Nghiên cứu thành phần hóa học và quy trình trích ly hoạt chất có khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ cây cù đề breynia vitis idaea (burm f ) c e c fischer

 Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức chế enzyme tyrosinase in-vitro của các chất đã phân lập được.. Nhóm nghiên cứu đã trích ly cao n-butanol từ l

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN NGỌC THẢO MY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ QUY TRÌNH TRÍCH LY HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE TỪ CÂY CÙ ĐỀ

BREYNIA VITIS-IDAEA (BURM F.) C E C FISCHER

Chuyên ngành : Kỹ thuật hóa học

Mã số: 60 52 03 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ QUY TRÌNH TRÍCH LY HOẠT CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE TỪ CÂY CÙ ĐỀ

BREYNIA VITIS-IDAEA (BURM F.) C E C FISCHER.

CHUYÊN NGÀNH : KỸ THUẬT HÓA HỌC

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS LÊ XUÂN TIẾN

2 Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong

3 Phản biện 2: TS Lê Văn Minh

4 Ủy viên: TS Tống Thanh Danh

5 Thư ký: TS Phan Thị Hoàng Anh

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý

chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Ngọc Thảo My MSHV: 1570172 Ngày, tháng, năm sinh: 23/07/1992 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 60520301

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thành phần hóa học và quy trình trích ly hoạt chất có

khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ cây cù đề Breynia vitis-idaea (Burm f.) C

E C Fischer

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Điều chế cao tổng và cao phân đoạn từ lá cây cù đề Breynia vitis-idaea

(Burm f.) C E C Fischer

 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức chế enzyme tyrosinase

in-vitro của các cao phân đoạn nhằm xác định các cao tiềm năng để tiến hành phân lập

 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ các cao tiềm năng và xác định cấu trúc hóa học

 Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức

chế enzyme tyrosinase in-vitro của các chất đã phân lập được

 Xây dựng quy trình trích ly 6-O-benzoylarbutin bằng hệ dung môi an toàn

trong mỹ phẩm

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/07/2016

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 18/06/2017

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Lê Xuân Tiến, PGS TS Lê Thị Hồng Nhan

Tp HCM, ngày 14 tháng 07 năm 2017

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến toàn thể quý thầy cô trong khoa kỹ thuật hóa học trường Đại học Bách Khoa Tp HCM nói chung và bộ môn kỹ thuật hữu cơ nói riêng đã chỉ dạy tận tình và giúp đỡ rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Giảng viên hướng dẫn - thầy Lê Xuân Tiến đã tận tình hướng dẫn, định hướng, sửa chữa và đóng góp kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ rất nhiều trong quá trình thực hiện

và hoàn thành luận văn

Cô Lê Thị Hồng Nhan và chị Phan Nguyễn Quỳnh Anh đã hỗ trợ, đóng góp nhiều ý kiến bổ ích trong quá trình nghiên cứu

Cô Nguyễn Kim Minh Tâm, Cô Hà Cẩm Anh, cô Huỳnh Thư đã truyền đạt, giúp đỡ

và đóng góp những kiến thức vi sinh quý báu

Các thầy, cô quản lý dụng cụ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi sử dụng

cơ sở vật chất, máy móc, thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm bộ môn để thực hiện luận văn

Các anh chị, bạn bè, gia đình và người thân đã giúp đỡ, ủng hộ trong suốt quá trình học tập

Mặc dù đã cố gắng nhưng do kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ thầy

cô và các bạn Em xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài đã phân lập được 3 hợp chất, bao gồm: 6-O-benzoylarbutin, Breynioside B, 6-O-benzoyl-α-D-glucose từ lá Breynia vitis-idaea (Burm f.) C E C Fischer Cấu

trúc của các hợp chất được giải đoán dựa vào dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR,

HR-MS và so sánh với tài liệu tham khảo Cả ba hợp chất đều thể hiện khả năng bắt gốc

tự do DPPH và ức chế tyrosinase tốt Trong đó, 6-O-benzoylarbutin thu được với

hiệu suất khá cao (H = 3,6%) và thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase nổi trội Do đó,

đề tài đã tiến hành xây dựng quy trình trích ly và tinh chế 6-O-benzoylarbutin bằng

dung môi an toàn đạt được hiệu suất toàn quá trình là 5,9%

ABSTRACT

Three compounds were isolated from Breynia vitis-idaea (Burm f.) C E C Fischer’s leaves: 6-O-benzoylarbutin, Breynioside B, 6-O-benzoyl-α-D-glucose Their structures were determined by 1D-NMR, 2D-NMR, HR-MS spectroscopic analyses and in comparison with the reported data All compounds show significant

radical scavenging and tyrosinase inhibition activities Among of them,

6-O-benzoylarbutin was obtained with high efficiency (H = 3,6%) and showed superior tyrosinase inhibition activities Therefore, thesis has proceeded a process for the

extraction and purification benzoylarbutin by the safety solvent obtained

6-O-benzoylarbutin crystal with total process efficiency is 5,9%

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2017 Người thực hiện

Nguyễn Ngọc Thảo My

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 0

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

LỜI NÓI ĐẦU xiii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu chung về chi Breynia 1

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Breynia 1

1.1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Breynia 1

1.2 Tổng quan về cây cù đề 7

1.2.1 Khái quát chung 7

1.2.2 Đặc điểm sinh sản và phát triển 8

1.2.3 Đặc điểm phân bố 9

1.2.4 Thành phần hóa học sơ bộ của cây cù đề 10

1.3 Một số công dụng trong dân gian của cây cù đề 10

1.4 Một số nghiên cứu trong nước và quốc tế về cây cù đề 10

1.4.1 Các nghiên cứu quốc tế 10

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 15

1.5 Enzyme tyrosinase 16

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 17

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.3.1 Hóa chất 19

2.3.2 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp trích ly 20

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 20

2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 21

2.3.4.1 Định lượng phenol tổng theo phương pháp Folin – Ciocalteau 21

2.3.4.2 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH 21

2.3.4.3 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS 22

2.3.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase 23

2.4 Thực nghiệm 25

2.4.1 Thu hái và xử lí nguyên liệu 25

2.4.2 Điều chế và thu cao 25

2.4.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của cao tổng và cao phân đoạn 28

2.4.3.1 Kháng oxy hóa 28

2.4.3.2 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase 30

2.4.4 Phân lập các hoạt chất trong cao 31

2.4.4.1 Sắc ký cột cao ethylacetate 31

2.4.4.2 Sắc ký cột cao n-butanol 34

2.4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được 37

2.4.6 Xây dựng quy trình trích ly 6–O–benzoylarbutin 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu 40

3.1.1 Định danh thực vật 40

3.1.2 Độ ẩm và hàm lượng tro nguyên liệu 40

3.2 Điều chế cao tổng và cao phân đoạn 41

3.2.1 Điều chế cao tổng 41

3.2.2 Điều chế cao phân đoạn 42

3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng và cao phân đoạn 44

3.3.1 Chất đối chiếu vitamin C 44

3.3.2 Cao tổng và cao phân đoạn 44

3.4 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase 46

3.4.1 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của β-arbutin 46

3.4.2 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các cao 47

3.5 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất trong các cao phân đoạn 48

3.5.1 Hợp chất F17 48

3.5.2 Hợp chất F19 52

3.5.3 Hợp chất B11 56

3.6 Đánh giá hoạt kháng oxy hóa của các hợp chất đã phân lập 59

3.7 Khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất đã phân lập 61

3.8 Xây dựng quy trình trích ly 6–O–benzoylarbutin 62

3.8.1 Lập đường chuẩn gallic acid và đường chuẩn 6 –O–benzoylarbutin 63

3.8.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly 63

3.8.2.1 Khảo sát độ cồn 63

3.8.2.2 Khảo sát tỷ lệ rắn/lỏng 64

3.8.2.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly 65

3.8.2.4 Khảo sát thời gian trích ly 66

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70

4.1 Kết luận 70

4.2 Kiến nghị 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Một số hình ảnh về cù đề 9

Hình 1 2 Một số terpenic glycoside 11

Hình 1 3 Một số phenolic glycoside 11

Hình 2 2 Phản ứng trung hòa DPPH 22

Hình 2 3 Quá trình tạo thành gốc tự do ABTS●+ 23

Hình 2 4 Quy trình sinh tổng hợp melanin 24

Hình 2 5 Sơ đồ tổng quát quy trình chiết cao tổng và cao phân đoạn 26

Hình 2 6 Quy trình trích ly 6-O-benzoylarbutin 38

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất trích ly cao phân đoạn 43

Hình 3 2 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH và ABTS của vitamin C 44

Hình 3 3 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của các cao 45

Hình 3 4 Giá trị IC50 của các cao chiết 45

Hình 3 5 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của β-arbutin 46

Hình 3 6 Khả năng ức chế tyrosinase của cao tổng và cao phân đoạn 47

Hình 3 7 Đồ thị thể hiện IC50 của các cao 47

Hình 3 8 Tương quan COSY và HMBC của hợp chất F17 50

Hình 3 9 6–O–benzoylarbutin 52

Hình 3 10 Tương quan COSY và HMBC của hợp chất F19 55

Hình 3 11 Breynioside B 56

Hình 3 12 Tương quan COSY của hợp chất B11 58

Hình 3 13 6–O–α-D-glucose 59

Hình 3 14 Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH và ABTS của các chất đã phân lập 59

Hình 3 15 Giá trị IC50 của các chất phân lập được so với chất chuẩn vitamin C 60

Hình 3 16 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất đã phân lập 61

Hình 3 17 Đồ thị thể hiện giá trị IC50 của các chất phân lập so với β-arbutin 61

Hình 3 18 Đường chuẩn gallic acid và 6-O-benzoylarbutin 63

Hình 3 19 Khảo sát độ cồn 64

Hình 3 20 Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng 65

Hình 3 21 Khảo sát nhiệt độ trích ly 66

Hình 3 22 Khảo sát thời gian trích ly 67

Hình 3 23 TLC và Phổ hấp thu UV – VIS của b) cao sau trích ly c) Tinh thể F17

sau khi kết tinh d) Tinh thể F17 phân lập từ SKC 68

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2 1 Hệ dung môi giải ly cột cao ethylacetate 32

Bảng 2 2 Hệ dung môi giải ly F19 34

Bảng 2 3 Hệ dung môi giải ly sắc kí cột cao n-butanol 35

Bảng 2 4 Hệ dung môi giải ly cột B11 36

Bảng 3 1 Cảm quan nguyên liệu lá cù đề 40

Bảng 3 2 Ngoại quan và tính chất cao tổng 41

Bảng 3 3 Các thông số điều chế cao tổng 42

Bảng 3 4 Ngoại quan và tính chất của cao phân đoạn 43

Bảng 3 5 So ánh dữ liệu phổ NMR của F17 và 6-O-benzoylarbutin 51

Bảng 3 6 So sánh dữ liệu phổ NMR của F19 và Breynioside B 55

Bảng 3 7 So sánh dữ liệu phổ NMR của B11 và 6-O-benzoyl-α-D-glucose 58

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

LỜI NÓI ĐẦU

Việt Nam là một quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á, có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng Tận dụng nguồn tài nguyên quý giá này, nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy tính ứng dụng rất cao của các loài dược liệu trong việc cung cấp các chế phẩm tự nhiên có giá trị trong lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm Cây cù đề là loài cây mọc hoang, vốn quen thuộc và phổ biến ở nước ta Tuy là một loài cây mọc dại nhưng chúng được biết đến với nhiều bài thuốc cổ truyền chữa bệnh như: trị sưng amidan, chống các chứng xuất huyết, trị đau dạ dày…

Các công trình nghiên cứu về đối tượng cù đề trên thế giới không nhiều và trong nước thì rất hạn chế nhưng đây là một đối tượng thực vật mới tiềm năng Do đó, việc tìm hiểu thành phần hóa học, hoạt tính của cây cù đề ở Việt Nam là một công

việc rất có ý nghĩa Chính vì những lý do đó, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và quy trình trích ly hoạt chất có khả năng ức chế enzyme

tyrosinase từ cây cù đề Breynia vitis-idaea (Burm.f.) C E C Fischer.” làm đề tài

nghiên cứu, nhằm góp phần tìm hiểu thêm và có những nghiên cứu khoa học chính xác về thành phần hóa học, dược tính cũng như định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sau này

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về chi Breynia

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Breynia

Trong hệ thực vật Việt Nam, Thầu dầu (Euphorbiaceae) được coi là họ lớn, đa dạng loài thứ tư trong số 305 họ thực vật bậc cao Ở Việt Nam, họ Thầu dầu hiện đã biết với 75 chi và trên 450 loài Các dạng sống gặp ở họ Thầu dầu có thể là cỏ hàng năm, cỏ nhiều năm, bụi, dây leo, gỗ nhỏ hoặc gỗ lớn Chúng phân bố khá rộng rãi ở các hệ sinh thái khác nhau từ các vùng ven biển, ruộng vườn, đồng cỏ đến các thảm cây bụi và các loại hình rừng thứ sinh hoặc nguyên sinh trên núi cao [1, 2]

Chi Breynia được đặt tên theo nhà thực vật học người Đức Jacob Breyne (1837 -

1897) là 1 chi lớn trong họ Thầu dầu Chi này bao gồm khoảng 25 loài thực vật phân phối rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái khác nhau, từ khu vực ven biển, ruộng vườn, đồng cỏ và một số loại rừng nguyên sinh trên núi [2, 3] Nhiều loài dược liệu

thuộc chi Breynia có nguồn gốc từ Trung Quốc, Đông Nam Á và các đảo ở Thái

Bình Dương

Các loài trong chi Breynia ở dạng cây bụi Lá mọc so le, xếp hai dãy, có cuống

Cụm hoa đơm ở nách, hoa đơn tính, không có cánh hoa Hoa đực có đài dạng con quay, chỉ nhị dính thành cột ở giữa, bao phấn dính nhau, có 2 ô, mở dọc Hoa cái có đài hợp, hình chuông có 6 mảnh, thành 2 vòng so le Bầu hình trứng, có khi cụt hoặc giãn ra, vòi nhụy ngắn, rời hay dính, ở giữa hay ở bên Quả nang, hay quả mọng, có đài, hạt có 3 cạnh [2, 3]

Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Breynia vẫn còn ít Nhưng

trong y học dân gian, một số loài được xem là dược liệu quý, được sử dụng để chữa bệnh kiết lỵ, chống viêm, hay bị rắn cắn [4]

1.1.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Breynia

Năm 1992, Nordin H Lojis, Ooi Beng Guan và các cộng sự đã phân lập được

Viroallosecurinine và ent-Phyllanthidine từ lá của loài Breynia coronata Nhóm nghiên cứu tiến hành trích ly lá Breynia coronata (7,14 kg) với MeOH, sau khi loại

bỏ dung môi thu được cao MeOH Tiếp tục trích ly cao MeOH với CHCl3 và

sulfuric acid, bay hơi dung môi thu được cắn, cắn này hòa tan vào n-BuOH, sau khi

bay hơi dung môi thu được 14,8 g cao n-BuOH Nhóm nghiên cứu tiến hành phân

lập cao này bằng sắc ký lớp mỏng điều chế trên TLC silica gel với hệ dung môi EtOAc-CHCl3 thu được 1 (viroallosecurinine, 24 mg) và 2 (ent-Phyllant hidine, 35

mg) [5]

Năm 2005, Butsarakham Supudompol, Sumphan Wongseripipatana và Kittisak

Likhitwitayawuid đã phân lập được 8 hợp chất từ lá của loài Breynia glauca Lá

Breynia glauca được thu hái tại tỉnh Chanthaburi vào tháng 04/1999 Sau khi rửa

sạch, phơi khô và xay nhuyễn, thu được 5 kg bột Breynia glauca khô Nhóm tiến hành trích ly nguyên liệu với các dung môi thu được các cao tương ứng, cao n- hexane (47 g), cao ethylacetate (63 g), cao n-butanol (21 g) Sau đó, nhóm tiến hành

phân lập cao EtOAc bằng sắc ký cột silica gel, cột Saphadex LH-20 thu được các

hợp chất: 3 (friedelin, 26 mg), 4 (3-oxo-sitosterone, 2 mg), 5 (friedelan 3-β-ol, 36 mg), 6 (β-sitosterol, 21 mg) Phân lập cao n-butanol (21g) bằng sắc ký cột silica gel

và cột Saphdex LH-20 thu được các hợp chất: 7 (kaempferol, 4 mg), 8 (arbutin, 16

mg), 9 (kaempferol-3-O-rutinoside, 7,6 mg), 10 (quercetin-3-O-glucoside, 4 mg)

Cấu trúc của các hợp chất phân lập được được xác định bằng phổ MS, 1H, 13C và so sánh với các tài liệu đã được công bố trước [6]

Năm 2007, Dahai Meng, Wenliang Chen và Weimin Zhao đã phân lập được 10 hợp

chất glycoside spiroketal chứa lưu huỳnh từ loài Breynia fruticosa Cấu trúc của các

hợp chất phân lập được xác định bằng phương pháp phổ và so sánh với các tài liệu

đã công bố trước Phần trên mặt đất của Breynia fruticosa được thu hái tại tỉnh

Guangxi, Trung Quốc vào tháng 06/2015 Nguyên liệu sau khi được rửa sạch, sấy

khô và xay nhuyễn, thu được 30 kg bột Breynia fruticosa Nhóm tác giả tiến hành

trích ly bột nguyên liệu với ethanol 95% ở nhiệt độ phòng, sau khi lọc, bay hơi dung môi thu được cao EtOH Sau đó tiến hành trích ly cao EtOH với CHCl3 và n-BuOH thu được các cao tương ứng Cao n-BuOH (800 g) sau đó được phân lập bằng sắc

ký cột Diaion D-101, cột silica gel, Saphadex LH-20 và HPLC thu được 10 hợp

chất: 11 (18 mg), 12 (137 mg), 13 (7 mg), 14 (9 mg), 15 (85 mg), 16 (14 mg), 17 (20 mg), 18 (16 mg), 19 (11 mg), 20 (10 mg) [7]

Năm 2010, Dahai-Meng, Jian Wu, Weimin Zhao đã tiến hành phân lập cao

n-butanol (800 g) từ bộ phận trên mặt đất của loài Breynia fruticosa (30,0 kg) và cao ethanol (10 g) từ bộ phận trên mặt đất của loài Breynia rostrata (5,0 kg) Kết quả

thu được 38 hợp chất, trong đó hợp chất 1-8 là các glycoside mà phần aglycon thộc các nhóm flavane, sesquiterpene, phenylprpanoid, phenolic…và 30 hợp chất glycoside còn lại đã được phân lập và xác định trong các nghiên cứu trước Nhóm

nghiên cứu đã trích ly cao n-butanol từ loài Breynia fruticosa và cao ethanol từ loài

Breynia rostrata, sau đó tiến hành phân lập các hợp chất từ hai cao bằng sắc ký cột

silica gel, Saphadex LH-20 với các hệ dung môi tương ứng Kết quả thu được các

hợp chất: 22 (18 mg), 23 (26 mg), 24 (100 mg), 25 (5 mg), 26 (9 mg), 27 (14 mg),

28 (28 mg), 29 (10 mg), 30 (43 mg), 31 (7 mg), 32 (9 mg), 33 (16 mg), 34 (15 mg),

35 (17 mg), 36 (45 mg), 37 (15 mg), 38 (68 mg), 39 (28 mg), 40 (20 mg), 41 (25 mg), 42 (14 mg), 43 (26 mg), 44 (8 mg), 45 (46 mg), 46 (145 mg), 47 (20 mg), 48

(22 mg), 49 (12 mg), 50 (27 mg), 51 (10 mg), 52 (28 mg), 53 (78 mg), 54 (70 mg),

55 (318 mg), 56 (197 mg), 57 (191 mg), 58 (627 mg), 59 (194 mg) [8]

Năm 2011, Ya-Ping Liu, Xiang-Hai Cai cùng các cộng sự đã phân lập được 10 hợp

chất từ rễ của Breynia fruiticosa, bao gồm các hợp chất triterpene và dẫn xuất của sterol Nhóm nghiên cứu đã tiến hành trích ly 8,5 kg rễ của Breynia fruiticosa

(nguyên liệu khô xay nhuyễn thành bột) bằng dung môi MeOH 90% Dịch trích sau khi lọc, bay hơi chân không thu được cao MeOH Cao MeOH được trích ly tiếp bằng EtOAc, thu được 120 g cao EtOAc Sau đó, nhóm tiến hành phân lập cao EtOAc bằng sắc ký cột silica gel, Saphadex LH-20, RP-15, thu được các hợp chất:

60-Breyceanothanolic acid (38 mg), 61-Fruticosie A (50 mg), 62-Fruticosie B (26 mg), 63-Fruticosie C (962 mg), 64-Fruticosie D (254 mg), 65-Fruticosie E (54 mg), 66-Fruticosie F (225 mg), 67-Fruticosie G (38 mg), 68-Zizyberanali acid (17 mg), 69-Isoceanothic acid (721 mg) [9]

Năm 2013, Yan-Ping Li, Liao-Bin Dong cùng các cộng sự đã phân lập được bốn

hợp chất trong cao chiết ethylacetate của toàn cây Breynia fruiticosa, trong đó (70),

(71) là hai hợp chất dihydrobenzofuran neolignan mới và hai hợp chất đã biết gồm

9-9'-dihydroxy-3,4-methylenedioxy-3'-methoxy [7-O-4',8-5'] neolignan (72) và

(-)-machicendiol (73) Nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập từ cao ethylacetate (340

g) được trích từ bột nguyên liệu toàn cây Breynia fruiticosa (10 kg) bằng sắc ký cột

Saphadex LH-20 với hệ dung môi giải ly H2O-MeOH thu được các đoạn FA-FE Tiếp tục sắc ký đoạn FB (38,5 g) bằng cột silica gel với hệ dung môi (CHCl3-MeOH) thu được các đoạn nhỏ B1-B5, thu được bốn hợp chất Sau đó tiến hành phân tách B2 bằng sắc ký cột silica gel (PE-Me2CO) thu được B2-1, B2-2, B2-3, trong

đó hợp chất 70 (2,0 mg) và 73 (10,0 mg) từ đoạn B2-2 Phân đoạn B2-3 sau khi sắc ký với cột RP-18 (MeOH-H2O) và tinh chế bằng cột Saphadex LH-20 = (CHCl3-

MeOH) thu được hợp chất 71 (4,5 mg) Đoạn B3 được phân tách bằng cột silicagel (CHCl3-Me2CO) thu được hợp chất 3 (3,0 mg) [10]

Loài: vitis – idaea

Tên Việt Nam: cù đề

Tên nước ngoài: Indian snowberry (Anh), Shan qi jing (Trung Quốc), Hime kobannoki, Takasago kobannoki (Nhật), Hujan panas, Semomah, Seruyan (Malaysia), Ang-sim-a, Ang-chu-a, Ang-a-chu (Đài Loan), Phiafān, Dapphit (Thái Lan) [1]

Tên khoa học: Breynia vitis-idaea (Burm f.) C E C Fischer

Hay còn gọi là Breynia rhamnoides (Retz.) Muell.Arg, Phyllanthus rhamnoides

Retz [2]

1.2.2 Đặc điểm sinh sản và phát triển

Cây dạng cây bụi, cao 0,5–3 m, không lông, vỏ nâu, nhánh ngắn dài 5-7 cm màu đỏ lúc còn non Lá xếp hai dãy, trải ra, mảnh, màu đo đỏ lúc non Lá xếp hai dãy, phiến mỏng hình trái xoan, mũi mác hay xoan bầu dục, đài tới 2,5 cm, rộng 1,6 cm, mặt trên xanh đậm, mặt dưới xanh mốc mốc, gân bên 3-5 đôi, cuống lá dài 2–4 mm,

lá kèm hình tam giác, có mũi nhọn, dài 1–2 mm

Cụm hoa ở nách lá, hoa đực xếp 2-3 cái một, hoa cái đơn độc ở phía ngọn các nhánh Hoa đực có đài dạng con quay với mép nguyên hay hơi lượn sóng, hình trụ

có 3 thùy ở đỉnh, mang bao phấn Hoa cái có đài hình chuông chia ở đỉnh thành 6 lá đài, bầu hình trứng dẹp với 3 vòi nhụy ngắn Quả nang hình trứng dẹp ở đỉnh, đường kính 5 mm, cao 6 mm, màu đỏ

a Cây

Hình 1 1 Một số hình ảnh về cù đề 1.2.3 Đặc điểm phân bố

Cây cù đề ưa sáng, mọc dại ở bờ ruộng, hay mọc thành bụi vùng thấp đến các rừng rụng lá ở độ cao 1000 m Cây hiện diện ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan, quần đảo Malaysia và Philippines [11] Ở nước ta, cây mọc tại nhiều nơi từ miền Bắc vào tới Lâm Đồng, Khánh Hòa, Bà Rịa - Vũng Tàu (Côn Đảo), Kiên Giang (đảo Phú Quốc) và các tỉnh miền Tây Nam Bộ

1.2.4 Thành phần hóa học sơ bộ của cây cù đề

Phân tích sơ bộ hóa của các chất chiết xuất từ lá của cây cù đề cho thấy sự hiện diện của tinh dầu, carotenoids, tannin, acid hữu cơ Thân cũng có sự hiện diện của các hợp chất có trong lá, ngoài ra, thân cây còn có một hàm lượng nhỏ saponin Rễ chứa

β-sitosterol

1.3 Một số công dụng trong dân gian của cây cù đề

Ở Ấn Độ, vỏ và lá cù đề được phơi khô, tán bột làm thuốc khi bị sưng amidan và hạch hạnh nhân [12]

Ở Malaysia có dân tộc ít người dùng lá làm rau ăn, dịch lá được dùng làm thuốc bổ trợ cho phụ nữ uống sau khi sinh [13]

Ở Philippines vỏ cây có vị se dùng làm thuốc chống các chứng xuất huyết, nước sắc

rễ dùng làm thuốc súc miệng trị đau răng, nước hãm lá dùng trị đau dạ dày [14]

Ở Quảng Đông (Trung Quốc) toàn cây được sử dụng làm để chữa bệnh hen suyễn, sưng đau họng và bệnh mẩn ngứa Trong y học cổ truyền ở Trung Quốc, cù đề cũng được sử dụng để điều trị viêm phế quản mạn và làm lành vết thương [15]

Cộng đồng người Tamil lấy nước ép từ 10 gram lá tươi uống hai lần mỗi ngày liên tiếp trong 10 ngày để điều trị bệnh vàng da [14]

1.4 Một số nghiên cứu trong nước và quốc tế về cây cù đề

1.4.1 Các nghiên cứu quốc tế

Năm 2004, Hiroyuki Morikawa cùng các cộng sự đã phân lập được sáu hợp chất

terpenic glycoside và sáu hợp chất phenolic glycoside trong cao chiết n-butanol

(313 g) từ lá Breynia vitis-idaea (4,11 kg), trong đó: 72 (Turpinoside B-41,3 mg) và

77 (Betulabuside-27,3 mg) là hai hợp chất mới lần đầu được công bố Các terpenic glycoside còn lại bao gồm: 73 (Breyniaionosides A-18,1 mg), 74 (Breyniaionosides B-0,3 mg), 75 (Breyniaionosides C-5,6 mg), 76 (Breyniaionosides D-4,0 mg) Sáu phenolic glycoside chủ yếu là arbutin và các dẫn xuất của arbutin, bao gồm: 78 (Arbutin-85,0 mg), 79 (Robustaside A-11,4 mg), 80 (Eximine-95,0 mg) Trong đó:

81 (Isorobustaside A-4,7 mg), 82 (Breynioside A-127 mg), 83 (Breynioside B-76

mg) là ba hợp chất mới được tìm thấy trên loài Quá trình phân lập được thực hiện

bằng các kỹ thuật sắc ký như: sắc ký cột silica gel, cột nhựa trao đổi ion HP-20, HPLC Các hợp chất phân lập được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ và đối chiếu với các tài liệu đã công bố trước [16]

đó sửa đổi bởi Chabra cùng các cộng sự (1984) và Harborne (1998) Quá trình

nghiên cứu 11 thành phần hóa học được thực hiện trong 21 mẫu cho thấy lá Breynia

vitis-idaea chứa 9 thành phần có hoạt tính, bao gồm các alkaloid, flavonoid, tannin,

carbohydrate, protein, steroid/triterpenoids, axit amin, steroid và leuco-anthocyanins [3]

Năm 2010, Da-Hai Meng cùng các cộng sự đã phân lập được một glycoside

spiroketal mới có chứa lưu huỳnh là: 86 (Breynin I-13 mg), và một glycoside terpenoid mới là: 87 (Breyniaionoside E–12 mg), cùng với 10 hợp chất khác từ cao

MeOH của các bộ phận trên mặt đất loài Breynia vitis-idaea (1,0 kg) Hai cấu trúc

đã được tìm ra và công bố bằng phương pháp phân tích phổ HR – ESI – MS và phổ NMR [15]

Và trong năm 2010, Kumar và Narayana đã nghiên cứu một số loại dược liệu dùng

để chữa bệnh viêm khớp và thấp khớp ở bộ tộc Yanadi tại Sriharikota 23 loài đã

được tìm thấy có tác dụng khắc phục hai bệnh trên, trong đó có Breynia vitis-idaea Ngoài ra, lá Breynia vitis-idaea được sử dụng cùng với lá Dodonaea viscosa và

Dalbergia paniculata trong 2-3 ngày còn có tác dụng chữa bệnh sưng chân và các

bệnh về tinh hoàn [12]

Năm 2011, Bhandary và Chandrasherkar tiến hành nghiên cứu 57 loài dược liệu ven biển Karnakata bằng 34 phương pháp khác nhau để điều trị bệnh Herpes Các dược liệu được nghiền, trộn với nhau để điều trị các tổn thương trên da Trong đó, 25 loài

dược liệu được phát hiện có tính chất kháng khuẩn, kháng virus và lá Breynia

vitis-idaea là một trong số đó [17]

Và trong năm 2011, Chandrashekar, Gopal Joshi và Vaigundan đã tiến hành nghiên cứu tiềm năng chống oxy hóa của các cao chiết hexane, ethyl acetate và methanol

bằng phương pháp chiết soxhlet từ các bộ phận trên mặt đất của Breynia vitis-idaea,

sử dụng trong các thử nghiệm in-vitro và so sánh với các hợp chất chống oxy hóa

tiêu chuẩn như ascorbic acid và rutin Hoạt tính ức chế gốc tự do và chống oxy hóa của các cao chiết là do sự hiện diện của các hợp chất thuộc họ phenolic và flavonoid

O S O O

H H

OH OH

H

O

O O

87

trong các chất chiết xuất thực vật Những nghiên cứu này đã chứng minh hoạt tính

chống oxy hóa của các chiết xuất từ Breynia vitis-idaea [18]

Trong năm 2011, Navatre và các cộng sự tiến hành đánh giá hoạt tính kháng giun

sán của cao chiết từ lá Breynia rhamnoides trên sán dây, sán lá gan, giun lươn và

giun móc với hai nồng độ tương ứng là 100 và 200 mg/mL Thời gian cho sự ức chế nhu động đã được ghi nhận và so sánh với các loại thuốc tiêu chuẩn là piperazine citrate 15 mg/mL Nghiên cứu cho thấy các cao chiết cồn và cao chiết nước của

Breynia rhamnoides cho thấy hoạt động kháng giun mạnh [19]

Năm 2012, Mahajan và Chaudhari nghiên cứu 181 loại dược liệu ở Maharashtra

thuộc 67 họ khác nhau và tìm thấy flavonoid hiện diện trong lá của Breynia

vitis-idaea nhiều hơn trong rễ, vỏ cây và hạt [20]

Và trong năm 2012, Rasingam L và các cộng sự đã tiến hành khảo sát các loài cây

có tác dụng chữa đau răng trên đảo Andaman và Nicobar (Ấn Độ) Kết quả thu được 11 loài thực vật thuộc 10 chi và 8 họ khác nhau có hoạt tính chữa đau răng

Trong đó, Breynia vitis-idaea được báo cáo có khả năng chữa đau răng và đã được

sử dụng bởi người Tamil sống trên đảo Nhóm nghiên cứu cho rằng hoạt tính đó gây

ra bởi sự có mặt của 2-phenylethyl alcohol và 2-phenylaceto-nitrile trong cây [14] Năm 2013, Devi Prasad cùng các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các loại dược liệu được sử dụng bởi các bộ tộc Kurichia, Kuruma, Kattunaika, Adiya và Paniya huyện Wayanad, Kerala Trong đó, một nghìn loại thuốc được sử dụng trong các bộ tộc có nguồn gốc từ 500 loại dược liệu Trong số này, 10 loài đã được thường xuyên

sử dụng để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác nhau Các cao chiết methanol, cao diethyl ether và cao nước từ lá của các cây đã được sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn,

chống Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Aspergillus niger bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Cao methanol của Breynia vitis-idaea cho thấy đường kính vùng ức chế tối thiểu là 16 và 10 mm tương ứng đối với Escherichia coli và ,

Staphylococcus aureus Và cao diethyl ether của Breynia vitis-idaea cho thấy đường

kính vùng ức chế tối thiểu là 24 mm đối với Staphylococcus aureus [21]

Trong năm 2013, Thippeswamy và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các cao chiết từ nước và dung môi của 48 loài dược liệu thuộc 24 họ để đánh giá hoạt tính

kháng nấm của chúng Các thử nghiệm kháng nấm Fusarium verticillioides được

phân lập từ ngô và được so sánh với tiêu chuẩn fumonisin B1 của nó (FB1) Hoạt tính kháng nấm được thực hiện phương pháp pha loãng Kết quả cho thấy, cao ether

dầu của Breynia vitis-idaea cho thấy hoạt tính kháng nấm vừa phải với phần trăm

ức chế sợi nấm 33,9 ± 0,37% tại 2 mg/mL và MIC 2,0 mg/mL [22]

Trong năm 2014, Devi Prasad và các cộng sự đã báo cáo các hoạt tính kháng khuẩn

và kháng nấm của cao nước, cao diethyl ether và cao methanol trích ly từ lá của 20

loài dược liệu thuộc 16 họ khác nhau đối với Staphylococcus aureus, Escherichia

coli, Aspergillus niger và Microsporum racemosum Trong số đó, cao chiết

methanol của Breynia vitis-idaea có tác dụng ức chế đối với Escherichia coli và

Microsporum racemosum Cao methanol, cao diethyl ether và cao nước của Breynia vitis-idaea có tác dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus [23]

Năm 2015, Venkatesh cùng các cộng sự tiến hành nghiên cứu các hoạt tính kháng

khuẩn của cao chiết alkaloid của các cây Acacia catechu, A ferruginea,

Adenanthera Pavonina, Albizia amara, A.saman, Breynia vitis-idaea, Senna spectabilis và Solanum indicum trên chủng Xanthomonas campestris Kết quả cho

thấy cao chiết alkaloid của tất cả các loài trên đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể với vùng ức chế (ZOI), nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) tương ứng dao động 9,1-12,5 mm, 31,25-500 µg/mL và 125-

2000 mg/mL Trong số đó, ZOI, MIC và MBC của Breynia vitis-idaea trên

Xanthomonas campestris tương ứng là 9,6 mm, 125 và 1000 mg/mL [24]

Và cũng trong năm 2015, Manjugowda cùng các cộng sự đã tiến hành đánh giá hoạt

tính chống ung thư của cao ethanol và cao nước trích ly từ lá của Breynia

vitis-idaea (Burm.f) C.E.C.Fisch trên dòng tế bào HEPG2 Hoạt tính chống ung thư đã

được nghiên cứu do độc tính clorua gây ra carbontetra trong dòng tế bào bằng cách

sử dụng phương pháp khảo nghiệm MTT Cả hai cao chiết đã cho thấy khả năng chống ung thư cao hơn 80% ở nồng độ 500 mg/mL Đồng thời nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng hoạt tính chống ung thư là do sự hiện diện của các hợp chất alcaloid, glycoside, flavonoid và saponin trong cao [25]

Năm 2016, nhóm Nagar và Chauhan đã tiến hành nghiên cứu về tác động làm giảm

hàm lượng glucose và lipid từ dịch chiết lá Breynia vitis-idaea để điều trị tiểu đường tuýp I Nghiên cứu được thực hiện in-vitro trên chuột, so sánh giữa chuột đã

bị tiểu đường không được điều trị, chuột bình thường, chuột bị tiểu đường được điều trị bằng Glibenclamide và chuột bị tiểu đường được điều trị bằng dịch trích từ

ethanol và dịch trích nước từ lá Breynia vitis-idaea Kết quả cho thấy sau 21 ngày

thử nghiệm, khả năng điều trị tiểu đường từ hai dịch trích từ lá cù đề tương đương với thuốc Glibenclamide đang được sử dụng trên thị trường [26]

Nói chung, Breynia vitis-idaea đã được nghiên cứu ở một số nước, đồng thời hoạt

tính sinh học của loài này cũng đã được chứng minh qua nhiều công bố Tuy nhiên,

ở Việt Nam, báo cáo về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của Breynia

vitis-idaea còn hạn chế Vì vậy, nghiên cứu này đã được tiến hành để điều tra sâu hơn về

thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của Breynia vitis-idaea tại Việt

Nam và ứng dụng thực tế của loài này trong lĩnh vực y học và mỹ phẩm

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2011, Đặng Minh Quân cùng các cộng sự đã tiến hành điều tra tại 11 địa điểm

có rừng ngập mặn của 4 xã thuộc vườn quốc gia Phú Quốc để tìm hiểu về các loài

và các tính năng của thảm thực vật trong hệ sinh thái này Kết quả là đã thực hiện một danh sách các thực vật bậc cao bao gồm 103 loài thuộc 80 chi của 41 họ trong 3

ngành Trong số đó, Breynia vitis-idaea được sắp xếp trong các thực vật vùng nội

địa phân bố ở ven rừng ngập mặn, được thu thập ở vùng cao ít ngập mặn hoặc chỉ

ngập mặn khi thủy triều lên, ven các bãi cát chịu ảnh hưởng của gió biển và sóng

Breynia vitis-idaea được coi là loại thảo dược để bào chế thuốc [27]

Năm 2015, tác giả Lê Thị Hồng Nhan cùng các cộng sự đã tiến hành đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi sinh vật của các hợp chất chiết xuất từ cù đề Nghiên cứu được thực hiện tách biệt trên hai bộ phận thân và lá của cù đề được thu hái tại Tân An–Long An Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa trên phương pháp DPPH của cụm cao ethyl acetate có hoạt tính mạnh, đặc biệt là các

cao thân, cành Khả năng kháng vi sinh vật được kiểm tra trên các dòng Escherichia

coli, Samonella typhi, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, MRSA, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis với hai phương pháp giếng thạch

và pha loãng đĩa thạch Kết quả thể hiện hoạt tính tập trung trong các cao chiết ethyl

acetate, cao tổng và n-hexane của thân cành và hoạt tính mạnh trên dòng Bacillus

cereus Các kết quả nghiên cứu này có giá trị định hướng cho các nghiên cứu ứng

dụng cây cù đề làm sản phẩm chức năng hay phân lập và tinh chế các hoạt tính cho mục tiêu sản xuất dược phẩm [28]

tố melanin thông qua các phản ứng có xúc tác enzyme và không xúc tác enzyme [29]

Cơ chất nội sinh chủ yếu của tyrosinase từ nấm là L-tyrosine, p-aminophenol,

γ-glutaminyl-4-hydroxybenzyl Tyrosinase có thể sử dụng mono-, di-, trihydroxylphenols làm cơ chất, nhưng có ái lực cao nhất đối với dihydroxyphenols

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra trong số các monohydroxyphenols (p-creosl

và tyrosine), dihydroxyphenols (catechol, L-dopa, D-dopa, catechin, chlorogenic acid), trihydroxyphenols (pyrogallol) thì catechol tạo cơ chất với enzyme cho hoạt tính cao nhất [30]

Về mặt sinh học, vai trò của tyrosinase ở nấm và thực vật bậc thấp vẫn chưa được tìm hiểu Đối với thực vật bậc cao, tyrosinase giúp chống lại côn trùng và vi sinh vật bằng cách xúc tác hình thành melanin tạo lớp màng bảo vệ Trong ngành thực phầm, tyrosinase xúc tác cho sự oxy hóa các hợp chất polyphenol có trong rau quả tươi suốt quá trình lưu trữ, dẫn đến làm giảm hương vị và hàm lượng dinh dưỡng

Do đó, các chất có khả năng ức chế tyrosinase được sử dụng để điều trị các bệnh về tăng sắc tố melanin, ứng dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm để làm hoạt chất trắng da [29]

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu phân lập các hoạt chất trong cây cù đề, đánh giá khả năng kháng oxy hóa, khả năng ức chế enzyme tyrosinase của cao và các hợp chất phân lập góp phần tìm hiểu thêm về thành phần hóa học cũng như dược tính của loài này

2.2 Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu trên, đề tài xây dựng nội dung nghiên cứu như sau:

 Định danh thực vật

 Chuẩn bị, đánh giá tính chất nguyên liệu (độ ẩm, độ tro, )

 Chiết cao tổng ethanol, sau đó tiến hành chiết các cao phân đoạn hexane, ethyl acetate, n-butanol, nước

n- Khảo sát hoạt tính sinh học của cao tổng, cao phân đoạn về khả năng kháng oxy hóa, tyrosinase để xác định được các cao tiềm năng

 Phân lập các hợp chất có trong cao ethyl acetate, cao n-butanol bằng

Lá cù đề tươi

Xử lý nguyên liệu

Điều chế cao tổng, cao phân đoạn

Phân lập và tinh chế các cao tiềm

Hình 2 1 Nội dung nghiên cứu

Lá cù đề tươi được thu hái, rửa sạch và phơi gió ở nhiệt độ phòng Sau khi xác định

độ ẩm, độ tro, đem lá khô xay nhuyễn và lưu trữ tránh ẩm Tiến hành điều chế cao tổng bằng phương pháp chiết lỏng – rắn và chiết kiệt, điều chế các cao thành phần

từ cao tổng như cao n-hexane, cao ethylacetate, cao n-buthanol và cao nước bằng

phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết kiệt Sau khi loại bỏ dung môi, thu được các cao Sau đó, đánh giá khả năng kháng oxy hóa, ức chế enzyme tyrosinase trên cao tổng, cao phân đoạn, xác định các cao tiềm năng Tiếp theo, tiến hành phân lập các hoạt chất bằng phương pháp sắc ký cột nhanh và sắc ký bản mỏng, tinh chế các chất

sau phân lập bằng phương pháp kết tinh hay sắc ký cột Xác định cấu trúc các hợp chất sau tinh chế bằng các phương pháp phổ hiên đại như HR-MS, NMR, các kỹ thuật phổ hai chiều…Sau đó tiến hành đánh giá khả năng kháng oxy hóa, tyrosinase đối với các hợp chất đã phân lập được từ các cao tiềm năng Cuối cùng là xây dựng

quy trình chiết 6-O-benzoylarbutin

2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

2.3.2 Thiết bị

Máy đo điểm nóng chảy Electrothermal 9100 – Phòng thí nghiệm hóa hữu cơ trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp.HCM

Máy cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500 MHz – Phòng NMR trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM

Máy khối phổ micrOTOF-QII Bruker Daltonic (Germany) – Phòng phân tích trung tâm trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM

Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis Thermo Genesys 10S UV-Vis – Phòng thí nghiệm hóa dược trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Tp.HCM

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2 Phân lập các hoạt chất trong cao

Quá trình phân lập được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký với hệ dung môi thích hợp thường được sử dụng trong tách chiết hợp chất tự nhiên như:

(HR-2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

Tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên cao tổng, cao phân đoạn và các hợp chất đã được phân lập trên các cao tiềm năng

2.3.4.1 Định lượng phenol tổng theo phương pháp Folin-Ciocalteau

Quy trình được thực hiện theo phương pháp của Vernon L Singleton cùng các cộng

sự (năm 1999) với một số thay đổi phù hợp [31]

Xác định khả năng bắt gốc tự do của chất nghiên cứu bằng phương pháp đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng λ = 517 nm Vitamin C được sử dụng làm chất đối chiếu Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp 3 lần để tính giá trị trung bình

C

Hình 2 2 Phản ứng trung hòa DPPH

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của chất nghiên cứu được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ bắt gốc DPPH (%) = Ab −(AS−Acolor)

Trong đó:

Ab: mật độ quang của blank

As: mật độ quang của mẫu

Giá trị IC50 được tính thông qua đồ thị phần trăm ức chế

2.3.4.3 Phương pháp xác định khả năng bắt gốc tự do ABTS

Quy trình được thực hiện theo phương pháp của Roberta Re và các cộng sự (năm 1999) với một số thay đổi phù hợp [33]

Nguyên tắc

Dung dịch chứa ABTS●+có màu lục đến xanh ngọc, có độ hấp thu cực đại tại bước sóng đặc trưng là 730 nm Khi cho các hợp chất có tính oxy hóa cao tác dụng với

dung dịch chứa ABTS●+, ABTS●+ bị khử tạo thành dạng không màu ABTS – R+, Quy trình được chia làm 3 giai đoạn:

 Tạo gốc tự do ABTS●+

 Pha loãng dung dịch ABTS●+

 Tạo hỗn hợp phản ứng

Hình 2 3 Quá trình tạo thành gốc tự do ABTS●+ [34]

Khả năng bắt gốc tự do ABTS●+ của mẫu phân tích được tính theo công thức:

S% =A0 −A1

Trong đó:

A0: giá trị độ hấp thu của mẫu trắng ở 730 nm

A1: giá trị độ hấp thu của mẫu phân tích ở 730 nm

2.3.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase

Melanin là sắc tố quan trọng giúp bảo vệ làn da chống lại các tia bức xạ, nhưng sự tích tụ bất thường của melanin sẽ gây ra các rối loạn sắc tố Quá trình tổng hợp