Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phần máu, đàm giả định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

VÕ NGỌC NGUYÊN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM MÁU, ĐÀM GIẢ ĐỊNH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60420201 L

VÕ NGỌC NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM MÁU, ĐÀM GIẢ ĐỊNH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số : 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2017

-

VÕ NGỌC NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẪU BỆNH PHẨM MÁU, ĐÀM GIẢ ĐỊNH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số : 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học:TS TRẦN HỮU TÂM

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

Chữ ký:……… Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Chữ ký:……… Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 5 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2 Phản biện 1: PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

3 Phản biện 2: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

4 Ủy Viên: TS HOÀNG MỸ DUNG

5 Thư ký: TS HOÀNG ANH HOÀNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: VÕ NGỌC NGUYÊN MSHV: 1570768

Ngày, tháng, năm sinh: 20/12/1983 Nơi sinh: Cà Mau

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định phục vụ công

tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Nhiệm vụ : Nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định phục vụ côngtác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

 Nội dung : Khảo sát và xác định các loại bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định ở quy mô phòng thí nghiệm.Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, áp dụng quy trình sau tối ưu sản xuất mẫu

ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: ngày 16/01/2017

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: ngày 18/6/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS TRẦN HỮU TÂM

Tp HCM, ngày 11 tháng 5 năm 2017

1 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS TRẦN HỮU TÂM PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP HCM, đặc biệt là TS Trần Hữu Tâm, Giám đốc Trung tâm vừa là người thầy, là người anh kính mến Thầy đã quan tâm, chỉ dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, kỷ năng sống, làm việc quí báu và tạo điều kiện tốt nhất để tôi

có thể hoàn thành luận văn và công việc được giao Đồng thời, Tôi cũng không quên cảm ơn đến tập thể khoa Sinh phẩm đã góp nhiều công sức, truyền nhiều cảm hứng và mọi người cùng nhau hỗ trợ, thực hiện thí nghiệm để hoàn thành đúng tiến độ nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy, cô bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường đại học Bách khoa TP HCM nhất là PGS TS Nguyễn Thúy Hương,

cô luôn quan tâm, rất tâm huyết để truyền đạt cho tôi và nhiều thế hệ học viên nhiều kinh nghiệm, kiến thức, kỹ năng và niềm đam mê nghiên cứu khoa học

Con cảm ơn ba mẹ, người đã hy sinh cả đời để nuôi dạy con khôn lớn và thành người Em cảm ơn các anh, chị đã yêu thương, động viên, hỗ trợ em rất nhiều trong suốt thời gian em đi học và cho đến hôm nay

Anh gửi đến em, Nguyễn Thị Vân lời yêu thương Em là hậu phương vững chắc, giúp anh thêm nhiều niềm tin để vượt qua nhiều khó khăn, hoàn thành tốt việc học và nhiệm vụ

Trân trọng

VÕ NGỌC NGUYÊN

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Tiếng Việt:

Nội dung và kết quả đề tài bao gồm 3 chuyên đề từ việc khảo sát và lựa chọn được

2 loại mẫu bệnh phẩm thường gặp ở các Phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là mẫu đàm

với 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii và mẫu máu với 2 chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii

Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman sàng lọc các yếu tố lý, hóa ảnh hưởng đến nồng độ vi khuẩn trong 15 ngày bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả lựa

chọn được các yếu ảnh hưởng đến nồng độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên mẫu

đàm là K2HPO4 (mg/ml), sodium glycerophoasphate (mg/ml), sodium thioglycolate

(mg/ml) và nồng độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trên mẫu máu là sodium

glycerophosphate (mg/ml), glycerol (% w/w), pH Sau đó, tối ưu hóa các yếu tố ảnh bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) và thiết kế tâm đối xứng (CCD) Kết quả tối ưu hóa

của mẫu đàm chứa vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa đạt cao nhất 9,80 log và của mẫu máu chứa vi khuẩn Acinetobacter baumannii đạt cao nhất 7,24 log với mức tối ưu các

yếu tố tương ứng theo thứ tự K2HPO4 2,5 (mg/ml), sodium glycerophoasphate 7 (mg/ml), sodium thioglycolate 1,8(mg/ml) và sodium glycerophosphate 13,22 (mg/ml), glycerol 14,3 (% w/w), pH 5 7,3 Đánh giá sự tương thích giữa mô hình tối ưu và thực nghiệm vi

khuẩn Pseudomonas aeruginosa đạt 9,81 log và vi khuẩn Acinetobacter baumannii đạt

7,26 log

Chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất mẫu chi tiết gồm 4 giai đoạn và cũng như đã sản xuất mẫu ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá đạt độ đồng nhất, độ ổn định Qua kết quả nghiên cứu và áp dụng thực tế, quy trình nghiên cứu đã tạo ra được mẫu bệnh phẩm giả định hoàn toàn thích hợp cho việc sử dụng đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, tập huấn nâng cao tay nghề nhân viên xét nghiệm, góp phần đảm bảo chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Tiếng Anh:

The contents and results of study included 3 specific subjects from surveying and selecting of 2 types of specimen presenting frequently in microbiology laboratory such

as sputum sample with 2 strains bacteria Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumannii, and blood sample with 2 strains of specified bacteria Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii

The design optimum multifactorial experiments Plackett – Burman was used estimating level effect of physical and chemical factors on bacterial concentration during

15 days in laboratory condition As the result, K2HPO4 (mg/ml), sodium glycerophoasphate (mg/ml), sodium thioglycolate (mg/ml) were identified as significant

factors for sputum sample with strain bacteria Pseudomonas aeruginosa and sodium

glycerophosphate (mg/ml), glycerol (% w/w), pH were identified as significant factors

for blood sample with strain bacteria Acinetobacter baumannii After screening, these

factors were subsequently optimized using the response surface method (RSM) – Central

Composite Design (CCD) Pseudomonas aeruginosa‘s concentration 9,80 log and

Acinetobacter baumannii ‘s concentration 7,24 log in blood sample was the highest with

the optimal levels were K2HPO4 2,5 (mg/ml), sodium glycerophoasphate 7 (mg/ml), sodium thioglycolate 1,8 (mg/ml) and sodium glycerophosphate 13,22 (mg/ml), glycerol

14,3 (% w/w), pH 5 7,3, respectively Testing the model obtained with Pseudomonas

aeruginosa‘s concentration 9,81 log and Acinetobacter baumannii‘s concentration 7,26

log

We created the detailed process for manufacturing samples with 04 stages and also practical tested in laboratory volume and evaluate homogeneity and stability of these samples Throughout the study results and practical application, the study process makes stimulated samples quite suitable for using in quality control of clinical microbiological testing, in training for laboratory staffs, contribution in quality assurance of clinical microbiology

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Võ Ngọc Nguyên, học viên cao học chuyên ngành công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường đại học Bách khoa Tp HCM Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC HÌNH xiii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng 5

1.1 Bệnh phẩm đàm 5

1.2 Bệnh phẩm máu 6

1.3 Bệnh phẩm phân 6

1.4 Bệnh phẩm mủ 7

1.5 Bệnh phẩm nước tiểu 7

1.2 Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng 9

1.3 Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng 10

1.3.1 Trên thế giới 10

1.3.2 Tại Việt Nam 11

1.4 Mẫu ngoại kiểm Vi sinh 12

1.5 Tối ưu hóa 14

1.5.1 Ma trâ ̣n Plackett-Burman 14

1.5.2 Phương pháp RSM-CCD 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 18

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.2.1. Chủng vi khuẩn ATCC 18

2.2.2 Hoá chất và môi trường nuôi cấy 18

2.2.3 Trang thiết bị và cơ sở vật chất 19

2.3 Phương pháp và nội dung thí nghiệm 20

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20

2.3.2 Khảo sát và lựa chọn các dạng mẫu bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp 20

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mô phòng thí

nghiệm 23

2.3.3.1 Xây dựng sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất và các bước thực hiện 23

2.3.3.2 Xây dựng nội dung kiểm tra và tiêu chí kiểm tra ở các công đoạn 23

2.3.3.3 Lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm tra trong lô sản xuất 23

2.3.3.4 Kiểm tra độ đồng nhất 23

2.3.3.5 Kiểm tra độ ổn định 24

2.3.3.6 Định danh vi khuẩn 25

2.3.3.7 Xác định nồng độ vi khuẩn trên mẫu bệnh phẩm giả định 25

2.3.4 Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 26

2.3.4.1 Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 26

2.3.4.2 Thiết kế thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất 29

2.3.4.3 Thiết kế tối ưu hóa môi trường bảo quản theo RSM - CCD 30

2.3.4.4 Đánh giá mức độ tương thích của mô hình tối ưu trên thực nghiệm 31

2.3.4.5 Áp dụng quy trình tối ưu sản xuất và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của mẫu ở quy mô phòng thí nghiệm 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

2.1 Khảo sát bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại các PXN Vi sinh lâm sàng 33 2.1.1 Kết quả thống kê mẫu bệnh phẩm phòng xét nghiệm thường gặp 33

2.1.2 Kết quả thống kê chủng vi khuẩn phòng xét nghiệm thường gặp 35

2.1.2.1 Mẫu bệnh phẩm đàm 37

2.1.2.2 Mẫu bệnh phẩm máu 38

2.2 Xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy mô phòng thí nghiê ̣m 41 2.2.1 Quy trình tổng quát 41

2.2.2 Xây dựng chỉ tiêu kiểm tra vi khuẩn 43

2.2.3 Xây dựng chỉ tiêu kiểm tra môi trường cơ chất bê ̣nh phẩm 44

2.2.4 Kết quả xây dựng chỉ tiêu kiểm tra mẫu thành phẩm 44

2.3 Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 45

2.3.1 Kết quả sàng lọc yếu tố ảnh hưởng trong điều kiện sản xuất mẫu 46

2.3.1.1 Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định 46

2.3.1.2 Mẫu bệnh phẩm Máu giả định 50

2.3.2 Kết quả thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất 54 2.3.2.1 Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định 54

2.3.2.2 Mẫu bệnh phẩm máu giả định 55

2.3.3 Kết quả thí nghiệm tối ưu môi trường bảo quản theo RSM – CCD 57

2.3.3.1 Mẫu bệnh phẩm Đàm giả định 57

2.3.3.2 Mẫu bệnh phẩm máu giả định 60

2.3.4 Sản xuất mẫu ở quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu 64

2.3.4.1 Mẫu bệnh phẩm đàm giả định 64

2.3.4.2 Mẫu bệnh phẩm Máu giả định 67

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

4.1 KẾT LUẬN 71

4.2 KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

PHỤ LỤC 76

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

ATCC Americal Type Culture Collection Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Hoa Kỳ CFU Colony forming unit Đơn vị khuẩn lạc

EQAs External Quality Assessment schemes Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượng

ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thiết kế ma trâ ̣n Plackett-Burman 11 yếu tố 15

Bảng 2.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy 18

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.3 Tổng hợp các thành phần môi trường chuyên chở 27

Bảng 2.4 Mười một yếu tố khảo sát cho thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 28

Bảng 2.5 Thí nghiệm thiết kế sàng lọc 11 yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman 28

Bảng 2.6 Bố trí 20 thí nghiệm theo CCD 30

Bảng 3 1 Thống kê số lượng các loại mẫu bệnh phẩm 33

Bảng 3 2 Thống kê số lượng phòng xét nghiệm thường gặp các chủng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm 36

Bảng 3 3 Chủng vi khuẩn cho từng mẫu bệnh phẩm giả định 39

Bảng 3 4 Nội dung công việc, thời gian và các hồ sơ liên quan đến sản xuất mẫu 42

Bảng 3 5 Chỉ tiêu kiểm tra vi khuẩn 43

Bảng 3 6 Các chỉ tiêu kiểm tra môi trường cơ chất bệnh phẩm 44

Bảng 3 7 Các chỉ tiêu kiểm tra mẫu thành phẩm 44

Bảng 3.8 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 47

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của mẫu Đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 48

Bảng 3.10 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 49

Bảng 3.11 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Pseudomonas aeruginosa 50

Bảng 3.12 Bước nhảy mới của 03 yếu tố ảnh hưởng đến Acinetobacter baumannii 50

Bảng 3.13 Kết quả thí nghiệm sàng lọc theo Plackett-Burman đối với mẫu

Máu chứa Acinetobacter baumannii 51

Bảng 3.14 Kết quả phân tích mức ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát của

mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 52

Bảng 3.15 Kết quả tính bước nhảy mới cho 03 yếu tố ảnh hưởng đến

Bảng 3.18 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Đàm chứa P aeruginosa 55

Bảng 3.19 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu đàm chứa Pseudomonas aeruginosa 55 Bảng 3.20 Thiết kế thí nghiệm leo dốc của mẫu Máu chứa Acinetobacter

baumannii 56

Bảng 3.21 Phạm vi nghiên cứu của 3 yếu tố dùng trong RSM-CCD đối với

mẫu Máu chứa Acinetobacter baumannii 56

Bảng 3.22 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu đàm chứa

Pseudomonas aeruginosa 57

Bảng 3.23 Mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bê ̣nh

phẩm đàm giả đi ̣nh ở 100 ml và 500ml 60Bảng 3.24 Kết quả CCD của 20 thí nghiệm đối với mẫu máu chứa

Acinetobacter baumannii 61

Bảng 3.25 Mâ ̣t đô ̣ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu bê ̣nh phẩm

máu giả đi ̣nh ở 100 ml và 500 ml 63

Bảng 3.26 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả

định để đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 64 Bảng 3.27 Mật độ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong mẫu đàm giả

định trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 66 Bảng 3.28 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả

định để đánh giá độ đồng nhất ở quy mô phòng thí nghiệm 68 Bảng 3.29 Mật độ vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong mẫu máu giả

định trong 15 ngày bảo quản ở quy mô phòng thí nghiệm 69

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Tổng quan kỹ thuật chung thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh 9

Hình 2.1 Mẫu phiếu khảo sát 22

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỉ lệ phần trăm từng loại mẫu bệnh phẩm 35

Hình 3.2 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm đàm 38

Hình 3.3 Biểu đồ chủng vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm máu 39

Hình 3 4 Quy trình tổng quát sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định 41

Hình 3.5 Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa trên môi trường Cetrimide 47

Hình 3 6 Khuẩn lạc Acinetobacter baumannii trên môi trường MacConkey 51

Hình 3.7 Mặt đáp ứng nồng độ Pseudomonas aeruginosa theo tỷ lệ Sodium thioglycolate, Sodium glycerolphosphate và K2HPO4 59

Hình 3.8 Mặt đáp ứng nồng độ Acinetobacter baumannii theo tỷ lệ Sodium glycerolphosphate, Glycerol và pH 62

Hình 3.9 Mẫu bệnh phẩm đàm giả định chứa vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa sau khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 65

Hình 3.10 Biểu đồ Pseudomonas aeruginosa trong mẫu bệnh phẩm đàm giả định trong thời gian bảo quản 15 ngày 67

Hình 3.11 Mẫu bệnh phẩm máu giả định chứa vi khuẩn Acinetobacter baumannii sau khi phân phối vào lọ ở quy mô phòng thí nghiệm 68

Hình 3.12 Acinetobacter baumannii trong mẫu bệnh phẩm đàm giả định trong thời gian bảo quản 15 ngày 70

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Tại Quyết định 316/QĐ-TTg ngày 27/2/2016 của Thủ tướng Chính phủ về việc Phê duyệt Đề án Tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn giai đoạn 2016-2025, trong đó xác định mục tiêu là nâng cao chất lượng xét nghiệm y học để đảm bảo kết quả chính xác kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở liên thông, công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở y tế thực hiện xét nghiệm Ngoài ra, tại thông báo số 99/TB-VPCP của Văn phòng Chính phủ ngày 26/3/2015, Thủ tướng kết luận một trong những nhiệm vụ trọng tâm sắp tới của ngành y tế là nâng cao chất lượng xét nghiệm, tiến đến liên thông kết quả Muốn đạt được điều này, cần phải thực hiện các biện pháp đảm bảo chất lượng xét nghiệm [13] Vấn đề đảm bảo và kiểm tra chất lượng xét nghiệm y khoa là một trong những vấn đề cần phải thực hiện, được Bộ

Y tế, Sở Y tế quy định thành những yêu cầu bắt buộc đối với các phòng xét nghiệm, trong những vấn đề về đảm bảo chất lượng xét nghiệm thì ngoại kiểm tra chất lượng

là công cụ đánh giá quan trọng bên cạnh nội kiểm tra và đã được quy định, hướng dẫn chi tiết trong thông tư 01/2013/TT-BYT do Bộ Y tế ban hành [1], [3]

Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM là cơ quan được giao chức năng thực hiện triển khai ngoại kiểm tra chất lượng để giúp các phòng xét nghiệm y khoa nâng cao chất lượng và tiến đến đạt các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế Trung tâm lần đầu tiên đã triển khai chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh cho các phòng xét nghiệm y khoa từ năm 2008 – 2009, qua ghi nhận đã có những tác động tích cực đến kết quả xét nghiệm vi sinh thực hiện trên bệnh nhân [8] Tuy nhiên, trong quá trình chuẩn bị mẫu còn một số vấn đề chưa giải quyết được như: sự đồng nhất của mẫu, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản và thay thế các yếu tố môi trường bằng nguồn nguyên liệu giá rẻ, vì vậy cần tiến hành nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định để làm rõ các luận cứ khoa học trước khi sản xuất hàng loạt và

áp dụng trong đánh giá chất lượng xét nghiệm vi sinh tại các phòng xét nghiệm theo thường quy hoặc kiểm tra đột xuất

Xét nghiệm vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm quan trọng trong xét nghiệm y khoa, kết quả xét nghiệm vi sinh là căn cứ để đưa ra các quyết định về phương hướng điều trị, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong cộng đồng, vì vậy đòi hỏi kết quả xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện, phòng xét nghiệm phải tin cậy Một trong những công cụ để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm là ngoại kiểm tra chất lượng, cần phải có các mẫu kiểm chuẩn [9]

Do đó, việc nghiên cứu sản xuất các mẫu bệnh phẩm giả định thường gặp phục

vụ cho công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng là vô cùng cấp thiết, nhất là các mẫu bệnh phẩm máu và đàm giả định vì các mẫu này có tầng suất thực hiện nhiều, phổ biến tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng Vì vậy, chúng tôi

thực hiện nghiên cứu đề tài: ”nghiên cứu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả

định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng” nhằm:

 Kiểm tra năng lực và giúp nâng cao chất lượng, khả năng xét nghiệm của phòng xét nghiệm

 Nâng cao chất lượng phòng xét nghiệm, giúp kết quả xét nghiệm vi sinh lâm sàng tin cậy

 Tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các phòng xét nghiệm, giúp tiết kiệm chi phí và thời gian cho người bệnh

 Giúp phòng xét nghiệm có cơ hội tiếp cận, diễn tập với nhiều tình huống, nhiều chủng loại vi khuẩn có nguy cơ tiềm ẩn các dịch bệnh, luôn trong tình trạng sẵn sàng ứng phó với các dịch bệnh nguy hiểm cho cộng đồng

 Cung cấp dữ liệu tham mưu cho cơ quan quản lý trong việc xây dựng các tiêu chuẩn, quy chuẩn chất lượng xét nghiệm

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Lựa chọn các loại mẫu bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất tại

các phòng xét nghiệm

- Xây dựng quy trình tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả

định, các tiêu chuẩn kiểm tra nguyên vật liệu và mẫu bệnh phẩm giả định

- Xây dựng công thức tối ưu sản xuất mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định; sản xuất mẫu ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của

mẫu

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Khảo sát và xác định các loại bệnh phẩm và vi khuẩn gây bệnh thường

gặp tại các phòng xét nghiệm

3.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng quát dùng sản xuất mẫu bệnh phẩm

máu, đàm giả định ở quy mô phòng thí nghiệm

3.3 Tối ưu hóa điều kiện sản xuất, áp dụng quy trình sau tối ưu sản xuất

mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định ở qui mô phòng thí nghiệm, đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu:

- Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman

- Thiết kế thí nghiệm leo dốc bằng phương pháp tối ưu hóa theo đường dốc nhất

- Thiết kế tối ưu hóa môi trường bảo quản theo RSM - CCD

- Đánh giá mức độ tương thích của mô hình tối ưu trên thực nghiệm

- Áp dụng quy trình tối ưu sản xuất và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định của mẫu ở quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Quy trình và công nghệ sản xuất mẫu ngoại kiểm được các công ty cung cấp mẫu ngoại kiểm trên thế giới bảo mật rất chặt chẽ vì đây là vấn đề thương mại của các công ty, tại Việt Nam chưa có bất kỳ hướng dẫn hoặc quy trình nào về sản xuất

và tiêu chuẩn mẫu ngoại kiểm sử dụng trong đánh giá độ thành thạo của phòng xét nghiệm Do đó việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng có tính mới và ý nghĩa về khoa học và thực tiễn như sau:

 Tạo ra quy trình kỹ thuật chế tạo mẫu bệnh phẩm giả định phục vụ công tác kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng, cùng với tiêu chuẩn kiểm nghiệm, giám sát toàn bộ các công đoạn của việc chế tạo mẫu, đảm bảo độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu

 Mẫu bệnh phẩm máu, đàm giả định lần đầu tiên có quy mô nghiên cứu sản xuất có hệ thống ở Việt Nam, giúp chủ động các mục tiêu và kế hoạch triển khai kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

 Thông qua công tác kiểm tra chất lượng, kết quả xét nghiệm vi sinh ngày càng tin cậy, nâng cao chất lượng, tạo sự thống nhất trong xét nghiệm, hướng đến

sự tin tưởng và thừa nhận kết quả lẫn nhau giữa các bệnh viện, phòng xét nghiệm ở Việt Nam nói chung, trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng

 Bên cạnh việc phục vụ công tác đánh giá - kiểm tra, mẫu bệnh phẩm giả định còn giúp các phòng xét nghiệm có thể diễn tập, chuẩn bị đối phó với các tình huống dịch bệnh có thể xảy ra

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Xét nghiệm Vi sinh lâm sàng là một trong các lĩnh vực xét nghiệm cơ bản và trọng yếu trong các xét nghiệm cận lâm sàng, là căn cứ trong việc đưa ra quyết định

về phương hướng điều trị lâm sàng, chỉ định kháng sinh, phát hiện và kiểm soát dịch bệnh trong cộng đồng, vì vậy đòi hỏi xét nghiệm Vi sinh tại các bệnh viện, phòng xét nghiệm phải tin cậy, chính xác Những yếu tố tác động quyết định kết quả xét nghiệm bao gồm nhân sự, điều kiện môi trường làm việc, kỹ thuật xét nghiệm, phương pháp xét nghiệm, trang thiết bị, do đó, cần phải thực hiện kiểm soát, kiểm tra chất lượng xét nghiệm nhằm đảm bảo được sự tin cậy của các kết quả, từ đó giúp cho công tác điều trị, dự phòng, được tốt, góp phần chăm sóc và bảo vệ sức khỏe người bệnh [7] Các dạng bệnh phẩm thường gặp trong xét nghiệm Vi sinh lâm sàng mà các phòng xét nghiệm thường tiếp nhận bao gồm [12],[18],[30],[34],[35]:

1.1 Bệnh phẩm đàm

Xét nghiệm đàm rất quan trọng để chẩn đoán các bệnh đường hô hấp, thông dụng nhất là dùng để kiểm tra trực khuẩn Koch, xác định bệnh lao phổi, trong trường hợp này xét nghiệm đàm trở thành một yếu tố quyết định có giá trị hơn cả lâm sàng

và X-quang

Đối với các bệnh của bộ phận lân cận như gan, tim, áp xe gan có lỗ rò sang phổi, viêm màng phổi,… xét nghiệm đàm cũng cho thêm các yếu tố chẩn đoán bệnh chính xác hơn

Bệnh phẩm đàm thường có màu trắng, vàng, hoặc hơi xanh, không có mùi hay

có mùi đặc trưng, chứa các vi khuẩn thường gặp như:

Heamophilus influenzae;

Streptococcus pneumoniae;

Moraxella catarrhalis;

Staphylococcus aureus;

đỏ, mùi tanh đặc trưng, trong các trường hợp nhiễm khuẩn huyết, phòng xét nghiệm thường phân lập được các vi khuẩn:

Bình thường, phân hơi mềm và có dạng như hình ống, có màu tuỳ thuộc bệnh

và vi khuẩn gây bệnh, một số vi khuẩn của bệnh phẩm phân:

Salmonella sp., Shigella sp.;

Các Escherichia coli gây bệnh;

Staphylococcus aureus (có enterotoxin);

Vibrio cholerae và các Vibrio khác;

Campylobacter jejuni và các Campylobacter sp khác;

Yersinia enterocolitica và các Yersinia khác;

Clostridium difficile (có toxin);

Các vi khuẩn difficile trong phân Plesiomonas sp., Aeromonas sp

1.4 Bệnh phẩm mủ

Mủ là chất ngoại tiết được tống ra trên hay trong mô trong một quá trình bệnh

lý Bệnh phẩm mủ thường có màu trắng đục ngả xanh hay vàng đỏ tuỳ thuộc bệnh lý

và thường có khác vi khuẩn như:

Enterobacteriaceae Pseudomonas Streptococci (các loài khác) Clostridium perfringens Bacteroides

Staphylococci coagulase (-)

1.5 Bệnh phẩm nước tiểu

Xét nghiệm nước tiểu giúp cho chẩn đoán một cách tương đối chính xác các bệnh về gan, thận, tuyến nội tiết, chuyển hóa các chất trong cơ thể, thai nghén, sự bài tiết các chất thuốc đưa vào cơ thể, nhiễm khuẩn và ký sinh trùng

Bình thường, nước tiểu mới ra trong hoặc hơi vàng, các vi khuẩn thường có trong các mẫu bệnh phẩm nước tiểu như:

Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.…);

Enterococcus spp.;

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus;

Hình 1 1 Tổng quan kỹ thuật chung thực hiện tại phòng xét nghiệm vi sinh

1.2 Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

Kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh là một phần của đảm bảo chất lượng trong phòng xét nghiệm xét nghiệm Vi sinh Kiểm tra chất lượng xét nghiệm có hai công cụ quan trọng là ngoại kiểm tra và nội kiểm tra:

Nội kiểm tra chất lượng (IQC) do phòng xét nghiệm tự làm thường quy theo một quy trình khoa học xác định, mang tính chủ quan nhằm mục đích [5]:

 Phát hiê ̣n sai số, xác đi ̣nh loa ̣i sai số và tính sai số toàn bô ̣;

 Tìm nguyên nhân gây ra sai số và đề xuất biê ̣n pháp khắc phu ̣c;

 Đánh giá đô ̣ tin câ ̣y của kết quả xét nghiệm, từ đó quyết đi ̣nh trả kết quả xét nghiệm hay làm la ̣i xét nghiệm đó;

 Đánh giá thiết bi ̣, phương pháp, hóa chất xét nghiệm;

 Đánh giá tay nghề của nhân sự thực hiê ̣n xét nghiệm

Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) mang tính khách quan, là công cụ kiểm tra chất lượng song song với nội kiểm tra Chương trình ngoại kiểm tra do một đơn vị bên ngoài tổ chức để các phòng xét nghiệm đăng ký tham gia thực hiện, nhằm mu ̣c đích [6], [35]:

 So sánh chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm khác nhau của mô ̣t thành phố, mô ̣t khu vực, mô ̣t nước (quốc gia), nhiều nước (quốc tế);

 Tìm nguyên nhân gây sai số và đề xuất biê ̣n pháp khắc phu ̣c;

 Làm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c công nhâ ̣n đa ̣t chất lượng quy đi ̣nh và chuẩn hóa các phòng xét nghiệm

1.3 Tình hình triển khai ngoại kiểm tra xét nghiệm (EQAs) vi sinh lâm sàng 1.3.1 Trên thế giới

Chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng được thực hiện tại hầu hết các nước trên thế giới với nhiều mức độ khác nhau từ sơ bộ cho đến rất chuyên biệt Tại châu Phi, các bệnh truyền nhiễm tạo thành một vấn đề y tế công cộng rất quan trọng

và sự bùng phát đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe [36] Các bệnh này ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế và xã hội và cần được nhắm mục tiêu thông qua kiểm soát dịch bệnh tích cực, phòng ngừa và các hoạt động giám sát [20]

Do đó vào năm 2002, 36 phòng xét nghiệm thuộc 29 quốc gia châu Phi tham gia vào chương trình ngoại kiểm vi sinh do WHO triển khai nhằm đánh giá khả năng chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh có nguy cơ tiềm ẩn trong các bệnh viêm não, tiêu chảy

và dịch bệnh Ngoài ra, 43 quốc gia và Tiểu vương quốc thuộc khu vực Trung Đông

cũng thực hiện ngoại kiểm tra vi sinh với mức độ phức tạp bằng cách thêm vào đánh giá chẩn đoán bệnh sốt rét và lao Tháng 10 năm 2007, hội thảo tại Manila (do WHO

chủ trì), gồm 17 nước khu vực châu Á về Đảm bảo chất lượng xét nghiệm y khoa kết

luận cần phải mở rộng EQAs Vi sinh lâm sàng Thái Lan là quốc gia trong khu vực lân cận Việt Nam, có triển khai ngoại kiểm tra tương đối đầy đủ các lĩnh vực xét nghiệm, riêng lĩnh vực Vi sinh chỉ ở mức phết nhuộm lame xác định vi khuẩn Gram

(+/-) và AFB

Tại Vương quốc Anh, chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng chủ yếu xác định vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm giả định (đàm, phân, dịch họng và vết thương), xác định độ nhạy kháng sinh, huyết thanh học và xác định nồng độ kháng thể trong huyết thanh [32]

1.3.2 Tại Việt Nam

Chương trình ngoại kiểm tra là một công cụ rất hữu ích trong so sánh liên phòng xét nghiệm, cũng như nâng cao chất lượng xét nghiệm Đối với lĩnh vực ngoại kiểm tra xét nghiệm vi sinh lâm sàng, phòng xét nghiệm thực hiện ngoại kiểm tra do Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP.HCM triển khai năm 2007 chiếm tỷ lệ 2,5 % và năm

2009 là 8,61 %, tỷ lệ này còn khá thấp so với số lượng các cơ sở có xét nghiệm vi sinh [10] Đến năm 2011, số lượng phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm vi sinh lâm sàng với Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm Tp.HCM tăng lên là 46 PXN và năm 2013 là 49 PXN, năm 2014 là 62 đơn vị, 2015 là 70 đơn vị, năm 2016 là 69 và năm 2017 khoảng 80 đơn vị [11]

Điều này cho thấy, ý nghĩa của chương trình ngoại kiểm tra vi sinh lâm sàng đã tác động tốt đến PXN Tuy nhiên, trong quá trình triển khai chương trình, còn tồn tại một số vấn đề như sự ổn định và đồng nhất về mẫu, tác động của môi trường trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng xét nghiệm cần phải được nghiên cứu thêm nữa Chương trình ngoại kiểm vi sinh của Vương quốc Anh (NEQAS) cũng gặp phải vấn

đề tương tự [30] Do đó, cần có những nghiên cứu về mẫu bệnh phẩm giả định phục

vụ cho chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh để góp phần nâng cao kỹ thuật cũng như khả năng chẩn đoán của phòng xét nghiệm

1.4 Mẫu ngoại kiểm Vi sinh

Mẫu ngoại kiểm vi sinh là các loại mẫu sử dụng trong các chương trình ngoại kiểm (EQAs) Vi sinh lâm sàng mà phòng xét nghiệm nhận được khi tham gia, có thể

là mẫu bệnh phẩm lâm sàng thật, các chủng vi sinh vật dưới dạng đông khô hoặc là các bệnh phẩm giả định đã được chuẩn bị đặc biệt mô phỏng bệnh phẩm lâm sàng Tùy đặc điểm dịch tễ của từng quốc gia mà việc chuẩn bị mẫu ngoại kiểm vi sinh bằng phương pháp đông khô hoặc mẫu bệnh phẩm giả định hướng đến kiểm tra và đánh giá khả năng của phòng xét nghiệm ở điều kiện địa phương [35]

Mẫu bệnh phẩm thật

Ưu điểm :

 Giống hoàn toàn mẫu phòng xét nghiệm nhận và thao tác hàng ngày

 Sát với thực tế xét nghiệm, bệnh cảnh lâm sàng

Nhược điểm :

 Số lượng ít, không đủ triển khai kiểm tra chất lượng cho nhiều phòng xét nghiệm

 Thu thập mẫu rất khó khăn, sau khi thu thập sẽ nan giải trong bảo quản

và vận chuyển về nơi triển khai ngoại kiểm (vi khuẩn có thể chết)

 Phải thu thập từ nhiều nguồn nên không đồng nhất, kém ổn định, không phù hợp với ngoại kiểm

 Không đa dạng được các bệnh cảnh hoặc không thể thiết kế theo mục tiêu để phòng xét nghiệm diễn tập, chuẩn bị

 Chất lượng mẫu không kiểm soát được

Chính vì nhược điểm trên, các nước không sử dụng mẫu bệnh phẩm thật cho ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm Vi sinh lâm sàng

Mẫu đông khô

Ưu điểm :

 Thời gian bảo quản lâu

 Thuận tiện trong vận chuyển xa, dài ngày

Nhược điểm :

 Chi phí đầu tư sản xuất cao nên giá thành cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế của các phòng xét nghiệm

 Chỉ phù hợp với một vài loại vi khuẩn có thể đông khô

 Kỹ thuật, thao tác và biện luận hoàn toàn khác xa với mẫu bệnh phẩm thật nên khả năng đánh giá phòng xét nghiệm, diễn tập kém

 Đặc biệt không giải quyết được yêu cầu giả định các tình huống ứng với những ca bệnh thực tế

Mẫu bệnh phẩm giả định

Ưu điểm :

 Kiểm soát được số lượng và chủng loại vi khuẩn trong mẫu

 Có đặc tính tương tự mẫu thật nên có thể thay thế mẫu thật trong ngoại kiểm vi sinh, ưu điểm nổi bật: tương tự mẫu phòng xét nghiệm nhận hàng ngày, bảo quản lâu hơn mẫu thật, chất lượng mẫu được kiểm soát,…

 Cung cấp được số lượng lớn cho ngoại kiểm vi sinh, chất lượng ổn định

 Được thiết kế chuyên biệt tùy thuộc: mục tiêu đánh giá - kiểm tra, nhu cầu diễn tập, các tình huống bệnh cảnh thực tế

Nhược điểm:

 Mẫu chứa vi khuẩn sống, khả năng chết cao trong quá trình vận chuyển

 Thời gian bảo quản mẫu ngắn ngày so với mẫu đông khô

 Không có công ty thương mại cung cấp

Mẫu bệnh phẩm đàm giả định đã từng được nghiên cứu và triển khai trong việc kiểm tra đánh giá phòng xét nghiệm vi khuẩn lao tại Nam Phi năm 2002, từ đó mẫu bệnh phẩm giả định được lựa chọn để nghiên cứu sản xuất và triển khai cho các chương trình kiểm tra chất lượng vi sinh lâm sàng, do các ưu điểm như: kiểm soát được số lượng và chủng loại vi khuẩn trong mẫu, có thể thay thế mẫu thật với những

ưu điểm như: thời gian bảo quản lâu hơn mẫu thật, chất lượng mẫu có thể kiểm soát được, có thể chủ động về nguồn mẫu cho chương trình ngoại kiểm vi sinh, hướng đến đánh giá từng mục tiêu theo khuyến cáo của các chuyên gia trong ngành và yêu cầu

xã hội đề ra Tuy nhiên, cho dù là dạng mẫu nào được dùng để sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm phải đạt được điều kiện tiên quyết là giống nhau (đồng nhất) và ổn định [35]

1.5 Tối ưu hóa

1.5.1 Ma trâ ̣n Plackett-Burman

Thí nghiê ̣m Plackett-Burman do RL.Plackett và J.P.Burman phát minh lần đầu tiên vào năm 1946 Thí nghiê ̣m này dùng để sàng lo ̣c các yếu tố quan tro ̣ng để tăng năng suất trong nông nghiê ̣p Có thể thiết kế tự đô ̣ng bằng các phần mềm Minitab, MSTAT, Design expert, Toolbox…[28]

Thí nghiê ̣m Plackett-Burman là mô ̣t phương pháp thực hiê ̣n hiê ̣u quả, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được giá tri ̣ tối ưu của các yếu tố theo Plackett-Burman, xác đi ̣nh được các biến cần kiểm soát nhất, duy trì sự lă ̣p la ̣i của thí nghiê ̣m, giới ha ̣n số lượng thí nghiê ̣m Ngoài ra nó còn cho kết quả đáng tin câ ̣y, tiết kiê ̣m chi phí và thời gian [28]

Bảng 1.1 Thiết kế ma trâ ̣n Plackett-Burman 11 yếu tố

(-) mã hóa mức dưới của biến

(+) mã hóa mức trên của biến

R1 thí nghiê ̣m 1

X1 biến 1

Dòng đầu tiên và cô ̣t đầu tiên được cho bởi Plackett RL, Burman JP Các dòng tiếp theo thành lâ ̣p bằng cách lấy dòng trước liền kề từ vi ̣ trí 1 đến vi ̣ trí thứ n-1 để thành lâ ̣p vi ̣ trí thứ 2 đến n của dòng tiếp theo

Công thức tính hê ̣ số ảnh hưởng của yếu tố thứ i:

𝐸𝑖 =∑ 𝑌𝑖𝑟

𝑁+1 𝑟=1

𝑁

1.5.2 Phương pha ́ p RSM-CCD

Phương pháp đáp ứng bề mă ̣t (RSM - Response Surface Method – Central Composite Designs) đã được áp du ̣ng để xác đi ̣nh điều kiê ̣n tối ưu các chỉ tiêu theo dõi Ảnh hưởng của các nhân tố đô ̣c lâ ̣p đến các chỉ tiêu theo dõi được xác đi ̣nh bằng

phương pháp quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m Các biến đô ̣c lâ ̣p được mã hóa theo phương trình [24]:

𝑋𝑖 =𝑥𝑖 − 𝑥𝑐𝑝

∆𝑥𝑖Trong đó: xi: là giá tri ̣ thực của biến Xi

xcp: là giá tri ̣ trung bình của khoảng biến đổi và ∆𝑥𝑖 là khoảng thay đổi

Ảnh hưởng của các nhân tố tới các hàm mu ̣c tiêu được mô tả theo mô hình bâ ̣c

2 với phương trình như sau:

j i ij n

i i ii n

i i

b b

Y

2

1 1

0

Trong đó:

Y: giá trị chỉ tiêu theo dõi

bo: hệ số hồi quy bậc 0

xi: yếu tố được mã hóa ảnh hưởng đến Y

bi: hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố xi với Y

bij: hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời xi và xj với Y

bii: hệ số hồi quy bậc 2 mô tả ảnh hưởng của nhân tố xi với Y

Phương án cấu trúc có tâm CCD: là mô ̣t trường hợp đă ̣c biê ̣t trong nhóm các

mô hình quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m, được cấu thành từ 3 thành phần [24]:

- Nhân: là một phương án tuyến tính với 2k đỉnh của một khối hình đều trong

không gian k chiều Nếu k> 5, có thể giảm bớt số thí nghiê ̣m bằng cách sử

du ̣ng phương án yếu tố từng phần 2 k-1

- 2k điểm sao (*) nằm trên các trục tọa độ của không gian yếu tố Các tọa độ của các điểm sao là (±α, 0, 0,…, 0), (0, ±α, 0,…, 0),…, (0, 0,…, 0, ±α) α là khoảng cách từ tâm phương án đến điểm sao gọi là cánh tay đòn Các điểm

sao là cần thiết để mở rộng không gian nghiên cứu khảo sát tác động của một yếu tố đơn để có thể tìm được các ước lượng của hệ số bii trong phương trình hồi quy bậc 2

- n0 thí nghiệm ở tâm phương án để tìm phương sai tái hiện

Cánh tay đòn α và số thí nghiệm n0 ở tâm được chọn phụ thuộc vào tiêu chuẩn tối ưu, thường là phương án trực giao hay phương án quay

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Kiểm chuẩn Xét nghiệm TP HCM Thời gian thực hiện 2015-2017

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Chủng vi khuẩn ATCC

Acinetobacter baumannii ATCC 19606

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

Streptococcus mitis ATCC 6249

Burkholderia cepacia ATCC 25608

Chủng vi khuẩn Streptococcus mitis được cho ̣n để nghiên cứu trong pha ̣m vi của đề tài đa ̣i diê ̣n cho Viridans streptococci

2.2.2 Hoá chất và môi trường nuôi cấy

Môi trường Blood Agar (BA), Brain Heart Infusion (BHI), Mac Conkey Agar (MC), Tryptic Soy Agar (TSA), Muller Hinton Agar (MHA), Urea Agar, Manitol Salt Agar (MSA), Cetrimide Agar, Tryptic Soy Broth (TSB), dung dịch McFarland chuẩn, dung dịch NaCl 0,85%

Bảng 2.1 Hóa chất và môi trường nuôi cấy STT Tên ho ́ a chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

1 Blood Agar (BA) Pháp – BD ISO 13485:2003

2 Brain Heart Infusion

STT Tên ho ́ a chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

5 Muller Hinton Agar

(MHA)

Đức – Merck Nhà sản xuất

6 Manitol Salt Agar

(MSA)

Pháp – Biokar Diagnostics

Dược điển châu Âu/USP

Đức – Merck Nhà sản xuất

10 Kit định danh API 20E BioMerieux - Pháp ISO 13485:2003

12 Kit định danh API

Staph

BioMerieux - Pháp ISO 13485:2003

2.2.3 Trang thiết bị và cơ sở vật chất

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bi ̣ Model Nhà sản xuất

1 Kính hiển vi quang ho ̣c CX41 Olympus – Nhâ ̣t

2 Tủ an toàn sinh học cấp II SC2 – 4A1 Esco – Singapore

4 Máy phân phối mẫu tự đô ̣ng Dose It P910 Integra – Thu ̣y Sĩ

5 Máy lắc ổn nhiê ̣t SI 500 Stuart – Anh

6 Nồi hấp tiê ̣t trùng KT – 30L ALP – Nhâ ̣t

10 Cân điê ̣n tử 4 số ML204 Mettler Toledo – Thu ̣y Sĩ

11 Máy đếm khuẩn la ̣c 8500 Funker Gerber – Đức

2.3 Phương pháp và nội dung thí nghiệm

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Khảo sát bệnh phẩm và

vi khuẩn gây bệnh thường gặp

Xây dựng quy trình sản xuất tổng quát

Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng

Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng theo đường dốc nhất

Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng theo RSM -

CCD

Đánh giá mức độ tương thích của mô hình tối

ưu trên thực nghiệm

SX mẫu ở quy mô PTN

và đánh giá độ đồng nhất, độ ổn định

Thiết kế mẫu phiếu khảo sát (Hình 3.2) và gửi đến phòng xét nghiệm Trong đó, đối với chủng vi khuẩn thường gặp [30], phòng xét nghiệm sẽ liệt kê chủng vi khuẩn

hiện diện trong loại bệnh phẩm với các chủng sau: Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Vibrio spp., Campylobacter spp., Neisseria spp.,

Pseudomonas spp., Burkholderia spp., Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp., Haemophilus spp và nhóm vi khuẩn khác Riêng họ Enterobacteriaceae, nhóm

nghiên cứu phân loại để khảo sát gồm các chủng Escherichia spp., Salmonella spp.,

Shigella spp., Enterobacter spp., Edwardsiella spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Providencia spp., Citrobacter spp., Serratia spp và các chủng còn lại

Phòng xét nghiệm sẽ điền thông tin vào mẫu phiếu khảo sát và gửi lại cho nhóm nghiên cứu

PHIẾU KHẢO SÁT MẪU BỆNH PHẨM VI SINH Tên đơn vị :

Bảng 1 Phân loại bệnh phẩm STT Loại Bệnh phẩm Tần suất thực hiện XN

PXN vui lòng ghi vi khuẩn thường gặp (từ hay gặp nhất đến ít gặp nhất):

Đối với họ vi khuẩn Enterobacteriaceae thì khai thông tin chi tiết vào bảng sau:

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất mẫu bệnh phẩm giả định ở quy

mô phòng thí nghiệm

2.3.3.1 Xây dựng sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất và các bước thực hiện

Căn cứ theo các hướng dẫn của ISO Guide 34:2000 về yêu cầu cần thiết của nhà sản xuất mẫu chuẩn

2.3.3.2 Xây dựng nội dung kiểm tra và tiêu chí kiểm tra ở các công đoạn

Kiểm tra nguyên vật liệu đầu vào: kiểm tra theo tiêu chuẩn chất lượng của nhà sản xuất

Kiểm tra đặc tính vi khuẩn: kiểm tra tính chất của vi khuẩn theo qui định Kiểm tra môi trường nuôi cấy: xây dựng tiêu chí kiểm tra phù hợp với từng loại môi trường

Kiểm tra quy trình sản xuất: xác định công đoạn và nội dung kiểm tra

Kiểm tra thành phẩm: xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bao gồm các tiêu chí chất lượng

và phương pháp thử theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam III, WHO và Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [2],[16],[35]

2.3.3.3 Lấy mẫu ngẫu nhiên để kiểm tra trong lô sản xuất

Áp dụng công thức lấy mẫu n = 0,4√𝑁 (tối thiểu số lượng mẫu cần lấy là n ≥ 10) để xác định số lượng mẫu cần lấy [2] Phương pháp lấy ngẫu nhiên được thực hiện bằng cách đánh số thứ tự các lọ trong lô từ nhỏ đến lớn (theo hàng dọc hoặc hàng ngang), sử dụng phần mềm Microsoft excel để lấy mẫu ngẫu nhiên

̅̅̅: nồng độ trung bình của mẫu sau thời gian lưu trữ (lô 2)

n1: cỡ mẫu của lô 1

n2: cỡ mẫu của lô 2

𝑠12: phương sai của lô 1

𝑠22: phương sai của lô 2

tlý thuyết: tra bảng phân phối t được giá trị có (n1+n2-2) bậc tự do, mức ý nghĩa α=0,05 Nếu tthực nghiệm < tlý thuyết: mẫu ổn định

Nếu tthực nghiệm > tlý thuyết: mẫu không ổn định

Tính xác suất của giá trị thống kê t: sử dụng phần mềm Excel để tính xác suất của giá trị thống kê

2.3.3.6 Định danh vi khuẩn

Sử dụng nguyên lý của Mac Faddin [26], cụ thể sử dụng bộ kit thương phẩm có sẵn trên thị trường là bộ Kit API để định danh vi khuẩn gồm các bước:

 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn

 Cho dịch vi khuẩn vào các giếng của bộ kit

 Ủ bộ kit ở 36oC ± 2 trong 18 – 24 giờ

 Đọc kết quả

 Lưu ý một số hướng dẫn riêng biệt cho vi khuẩn cụ thể theo nhà sản xuất

2.3.3.7 Xác định nồng độ vi khuẩn trên mẫu bệnh phẩm giả định

Phương pháp đếm sống

Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1 đến 10-9 Mỗi bậc pha loãng là 10-1 được thực hiện bằng cách dù ng 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có

độ pha loãng trước đó) thêm vào 9 ml nước muối NaCl 0,85% Sau khi vortex kỹ sẽ

có độ pha loãng 10-1 Tiếp tục thao tác tương tự như trên cho đến khi thu được các dung dịch có nồng độ từ 10-2 đến 10-9

Dùng Pipette và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa vi khuẩn kiểm tra của mẫu bệnh phẩm giả định ở 03 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau lên

bề mặt đĩa môi trường phân lập thích hợp (BA, TSA, ), mỗi độ pha loãng thực hiện

03 đĩa

Mở đĩa Petri, đặt nhẹ nhàng que trải vô trùng lên bề mặt thạch của môi trường phân lập, trải đều dịch vi khuẩn của mẫu bệnh phẩm giả định lên bề mặt thạch (trong khi trải thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng ½ chu vi đĩa tạo điều kiện cho que trải trải dịch đều khắp bề mặt môi trường)