Khảo sát khả năng nhân nhanh protocorm like bodies và tái sinh chồi like bodies và tái sinh chồi lan mokara vàng chanh trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời rita

Quy tr nh tăng sinh v tái sinh chồi lan Mokara v ng chanh trong hệ thống RITA® ..... Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng hình 2.1 Tisserat và Vandercook 19

ng tr nh c ho n th nh t i: Trườn ọ B K o - HQG-TP.HCM

án bộ h ớng dẫn khoa học :

(Ghi rõ họ tên học h m học vị v chữ ký) án bộ chấm nhận xét :

(Ghi rõ họ tên học h m học vị v chữ ký) án bộ chấm nhận xét : (Ghi rõ họ tên học h m học vị v chữ ký) Luận văn th c sĩ c b o vệ t i Tr ng i Học ách Khoa HQG Tp H M ng y tháng năm

Th nh ph n Hội ồng ánh giá Luận văn th c sĩ gồm: (ghi rõ họ tên học h m học vị c a Hội ồng chấm b o vệ luận văn th c sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận c a h tịch Hội ồng ánh giá LV v Tr ng khoa qu n lý chuyên ng nh sau khi luận văn c s a chữa (nếu c ) HỦ TỊ H H I NG TRƯỞNG KHO

ẠI HỌ QUỐ GIA TP H M

TRƯỜNG I HỌ BÁ H KHO

NG HÕ X H I HỦ NGHĨ VIỆT NAM ộ lập - Tự do - H n p ú

NHIỆM VỤ LUẬN V N THẠ SĨ

Họ tên học viên: V ơng Thị Hồng Loan MSHV: 10310943

Ng y tháng năm sinh: 01/10/1982 Nơi sinh: H Nội huyên ng nh: ng nghệ Sinh học M số : 60.42.80

I T N Ề T I K ảo s t k ả năn n ân n n Proto orm l ke bod es và t

s n ồ l n Mok r Vàn n tron ệ t ốn nuô ấy n ập ìm t m

t ờ RITA ®

II NHIỆM VỤ V N I DUNG

T o PL s từ mẫu phát hoa cây ex vitro: s dụng hai lo i cytokinin là

A v Kinetin các nồng ộ khác nhau

Kh o sát nh h ng c a sự kết h p giữa A v NAA ến sự tăng sinh c a

PL s v sự tái sinh chồi từ PL s trên m i tr ng th ch

Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng sinh PL s v tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m

th i RITA®

Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s tới sự tăng sinh PL s v tái sinh chồi từ

PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA®

III NG Y GI O NHIỆM VỤ : tháng năm

IV NG Y HO N TH NH NHIỆM VỤ: tháng 8 năm

V ÁN B HƯ NG D N: TS Lê Thị Thuỷ Tiên

th n gi p t i ho n th nh luận văn cao học

- ác th y c bộ m n C ng nghệ Sinh học truy n t kiến th c chuyên

ng nh v ph ơng pháp nghiên c u khoa học tiếp thêm h nh trang t i tự tin hơn trong học tập v c ng tác

- an Giám ốc Trung tâm Nghiên c u v phát tri n N ng nghiệp c ng nghệ cao Th nh phố Hồ hí Minh t o mọi i u kiện v th i gian và kinh phí

gi p t i ho n th nh luận văn n y

- ác b n ồng nghiệp phòng ng nghệ tế b o thực vật gi p ỡ chia sẻ buồn vui trong suốt th i gian l m việc gi p t i ho n th nh nhiệm vụ c giao

- Gia nh b n bè ặc biệt l mẹ chồng v ng x t o mọi i u kiện ộng viên phụ gi p t i chăm s c con gái nhỏ l m ch dựa tinh th n vững chắc cho

t i yên tâm học tập v c ng tác

T i c thực hiện luận văn trong sự yêu th ơng quý mến v h tr nhiệt

t nh c a tất c mọi ng i T i xin c m ơn v g i l i ch c s c khỏe ến tất c

V ơng Thị Hồng Loan

gi trong i u kiện n y tỷ lệ tăng sinh PL s cao gấp 43 l n so với khi nu i trên

m i tr ng th ch v gấp 779 l n so với m i tr ng lỏng c lắc liên tục với tốc

ộ lắc 4 vòng/ph t hế ộ ngập ch m thích h p cho sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống RITA® l 3 ph t ngập ch m sau m i 4 gi với mật ộ kh i u l 7

PL s/b nh trong m i tr ng MS bổ sung A mg/l kết h p với NAA mg/l Số

l ng chồi tái sinh trong hệ thống RITA® cao gấp 7 l n so với trên m i tr ng

th ch v gấp 4 l n so với m i tr ng lỏng lắc

MỤ LỤ

DANH MỤ ẢNG……….… vii

DANH MỤ HÌNH……… ……… … viii

DANH MỤ ẢNH……… ……….… ix

DANH MỤ HỮ VIẾT TẮT……… …x

HƯƠNG 1 MỞ ẦU 1 1 Tín ấp t ết ủ đề tà 1

1 Mụ t u n n ứu 2

HƯƠNG TỔNG QU N T I LIỆU 1 Sơ lượ về đặ đ ểm ủ Mok r vàn chanh (Full moon) 3

Nguồn gốc v phân bố 3

ặc i m h nh thái 3

3 ặc i m sinh tr ng 4

4 T o nguồn PL s v tính 5

Hệ t ốn nuô ấy n ập ìm t m t ờ 7

Giới thiệu 7

Nguyên tắc vận h nh v cấu tr c cơ b n c a hệ thống 7

2.2.1.2 Phân lo i hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i 8

3 n n ứu tron và n oà nướ 15

2.3.1 Các nghiên c u ngo i n ớc 15

3 Ảnh h ng c a hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i ến hiệu suất sinh học c a các ki u vi nhân giống khác nhau 15

3 ác th ng số nh h ng tới hiệu qu c a hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i 18

3 ác nghiên c u trong n ớc 20

HƯƠNG 3 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHI N ỨU

3 1 Vật l ệu 24

3 P ươn p p n n ứu 26

3 Ph ơng pháp t o mẫu s ch in vitro 27

3 Kh o sát nh h ng c a A v KIN lên sự t o PL s từ phát hoa 28

3 3 Kh o sát nh h ng c a sự kết h p nồng ộ giữa A v NAA ến sự tăng sinh c a PL s v sự tái sinh chồi từ PL s trên m i tr ng th ch 29

3.2.4 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng sinh PL s v sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA® 30

3 4 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng sinh PL s 30

3 4 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tái sinh chồi từ PL s 31

3.2.5 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s tới sự tăng sinh PL s v sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA® 32

3 5 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s tới sự tăng sinh PL s 32

3 5 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s tới sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA® 33

3 6 Ph ơng pháp x lý số liệu 34

HƯƠNG KẾT QUẢ - B N LUẬN 1 Kết quả 35

4 Kh o sát nh h ng c a A KIN lên sự t o PL s từ phát hoa 35

4 Ảnh h ng c a A v NAA lên sự tăng sinh PL s v sự tái sinh chồi từ PL s trên m i tr ng th ch 41

4 3 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng sinh PL s trong hệ thống RITA®

46

4 4 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s ến sự tăng sinh PL s 53

4 5 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tái sinh chồi từ PL s 54

4 6 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s kh i u tới sự tái sinh chồi 61

Bàn luận 63

4 Ảnh h ng c a cytokinin lên sự h nh th nh PL s c a mẫu cấy 63

4 ác th ng số nh h ng ến hiệu qu tăng sinh PL s v tái sinh chồi c a hệ thống ngập ch m t m th i RITA® 64

4 3 Ảnh h ng c a mật ộ PL s kh i u trong hệ thống nu i cấy 67

4 4 Ảnh h ng c a h nh th c nu i cấy tới sự tăng sinh PL s v sự tái sinh chồi 68

4 5 Ảnh h ng c a hệ thống ngập ch m lên chất l ng cây nu i cấy 69

HƯƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 5 1 Kết luận 71

5 Sự t o PL s 71

5 Sự tăng sinh PL s v tái sinh chồi trên m i tr ng th ch 71

5 3 Sự tăng sinh PL s trong hệ thống RITA® 71

5 4 Sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống RITA® 71

5 K ến n ị 73

T I LIỆU TH M KHẢO 74

D NH MỤ BẢNG Bản 1 Ảnh h ng c a A KIN lên sự t o PL s từ phát hoa sau 45 ng y nu i

cấy 36

Bản Ảnh h ng c a A v NAA lên sự tăng sinh PL s v tái sinh chồi từ

PLBs trên môi tr ng th ch sau 45 ng y nu i cấy 42

Bản 3 Ảnh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng

sinh PL s sau 45 ng y nu i cấy: 47

Bản Ảnh h ng c a mật ộ PL s tới sự tăng sinh PL s sau 45 ng y nu i cấy:

53

Bản 5 Ảnh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tái sinh

chồi từ PL s sau 45 ng y nu i cấy 55

Bản Ảnh h ng c a mật ộ PL s kh i u tới sự tái sinh chồi sau 45 ng y

nu i cấy 61

D NH MỤ HÌNH

Hình 2.1 Hệ thống AP S 9

Hình 2.2 Sơ ồ hệ thống nu i cấy bán tự ộng 10

Hình 2.3 Sơ ồ hệ thống nu i cấy bán tự ộng……… 11

Hình 2.4 Hệ thống RITA® (Teisson và Alvard, 1995) 13

Hình 2.5 Hệ thống b nh i IT® (Escalona v cộng sự 998) 14

Hình 2.6 Hệ thống Plantima® 14

Hình 3.1 Sơ ồ nghiên c u chung 26

Hình 3.2 Sơ ồ kh trùng mẫu 27

Hình 4.1 Ảnh h ng c a A KIN lên tỷ lệ mẫu t o PL s sau 45 ng y nu i cấy 37 Hình 4.2 Ảnh h ng c a A KIN lên số l ng PL s/mẫu sau 45 ng y nu i cấy 37

Hình 4.3 Ảnh h ng c a A v NAA ến sự tăng sinh PL s trên m i tr ng th ch sau 45 ng y nu i cấy 43

Hình 4.4 Ảnh h ng c a A v NAA ến sự tái sinh chồi từ PL s trên m i tr ng th ch sau 45 ng y nu i cấy 43

Hình 4.5 Ảnh h ng c a th i gian v t n suất ngập ch m tới sự tăng sinh PL s trong hệ thống RITA® sau 45 ng y nu i cấy 48

Hình 4.6 Ảnh h ng c a th i gian v t n suất ngập ch m tới số l ng PL s/g trọng l ng t ơi khi nu i cấy trong hệ thống RITA® sau 45 ng y nu i cấy 48

Hình 4.7 Ảnh h ng c a th i gian v t n suất ngập ch m tới sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống RITA® sau 45 ng y nu i cấy 56

Hình 5.1 Quy tr nh tăng sinh v tái sinh chồi lan Mokara v ng chanh trong hệ thống RITA® 72

D NH MỤ ẢNH

Ản 1 Cây Mokara vàng chanh 3

Ản 3 1 Phát hoa Mokara v ng chanh ng y tuổi (a) lát cắt phát hoa (b) 24

Ản 3 Hệ thống nu i cấy ngập ch m RITA®(Cirad, Pháp) 25

Ản 1 PL s trên m i tr ng MS kh ng bổ sung A KIN sau 45 ng y nu i cấy

Ản ụm PL s trong các chế ộ nu i cấy khác nhau sau 45 ng y nu i cấy 52

Ản 7 Sự tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống RITA®

sau 45 ng y nu i cấy với

Á TỪ VIẾT TẮT

NAA 1-naphthalene acetic acid

KIN Kinetin (6- furfurylaminopurine)

PLBs protocorm like bodies

TIS temporary immersion system

HSTTV i u hòa sinh tr ng thực vật

HƯƠNG 1

MỞ ẦU

1.1 Tín ấp t ết ủ đề tà

Mokara là nh m giống ch lực trong việc phát tri n diện tích v cung cấp s n phẩm hoa lan cắt c nh t i Th nh phố Hồ hí Minh Hiệu qu c a việc trồng Mokara cắt c nh rất cao nhu c u tiêu thụ c a thị tr ng nội ịa v xuất khẩu cũng rất lớn Với tốc ộ phát tri n kinh tế x hội nhanh nh hiện nay th việc trồng lan Mokara vừa mang l i l i nhuận cao vừa phù h p với ịnh h ớng n n n ng nghiệp thị c a

th nh phố

Mokara l lo i lan ơn thân các ki u nhân giống truy n thống cho hệ số nhân rất thấp v vậy nguồn cây giống hiện nay ch yếu nhập khẩu từ Thái Lan Trong những năm g n ây sự phát tri n c a c ng nghệ sinh học ặc biệt l kỹ thuật nu i cấy m tế b o thực vật m ra một h ớng i y tri n vọng cho ng nh s n xuất cây giống trong n ớc ho ến nay các báo cáo trong v ngo i n ớc trên lo i hoa

n y s dụng nguyên liệu cho nghiên c u tái sinh gồm: ỉnh sinh tr ng ỉnh chồi bên lá non tuy nhiên khi s dụng các bộ phận n y sẽ l m nh h ng tới s c sống

c a cây mẹ hoặc h y c cây mẹ Do vậy nghiên c u tái sinh từ phát hoa sẽ gi p

ch ng ta ch ộng c nguồn nguyên liệu ban u mặt khác khi cắt phát hoa sẽ

kh ng nh h ng nhi u tới s c sống c a cây mẹ phát hoa c th thu ho ch quanh năm trên phát hoa c các ốt mang mắt ng nên rất thuận l i cho việc kích thích

t o chồi

Do những h n chế c a ph ơng pháp nhân giống in vitro trên m i tr ng th ch

nh ph i s dụng số l ng lớn b nh nu i cấy giá th agar ắt ti n tốn c ng lao ộng cho việc cấy chuy n mẫu ịnh k sang m i tr ng dinh d ỡng mới l m s ch rót môi tr ng bao g i … các b nh nu i cấy dẫn ến việc tăng giá th nh c a s n phẩm (Etienne và Berthouly, 2005 [16]; hakrabarty v cộng sự 7 [18]) Một

h n chế khác ph i k ến l hiện t ng mẫu cấy tiết ra các h p chất phenol làm môi

tr ng v mẫu cấy hóa nâu dẫn ến sự gi m s c sống v sự chết c a mẫu cấy Trong khi nu i cấy trên m i tr ng lỏng to n bộ mẫu cấy sẽ tiếp x c với m i

tr ng l m tăng sự phân chia tế b o v tái sinh cơ quan gia tăng hệ số nhân chồi

rễ c v ph i soma (Ziv, 1989 [56]; Sandal v cộng sự [42]) Tuy nhiên nếu

nu i cấy ho n to n trong m i tr ng lỏng c th dẫn tới sự kh ng thoáng khí l m mẫu cấy bị chết ặc biệt l x y ra hiện t ng th y tinh th (Kevers và cộng sự, 2004) [36]

Hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i kh ng những tận dụng c các u

i m c a nu i cấy lỏng v nu i cấy trên th ch m còn h n chế c nh c i m

c a hai hệ thống nu i cấy trên gi p t o ra m i tr ng nu i cấy thoáng khí cây con khỏe m nh tỉ lệ sống cao gi m chi phí nhân c ng tiết kiệm v gi m chi phí m i

tr ng nu i cấy do s dụng ít m i tr ng trên một mẫu cấy v kh ng s dụng

th ch hệ số nhân gia tăng nhi u l n so với khi nhân giống hệ thống nu i cấy th ng

th ng [16] Luận văn c thực hiện nhằm mục ích kh o sát kh năng t o protocorm like bodies (PL s) từ cơ quan sinh d ỡng l cọng phát hoa giai o n non (7- ng y tuổi), kh năng nhân nhanh PL s và tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA®

1.2 Mụ t u n n ứu

T o PL s từ cọng phát hoa giai o n còn non (7- ng y tuổi) v xác ịnh một v i th ng số quan trọng nh h ng tới hiệu qu nhân PL s và tái sinh chồi c a lan Mokara trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA® từ xác ịnh

c i u kiện nu i cấy thích h p cho từng giai o n phát tri n nhằm t o ra số

l ng lớn cây giống c chất l ng tốt trong th i gian ngắn áp ng c nhu c u

c a thị tr ng

Nộ dun n n ứu

 T o PL s từ mẫu phát hoa cây ex vitro: s dụng hai lo i cytokinin là BA và Kinetin

các nồng ộ khác nhau

 Kh o sát nh h ng c a sự kết h p giữa A v NAA ến sự tăng sinh c a PL s v

sự tái sinh chồi từ PL s trên m i tr ng th ch

 Kh o sát nh h ng c a t n suất ngập ch m v th i gian ngập ch m tới sự tăng sinh

PL s v tái sinh chồi từ PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA®

 Kh o sát nh h ng c a mật ộ PL s tới sự tăng sinh PL s v tái sinh chồi từ

PL s trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA®

HƯƠNG TỔNG QU N T I LIỆU

2.1 Sơ lƣợ về đặ đ ểm ủ Mok r vàn n (Full moon)

Tên lai: Mokara

Tên th ơng m i: Mokara vàng chanh

nh 2.1 Cây Mokara vàng chanh

2.1.1 N uồn ố và p ân bố

Giống hoa lan Mokara lai u tiên c tên l Mokara Wai Liang (Arachnis

Isable x Ascocenda Red Gem) Tác gi c a giống lan n y l Y Mok từ Singapore

ng i ăng ký b n quy n giống lan n y v o năm 969 N n t ng cơ b n c a việc

lai t o n y l tổ h p lai c a ba giống bố mẹ: Arachnis x Vanda x Ascocentrum n

mang ặc tính nổi trội từ bố mẹ l d ng hoa v m u sắc ẹp từ Vanda tăng tr ng

nhanh từ Ascocenda (Ascocentrum x Vanda) Giống lan Mokara v ng chanh (Full

moon) c nguồn gốc từ Thái Lan [2]

1 ặ đ ểm ìn t

Lan Mokara v ng chanh l lo i lan ơn thân thân h nh trụ d i kh ng c gi

h nh lu n mọc cao v phía ỉnh sinh tr ng v h n Thân mang c lá v rễ Lá d i

h nh lòng máng hay h nh trụ mọc cách hai bên thân lá d y v c ng hai mép lá

hơi xòe ra Rễ tr n mọc từ thân xen kẽ với lá rễ xẻ bẹ lá chui ra ngo i dọc theo

chi u d i c a cây rễ ra nhi u thân rễ lớn [2]

Phát hoa mọc từ nách lá giữa thân phát hoa d i phân nhánh ng kính phát

hoa lớn số l ng hoa nhi u c th từ -15 hoa/phát hoa Hoa m u v ng t ơi rực

rỡ cánh hoa lớn v d y ặc biệt trên cánh hoa th ng c chấm c ốm rất ẹp

2.1.3 ặ đ ểm s n trưởn [8]

N ệt độ Mokara v ng chanh thuộc nh m lan a n ng Nhiệt ộ thích h p

ban ng y kh ng d ới 0 nhiệt ộ ban êm kh ng d ới 80

C

Ánh sáng: Mokara v ng chanh l lo i cây a sáng nh sáng yếu l m cho

c ng ộ quang h p gi m cây thiếu dinh d ỡng v kh ng ra hoa ây sẽ phát tri n tốt với ộ che nắng 5 -6 % ánh sáng tự nhiên

Ẩm độ Mokara v ng chanh c n ộ ẩm cao mùa kh ph i t ới n ớc

tránh hiện t ng rụng lá v gi m c ng ộ quang h p

ộ t ôn t o n m i tr ng thiếu th ng thoáng dễ l m tăng bệnh cho lan

Trái l i nơi quá thoáng sự thoát hơi n ớc cao cây kém phát tri n

K ểu trồn lan Mokara c th c trồng trên l ới hay trên luống c ch a vỏ

ậu

T u í ọn ốn l n Mok r [8]:

- Hoa ẹp cánh to nhi u hoa trên một phát hoa m u sắc hoa rực rỡ

- ây siêng ra hoa liên tục quanh năm cho tối thi u 6-8 phát hoa/ năm

- Phát hoa dài, có phân nhánh

- ây phát tri n m nh v chi u cao lá kh ng b chặt v o thân cây ra rễ nhi u v nhanh

- ây kh ng bị rụng lá chân nếu c th chậm v ít

- t bị nhiễm sâu bệnh ặc biệt l bệnh ốm lá v bệnh thối nhũn ọt

- Tiêu chuẩn cây giống: cao tối thi u từ 5-3 cm trên thân c từ -3 rễ chính

P ươn p p n ân ốn [2], [8]

Quá tr nh nhân giống từ h t cho ến khi c th ra hoa mất kho ng 4 năm hoặc nhi u hơn tùy giống Tuy nhiên một ặc i m nổi bật các cây họ lan l biến dị

x y ra th ng xuyên v dễ d ng i u n y gi p em l i sự a d ng cho các lo i lan nh ng cũng gây kh khăn cho quá tr nh nhân giống v các cây con t o th nh từ

h t kh ng ồng nhất v mặt di truy n

ên c nh việc nhân giống v tính bằng ph ơng pháp tách chiết truy n thống t o c cây con ồng nhất nh ng th i gian nhân giống rất d i v hệ số nhân giống rất thấp hơn nữa cây con t o th nh c s c sống kh ng cao

Nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy m (in vitro): ây l ph ơng pháp nhân

giống chung c áp dụng cho lan rất hiệu qu Từ một cây mẹ ban u c th nhân

ra h ng ng n cây con c kích th ớc v chất l ng ồng u nh nhau Kh khăn lớn nhất trong nhân giống v tính lan Mokara l nguồn mẫu rất h n chế do ch ng l lan ơn thân s dụng chồi ỉnh nu i cấy nh nhi u lo i lan khác sẽ l m tổn

th ơng cây mẹ Hơn nữa Mokara th ng tiết nhi u h p chất phenol từ b mặt cắt ra

m i tr ng nu i cấy gây ộc cho mẫu

2.1.4 T o n uồn PLBs vô tín

Protocorm l thuật ngữ c ặt ra u tiên b i nh qu n lý Melchoior Treub

c a v n bách th o ogor Indonesia (hiện nay l v n Kebun Raya) ng dùng từ

n y chỉ ra một giai o n phát tri n c a rêu Sau Noel ernard dùng protocorm cho các cây họ lan v o những năm 899 - 9 Hiện nay protocorm dùng m t những cấu tr c h nh c u nhỏ c a lan h nh th nh từ h t

Protocorm like bodies (PL s) l thuật ngữ dùng chỉ các th c cấu tr c

t ơng tự protocorm c h nh th nh từ m sẹo nu i cấy in vitro Quá trình hình

th nh mới các PL s c th thu c bằng cách cắt nhỏ các PL s v cấy lên m i

tr ng t o PL s Sự h nh th nh PL s từ những PL s cũ cho thấy t m quan trọng

c a PL s trong c ng nghiệp nu i cấy m lan

Hai nguồn vật liệu chính t o PL s lan Mokara l ch p rễ và phát hoa Do cấu tr c ơn thân ặc biệt ỉnh sinh tr ng v chồi bên ít c dùng l m vật liệu

nu i cấy ban u v sẽ gây tổn th ơng nặng ến cây mẹ

Sử dụn đầu rễ t o n uồn PLBs vô tín

ác c ng tr nh c a Park v cộng sự ( 0), Michio Tanaka (1976), Tian Su Zhou (1995, 1999), T W Yam (1991), M Kobayashi (1997) u cho thấy ch p rễ tuy l nguồn vật liệu khá dễ t m so với phát hoa nh ng hiệu suất tái sinh PL s l i rất thấp (theo Park v cộng sự ) [41]

Sử dụn p t o t o n uồn PLBs vô tín

Ở lan Hồ iệp phát hoa c dùng l m vật liệu t o PL s khá phổ biến th ng qua m sẹo từ phát hoa từ cụm chồi trực tiếp trên phát hoa hay từ lá trên chồi c a phát hoa Trong thực tế ng i ta th ng kết h p sự t o cụm chồi trực tiếp sau

t o PL s từ các gốc chồi con v lá

T s n PLBs t ôn qu mô sẹo từ p t oa

Chin Chi-Lin ( 986) c m ng t o c m sẹo từ b mặt vết th ơng trên lát cắt phát hoa non trên m i tr ng MS bổ sung mg/l AP Tuy nhiên ph ơng pháp n y cho hiệu qu kh ng ổn ịnh ồng th i hiệu suất biến dị cao do m phát hoa l vùng c m c ộ tập trung cao các tế b o biến dị ki u a bội h a Tuy việc

c m ng t o m sẹo khá dễ d ng nh ng d ng m sẹo n y chỉ tồn t i trong th i gian ngắn v kh năng tái sinh PL s rất thấp (theo Park v cộng sự ) [41]

Nghiên c u c a Tokuhara và Mii (2001) cho thấy c th c m ng m sẹo trực tiếp từ chồi c a phát hoa trên m i tr ng New Dogashima bổ sung mg/l NAA g/l sucrose g/l Gellan Gum M sẹo sẹo c t o ra cũng c hệ số tái sinh rất thấp m i tr ng c n c bổ sung y các chất dinh d ỡng nh khoai tây n ớc dừa …[52]

T s n PLBs từ ụm ồ trự t ếp tr n p t o

Khi tách các lá c a chồi in vitro từ phát hoa Hồ iệp tháng tuổi nu i cấy trên

m i tr ng c chất i u hòa sinh tr ng thực vật sẽ h nh th nh nhi u chồi con Những chồi n y th ng chỉ ho t ộng sau khi ỉnh sinh tr ng chính bị h y ây l

cơ s cho việc s dụng nồng ộ AP cao t o cụm chồi trực tiếp từ chồi ng trên phát hoa từ cụm chồi sau t o PL s

T s n PLBs từ l tr n ồ ủ p t o

Michio Tanaka v cộng sự l những ng i u tiên thực hiện nghiên c u tập trung trên việc tối u h a quy tr nh t o chồi dinh d ỡng v nu i cấy t o chồi từ lá Tuy nhiên hiệu suất vẫn ch a cao v kh ng ng dụng c trên nhi u giống [47] Năm 2 Park v cộng sự kh o sát tối u h a quá tr nh t o PL s từ lá a

ra quy tr nh ho n chỉnh v ki m ch ng trên nhi u giống lan Hồ iệp khác nhau ác

yếu tố c tối u h a gồm: n n khoáng nồng ộ chất i u hòa sinh tr ng thực vật nồng ộ ng …[41]

-Tránh sự ngập liên tục v ây l yếu tố nh h ng tiêu cực lên sự sinh

tr ng v phát sinh h nh thái c a mẫu cấy

- ung cấp oxy y cho mẫu cấy

- To n bộ mẫu cấy c th tiếp x c với m i tr ng nu i cấy

ác hệ thống u c ngăn ch a m i tr ng riêng c th chung một b nh ch a

nh ng c hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống b nh ch a nối với hệ thống

ch a mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn v bơm i u khi n ác mẫu cấy th ng c

ặt trên những ĩa bằng nhựa polypropylene th nh một cụm i u n y gi p tiết kiệm

c th i gian ph i ặt mẫu lên trên giá th th ch trong nu i cấy th ng th ng

T m l i hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i th ng th ng c những bộ phận ch yếu sau:

- ơm hay máy nén khí t o áp lực h t m i tr ng từ ngăn ch a lên ngăn

ch a mẫu cấy v ng c l i

- Hệ thống c i ặt th i gian dùng i u khi n chu kỳ ngập

- Hệ thống ống dẫn v van i u khi n

- ác m ng lọc

- nh nu i cấy th ng bằng nhựa polycarbonate hay th y tinh

Dựa theo nguyên tắc v nguyên lý t o ra hệ thống ngập ch m t m th i nhi u nh khoa học thiết kế v t o ra các hệ thống ngập khác nhau tùy v o mục ích nu i cấy khác nhau

2.2.1.2 P ân lo ệ t ốn nuô ấy n ập ìm t m t ờ [16]

Hệ thống ngập ch m s dụng trong vi nhân giống thực vật c m t v phân

lo i theo 4 nh m chính theo cách th c vận h nh nh sau: hệ thống nu i cấy ngập

ch m nghiêng lắc; hệ thống ngập ch m ho n to n c sự thay mới m i tr ng dinh

d ỡng; hệ thống ngập ch m một ph n c sự thay mới m i tr ng dinh d ỡng; hệ thống ngập ch m ho n to n trong m i tr ng dinh d ỡng c bơm v o khu vực

nu i cấy v kh ng c sự thay mới m i tr ng

ác hệ thống ngập ch m c phân lo i dựa trên các yếu tố v kích th ớc b nh

nu i cấy lo i giá ỡ c hay kh ng c s dụng hệ thống máy vi tính i u khi n hay chỉ ơn gi n i u khi n bằng các máy hẹn gi cách th c vận chuy n m i

tr ng (s dụng bơm nhu ộng bơm khí hay di chuy n b nh ch a)

Những i m khác biệt khác giữa các hệ thống ngập ch m l c hay kh ng c việc tái s dụng m i tr ng dinh d ỡng s dụng hai b nh riêng biệt dự trữ môi

tr ng v tăng sinh mẫu cấy hay chỉ s dụng một b nh ặc i m chung c a các hệ thống n y l s dụng những b nh ch a c dung tích lớn hơn những b nh ch a truy n thống trong suốt v c th hấp kh trùng c Việc vận h nh hệ thống n y ơn

gi n hơn các bioreactor truy n thống v cho phép kéo d i th i gian cấy chuy n Những hệ thống nu i cấy ngập ch m cho phép lập tr nh chế ộ ngập c a mẫu cấy (ngập một ph n hay ngập to n ph n) ác hệ thống ngập ch m c chia l m 4 ki u thiết kế nh sau:

Hệ thống thùng nghiêng hay lắc

hệ thống thuộc d ng n y c thiết kế b i Harris và Mason (1983):

(1) hệ thống thùng nghiêng sẽ kéo b nh tam giác nghiêng một g c 3 o theo hai

h ớng ng c nhau một máy c th kéo nghiêng kho ng 4 b nh erlen dung tích

5 ml hoặc 3 b nh tam giác dung tích 5 ml; ( ) hệ thống Rocker lăn 7 b nh trụ

tròn miệng rộng c th tích 9 ml trên các khay c a hệ thống một g c 3 o – 40o c sau m i 3 ph t Hai hệ thống n y u kh ng c hệ thống bổ sung m i tr ng mới [30]

Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng (hình 2.1)

Tisserat và Vandercook (1985) thiết kế một buồng nuôi cấy lớn có th nâng lên h xuống m i tr ng c bơm v o v r t ra khỏi buồng nuôi cấy theo chu kỳ nhất ịnh trong i u kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy thực vật tự ộng (APCS) bao gồm hệ thống ống bằng silicone hai bơm ẩy, hai bình th y tinh ch a m i tr ng, một van inox ba chi u bằng thép không gỉ, một buồng nuôi cấy và một b ng i u khi n có gắn bộ ngắt iện tự ộng Hệ thống này có th s dụng nuôi cấy thực

vật in vitro trong một th i gian dài [51]

Hình 2.1 Hệ thống APCS (Tisserat và Vandercook, 1985) [51]

Hệ thống ngập chìm một phần và cơ chế thay mới môi trường dinh dưỡng

Trong hệ thống n y m thực vật lu n c ặt nằm trên phía trên giá ỡ (agar m ng propylene cellulose) M i tr ng lỏng c bổ sung v r t khỏi b nh

nu i cấy hỉ c ph n d ới c a mẫu cấy c tiếp x c với m i tr ng Hệ thống

n y c phát tri n th nh m h nh:

Mô hình 1: Mô hình Aitken – Christie và Jones (1987) [10] và Aitken –

Christie và Davies (1988) [9] gồm một hệ thống b nh ch a bằng polycarbonate c

kích th ớc 5 x 39 x (mm) i u khi n bán tự ộng (hình 2.2) Trong hệ

thống n y chồi Pinus spp c nu i trên m i tr ng c giá th agar với hệ thống

r t v bổ sung m i tr ng lỏng bằng hệ thống bơm theo một chu kỳ nhất ịnh M i

tr ng lỏng vừa c bổ sung sẽ tiếp x c với mẫu cấy trong kho ng th i gian 4 ến

6 gi bằng cách s dụng máy h t chân kh ng sau m i tr ng sẽ c r t c n

Mô hình n y ho t ộng trên cơ s nh h ng tích cực c a việc bổ sung m i tr ng

lỏng hoặc auxin v o m i tr ng bán rắn giai o n cuối c a kỹ thuật nu i cấy in

vitro mà Maene và Debergh (1985) nghị tr ớc

Hình 2.2 Sơ đồ hệ thống nuôi cấy bán tự động (Aitken và cộng sự, 1987) [10]

1 Bình chứa 6 Cửa ra môi trường

2 Bơm nhu động 7 Bể chứa môi trường

3 Thì kế được cài đặt chương trình 8 Bể chứa chất thải

4 Cửa thông thí 9 Cửa thông khí

5 Cửa vào của môi trường

Mô hình 2: mô hình do Simonton v cộng sự (1991) thiết kế gồm hệ thống

bơm i u khi n bằng hệ thống vi tính c th bơm m i tr ng lỏng v o b nh nu i cấy c th tích 7 lít theo chu kỳ (hình 2.3) Mẫu cấy c ặt trên một tấm l ới polypropylene gắn v o th nh b nh nu i cấy Quá tr nh i u khi n thực hiện việc

n p m i tr ng ộ sâu c a mực chất lỏng chu kỳ tu n ho n c a m i tr ng lỏng

v c i u chỉnh theo lịch tr nh trong suốt quá tr nh nu i cấy Hệ thống c kh năng i u khi n ồng th i 4 b nh nu i cấy [44]

Hình 2.3 Sơ đồ hệ thống nuôi cấy bán tự động (Simonton và cộng sự, 1991) [44]

Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường

Nhi u hệ thống khác nhau c Alvard v cộng sự (1993) m t trong

c những hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i c thiết kế g n ây nhất tất c

u khá ơn gi n v rất dễ s dụng Hệ thống n y cho phép to n bộ mẫu cấy c tiếp x c với m i tr ng dinh d ỡng ồng th i th nh ph n kh ng khí trong b nh

nu i c l m mới nh s dụng bộ phận bơm khí c ch c năng vừa cung cấp kh ng khí v o m i tr ng vừa ẩy chất lỏng ra v o b nh nu i cấy Mẫu cấy c ặt trong b nh nu i th nh một khối gi p tiết kiệm th i gian ặt mẫu trên giá ỡ [12]

M i tr ng lỏng c ẩy từ b nh ch a m i tr ng sang b nh nu i cấy v

ng c l i nh một áp lực khí c bơm v o b nh ch a chất lỏng tránh s dụng nhi u ống nối b nh ch a th ng thiết kế gồm hai b nh c cùng th tích p suất

v t m c c a qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với c ng tắc

c lập tr nh i u n y cho phép xác ịnh c th i gian v th i i m bơm m i

tr ng v o ngăn ch a cây

Do những hệ thống n y kh ng c b nh ch a m i tr ng mới nên m i tr ng

nu i cấy ph i c thay mới sau 4 - 6 tu n Tuy nhiên việc thay ổi n y rất nhanh

v kh ng c n thiết ph i di chuy n mẫu cấy ác biến th khác nhau c a hệ thống

n y c phát tri n v bán rộng r i trên thị tr ng l hệ thống RITA® hệ thống b nh i (BIT®) v hệ thống Plantima®

Hệ thống RITA ®

Hệ thống RITA®

(hình 2.4) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một b nh ch a dung tích lít c hai ngăn ngăn trên ch a mẫu cấy v ngăn d ới ch a m i tr ng lỏng Một áp suất khí d ơng c cung cấp v o ngăn d ới sẽ ẩy m i tr ng lỏng dâng lên ngăn ch a mẫu cấy Mẫu cấy c ngập ch m trong m i tr ng lỏng nhanh hay chậm tùy theo th i gian áp suất v t m c c duy tr Trong th i gian mẫu ngập trong m i tr ng lỏng kh ng khí vẫn c cung cấp v o b nh nu i cấy

d ới d ng những bọt khí g p ph n l m xoay tr nhẹ mẫu cấy v l m mới kh ng gian bên trong b nh nu i cấy p suất d ơng trong b nh cấy sẽ ẩy kh ng khí trong bình ra ngoài qua một m ng lọc khí trên nắp b nh [48]

Hình 2.4 Hệ thống RITA ® (Teisson và Alvard, 1995)[48]

M t ho t ộng c a hệ thống

- Pha : M kh ng ngập trong m i tr ng

- Pha : ác van m ra cho khí i qua các m ng lọc ẩy m i tr ng lỏng lên ngập m cấy

- Pha 3: Mẫu cấy tiếp x c trực tiếp với m i tr ng lỏng

- Pha 4: hu kỳ kết th c các van ng l i v m i tr ng lỏng r t xuống ngăn bên d ới

Hệ thống bình đôi BIT ®

Hệ thống b nh i IT® (hình 2.5) do Escalona v cộng sự (1998) [22] c

dự ịnh nhân giống số l ng lớn qua con ng phát sinh ph i soma; thiết kế ch yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do c th tích b nh ch a lớn hơn v c giá th nh thấp hơn ách dễ d ng nhất vận h nh hệ thống nu i cấy ngập ch m s dụng áp lực khí l nối hai b nh th y tinh hay plastic c dung tích từ 5 ml - 10 lít bằng một hệ thống ống dẫn v i u khi n t o ra áp suất v t m c a m i

tr ng v o b nh ch a mẫu v ng c l i Hệ thống IT® c thiết kế áp ng với những yêu c u trên

Hình 2.5 Hệ thống bình đôi BIT ® (Escalona và cộng sự, 1998) [22]

Hệ thống Plantima ®

Hệ thống n y c thiết kế tổng th t ơng tự nh hệ thống RITA® tuy nhiên

c thay ổi v c i tiến một số chi tiết nh hệ thống bơm v vị trí các m ng lọc Hệ thống n y c s n xuất v cung cấp b i ng ty A-tech ioscientific t i o Ð i

Loan ấu t o v ph ơng pháp vận h nh cơ b n (hình 2.6)

Hình 2.6 Hệ thống Plantima ®

2.3 n n ứu tron và n oà nướ

2.3.1 n n ứu n oà nướ

c th th ơng m i h a hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i tự ộng c n

c những số liệu cụ th v m c ộ tăng tr ng s n l ng v chất l ng c a s n phẩm từ hệ thống n y ồng th i c sự so sánh với những hệ thống nu i cấy truy n thống

2.3.1.1 Ản ưởn ủ ệ t ốn nuô ấy n ập ìm t m t ờ đến ệu suất

s n ọ ủ k ểu v n ân ốn k n u

 Sự n ân ồ

Hệ thống ngập ch m c tác dụng th c ẩy việc nhân chồi Aitken – Christie và Jones (1987) ch ng minh rằng bằng cách thay mới m i tr ng lỏng kết qu sinh

tr ng c a chồi cây th ng (Pinus radiata) tốt hơn việc cấy chuy n m i tháng trên

m i tr ng th ch Trong hệ thống n y chồi c th tăng tr ng liên tục v thế cho phép thu ho ch chồi sau m i tháng trong kho ng th i gian 8 tháng m kh ng c n cấy chuy n hồi thu c từ hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i c chất l ng tốt hơn v d i hơn so với chồi thu nhận trên m i tr ng bán rắn [9] Một ch ng minh y v thuyết phục v tính hiệu qu c a hệ thống nu i cấy ngập ch m t m

th i trong việc gia tăng số l ng chồi khi nu i cấy ỉnh sinh tr ng cây chuối

(Musa nh m phụ AAH) ồng th i Alvard v cộng sự (1993) cho thấy rằng việc s

dụng m i tr ng lỏng nh h ng m nh mẽ tới sự phát tri n v hệ số nhân trong

vi nhân giống cây chuối Khi so sánh các ph ơng pháp nu i cấy lỏng với ph ơng pháp nu i cấy truy n thống trên m i tr ng bán rắn sau ng y nu i cấy kết qu thu c nh sau: những chồi nu i cấy trong m i tr ng lỏng hoặc m i tr ng lỏng

c giá th c hệ số nhân chồi rất thấp những chồi nu i cấy trên m i tr ng th ch hay trong m i tr ng lỏng ngập ch m một ph n c hệ số nhân l - 3 hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu c trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i RITA® với ph t ngập ch m sau m i gi [12]

Một nh m tác gi ng i uba thu c kết qu t ơng tự trên ối t ng cây

chuối (Musa acuminata) khi s dụng hệ thống b nh i (Teisson v cộng sự 1995)

[47] hồi cây hoa anh o (serviceberry) c nu i cấy trong hệ thống ngập ch m

t m th i v c so sánh với mẫu cấy trong m i tr ng th ch m i tr ng lỏng tĩnh trong các b nh nhỏ kết qu cho thấy nu i cấy trong hệ thống ngập ch m t m th i cho số l ng chồi gấp 6 l n trọng l ng m i chồi gấp l n chi u d i chồi gấp

l n v tổng trọng l ng t ơi c a mẫu cấy gấp l n [44]

Với cây mía (Saccharum spp ) Lorenzo v cộng sự ( 998) ch ng minh rằng

hệ thống b nh i s dụng cơ chế ngập ch m kích thích sự h nh thành và kéo dài chồi một cách rõ rệt hệ số nhân ( 3 9 chồi/3 ng y) lớn gấp 6 l n hệ số nhân khi

nu i cấy trên m i tr ng bán rắn [37]; t ơng tự nh vậy Angela M Mordocco và Jean A Brumbley (2009) khi kh o sát sự nhân chồi cây mía trong hệ thống RITA®

t c trung b nh 75 chồi/b nh nu i sau 45 ng y nu i cấy với chu kỳ ph t ngập ch m sau m i hoặc 4 gi [13]

Escalona v cộng sự (1999) s dụng hệ thống b nh i nu i cấy ỉnh

sinh tr ng cây d a (Ananas comosus), kết qu cũng cho thấy ph ơng pháp nu i

cấy ngập ch m t m th i gi p gia tăng hệ số nhân cùng với trọng l ng t ơi v trọng

l ng kh sau 4 ng y nu i cấy Hệ số nhân tăng kho ng 3 % so với nu i cấy lỏng v 4 % so với nu i cấy trên m i tr ng bán rắn g n 5 cây d a thu

c từ một hệ thống nh vậy [23]

ác ỉnh chồi cây lan Potinera sp và Mitragyna inermis Willd c nu i cấy

trong hệ thống ngập ch m AP S phát tri n nhanh hơn trên m i tr ng th ch hai

th ng số trọng l ng t ơi v th tích u tăng gấp 4 l n cây lan Potinera sp.và 1,8

l n cây Mitragyna inermis Willd sau 45 ng y nu i cấy Thí nghiệm t ơng tự trên cây cúc sao (Callistephus hortensis) kh ng th hiện một sự khác biệt áng k giữa

các hệ thống nu i cấy tuy nhiên cây tái sinh trong hệ thống ngập ch m t m th i c

s c sống tốt hơn khi ra ngo i v n ơm (Tisserat B và Vandercook, (1985) [51]

ối với cây c phê (Coffea arabica và Coffea canephora) vi nhân giống trên

m i tr ng th ch cho hệ số nhân kho ng 6-7 l n sau 3 tháng chồi sinh tr ng chậm (Sondhal v cộng sự 1989) [45] Khi s dụng hệ thống RITA® hệ số nhân t ơng tự

c th t tới chỉ trong vòng 5 - 6 tu n (Berthouly v cộng sự 1995) [14]

ối với cây cỏ tranh Cymbopogon citratus (D ) Stapf khi nu i cấy trong hệ

thống ngập ch m t m th i t c hệ số nhân chồi cao nhất ( 3) với chu kỳ 6 l n ngập ch m/ng y ồng th i giá trị gia tăng trọng l ng t ơi cũng cao nhất (66 g) Tuy nhiên trọng l ng kh (6 4 g) v chi u cao chồi (8 97 cm) cao nhất t c với chu kỳ 4 l n ngập ch m/ ng y (Elisa Quiala v cộng sự 6) [21]

 Sự ìn t àn ủ b

Sự sinh tr ng c a cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) v sự h nh th nh c

bi c kích thích trong hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i d ng b nh i (Akita

v Takayama 994) Sau tu n nu i cấy kho ng 5 -6 c khoai tây bi c

h nh th nh trong m i hệ thống cao hơn những kết qu nu i cấy tr ớc ây (kho ng

c trong một mẻ nu i cấy) Trọng l ng v ộ ồng u giữa các c cũng c

c i thiện áng k Ng c l i trong i u kiện nu i cấy ngập liên tục kh ng c bất c

sự h nh th nh c n o [11] Một thí nghiệm khác cũng trên ối t ng cây khoai tây

c Teisson v Alvard ( 999) thực hiện s dụng hệ thống ngập ch m t m th i RITA® Sau tu n nu i cấy từ một mẫu cấy nốt ơn thân tác gi thu c 3 c khoai tây bi Kho ng 5 % c bi c trọng l ng trên 5 g n y m m ngay trong hệ thống 3-4 chồi h nh th nh từ một c ch ng tỏ ây l hệ thống nu i cấy nhanh v hiệu qu [48]

 Quá trình nhân phôi soma

Hệ thống nu i cấy ngập ch m c ng dụng tăng sinh ph i soma v so sánh với các ph ơng pháp nu i cấy truy n thống nh nu i cấy trên th ch hay nu i cấy huy n phù tế b o trong erlen Tisserat v Vandercook ( 985) khi nghiên c u sự

sinh tr ng ph i c rốt (Daucus carota) v cây cọ (Phoenix dactylifera) trong hệ

thống ngập ch m t m th i AP S áp dụng chế ộ ngập ch m 5- ph t sau m i

gi nhận thấy so với nu i cấy trên th ch sinh khối ph i soma tăng gấp 9 l n cây c rốt v 4 l n cây cọ [50] T ơng tự kết qu n y khi th nghiệm trên ph i c a

cây cà phê (Coffea arabica) với các ki u gen khác nhau ph i c nu i cấy trong

hệ thống AP S tăng tr ng tốt hơn so với nu i cấy lắc trong erlen ( erthouly v cộng sự 995) [14] Nghiên c u g n ây c a tác gi Sankar-Thomas và cộng sự

(2008) cũng cho thấy hiệu qu nhân phôi soma c a cây Camptotheca acuminata

cũng c gia tăng áng k khi nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm t m th i RITA®

[43]

 Sự p t tr ển ủ p ô som

S n l ng v chất l ng ph i soma c a nhi u lo i thực vật c c i thiện

nh v o hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i Trên cây Citrus deliciosa, Cabasson

v cộng sự ( 997) so sánh quá tr nh phát tri n ph i soma trong nhi u hệ thống

nu i cấy khác nhau Kết qu cho thấy kho ng 6 % ph i trên m i tr ng th ch phát tri n sang giai o n lá m m nh ng c hiện t ng mọng n ớc Mẫu trong hệ thống

Trong các hệ thống nu i cấy ch m ngập t m th i th i gian ngập ch m l một

th ng số rất quan trọng v n nh h ng ến sự hấp thu chất dinh d ỡng v hiện

t ng th y tinh th c a mẫu cấy ối với các hệ thống nu i cấy khác nhau th i gian ngập ch m khác nhau tuỳ theo lo i thực vật

 T ể tí mô trườn nuô ấy

Th tích m i tr ng lỏng cũng l một yếu tố quan trọng khi s dụng các hệ thống nu i cấy ch m ngập t m th i m kh ng c sự thay mới m i tr ng nh hệ thống IT® hệ thống RITA® hay hệ thống nghiêng lắc Lorenzo v cộng sự ( 998)

t m ra một th tích m i tr ng dinh d ỡng tối thích cho sự tăng sinh chồi mía khi

nu i cấy trong hệ thống b nh i IT® Khi tiến h nh tăng th tích m i tr ng nu i cấy từ th tích chuẩn ban u 5 ml lên 5 ml hệ số nhân tăng từ 8 3 chồi/3 ng y lên 3 9 chồi/3 ng y nh ng kh ng l m tăng kích th ớc chồi Tiếp tục tăng th tích

m i tr ng th hiệu qu l i gi m i Theo các tác gi i u n y c th c gi i

thích l do c sự tiết ra các chất kích thích cho sự t o chồi v khi tăng th tích m i

tr ng lên quá nhi u th nồng ộ các chất n y sẽ gi m i [37] T ơng tự trong một thí nghiệm s dụng cùng hệ thống IT trên Escalona v cộng sự ( 999) ch ng minh c n c một th tích m i tr ng tối u cho quá tr nh nhân chồi d a (kho ng ml/ mẫu cấy) v khi tăng th tích lên nữa th tỉ lệ tăng sinh gi m i [23]

Với h u hết hệ thống nu i cấy ch m ngập t m th i th tích ngăn nu i cấy lớn hơn so với các ph ơng pháp th ng th ng khác Hơn nữa các thùng ch a c th tích khác nhau từ ến lít th ng u c th gắn c v o hệ thống Krueger v cộng sự ( 99 ) ch ng minh kích th ớc b nh nu i cấy lớn (7 lít) cho kết qu tốt

hơn trong vi nhân giống cây serviceberry khi so sánh với nu i cấy trong các b nh

nhỏ 4 ml trong áng ch ý l việc tránh c hiện t ng qu n th c nu i cấy quá d y ồng th i th c ẩy sự kéo d i c a chồi m m [35] Monette (1983)

cũng cho rằng khi nu i cấy Vitis vinifera L trong các b nh ch a lớn sẽ thu c

chồi d i hơn [39] Sự tăng tr ng c a mẫu cấy cây nho trong m i tr ng lỏng s dụng hệ thống nghiêng rất m nh v thế Mason c n ph i s dụng b nh ch a miệng rộng c th tích 9 ml thay cho b nh 5 ml tránh t nh tr ng mật ộ mẫu

nu i cấy trong b nh quá d y ồng th i việc n y còn em l i l i lích nh t o kho ng không gian rộng hơn dễ di chuy n các mẫu nu i cấy th tích m i tr ng lớn còn

h n chế sự thiếu hụt dinh d ỡng cho mẫu cấy (Harris v Mason 983) [30] Khi s dụng những b nh ch a c ng lớn th l ng m i tr ng lỏng c th c dùng nhi u hơn i u n y c th nh h ng tốt ến sự tăng sinh v phát tri n c a mẫu thực vật

nu i cấy

Thí nghiệm b i Alvard v cộng sự ( 993) [12] trên m phân sinh chuối ch ng minh sự thiếu khí oxy trong m i tr ng nu i cấy lỏng l nhân tố chính h n chế sự phát tri n c a mẫu cấy thực vật Trong thí nghiệm nếu m i tr ng lỏng kh ng

c khuấy trộn sẽ dẫn ến hiện t ng m bị ng t th Sự sục khí v o sẽ gi p m phát tri n tốt còn sự ch m ngập một ph n m th kh ng cung cấp l ng oxy c n

thiết cho m Trong khi hệ thống ch m ngập t m th i ch ng tỏ l hệ thống

nu i cấy c hiệu qu tốt nhất Tuy nhiên ối với các hệ thống nu i cấy khác hiệu

qu c a việc cung cấp khí kh ng c ch ng minh Aitken-Christie và Jones (1987) cho rằng nếu chỉ cung cấp khí th kh ng c th th c ẩy sự phát tri n chồi cây

th ng cũng nh sẽ kh ng ph i l nhân tố g p ph n v o sự gia tăng kh năng phát tri n m ch yếu l nh sự bổ sung thêm m i tr ng dinh d ỡng [10] Năm 95 Stewart v cộng sự cho rằng sự phát tri n chồi sẽ tốt hơn nếu s dụng một hệ thống cung cấp khí oxy c c i tiến th ng qua việc thay ổi chế ộ ch m ngập Tuy nhiên các lớp phim gắn trên các b nh tiếp nhận kh ng h c nh h ng xấu ến sự phát tri n c a m sau tháng nu i cấy (theo Berthouly M, Etienne H (2005, [16]) Trong các hệ thống s dụng ph ơng pháp ẩy m i tr ng dinh d ỡng v o

b nh ch a nh áp lực khí nén ph ơng pháp th ng khí c ỡng b c n y l m cho việc thay mới kh ng khí trong b nh nu i cấy c x y ra ho n to n m i giai o n

ch m ngập Theo Teisson v Alvard ( 995) sự trao ổi khí trong hệ thống nh thế

x y ra u tiên suốt giai o n ch m ngập v c gây ra gián tiếp nh sự chuy n ộng c a m i tr ng lỏng hoặc trực tiếp nh s dụng bơm kh ng khí trong những

i u kiện nu i cấy thích h p th ng dùng thay mới ho n to n kh ng khí sau m i

5 ph t ch m ngập ối với các bioreactor th tích lít [47]

2.3.2 n n ứu tron nướ

Thế giới ng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm t m th i trong nhân giống cây trồng từ lâu, tuy nhiên công nghệ này mới c áp dụng t i Việt Nam trong vài năm g n ây

Hệ thống n y c tiến hành kh o sát trên các ối t ng nh hoa lan cây thu h i ng và các giống ki ng lá

Năm 7 ung Ho ng Phi Ph ng và cộng sự (Trung tâm công nghệ sinh

học Tp H M) ho n thiện qui trình nhân giống lan Phalaenopsis bằng hệ thống

Plantima® Kết qu t c nh sau: tỉ lệ nhân PLBs gấp 2,27 l n so với nhân trên

m i tr ng th ch và gấp 1,2 l n so với m i tr ng lỏng lắc; tỉ lệ chồi gấp 3,37 l n

khi so sánh với nuôi cấy trên m i tr ng th ch, từ 1 chồi ban u thu nhận c 10 chồi mới, cây con phát tri n m nh [5]

Cùng với những u i m c a hệ thống Plantima® và phát huy kết qu t

c,Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP H M tiến hành ng dụng hệ thống

nuôi cấy ngập chìm t m th i trong nhân giống cây ki ng lá Spathiphyllum sensation thuộc họ Araceae cho kết qu ban u rất kh quan Sau 2 tháng nuôi cấy, các

mẫu cấy sống 100% và có kh năng tái sinh chồi, chồi thu c có từ 3 - 4 lá, xanh

m ớt, hệ số nhân chồi gấp 4 l n trên m i tr ng th ch [6]

Năm 8 KS Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Mi n Nam ng dụng thành công hệ thống bioreactor d ng ngập

chìm t m th i trong nhân chồi và PLBs hoa lan Dendrobium và Phalaenopsis Kết

qu thu c l ng chồi PL s cao hơn 3 ến 20 l n so với nuôi cấy trên môi

tr ng th ch, chồi khỏe PL s c m u xanh ậm [7]

Nghiên c u c a Nguyễn c Minh Hùng và cộng sự (2010) t i phòng thí nghiệm trọng i m phía Nam v Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt ới khi s dụng hệ thống nuôi cấy bioreacror bán chìm nổi d ng Plantima® ( i Loan) trong nhân giống hoa lan Mokara cho kết qu tốt khi nhân cụm chồi trên m i tr ng

MS có bổ sung A ( 5 mg/l) + (5 mg/l) + n ớc dừa (10%) với 1 phút mẫu ngập sau m i 2 gi M i tr ng nuôi cấy phát sinh rễ cây Mokara tốt nhất trong thí nghiệm l MS+NAA ( mg/l) + (5 mg/l) + n ớc dừa (10 %) (Nguồn- T p chí Nông nghiệp và phát tri n nông thôn ISSN 0866-7020 số 16/2011) [1]

Mai Thị Ph ơng Hoa v cộng sự ( ) thực hiện nghiên c u nhân nhanh protocorm like bodies (PLBs) và chồi hoa hoàng lan, hồ iệp ịa lan và ngọc i m bằng công nghệ bioreactor bán chìm nổi, kết qu thu c nh sau: t n suất ngập chìm 1 phút trong 4 gi thích h p cho nuôi cấy nhân PLBs, tái sinh chồi và sinh

tr ng chồi Khi nuôi cấy trong hệ thống bioreactor bán chìm nổi, hoa hoàng lan tỏ

ra thích h p cho mục ích nhân chồi (6,6 chồi/mẫu) v sinh tr ng nhanh (chi u dài

lá 45 mm), lan hồ iệp, ngọc i m thích h p trong mục ích nhân PLBs và nhân chồi

Những th nh c ng b ớc u trong việc ng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm

t m th i trong nuôi cấy mô góp ph n phát tri n nguồn cây giống n ớc ta lên t m cao mới; và phục vụ tốt cho việc s n xuất theo qui mô công nghiệp trong th i gian tới

Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Ưu điểm

Hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i (Temporary Immersion System TIS)

c tác ộng tích cực lên tất c các giai o n từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh

ph i soma trên nhi u ối t ng cây trồng khác nhau Sự sinh tr ng v hệ số nhân nhanh chồi c a cây c nu i cấy trong hệ thống ngập ch m t m th i lu n cao hơn

so với những cây nu i cấy trong hệ thống th ng th ng trên m i tr ng rắn hay trong những hệ thống bioreactor th ng th ng

ây tái sinh v ph i soma thu c trong hệ thống n y lu n c chất l ng tốt hơn Từ , cây c nguồn gốc từ hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i c tỷ lệ sống

s t cao sinh tr ng khỏe m nh trong quá tr nh thu n hoá ngo i v n ơm th

n i hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i kết h p th nh c ng những u i m c a

hệ thống nu i cấy rắn thoáng khí v hệ thống nu i cấy lỏng gi p cây tránh c những hiện t ng bất l i do sự thiếu th ng thoáng c a m i tr ng lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên m i tr ng rắn gi p gia tăng sự hấp thu chất dinh

d ỡng

Chu kỳ v t n số ngập ch m l những chỉ số ch yếu nh h ng ến sự phát tri n c a mẫu cấy cũng nh to n bộ quy tr nh nhân giống Khi những chỉ số n y

c tối u h a s n l ng sẽ gia tăng quá tr nh ki m soát sự phát sinh h nh thái tốt hơn v còn c kh năng h n chế tối a hiện t ng th y tinh th Ðây l u i m lớn nhất c a hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i so với hệ thống bioreactor th ng

th ng

Hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i tiết kiệm c c ng lao ộng v kh ng gian phòng nu i cấy v gi m c chi phí s n xuất Những quá tr nh nhân nhanh

ph i soma tái sinh chồi t o c bi c kh năng c tối u hoá trên nhi u ối t ng cây trồng, từ gi m c chi phí s n xuất một cách áng k

Nhược điểm

Mật ộ nu i cấy l một yếu tố kh ng kém ph n quan trọng nh ng hiện nay vẫn ch a c kh o sát một cách sâu rộng Th i gian ngập tối u ph i c kh o sát v xác ịnh chính xác cho từng giai o n nu i cấy c a từng lo i cây cũng nh

th i gian giữa các l n cấy chuy n ối với những hệ thống kh ng th bổ sung m i

tr ng mới cuối cùng l ph i tối u h a th nh ph n m i tr ng cho từng giai o n

nu i cấy

Hiện nay nhi u nghiên c u sâu hơn v nh h ng c a hệ thống nu i cấy ngập

ch m t m th i v mặt vật lý l rất c n thiết c th tối u h a i u kiện nu i cấy trong những hệ thống n y

Một u i m khác c a hệ thống n y trong việc gi m c tác ộng c a các chất ộc ngo i b o hay các chất c chế sinh tr ng c tiết ra ngo i m i tr ng

c a mẫu cấy trong th i gian nu i cấy

Trong i u kiện Việt Nam hiện nay giá th nh c a những hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i t ơng ối cao do ph i nhập hệ thống n y từ n ớc ngo i nh Pháp uba i Loan do nếu muốn ng dụng rộng r i th những hệ thống này nhất thiết ph i c nghiên c u thiết kế ngay trong n ớc gi m giá th nh Ngo i

ra những th ng số kỹ thuật c a hệ thống n y c n c kh o sát kỹ l ỡng v tối u

h a ối với từng giai o n nu i cấy c a từng lo i cây c c những i u kiện nh vậy th ch ng ta mới c kh năng áp dụng hệ thống nu i cấy ngập ch m t m th i rộng r i trong s n xuất cây giống

HƯƠNG 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

NGHI N ỨU

3 1 Vật l ệu

Nguyên liệu t o protocom like bodies (PL s): cọng phát hoa còn non (7 ến

ng y tuổi) c a giống Mokara V ng chanh (Full moon) nhập nội từ Thái Lan trồng t i v n s n xuất thực nghiệm Trung tâm nghiên c u v phát tri n N ng nghiệp c ng nghệ cao Tp H M ( nh …) ây lấy mẫu cọng phát hoa là các cây

c tuy n chọn c các ặc i m nh cây phát tri n tốt rễ nhi u ra rễ mới lá xanh

m ớt ang cho hoa ổn ịnh với số l ng phát hoa từ 8-9 phát hoa/năm hoa ẹp cánh to trung b nh từ -15 hoa/phát hoa, phát hoa có phân nhánh

nh 3.1 Phát hoa Mokara vàng chanh 10 ngày tuổi (a), lát cắt phát hoa

(b)

1 cm

1 cm

Hệ thống ngập ch m t m th i c s dụng trong nghiên c u n y l hệ thống

b nh nu i cấy RITA®

c a h ng irad Pháp Hệ thống n y gồm c những bộ phận

ch yếu sau: m i b nh ch a c dung tích lít c chia l m hai ngăn: ngăn d ới

ch a m i tr ng v ngăn trên ch a mẫu mẫu cấy nằm trên tấm l ới polypropylene Trên nắp b nh ch a c gắn hai m ng lọc khí chịu nhiệt (Midisart Sartorius)

ng kính l m ng lọc l m ơm hay máy nén khí (l u l ng lít/ph t) t o

áp lực ẩy m i tr ng từ ngăn d ới ch a m i tr ng lên ngăn trên ch a mẫu v

ng c l i Máy hẹn gi tự ộng (timer) dùng i u khi n chu kỳ ngập Hệ thống ống dẫn khí c l m từ silicone chịu nhiệt các van i u khi n ba chi u bằng thép không rỉ

nh 3.2 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm RITA ®