp (Direct Fluorescent Antibody test – DFA) sử dụng kháng thể đặc hiệu đánh dấu hu nh qu ng để phát hiện trực tiếp kháng nguyên đặc hiệu loài MOMP hoặc kháng nguyên nhóm LPS

Có 2 loại kháng nguyên nhưng phần lớn phư ng pháp này sử dụng kháng nguyên MOMP vì kháng nguyên LPS có thể phản ứng chéo với LPS củ các vi khuẩn khác Với việc sử dụng kháng nguyên MOMP thì độ nhạy và độ đặc hiệu của phư ng pháp kháng thể hu nh quang trực tiếp lần lượt là 80 - 90% và 98 - 99%

Phư ng pháp DFA không đ i hỏi điều kiện vận chuyển nghiêm ngặt, thời gian thực hiện nh nh nhưng việc đọc kết quả đ i hỏi chuyên môn c o Do đó, phư ng pháp này được khuyến cáo sử dụng trong ph ng thí nghiệm với số lượng mẫu thấp

Nó được đánh giá là nhạy h n so với nuôi cấy để phát hiện CT trong mẫu nội mạc

tử cung [41]

1.2.3 Phương pháp miễn dịch liên kết enzyme

Nguyên tắc: Phư ng pháp mi n dịch liên kết enzyme (Enzyme-Linked

một kháng thể đặc hiệu Kết quả phản ứng mi n dịch được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể cộng hợp với enzyme Phức hợp kháng nguyên – kháng thể hoạt hó enzyme, chuyển c chất không màu thành sản phẩm có màu, thông qu cường độ màu có thể phát hiện và định lượng nồng độ kháng nguyên h y kháng thể

có trong mẫu Hiện n y, phư ng pháp ELISA được qu n tâm nhiều do tính đ n giản

và hiệu quả cao

Phư ng pháp ELISA có độ nhạy khoảng 62 - 96% và độ đặc hiệu từ 86 - 99% so với phư ng pháp nuôi cấy tế bào Phư ng pháp này ph hợp với các ph ng thí nghiệm không thể sử dụng phư ng pháp nuôi cấy [41]

1.2.4 Phương pháp PCR và multiplex PCR

PCR là phản ứng tổng hợp phân tử DNA in vitro bằng enzyme DNA polymerase

chịu nhiệt (thường là Taq polymer se) Các DNA polymer se chỉ có thể tổng hợp

được mạch DNA mới từ mạch khuôn bằng cách kéo dài một mồi (primer) là một trình tự nucleotide ngắn đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu k (30 - 40 chu k ); mỗi chu k gồm b bước : (1) biến tính để tách rời hai mạch củ phân tử DNA, (2) bắt cặp các mồi xuôi và ngược đặc trưng cho trình tự cần nhân bản, (3) tổng hợp mạch mới bằng cách kéo dài mồi đã bắt cặp Multiplex PCR là phư ng pháp cải biên củ PCR, nhiều trình tự DNA được nhân bản c ng lúc, sử dụng nhiều h n 1 cặp mồi trong một phản ứng PCR Phư ng pháp này cho phép phát hiện c ng lúc nhiều tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm giúp rút ngắn thời gi n cho ra kết quả xét nghiệm Phư ng pháp multiplex PCR được áp dụng đã làm tăng độ chính xác củ xét nghiệm chẩn đoán CT và NG Các công trình trên thế giới đều cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu củ phư ng pháp PCR chẩn đoán

qu ng phát r tư ng ứng với một trình tự mục tiêu được nhân bản thành công Những hó chất phát hu nh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA (Evagreen, SYBR Green I, SYBR Green II) và một đoạn DNA mạch đ n đặc hiệu cho v ng gene mục tiêu được gắn chất hu nh quang gọi là mẫu d (mẫu d TaqMan®, molecular beacon, mẫu d Eclipse,…)

Multiplex real-time PCR dựa trên nguyên tắc của kỹ thuật real-time PCR nhưng trong một ống phản ứng đ n có thể nhân bản đồng thời nhiều trình tự mục tiêu khi

sử dụng nhiều h n một cặp mồi và các mẫu d khác nh u

Hiện nay, mẫu d TaqMan® và thuốc nhuộm liên kết Evagreen, SYBR Green được sử dụng phổ biến nhất Mỗi loại đều có những ưu điểm và mặt hạn chế của chúng nó

1.2.5.2 Các hóa ch t phát huỳnh quang thường được sử dụng [16], [18]

a Thuốc nhuộm liên kết DNA được sử dụng chủ yếu là SYBR Green I và

Ev green cho phép liên kết không đặc hiệu với DNA mạch đôi (Hình 1.8) Các chất này chỉ phóng thích một lượng nhỏ tín hiệu hu nh quang khi chúng ở dạng tự do trong dung dịch, nhưng tín hiệu hu nh quang sẽ tăng lên đến 1000 lần khi chúng liên kết với DNA mạch đôi Như vậy, tín hiệu hu nh quang tổng từ phản ứng sẽ tỷ

lệ với lượng DNA mạch đôi hiện diện và gi tăng khi trình tự mục tiêu được nhân bản

Hình 1.8 Thuốc nhuộm liên kết DNA trong phản ứng real-time PCR [65]

Phân tử SYBR Green I chư gắn chèn

Phân tử SYBR Green I được gắn chèn

Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đ n giản (chỉ cần 2 mồi, không cần thiết kế mẫu d ), chi phí b n đầu thấp Tuy nhiên trở ngại lớn nhất của thuốc nhuộm liên kết DNA là chúng không đặc hiệu, nghĩ là chúng liên kết với bất k DNA mạch đôi nào do đó phải thực hiện phân tích melting-curve (đường cong nóng chảy) để kiểm tr độ đặc hiệu của phản ứng nhân bản Kết quả là sự hiện diện củ các sản phẩm không đặc hiệu trong phản ứng real-time PCR có thể làm tăng lượng tín hiệu hu nh quang tổng và ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả định lượng

b Hóa ch t phát huỳnh quang dựa trên mẫu dò được sử dụng phổ biến hiện

mục tiêu c ng với phân tử phát hu nh qu ng (reporter) và phân tử dập tắt hu nh

qu ng (quencher) được gắn cộng hó trị ở hai đầu Khi mẫu d vẫn c n nguyên v n, tín hiệu hu nh qu ng phát r bởi reporter sẽ bị quencher dập tắt Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu d bắt cặp với v ng gene mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi

hoạt tính 5’ – 3’ exonucle se của Taq DNA polymer se Lúc này, phân tử reporter

và quencher được tách nh u r và tín hiệu hu nh qu ng thu được từ reporter trở nên mạnh h n Sự gi tăng tín hiệu này mạnh h n s u mỗi chu k và tư ng ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra

Hình 1.9 Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan ® [64]

Ưu điểm chính của mẫu d TaqMan® là độ đặc hiệu cao và cho phép thực hiện các phản ứng multiplex Tuy nhiên giá thành đắt và việc thiết kế phản ứng phức tạp

h n

Một khí cạnh quan trọng trong việc thiết kế mẫu d là việc lựa chọn chất phát

và hấp thu hu nh quang

Bảng 1.2 Các ch t phát và h p thu huỳnh quang thường sử dụng

Tên reporter Bước sóng kích thích (nm) Bước sóng HQ phát ra (nm) Quencher

1.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam

1.3.1 Trên thế giới

Hiện n y, các phư ng pháp nhân bản gene được lựa chọn trong các ph ng thí nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới để chẩn đoán thường quy CT và NG [27]

Năm 2014, Dhawan và cộng sự đã sử dụng phư ng pháp real-time PCR để phát

hiện việc nhi m CT ở những phụ nữ vô sinh tại khu vực Bắc Ấn Độ Kết quả độ

nhạy và độ đặc hiệu ph hợp với kit COBAS TaqMan C trachomatis Test (Roche,

Mỹ) và có thể phát hiện CT ở nồng độ 10 bản sao/phản ứng [24]

Đến năm 2015, nghiên cứu củ T youn và cộng sự sử dụng phư ng pháp

multiplex PCR và Melt Curve An lysis để phát hiện đồng thời CT, NG,

Trichomonas vaginalis (TV) và chứng nội (Internal Control) được bổ sung vào

trong quá trình tách chiết DNA để kiểm soát quá trình tách chiết DNA và PCR Kết quả phư ng pháp chẩn đoán này tiết kiệm được chi phí, có độ nhạy, độ đặc hiệu

c o, d dàng phát hiện sự đồng nhi m củ CT, NG, TV và có thể sử dụng nhiều loại mẫu khác nh u: nước tiểu, dịch phết âm đạo [56]

Tiếp theo đó cũng vào năm 2015, công trình nghiên cứu củ Rumy ntsev và cộng sự đánh giá phư ng pháp multiplex re l-time PCR (AmpliSens) phát hiện

đồng thời 4 mục tiêu CT, NG, TV và Mycoplasma geneitalium (MG) Phư ng pháp

c n phát hiện thêm trình tự DNA chứng nội Kết quả cho thấy phư ng pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu c o với tỷ lệ nhi m CT, NG, TV, MG lần lượt là 6,3%; 0,3%; 0,08% và 5,7% [51]

Gần đây là nghiên cứu củ Meyer và cộng sự năm 2016 Các tác giả thực hiện đánh giá kit PelvoCheck CT/NG bằng phư ng pháp PCR để phát hiện CT và NG,

kit sử dụng gene ADAT1 được bổ sung vào m ster mix làm chứng nội kiểm soát quá

trình nhân bản c ng với DNA CT/NG [43] Cũng trong năm 2016, nghiên cứu củ

J ureguy và cộng sự sử dụng phư ng pháp re l-time PCR để xác định tỷ lệ nhi m

CT và NG ở những cá nhân bị tấn công tình dục ở P ris, Pháp Kết quả phát hiện

15% nhi m CT, 5% nhi m NG và 3% đồng nhi m cả h i loại vi khuẩn trên [38]

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt N m, các nghiên cứu đã công bố về xây dựng các phư ng pháp phát hiện

CT và NG có phần hạn chế h n so với thế giới

Năm 2007, Võ Hồ Hồng Hải đã xây dựng và chuẩn hó quy trình phát hiện đồng

thời CT và NG sử dụng kỹ thuật PCR-ELISA và chứng nội Kết quả phát hiện 6%

nhi m CT, 2% nhi m NG trong 100 mẫu dịch phết cổ tử cung [14]

Vào năm 2011, Trần Đăng Thắng và cộng sự đã xây dựng thành công quy trình multiplex PCR phát hiện đồng thời h i tác nhân gây bệnh HPV và NG Kết quả cho

thấy 2 trường hợp dư ng tính với NG chiếm 6% trong 30 mẫu thu thập từ bệnh

nhân và 1 trường hợp đồng nhi m với HPV [13]

Như vậy, các công trình nghiên cứu về phư ng pháp phát hiện CT và NG đã được thực hiện rộng rãi trên thế giới dưới nhiều hình thức khác nh u Tuy nhiên, ở Việt N m các công trình nghiên cứu đã được công bố sử dụng phư ng pháp

multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG chư phổ biến Phư ng pháp real-time

PCR có nhiều ưu điểm h n so với PCR truyền thống là nó cho phép xác định số lượng bản s o khuôn mẫu b n đầu với sự chính xác và độ nhạy cao, kết quả real-time được đánh giá không cần phải điện di trên gel g rose, giúp tiết kiệm thời

gi n Đồng thời, việc tiến hành phản ứng và đánh giá kết quả trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy c ngoại nhi m và loại bỏ những th o tác s u phản ứng nhân bản

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng mẫu d TaqMan® và mồi nhân bản v ng gene đặc trưng của CT và NG Ngoài r , trong hỗn hợp phản ứng real-time PCR c n

chứa một cặp mồi nhân bản một đoạn gene ALAS1 củ người làm chứng nội nội

sinh Khác với một số công trình công bố gần đây đã sử dụng chứng nội ngoại sinh, đoạn gene này được ly trích c ng với DNA CT và NG trong quá trình tách chiết giúp phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả củ quá trình tách chiết DNA cũng như phản ứng PCR [38], [51], [56]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Kho Thư ng Thời gian thực hiện đề tài: 16/01/2017 – 18/06/2017

2.2 Vật liệu

2.2.1 Mẫu thực nghiệm

Mẫu DNA và mẫu lâm sàng được thu tại một bệnh viện có chuyên kho d li u ở

Hà Nội được chỉ định xét nghiệm CT và NG từ tháng 01/2017 đến 04/2017

Mẫu DNA các vi sinh vật khác được lưu trữ tại ph ng Kiểm định Chất lượng - công ty TNHH Công nghệ Sinh học Kho Thư ng

2.2.2 Mồi, mẫu dò và amplicon

Cặp mồi, mẫu d CT và NG sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo từ các công trình nghiên cứu đã công bố [54], [37] Trình tự mồi và mẫu d bắt cặp trên

đoạn gene ALAS1 của người d ng làm chứng nội (IC) từ một công trình nghiên cứu

khác trong nhóm nghiên cứu củ chúng tôi tại công ty TNHH Công nghệ Sinh học Kho Thư ng

Các trình tự mplicon được xác định bằng phần mềm Annhyb dự trên các cặp mồi [54], [37] và các trình tự được công bố trên ngân hàng gene (NCBI), trong đó:

- Amplicon CT: m ng v ng trình tự dài 71 bp nằm trên cryptic plasmid của CT

- Amplicon NG: m ng v ng trình tự dài 90 bp nằm trên v ng gene opa của NG

- Amplicon IC: m ng v ng trình tự dài 144 bp nằm trên v ng gene ALAS1 ở

người

Các cặp mồi, mẫu d và mplicon được tổng hợp bởi công ty Integrated DNA Technologies - IDT (Mỹ)

2.2.3 Hóa ch t

Bảng 2.1 Danh sách hóa ch t sử dụng Tên hóa ch t Hãng sản xu t Xu t xứ

Hóa ch t dùng tách chiết DNA

Kit tách chiết DNA tủa: AccuRive

Kit tách chiết DNA sử dụng cột

Kit tách chiết DNA bán tự động:

TANBead DNA Auto Kit

Taiwan Advanced

Hóa ch t dùng trong phản ứng real-time PCR

2.2.4 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.2 Danh sách thiết bị và dụng cụ Tên thiết bị và dụng cụ Hãng sản xu t Xu t xứ

Máy tách chiết DNA tự động

Smart LabAssist

Taiwan Advanced

2.3 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Mục tiêu củ đề tài là xây dựng quy trình multiplex re l-time PCR phát hiện đồng thời CT và NG Trước tiên, chúng tôi thiết lập phản ứng re l-time PCR và sử dụng mplicon nhân tạo để tối ưu hó các phản ứng monoplex, từ các thành phần được tối ưu tiến hành thiết lập, đánh giá tính hiệu quả và tối ưu hó phản ứng multiplex Sau khi tối ưu thành công phản ứng multiplex, tiếp tục so sánh các phư ng pháp tách chiết DNA từ mẫu dịch phết tế bào để chọn phư ng pháp tách chiết đạt hiệu quả c o Nhằm hướng tới việc phát triển kit trong tư ng l i, chúng tôi xác định các thông số kỹ thuật củ phản ứng multiplex re l-time PCR và áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng Công trình nghiên cứu được thực hiện theo s đồ s u:

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Đánh giá hiệu quả của quy trình phát

hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

2.4 Bố trí thí nghiệm

2.4.1 Thiết lập quy trình multiplex real-time PCR phát hiện CT và NG

2.4.1.1 Thiết lập phản ứng real-time PCR

Để thiết lập phản ứng real-time PCR chúng tôi thực hiện các nội dung sau:

- Lựa chọn các cặp mồi (primer) và mẫu d (probe) phát hiện CT, NG từ các công trình nghiên cứu đã công bố [54], [37]

- Kiểm tra in silico và bằng thực nghiệm hiệu quả hoạt động của các cặp mồi và

mẫu d đã chọn

Sử dụng các mẫu DNA gồm mẫu âm tính với CT và NG, mẫu dư ng tính với

CT, mẫu dư ng tính với NG để kiểm tra hoạt động củ các cặp mồi và mẫu d mục tiêu

Thành phần b n đầu của một phản ứng monoplex real-time PCR được trình bày trong Bảng 2.3

1 chu kì 950C – 15 phút

600C – 60 giây, đọc tín hiệu (FAM/HEX/CY5)

Phân tích kết quả real-time và điện di kiểm tra kích thước sản phẩm mục tiêu

S u đó chúng tôi gửi giải trình tự sản phẩm phản ứng PCR củ CT và củ NG tại công ty Axil Scientific (Sing pore) Chúng tôi sử dụng phần mềm Clust lX2 để tiến hành so sánh sự tư ng đồng với các trình tự đã được công bố trên NCBI

2.4.1.2 Tối ƣu hóa các phản ứng monoplex real-time PCR

a Chuẩn bị chứng dương (amplicon)

Chứng dư ng được tổng hợp ở dạng đông khô, bổ sung TE 1X để được chuẩn gốc có nồng độ 2 x 109 bản s o/µl Ph loãng chuẩn gốc về các nồng độ thích hợp bằng TE 1X d ng trong các thí nghiệm tiếp theo

Đối với phản ứng monoplex ph loãng từng amplicon CT, NG và IC theo bậc 10 giảm dần xuống nồng độ 2 x 108, 2 x 107 và tiếp tục đến 2 x 10-1 bản s o/µl (mỗi nồng độ được ph 1000 µl)

Chúng tôi sử dụng 3 mẫu chứng dư ng với các nồng độ s u khi đặt phản ứng PCR là 102, 104 và 106 bản sao/phản ứng Tất cả các phản ứng PCR tại mọi điều kiện thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần Tiêu chí đánh giá là chọn giá trị Ct trung bình thấp nhất hoặc giá trị Ct ph hợp với thí nghiệm nếu các giá trị Ct không quá khác biệt khi tối ưu Đồng thời phản ứng sau tối ưu phải đạt giá trị hệ số tư ng qu n

R2 0,980 và hiệu quả nhân bản từ 90% - 105% [18][25]

b Khảo sát nhiệt độ lai tối ưu: Dự vào Tm củ các cặp mồi và mẫu d , chúng

tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp trên dãy các nhiệt độ bắt cặp từ 56oC đến

66oC, khoảng cách nhiệt độ do máy tự thiết lập, từ đó chọn ra nhiệt độ lai tối ưu chung cho các phản ứng monoplex CT, NG và IC

c Khảo sát nồng độ MgCl 2 : Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến quá trình PCR [4] Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 từ 2,0 – 5,0 mM, mỗi bậc khảo sát tăng 0,5 mM [50] Các thành phần củ các phản ứng monoplex real-time PCR được giữ nguyên

d Khảo sát nồng độ mồi: Mồi là chỉ tiêu qu n trọng nhất để đạt được một sự

nhân bản đặc trưng và có hiệu quả cao [4] Trong thí nghiệm này, mồi được khảo

sát ở 5 nồng độ từ 200 - 400 - 600 - 800 - 1000 nM [23]

e Khảo sát nồng độ mẫu dò: Như mọi thí nghiệm PCR khác, thí nghiệm bằng

TaqMan® yêu cầu sự nhân bản hiệu quả và đặc hiệu sản phẩm Mẫu d TaqMan® là thành phần tốn kém nhất của một thí nghiệm TaqMan® Trong thí nghiệm này,

chúng tôi khảo sát nồng độ mẫu d ở 3 nồng độ 100 nM, 200nM, 300 nM [18]

f Khảo sát nồng độ enzyme Taq DNA polymerase: Taq DNA polymerase từ

những nhà cung cấp khác nh u có thể đạt hiệu quả khác nh u bởi công thức, điều kiện thí nghiệm và/hoặc đ n vị đo lường khác nhau [35] Do đó, chúng tôi tiến hành

khảo sát 4 nồng độ Taq DNA polymerase: 1,0 U; 1,5 U; 2,0 U; 2,5 U [35], [42]

g Kiểm tra hiệu quả nhân bản và giới hạn phát hiện của phản ứng monoplex

Hiệu quả nhân bản và giới hạn phát hiện sau khi tối ưu các phản ứng monoplex được kiểm tr để đánh giá hiệu quả nhân bản của phản ứng có tốt không Hiệu quả nhân bản (E) được tính toán từ độ dốc củ đường chuẩn theo công thức sau:

E = 10 -1/độ dốc

Hiệu quả nhân bản thường được biểu thị ở dạng số phần trăm:

% Hiệu quả = (E - 1) x 100%

Đối với phản ứng l tưởng: % Hiệu quả = (2 - 1) x 100% = 100% [18]

Trong thí nghiệm này, sử dụng 9 nồng độ chứng dư ng ph loãng bậc 10 từ 108

s o/µlphát hiện cả 3 trình tự CT, NG và IC Tiếp tục ph loãng theo bậc 10 giảm dần đến nồng độ 2 x 10-1 bản s o/µl (mỗi nồng độ được ph 1000 µl) d ng để tối ưu

b Đánh giá tính hiệu quả và tối ưu h a phản ứng multiplex real-time PCR

Chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng multiplex bằng cách kết hợp các thành phần đã được tối ưu ở phản ứng monoplex lại với nh u S u đó các phản ứng monoplex và phản ứng multiplex được chạy c ng với nh u trên c ng một bản mẫu

và chúng tôi so sánh giá trị Ct giữa phản ứng multiplex và các phản ứng monoplex

đã được tối ưu hó Giá trị thu nhận từ phản ứng multiplex không được quá khác biệt với các phản ứng monoplex Nếu giá trị Ct từ các phản ứng multiplex quá khác biệt, chúng tôi tiến hành tối ưu hó phản ứng multiplex [18]

2.4.1.4 So sánh các phương pháp tách chiết DNA

Chúng tôi sử dụng mẫu dịch phết tế bào đồng nhi m với CT/NG nồng độ c o pha loãng với các mẫu dịch phết tế bào âm tính với CT/NG theo bậc 10 để được 7 mẫu dịch phết tế bào có các nồng độ từ thấp đến c o Tiến hành tách chiết DNA, sử dụng

3 phư ng pháp (phư ng pháp tủ , phư ng pháp sử dụng cột silica và phư ng pháp bán tự động), mỗi mẫu lặp lại 3 lần trong mỗi phư ng pháp tách chiết Phát hiện

CT và NG bằng phản ứng multiplex đã xây dựng và chọn phư ng pháp tách chiết DNA cho hiệu quả tốt nhất

2.4.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phản ứng multiplex real-time PCR 2.4.2.1 Độ nhạy phân tích

Định nghĩa: Độ nhạy phân tích được đánh giá qu chỉ số LOD (limit of

detection), là giới hạn lượng mẫu phân tích ít nhất có trong chất nền đặc trưng có thể cho kết quả dư ng tính Tại giới hạn này, khả năng phát hiện chính xác đối tượng mục tiêu ít nhất là 50% (LOD50) [46]

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 5 nồng độ chứng dư ng (1, 5, 10, 20,

100 bản sao/phản ứng) chứ đồng thời 3 trình tự CT, NG và IC, mỗi nồng độ được lặp lại 10 lần Lặp lại 4 lần thí nghiệm để xác định độ nhạy phân tích của phản ứng multiplex real-time PCR

2.4.2.2 Độ đặc hiệu phân tích

Định nghĩa: Độ đặc hiệu phân tích là khả năng phân biệt giữ trình tự mục tiêu

và các trình tự khác có thể xuất hiện trong mẫu [46]

Chúng tôi sử dụng 2 nhóm mẫu: Mẫu DNA có trình tự của vi sinh vật mục tiêu

(CT và NG) và 21 mẫu DNA củ các chủng vi sinh vật khác gồm mẫu có nền mẫu

b n đầu thu từ người và mẫu tách chiết từ dịch tăng sinh bằng phư ng pháp nuôi cấy Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần

2.4.2.3 Độ lặp lại

Định nghĩa: Độ lặp lại là mức độ tư ng đồng giữ các kết quả trong nhiều lần lặp

lại của 1 mẫu, trong c ng 1 lần chạy và giữ các lần chạy khác nhau vào những ngày khác nh u Những thí nghiệm này chạy trong các ph ng thí nghiệm khác nhau hoặc sử dụng lô thuốc thử khác nh u hoặc các thiết bị khác nh u [34], [46]

Để kiểm tr độ lặp lại, chúng tôi sử dụng 3 nồng độ chứng dư ng 102

, 104, 107bản sao/phản ứng, mỗi nồng độ được lặp lại 4 lần trong 1 lần chạy Thực hiện 6 lần chạy:

- Lần chạy 1, 2, 3 với 3 lô hó chất khác nh u trên c ng d ng máy Stratagene Mx3000P

- Lần chạy 4, 5, 6 với 3 d ng máy real-time PCR khác nh u (Stratagene Mx3005P, CFX96 và Ari Mx) với c ng 1 lô hó chất

Xác định hệ số biến thiên nội phản ứng (coefficient of intra-assay variability) và liên phản ứng (coefficient of inter-assay variability) giữ các lần lặp và các lần chạy khác nh u để đánh giá độ lặp lại củ quy trình

2.4.3 Đánh giá hiệu quả của quy trình phát hiện CT và NG trên các mẫu lâm sàng

Tiến hành thực hiện quy trình multiplex real-time PCR trên 100 mẫu bệnh phẩm dịch phết tế bào thu từ bệnh viện để phát hiện CT và NG Các mẫu dịch phết tế bào được tách chiết DNA bằng phư ng pháp sử dụng cột silica, s u đó đặt phản ứng các mẫu DNA và chạy trên máy re l-time PCR Stratagene Mx3005P Phân tích kết quả, xác định tỷ lệ nhi m CT và NG

Một số mẫu dư ng tính với CT và NG được gửi giải trình tự tại công ty Axil Scientific (Singapore) để kiểm tra lại độ đúng củ quy trình thực hiện

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp kiểm tra mồi và mẫu dò

Thông số của các cặp mồi và mẫu d được kiểm tra bằng phần mềm

OligoAn lyzer Tool (IDT) và kiểm tra sự đặc hiệu in silico bằng Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST) Đồng thời sử dụng phần mềm Annhyb kiểm tra

vị trí bắt cặp củ các mồi, mẫu d tham khảo trên v ng cryptic plasmid của CT,

trình tự gene opa củ NG và trình tự gene ALAS1 của người được công bố trên

NCBI Từ đó, chúng tôi kiểm tr lại kích thước của sản phẩm PCR

2.5.2 Thu mẫu lâm sàng

Mẫu dịch phết tế bào được trữ trong 700 µl dung dịch bảo quản mẫu PBS 1X do các kỹ thuật viên củ bệnh viện thu mẫu và gửi đến công ty TNHH Công nghệ sinh học Kho Thư ng

2.5.3 Phương pháp tách chiết DNA

2.5.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tủa

Nguyên tắc: DNA bộ gene củ các phần tử vi khuẩn CT và NG có trong mẫu

dịch phết được thu nhận bằng phư ng pháp phenol-chloroform Các thành phần như phenol, guanidine isothiocyanate, β-merc ptopeth nol có trong dung dịch KTS1-D

có v i tr chính trong việc phá vỡ cấu trúc protein củ màng tế bào người và vỏ capsid của CT và NG Ngoài r , hoạt động biến tính protein củ các chất này cũng làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA có trong hỗn hợp DNA s u khi được giải phóng sẽ di chuyển vào ph nước Chloroform được bổ sung vào hỗn hợp nhằm thu hút hoàn toàn phenol r khỏi ph nước và giúp sự phân tách giữ ph nước và ph hữu c (phenol-chloroform) trở nên rõ ràng h n DNA trong ph nước s u đó được chuyển sang trạng thái không t n bằng isoprop nol Các gốc isoprop nol được loại

bỏ ra khỏi tủa DNA bằng ethanol 70% Dung dịch này đảm bảo việc làm sạch DNA

và giữ DNA ở trạng thái không t n Cuối c ng, tủ DNA được h t n trong dung dịch nước đã qu xử l để bất hoạt RNAse, DNase (KTS5) trước khi sử dụng cho

phản ứng PCR

Quy trình tách chiết DNA tủa

- Bước 1: Chuẩn bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tư ng ứng với số lượng mẫu Bổ sung 900 l dung dịch KTS1-D

- Bước 2: Chuyển 100 l dịch phết s ng các eppendorf 1,5 ml đã chuẩn bị

- Bước 3: Vortex để tan hết protein biến tính và để yên 10 phút

- Bước 4: Bổ sung 200 l dung dịch KTS2 Vortex kỹ

- Bước 5: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ ph ng

- Bước 6: Chuyển 600 l dịch nổi s ng các eppendorf 1,5 ml mới chứa sẵn

600 l dung dịch KTS3

- Bước 7: Vortex trộn đều Để yên 10 phút

- Bước 8: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ ph ng

- Bước 9: Đổ bỏ dịch nổi, giữ cặn Thêm 900 l dung dịch KTS4

- Bước 10: Ly tâm 13.000 v ng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ ph ng

- Bước 11: Đổ bỏ dịch nổi, giữ cặn Làm khô cặn trong 10 phút ở 60C

- Bước 12: H cặn trong 50 l KTS5 để thu nhận DNA

2.5.3.2 Phương pháp tách chiết DNA sử dụng cột silica

Nguyên tắc: Các mẫu dịch phết trong dung dịch bảo quản mẫu sẽ được ly giải

bằng các dung dịch đệm ly giải có chứ các muối, hó chất biến tính và chất tẩy để giải phóng DNA r khỏi chất nền Các dịch ly giải sẽ được làm sạch bằng cách ly tâm, cho phép loại bỏ các chất bẩn, cặn tế bào, các đại phân tử khỏi dịch nổi S u đó dịch nổi sạch được trộn với dung dịch đệm gắn cột và isoprop nol để tạo các điều kiện tối ưu cho sự liên kết củ DNA và màng silic Tiếp đó cột được rửa với hai dung dịch đệm khác nh u để loại bỏ hết các chất ức chế PCR DNA có thể được dung giải trong các dung dịch có nồng độ muối thấp và sẵn sàng được sử dụng ngay

cho các phản ứng PCR

Quy trình tách chiết DNA s ng cột silica

- Bước 1: Bật bồn ủ nhiệt khô ở 60oC Hút 1 ml dung dịch KTL2 vào eppendorf 1,5 ml (lượng này có thể d ng cho 20 mẫu) và ủ ở 60oC

- Bước 2: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml tư ng ứng với số lượng mẫu xét