Nghiên cứu và khảo sát các thành phần có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5 của nọc bò cạp heterometrus laoticus

TIẾNG VIỆT Những nghiên cứu trước đây về tác động chống đông máu của nọc bò cạp Heterometrus laoticus An Giang, trong 5 phân đoạn đã được tách ra bằng sắc ký lọc gel, người ta đã xác đị

Trang 1

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT CÁC THÀNH PHẦN

CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ PHÂN ĐOẠN 5

CỦA NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS

Chuyên ngành : Công Nghệ Hóa Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013

Trang 2

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TSKH HOÀNG NGỌC ANH

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 25 tháng 12 năm 2013

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 PGS TS PHAN THANH SƠN NAM

2 TS HUỲNH KHÁNH DUY

3 TS TRẦN THỊ KIỀU ANH

4 TSKH HOÀNG NGỌC ANH

5 TS TỐNG THÀNH DANH

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

Trang 3

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ THANH THẢO MSHV: 12050167

Ngày, tháng, năm sinh: 10/08/1988 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Tổng hợp hữu cơ Mã số :

I TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu và khảo sát các thành phần có hoạt tính chống

đông máu từ phân đoạn 5 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus.”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

‾ Nuôi và thu nọc bò cạp Heterometrus laoticus

‾ Phân tích nọc bò cạp bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G-50

‾ Phân tích phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha trên cột Eclipse XDB - C18

‾ Khảo sát tác động chống đông máu của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 tách ra

‾ Làm sạch một số phân đoạn có hoạt tính tác động lên quá trình đông – chảy máu

để thu các toxin có hoạt tính quan tâm

‾ Xác định khối lượng phân tử của các toxin có hoạt tính

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TSKH HOÀNG NGỌC ANH

Trang 4

Lu n

t nghiệp c th c hiện t i phòng V t liệu Y sinh - Viện Khoa h c V t liệu Ứng dụng i s ng d n c a Tiế ĩ Khoa h c Hoàng Ng c Anh

ế , em xin gởi lời ến:

‾ B Mẹ ều kiện về kinh tế ộng viên tinh th n cho em th c hiện

Tr n Hiếu Trung và Hoàng Mỹ Quỳnh Trang , t ều kiện thu n l i cho

em trong thờ ề tài ở Viện Khoa h c V t liệu Ứng dụng, Viện Sinh h c Nhiệ i, ờng Đ i h c Khoa H c T Nhiên Thành ph Hồ Chí Minh ờng

Đ i h Y D c Thành ph Hồ Chí Minh

Em xin chân thành c ể th y cô gi ng d i h ờ Đ i

h c Bách Khoa Thành ph Hồ Chí Minh p kiến thức cho em trong su t khóa h c

Cu i cùng em xin c tất c các anh ch , b è ê nh , hỗ

tr ể em hoàn thành t t lu

Trong quá trình tìm hiểu nguồn kiến thức bao la, có những sai sót không mong

mu n, kính mong các th y cô trong hộ ồng b o vệ lu thông c ng

d n thêm cho em Em xin chân thành c

Một l n nữa em xin chân thành c các th y cô, các b n luôn vui khỏe, thành công trong công việc và cuộc s ng

Thành ph Hồ Chí Minh, 12 2013

Nguyễn Th Thanh Th o

Trang 5

TIẾNG VIỆT

Những nghiên cứu trước đây về tác động chống đông máu của nọc bò cạp

Heterometrus laoticus An Giang, trong 5 phân đoạn đã được tách ra bằng sắc ký lọc

gel, người ta đã xác định được 3 phân đoạn có tác động chống đông máu, đó là các phân đoạn 2, 4 và 5 Nhiệm vụ của luận văn này là phân lập các phân đoạn thứ cấp

từ phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha, khảo sát tác động của chúng lên quá trình đông – chảy máu và xác định khối lượng phân tử của chúng Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã xác định trong 24 phân đoạn thứ cấp

đã tách ra từ phân đoạn 5, có 6 phân đoạn tác động lên quá trình đông – chảy máu là: 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 Sáu phân đoạn này đã được làm sạch lại bằng sắc ký để thu được các toxin sạch, các toxin này đã được xác định khối lượng phân

tử bằng phương pháp khối phổ Khối lượng phân tử của 6 toxin này là 1091,1 Da, 444,2 Da, 418,0 Da, 1505,6 Da, 165,0 Da, 831,3 Da

TIẾNG ANH

The crude venom of the An Giang Heterometrus laoticus scorpion, was

separated into 5 fractions by gel filtration chromatography Among them, there were

3 fractions affecting the blood coagulation process as practions 2, 4 and 5, this have been shown in previous studies The thesis focused to separate sub-fractions from fraction 5 by reversed phase – high performance liquid chromatography, research anticoagulant effect of sub-fractions of fraction 5 in Swiss albino male mice and determine their molecular weight

The fraction 5 was separated into 24 sub-fractions The anticoagulant test showed that sub-fractions 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 522 have anticogulation effect

By reversed phase – high performance liquid chromatography, these sub-fractions were purified to get the purified toxins and we determined molecular weight of these toxins The molecular weight of six toxins were 1091,1 Da, 444,2 Da, 418,0

Da, 1505,6 Da, 165,0 Da, 831,3 Da

Trang 6

Tôi xin cam đoan:

(i) Luận văn này là sản phẩm nghiên cứu của tôi

(ii) Số liệu trong luận văn là trung thực

(iii) Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Thảo

Trang 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

LỜI MỞ ĐẦU

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BÒ CẠP 3

1.1.1 Phân bố địa lý 3

1.1.2 Hình thái và đặc tính sinh học 5

1.1.2.1 Hình thái học 5

1.1.2.2 Đặc tính sinh học 6

1.1.2.3 Tập tính sinh học 7

1.1.2.4 Sinh sản và phát triển 7

1.2 NỌC BÒ CẠP 8

1.2.1 Giới thiệu về độc tính của nọc bò cạp 8

1.2.2 Thành phần hóa học và dược lý của nọc bò cạp 8

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NỌC BÒ CẠP TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 13

1.3.3 Các ứng dụng từ nọc bò cạp 14

1.4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 15

1.4.1 Phương pháp Biuret 16

1.4.2 Phương pháp Lowry 16

1.4.3 Phương pháp Bradford 16

1.5 SẮC KÝ LỌC GEL PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN NỌC BÒ CẠP 17

1.5.1 Khái niệm 17

Trang 8

1.5.4 Pha tĩnh của sắc ký lọc gel 18

1.5.5 Chọn cột 19

1.5.6 Dung môi và tốc độ dòng chảy 19

1.5.7 Ứng dụng của sắc ký lọc gel 19

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 19

1.6.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khô 20

1.6.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô 20

1.7 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC) 20

1.7.2 Các bộ phận chính của máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 21

1.7.2.1 Bình chứa dung môi giải ly cột 21

1.7.2.2 Máy bơm 21

1.7.2.3 Cột sắc ký 21

1.7.2.4 Bộ phận tiêm mẫu vào máy 22

1.7.2.5 Detector 22

1.7.3 Dung môi dùng trong máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 22

1.7.4 Một số kỹ thuật dùng trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 23

1.8 TÁC ĐỘNG CỦA CÁC HOẠT CHẤT LÊN QUÁ TRÌNH ĐÔNG – CHẢY MÁU 23

1.8.1 Cầm máu sơ khởi 24

1.8.2 Cầm máu duy trì 24

Chương 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 NUÔI VÀ THU NỌC BÒ CẠP TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 26

2.1.1 Nuôi bò cạp 26

2.1.2 Thu và bảo quản nọc bò cạp 26

2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị 26

2.1.2.2 Phương pháp tiến hành 27

Trang 9

2.2.1 Nguyên tắc thực hiện 27

2.2.2 Tiến hành 28

2.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất 28

2.2.2.2 Lập đồ thị chuẩn 28

2.2.2.3 Xác định hàm lượng protein có trong mẫu nọc bò cạp 29

2.3 TÁCH PROTEIN TRONG NỌC BÒ CẠP H.LAOTICUS BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TRÊN GEL SEPADEX G-50 29

2.3.1 Nguyên tắc thực hiện 29

2.3.2 Tiến hành 29

2.3.2.1 Dụng cụ và hóa chất 29

2.3.2.2 Thực nghiệm 30

2.3.2.3 Thu và đông khô mẫu 32

2.4 TÁCH CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 5 BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP ĐẢO PHA (RP-HPLC) 33

2.4.1 Dụng cụ và hóa chất 33

2.4.2 Thực nghiệm 34

2.5 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 5 LÊN QUÁ TRÌNH ĐÔNG - CHẢY MÁU 35

2.5.1 Hóa chất và dụng cụ 35

2.5.2 Đối tượng thử nghiệm 35

2.5.3 Thuốc thử nghiệm 36

2.5.4 Tiến hành thử nghiệm 36

2.5.5 Phân tích kết quả thống kê 37

2.6 LÀM SẠCH CÁC PHÂN ĐOẠN CÓ HOẠT TÍNH TÁC ĐỘNG LÊN QUÁ TRÌNH ĐÔNG – CHẢY MÁU BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (RP-HPLC) VÀ XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ 37

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 KẾT QUẢ CỦA VIỆC THU NỌC BÒ CẠP 39

Trang 10

3.2 HÀM LƢỢNG PROTEIN TRONG NỌC BÒ CẠP 42

3.2.1 Đồ thị đường chuẩn 42

3.2.2 Hàm lượng protein trong nọc bò cạp 43

3.3 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỌC GEL VÀ ĐÔNG KHÔ 44

3.4 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP ĐẢO PHA (RP-HPLC) CỦA PHÂN ĐOẠN 5 46

3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN THỨ CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN 5 LÊN QUÁ TRÌNH ĐÔNG - CHẢY MÁU 46

3.5.1 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.1 lên thời gian chảy máu và đông

máu…… 47

máu…… 48

máu…… 49

máu…… 50

máu…… 51

máu…… 52

máu…… 53

máu…… 54

máu…… 55

máu…… 56

Trang 11

3.5.12 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.12 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 58 3.5.13 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.13 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 59 3.5.14 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.14 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 60 3.5.15 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.15 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 61 3.5.16 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.16 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 62 3.5.17 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.17 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 63 3.5.18 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.18 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 64 3.5.19 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.19 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 65 3.5.20 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.20 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 66 3.5.21 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.21 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 67 3.5.22 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.22 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 68 3.5.23 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.23 lên thời gian chảy máu và đông máu………… 69 3.5.24 Ảnh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.24 lên thời gian chảy máu và đông máu…… 70 3.5.25 Bảng tổng kết các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính của phân đoạn 5 so với

lô chứng……… 71

Trang 12

- CHẢY MÁU 75

3.6.1 Phân đoạn thứ cấp 5.5 76

3.6.7 Nhận xét 82

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83

4.1 KẾT LUẬN 83

4.2 KIẾN NGHỊ 84 BÀI BÁO ĐÃ ĐĂNG

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 13

BmKAPi : Peptide Buthus Martensii Karsch Api

RP-HPLC : Sắc ký lỏng cao áp đảo pha

Trang 14

Trang

Bảng 1.1: Các loại cột sắc ký lỏng cao áp dùng trong các kỹ thuật sắc ký 22

Bảng 2.1: Lập đồ thị đường chuẩn nồng độ protein 28

Bảng 3.1: Khối lượng nọc bò cạp H.laoticus thu được 40

Bảng 3.2: Mật độ quang OD750 của các nồng độ protein chuẩn 42

Bảng 3.3: Hàm lượng protein trong nọc bò cạp 43

Bảng 3.4: Khối lượng 5 phân đoạn sau khi chạy lọc gel 45

Bảng 3.5: Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.1 và lô chứng 47

Bảng 3.6: Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.1 và lô chứng 47

Trang 15

Bảng 3.53: Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính và lô chứng 72

Trang 16

Bảng 3.55: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời

gian chảy máu và thời gian đông máu 74

Bảng 3.56: Khối lượng phân tử của các toxin thu được 82

Trang 17

Trang

Hình 1.1: Bò cạp đen Heterometrus laoticus 5

Hình 1.2: Sự phát triển của bò cạp H.spinifer 6

Hình 1.3: Cấu trúc toxin của nọc bò cạp 10

Hình 1.4: Tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký lọc gel 17

Hình 1.5: Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 21

Hình 2.1: Thu nọc bò cạp bằng phương pháp kích điện 27

Hình 2.2: Hệ thống chạy sắc ký lọc gel phân tách protein của nọc bò cạp 32

Hình 2.3: Máy đông khô hãng Thermo 33

Hình 3.1: Nọc thu từ bò cạp H.laoticus 39

Hình 3.2: Đồ thị đường chuẩn nồng độ protein 43

Hình 3.3: Sắc ký đồ của nọc bò cạp H.laoticus 44

Hình 3.4: Sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) trên cột SDB - C18 của phân đoạn 5 46

Hình 3.5: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời gian chảy máu 73

Hình 3.6: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời gian đông máu 73

Hình 3.7: Sắc ký đồ của phân đoạn thứ cấp 5.5 76

Hình 3.8: Sắc ký đồ của toxin 5.5.1 76

Trang 18

Trang 19

LỜI MỞ ĐẦU



Với xu hướng phát triển của ngành dược, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ cây cỏ, động vật,… và đặc biệt là nọc từ các con vật như rắn, bò cạp, ong… đã và đang được nghiên cứu dùng làm thuốc để chữa bệnh

Trải qua hơn 1000 năm, bò cạp đã được sử dụng rất rộng rãi trong ngành dược

và là một vị thuộc quý của các bài thuốc cổ truyền đối với nhiều quốc gia trên thế giới Theo kinh nghiệm dân gian, bò cạp thường được dùng nguyên con (toàn yết), hoặc phần đuôi (yết vĩ) để trị động kinh ở trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị, méo miệng… dưới dạng thuốc bột hoặc làm viên uống [1, 2] Cùng với sự tiến bộ khoa học, đã có những nghiên cứu trên thế giới về nọc bò cạp và đã xác định có hoạt tính về thần kinh [3] Tuy nhiên, việc nghiên cứu nọc bò cạp ở Việt Nam mới chỉ bắt đầu

Trong nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide toxin, có tác động lên các receptor và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu và khảo sát để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh như: Parkinson, bệnh cao huyết áp, ung thư, Alzheimer [3,4,5,6,7,8],… Bên cạnh đó, đã

có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính tác động lên quá trình đông – chảy

máu của nọc độc các loài bò cạp như Tityus Discrepans, Buthus Martensii Karsch

[8], …

Ngày nay, những vấn đề về đột quỵ, mất máu, chậm đông máu, thiếu máu não đang là vấn đề được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cả Việt Nam Số lượng bệnh nhân chết về nhồi máu cơ tim, đột quỵ hơn khoảng 10000 bệnh nhân, đây là một con số khá cao Và nguyên nhân chính là do tình trạng rối loạn đông máu gây nên

Để có thể đóng góp một nguồn nguyên liệu mới cho ngành dược dùng làm thuốc chữa bệnh, và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo; nhóm nghiên cứu

chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu về nọc bò cạp Heterometrus laoticus Qua đề

tài “Nghiên cứu và khảo sát các thành phần có hoạt tính chống đông máu từ

Trang 20

phân đoạn 5 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus”, đây là hướng nghiên cứu

mới về nọc bò cạp Heterometrus laoticus, chúng tôi hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho

những nghiên cứu tiếp theo về việc ứng dụng của nọc bò cạp được rộng rãi hơn

Trang 21

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BÒ CẠP

Bò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới Trải qua hơn

450 triệu năm tiến hóa, hình dạng của bò cạp không thay đổi nhiều [9, 10] Bên cạnh việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính đa dạng loài, phương diện sinh thái, các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các thành phần của nọc độc bò cạp Hướng nghiên cứu này đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vì nọc

bò cạp chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học

1.1.1 Phân bố địa lý

Bò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thường xuất hiện ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bò cạp sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vài loài còn được tìm thấy dưới các tảng đá ở những núi có độ cao 5000 m [11]

Có khoảng 2000 loài bò cạp, thuộc 20 họ khác nhau, phân bố rộng rãi nhất tại những vùng phía nam của vĩ tuyến 45 Bắc (ngoại trừ New Zealand và Nam cực) Ví

dụ như: giống Androctonus, Leiurus: phân bố chủ yếu ở Châu Á, Bắc Phi, Trung Đông [12, 13]; giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazil, Venezuela, Columbia và Argentina) [14]; giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ [15]; giống

Heterometrus phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á (Campuchia,

Lào, Thái Lan, Việt Nam), cũng như Ấn Độ, Sri Lanka, Nepal và Trung Quốc (Tây Tạng) [16, 17]

Ở Việt Nam, bò cạp phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bằng đến miền núi trong những khu rừng ẩm ướt và hải đảo Có bốn họ thuộc bộ bò cạp: Buthidae, Scorpionidae, họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae Trong đó, họ Buthidae và Scorpionidae chiếm nhiều nhất [18] Chúng phân bố ở các vùng khác nhau [18, 19,

20, 21, 22, 23]:

Họ Buthidae:

‾ Lychas mucronatus Fabricius: phân bố ở các tỉnh miền Trung và miền Nam,

phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước)

Trang 22

‾ Isometrus basilicus karch: phân bố ở các tỉnh Nghệ An, Quảng Trị, Bình

Định, Khánh Hoà (Trường Sa), Bình Phước (Đồng Phú)

‾ Isometrus sp: phân bố ở Nghệ An (Vinh)

‾ Isometrus deharvengi sp: phân bố ở Hòn Chồng, Kiên Giang

Họ Scorpionidae:

‾ Heterometrus spinifer spinifer: phân bố ở Bình Phước (Bù Đốp, Bù Gia

Mập, Đồng Phú)

‾ Heterometrus petersii petersii: phân bố ở thành phố Hồ Chí Minh, Bình

Thuận, Khánh Hoà, Gia Lai, Lâm Đồng, Quảng Ninh

‾ Heterometrus laoticus: phân bố ở Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh,

Đồng Nai (Biên Hoà), An Giang

‾ Heterometrus cyaneus cyaneus: phân bố ở Thừa Thiên Huế, Quảng Trị

‾ Heterometrus sp: phân bố ở Sơn La (Mộc Châu), Hà Tây (Ba Vì)

Họ Chaerilidae:

‾ Chaerilus petrzelkai: ở miền Nam Việt Nam, đảo Côn Sơn

‾ Chaerilus Simon, 1877: ở miền Nam Việt Nam

‾ Chaerilus vietnamicus Lourenco and Zhu, 2008: phân bố ở miền Bắc

‾ Chaerilus julietteae Lourenco, 2011: phân bố ở miền Nam

‾ Chaerilus phami sp: tập trung ở đảo Côn Sơn

Họ Pseudochactidae:

‾ Vietbocap canhi Lourenco & Pham, 2010

‾ V.canhi Lourenco & Pham, 2010

‾ V thienduongensis Lourenco & Pham, 2012

Và trong năm 2013, vừa phát hiện loài bọ cạp mới ở miền núi phía bắc Việt

Nam có tên có tên khoa học Euscorpiops cavernicola Lourenco & Phạm Loài bò

cạp mới này thuộc họ Euscorpiidae, phân bố ở hang Hua Ma, xã Quảng Khê (huyện

Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn) [24]

Trong nghiên cứu này, đối tượng chúng tôi đề cập đến là loài bò cạp đen

Heterometrus laoticus phân bố ở An Giang Đây là loại bò cạp đen hay bò cạp rừng,

chúng hầu hết được tìm thấy ở vùng có than bùn ở Lào, vùng Nam Bộ của Việt

Trang 23

Nam và ở Thái Lan Cơ thể có màu đen hoặc xanh đen, chiều dài trung bình khoảng 10-12 cm [18]

Sự biến đổi về màu sắc của bò cạp được quan sát rõ nhất Loài bò cạp

Heterometrus có màu trắng khi mới sinh, nằm trên lưng mẹ vài ngày, màu trắng

chuyển mầu sẫm dần, đến khi lột xác lần thứ nhất, bò cạp con có màu nâu đen gần giống màu của bò cạp mẹ [26]

Bên cạnh sự biến đổi về màu sắc, kích thước cũng tăng dần qua các lần lột

xác Ví dụ: loài Heterometrus spinifer có chiều dài cơ thể qua các tháng tuổi như

sau: tháng 1: 12 -15 mm, tháng 2: 32 - 40 mm, tháng 3: 44 - 51 mm, tháng 4: 56 -

62 mm, tháng 5: 69 - 75 mm, tháng 6: 82 - 90 mm Trong phòng thí nghiệm, ở dạng trưởng thành loài này có chiều dài từ 95 -110 mm, trong tự nhiên có thể dài 125 mm [18]

Trang 24

(Nguồn Internet)

Hình 1.2: Sự phát triển của bò cạp H.spinifer

1.1.2.2 Đặc tính sinh học

Toàn thân bò cạp được bao bọc bởi một lớp giáp bằng chất sừng, ở một số chỗ

có lông làm cơ quan cân bằng Một lớp phủ ngoài giáp trong suốt, khi có tia tử ngoại sẽ chuyển thành màu xanh lục huỳnh quang [2] Thân bò cạp có tất cả khoảng

18 đốt, chia làm hai phần: phần đầu ngực (đốt thân trước) và phần bụng (vùng thân sau), phần bụng này gồm cả bụng trước và đuôi [2]

Phần đầu ngực có 7 đốt, đốt đầu có 2 mắt giữa và 6 mắt bên, đốt 2 có câu túc

và miệng, đốt 3 có chân xúc giác (càng), 4 đốt còn lại mỗi đốt có một cặp chân Phần bụng trước có 8 đốt, hai đốt đầu tiên chứa cơ quan sinh dục và nắp sinh dục (chỉ còn dấu vết trong quá trình tiến hóa), đốt kế là cơ quan cảm giác – lược pectine,

Trang 25

các đốt còn lại bao gồm 4 đôi túi hô hấp mở ra ngoài là 4 đôi lỗ thở trong túi có nhiều tâm kitin xếp song song, bên trong có khe để máu di chuyển trao đổi khí CO2

và O2 với không khí [2] Phần đuôi hẹp lại gồm 5 đốt, hậu môn của bò cạp nằm ở đốt cuối cùng, đồng thời tại đốt này chứa tuyến độc và mũi tiêm nọc độc [2, 18]

1.1.2.3 Tập tính sinh học

Tuổi thọ của bò cạp phụ thuộc vào loài, cá thể, thức ăn, chuyển hóa và bệnh

tật Bò cạp có thể sống từ 4 - 25 năm (loài Hadrurus arizonensis thọ 25 năm); trong thiên nhiên, loài Hadogenes sống được 25 - 30 năm [2, 18] Môi trường sống có

nhiệt độ cao và phạm vi hoạt động kiếm ăn rộng giúp gia tăng sự trưởng thành, tuy nhiên sẽ làm giảm tuổi thọ của loài [27] Bò cạp thích sống tại những vùng nhiệt độ thay đổi từ 68 đến 99 độ F (20 - 37oC) giới hạn chịu dựng khoảng 14 - 45oC [27, 28]

Bò cạp là loài động vật sống về đêm, ban ngày hay đào hang tìm nơi trú ẩn mát mẻ (dưới hoặc trong kẽ các tảng đá, các thân gỗ mục,…), ban đêm ra ngoài săn mồi Bò cạp thường sợ ánh sáng và các loài chim, thằn lằn, những thú có túi và chuột [27]

Bò cạp là động vật ăn thịt, thức ăn của chúng rất đa dạng, từ các loài côn trùng

và những động vật thân khớp nhỏ như: nhện, ruồi, dán, bướm, cào cào, châu chấu, kiến, rết tới những con chuột nhắt mới sinh [29] Đầu tiên chúng dùng càng để bắt mồi, tùy vào lượng nọc độc và kích cỡ càng mà bò cạp sẽ chích độc hay dùng càng

ép con mồi Cách này có thể làm tê liệt, thậm chí giết chết con mồi để sau đó bọ cạp

có thể ăn [27, 30] Bò cạp có một kiểu ăn duy nhất là sử dụng chân kìm (là những vuốt nhỏ từ miệng) để nghiền mồi, và chỉ có thể tiêu hóa thức ăn ở dạng lỏng, tất cả chất rắn (lông, bộ xương ngoài,… của con mồi) đều bị chúng bỏ lại [2, 30]

Bò cạp khá là nhút nhát và vô hại với con người, chúng chỉ phun nọc khi bắt mồi hoặc tự vệ Trong một số trường hợp nguy hiểm, bò cạp thường bỏ chạy tìm cách ẩn mình hoặc là đứng yên [2]

1.1.2.4 Sinh sản và phát triển

Bò cạp sinh sản theo phương thức hữu tính, có con đực và con cái riêng biệt, ngoại trừ vài loài có cách sinh sản vô tính Bò cạp Heterometrus thường sinh sản

Trang 26

vào mùa mưa, khoảng từ tháng 5 – 7 hàng năm [1, 2]

Bò cạp con sinh ra sẽ được mang trên lưng mẹ trong một thời gian ít nhất là một kỳ lột xác Trước kỳ lột xác đầu tiên, bò cạp con không thể sống sót nếu không phụ thuộc vào mẹ chúng Sau 5 – 7 lần lột xác, bò cạp mới trưởng thành và rất giống bố mẹ của mình Lớp vỏ mới sau mỗi kỳ lột xác rất mềm, nhưng sau đó sẽ cứng dần theo tiến trình keratin hóa [2, 11]

1.2.1 Giới thiệu về độc tính của nọc bò cạp

Tất cả các loài bò cạp được nghiên cứu đến nay đều có nọc độc Nọc độc của

tất cả các loài bò cạp đều có độc làm hủy thần kinh, ngoài trừ loài Hemiscorpius

lepturus có nọc độc hoại tế bào Bò cạp dùng nọc của mình để giết hay làm tê liệt

con mồi trước khi ăn thịt [31] Nọc bò cạp có độc tố đối với động vật, côn trùng và các loài giáp xác

Với hơn 1500 loài bò cạp trên toàn thế giới thì phần lớn là vô hại đối với con người, chỉ khoảng 20 - 25 loài được xem là nguy hiểm Một số bò cạp có nọc độc

mạnh và nguy hiểm như họ Buthidae (Leiurus quinquestriatus), chi Parabuthus,

Tityus, Centruroides và Androctonus Nọc độc của các loài bò cạp có thể gây đau,

sưng phồng, tê liệt, hay bị cảm giác khó chịu kèm theo các phản ứng toàn thân như nôn mửa, bắp thịt co tê, mắt mờ, chảy nước bọt, khó nuốt, tinh thần bất ổn và có thể dẫn đến tử vong [31] Nhưng thật ra, lượng nọc của một con bò cạp không đủ để giết chết một cơ thể trưởng thành khỏe mạnh, chỉ có một số trường hợp dị ứng với

bò cạp mới có thể gây tử vong nhanh Thông thường, sau khi bị bò cạp chích, vị trí lân cận sẽ đau tê cứng trong vài ngày, sau đó sẽ trở lại bình thường [32]

Nọc bò cạp H.laoticus thường không độc, nhưng gây ra sự sưng phù, đau và

vùng bị chích có màu đỏ khoảng vài giờ đến nhiều ngày [16, 17]

1.2.2 Thành phần hóa học và dƣợc lý của nọc bò cạp

Nọc bò cạp là nguồn giàu các chất có hoạt tính sinh học, là một hỗn hợp gồm các polypeptide, mucoprotein, mucopolysaccharid, lipid, enzyme, nucleotide, các amin sinh học, glycosaminoglycan, hemotoxin, một lượng nhỏ hyaluronidase, phospholipase, những chất có khối lượng phân tử tương đối thấp như serotonin,

Trang 27

histamin, các chất ức chế protease,… và các thành phần chưa biết [33, 34] Trong

đó, quan trọng nhất là các độc tố thần kinh, những polypeptide toxin tác động lên các receptor và các kênh ion của tế bào thần kinh [3, 4, 9, 26, 34] Các nghiên cứu cho đến nay đã xác định được khoảng 250 độc tố thần kinh từ nọc bò cạp [35] Bên cạnh các độc tố thần kinh, trong nọc độc bò cạp còn có những polypeptide, các enzyme phospholipase tác động lên quá trình đông - chảy máu [8]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NỌC BÒ CẠP TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu trên thế giới đã xác định trong thành phần nọc bò cạp có rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học tác động lên trên hệ thống thần kinh và quá trình đông – chảy máu

Độc tố thần kinh

Trong các thành phần có hoạt tính sinh học trong nọc bò cạp, các polypeptide - neurotoxin là thành phần được nghiên cứu nhiều nhất, chúng tác động lên các receptor và các kênh ion của các màng tế bào bị kích thích [3, 4, 26] Phụ thuộc vào tác động của các toxin với các kênh ion, phân chia làm 4 loại toxin tác động với các kênh ion: kênh Na+, kênh K+, kênh Cl-, kênh Ca2+ [36]

Các toxin tác động lên kênh Na+ thường là một chuỗi polypeptide được cấu tạo từ 60 – 76 gốc acid amin và cấu trúc của chúng được ổn định bởi bốn cầu disulfide [33, 36, 37, 38] Các toxin tác động lên kênh K+ là những polypeptide ngắn, được cấu tạo từ khoảng 31 – 39 gốc acid amin liên kết với ba hoặc bốn cầu disulfide [4, 39] Các toxin này liên kết với bề mặt ngoài tế bào và cản trở sự di chuyển qua màng tế bào của kênh K+ [39] Các toxin tác động lên kênh Ca2+ đã được xác định gồm hai peptide, các peptide này làm thay đổi sự liên kết của ryanodine với kênh Ca2+ [40] Trong số đó, có một toxin được xác định là peptide

có cấu tạo từ 33 amino acid làm tăng sự liên kết với ryanodine, và toxin còn lại là heterodimer peptide cấu tạo từ 104 và 27 amino acid có vai trò làm ức chế sự liên kết với ryanodine [40] Chlorotoxin, độc tố cực độc tác động lên kênh Cl- là peptide cấu tạo từ 36 gốc acid amine với bốn cầu disulfide [41]

Trang 28

Trong khi cấu trúc bậc một của các độc tố nọc bò cạp khác nhau thì cấu trúc không gian của chúng khá giống nhau Trừ cấu trúc không gian của các độc tố tác động lên kênh Ca2+ là chưa biết, phần lớn các peptide độc tố bò cạp đều cấu tạo bởi một alpha-spiral và ba hay bốn nhánh của cấu trúc beta (cấu trúc beta được tạo thành bởi các chuỗi peptide đối song song) và được ổn định bởi các cầu disulfide [36, 39]

Hình 1.3: Cấu trúc toxin của nọc bò cạp

A Cấu trúc toxin dài

B Cấu trúc toxin ngắn

Ảnh hưởng lên quá trình đông – chảy máu

Trong tất cả các nghiên cứu về nọc độc, nọc rắn là đối tượng đã được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất, và đã phân lập được các thành phần có hoạt tính chống đông máu và gây xuất huyết từ loại nọc này như: protease, metalloproteinase, C-type lectin, disintegrin và những phospholipase [8] Các thành phần này gây rối loạn tiểu cầu và ảnh hưởng lên quá trình đông máu như: quá trình hình thành phức hợp prothrombinase, quá trình fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin không hòa tan, quá trình hình thành mạng lưới fibrin [42, 43]

Bên cạnh nọc rắn, trong nọc bò cạp của các loài: Buthidae, Caraboctonidae, Iuridae, Ischnuridae, Scorpionidae, Vejovidae,… cũng có nhiều peptide và protein

có hoạt tính chống đông máu [8] Nọc độc của loài Parabuthus transvaalicus,

Parabuthus imperator kéo dài thời gian đông máu từ 2,3 – 2,5 so với thời gian đông

Trang 29

máu của mẫu chứng, đối với một số loài khác chỉ từ 0,8 -2,0 lần [44] Nọc độc của

bò cạp Buthus tamulus cũng gây rối loạn đông máu nội mạch lan tỏa, và được thử nghiệm in vitro ở liều gây chết đã làm thay đổi cơ chế đông máu của thỏ khi tiêm tĩnh mạch [45] Gần đây, các nghiên cứu về nọc độc của loài bò cạp Tityus

discrepans, cho thấy với hàm lượng nọc cao khi tiêm vào máu sẽ làm tăng mức độ

nghiêm trọng của các triệu chứng ngộ độc như thay đổi thời gian thrombolpastin (PTT) và thời gian prothrombin (PT), gia tăng nồng độ các cytokine, amylase và glucose [46]

Các enzyme phospholipase (PLA2s) chống đông máu được phân chia làm 3 nhóm khác nhau về hiệu quả ức chế quá trình chống đông máu: nhóm A là những PLA2s có tác động chống đông máu mạnh, nhóm B là những PLA2s chỉ có tác động chống đông máu ở nồng độ cao, và nhóm C là những PLA2s có tác động chống đông máu ở biên hay không có tác động [47] Những PLA2s được phân lập

từ bò cạp được xếp vào giữa nhóm B và nhóm C [8] Trong số 12 PLA2s được phân

lập từ các loài bò cạp như: Anuroctonus phaiodactylus, Pandinus imperator,

Opisthacanthus cayaporum, Hadrurus gertschi,… có enzyme Imperatoxin inhibitor

(IpTxi) của P.imperator và Phaiodactyliphin của A.phaiodactylus đã được công bố

làm trì hoãn thời gian đông máu đối với những cơ thể sống có số lượng tiểu cầu thấp và lượng huyết tương cao [48, 49]

Imperatoxin inhibitor (IpTxi) và Phaiodactylipin là hai peptide được phân lập

từ nọc độc của loài bò cạp P.imperator, đã được xác định làm trì hoãn thời gian

đông máu trên cơ thể sống [49] IpTxi với khối lượng phân tử 14314 Da và Phaiodactylipin với khối lượng phân tử 19172 Da So sánh hoạt tính ảnh hưởng lên quá trình đông máu của hai peptide này đã xác định được IpTxi có hiệu quả hơn so với Phaiodactylipin [49]

Bên cạnh những protein có khối lượng phân tử cao (trên 30 kDa) và những PLA2s có khối lượng phân tử trong khoảng 14 – 16 kDa, trong nọc độc của bò cạp cũng có những peptide có khối lượng phân tử nhỏ có hoạt tính chống đông máu [8]

Các nghiên cứu trên nọc độc của loài Buthus Martensii Karsch cũng đã chỉ ra có

tác động chống đông máu, nghiên cứu này được thực hiện trên cả hai phương pháp

Trang 30

in vivo và in vitro [50] Qua đó đã phân lập và đặt tên cho peptide vừa tìm được là

peptide scorpion venom active polypeptide (SVAP), peptide này ảnh hưởng lên quá trình tạo cục máu đông và làm thay đổi Thromboxane B2 và 6-keto-protaglandin F1[50] Dựa trên peptide này, các nhà khoa học đã nhân bản thành công một peptide mới và đặt tên là peptide Buthus Martensii Karsch APi (BmKAPi) [51] BmKAPi được mã hóa từ peptide cấu tạo gồm 89 amino acid và năm cầu disulfide [51] Có cấu tạo khác so với các peptide có trong nọc độc bò cạp nên cấu trúc ba chiều của BmKAPi có thể cũng sẽ khác Nghiên cứu trình tự acid amin của BmKAPi đã xác định hoạt tính chống đông máu của BmKAPi thấp hơn so với một số peptide chống đông máu được phân lập từ giun móc, ong mật [51] Gần đây, nhà khoa học Brazón

và các đồng nghiệp của mình đã đưa ra một peptide ức chế plasmin, có khối lượng phân tử khoảng 6000 Da, có hoạt tính chống tiêu sợi huyết tương có tên gọi là

discreplasminin, được phân lập từ loài bò cạp Tityus discrepans và đang tiếp tục

nghiên cứu các thành phần có hoạt tính từ nọc của loài này [52, 53]

Nghiên cứu về bò cạp H.laoticus

Những nghiên cứu về loài bò cạp H.laoticus không nhiều Từ nọc độc của loài

này, người ta đã phân lập được hai toxin Toxin đầu tiên được phân lập là

Heteroscorpine-1 (HS-1) thuộc họ Scorpine từ nọc bò cạp H.laoticus ở Thái Lan có

khối lượng phân tử là 8293 Da với 6 gốc cysteine [54] Toxin này đã được xác định

có độc tính đối với côn trùng và có tính kháng khuẩn, kháng nấm [54] Toxin thứ

hai đã được tách từ nọc độc của bò cạp H laoticus bằng phương pháp sắc ký lỏng

cao áp, và đã xác định là polypeptide HelaTx1 có khối lượng phân tử là 2763 Da với 4 gốc cysteine [55] HelaTx1 tác động có hiệu quả đối với kênh Kv1.1 và Kv1.6 với nồng độ thấp (Kv1.1 EC50 = 9,9 ± 1,6 µM), tuy nhiên lại không làm thay đổi sự hoạt động của các kênh K+ này [55] HelaTx1 là peptide đầu tiên đã được phân lập

từ nọc bò cạp H.laoticus có tác động lên kênh κ - KTx5 [55]

Đó là những nghiên cứu về độc tố thần kinh của nọc bò cạp H.laoticus, còn

độc tố ảnh hưởng lên quá trình đông – chảy máu, đang trên quá trình phân lập và xác định các loại toxin này Đây là hướng nghiên cứu có ứng dụng trong y học cao

của loài bò cạp H.laoticus

Trang 31

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ xa xưa, cha ông ta đã sử dụng bò cạp trong y học cổ truyền với tên gọi là toàn yết – dùng nguyên con, hay yết vĩ – dùng phần đuôi có túi nọc để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến hệ thần kinh như động kinh, co giật, liệt bán thân bất toại, méo miệng, [1, 2]… Ngoài ra, bò cạp còn được ngâm trong cồn được dùng để làm thuốc xoa bóp chữa đau cơ, xương và nhức mỏi mang lại hiệu quả cao [26]

Tại Việt Nam, một số loài bò cạp đã được nghiên cứu tính chất và thành phần

như: Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus Từ nọc bò cạp nâu L.mucronatus,

nhóm nghiên cứu của TSKH Hoàng Ngọc Anh, đã tách được một glycoprotein có hoạt tính lectin và các toxin ngắn có khối lượng phân tử trong khoảng 3,5 – 5,0 kDa

có tác động lên myelin thần kinh [23, 39] Một trong những độc tố thần kinh này đã xác định được cấu trúc bậc một một phần của một độc tố và xác định cấu trúc toàn phần của một độc tố khác, kết quả này đã đăng ký ở ngân hàng dữ liệu của protein [23] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu này đã xác định độc tính cấp và tác động kháng

viêm giảm đau của nọc bò cạp nâu L.mucronatus [56]

Đối với nọc bò cạp đen, H.laoticus, nhóm nghiên cứu này đã khảo sát thành

phần protein và dược tính của nó Xác định được loại nọc này chứa các thành phần độc với động vật và độc với côn trùng, nọc toàn phần có tác động kháng viêm, giảm đau [56, 57, 58] Đã xác định được khối lượng phân tử của 2 toxin ngắn có độc tính với côn trùng là 317,974 Da và 832,600 Da [59] Và mới đây, từ nọc bò cạp

H.Laoticus nhóm nghiên cứu này đã tách và xác định được cấu trúc một toxin

Toxin này được đặt tên là Hetlaxin [60] Hetlaxin có khối lượng phân tử là 3669,2 với 8 gốc cysteine hình thành nên 4 cầu disulfide Đây là toxin tác động lên kênh

Kv1.3 với nồng độ nanomol (EC50 = 0,48 ± 0,01 µM) đầu tiên được phân lập từ nọc

độc bò cạp H.laoticus [60]

Bên cạnh đó, qua những nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho thấy nọc bò cạp

H.laoticus còn chứa các thành phần tác động lên quá trình đông – chảy máu, đây là

một hoạt tính mới phát hiện của nọc bò cạp H.laoticus [26, 61, 62] Trước đây, đã

có nghiên cứu ban đầu về tác động chống đông máu của các phân đoạn được tách ra

Trang 32

từ nọc bò cạp H.laoticus bằng sắc ký lọc gel Qua đó, người ta đã xác định 3 phân

đoạn có tác động đông – chảy máu, đó là: phân đoạn 2, phân đoạn 4 và phân đoạn 5 [62] Dựa trên cơ sở này, chúng tôi chọn nghiên cứu sâu hơn về tác động chống đông máu của các phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn 5, phân đoạn có tác động lên quá trình đông – chảy máu

1.3.3 Các ứng dụng từ nọc bò cạp

Tuy nọc bò cạp là độc, nhưng trong thành phần nọc bò cạp có chứa các chất có hoạt tính sinh học, các protein đặc hiệu,… chỉ với hàm lượng nhỏ nhưng đã gây tác động lên cơ thể sống [55, 60] Chính vì điều này đã hấp dẫn các nhà khoa học nghiên cứu khảo sát và đưa nọc bò cạp vào ứng dụng trong y học

Hiện nay trên cơ sở các toxin đã nghiên cứu được từ nọc bò cạp người ta đã ứng dụng để tạo ra nhiều loại thuốc chữa các bệnh hiểm nghèo Từ các toxin tác động lên kênh K+

, các nhà khoa học đã thử nghiệm sản xuất ra các loại thuốc điều trị các bệnh thần kinh như: Azheimer, Parkinson, [4, 7, 39]… Margatoxin tách từ

nọc bò cạp Centruroides margaritatus đã được hãng Merck (Đức) đăng kí bản

quyền như thuốc để điều trị bệnh tự miễn dịch hoặc ngăn cản sự đào thải trong quá trình cấy ghép các cơ quan [63, 64]

Vào năm 1991, ông DeBin - nhà độc chất học đã chứng minh trong nọc bò cạp chứa chất chlorotoxin cực độc có tác động ức chế kênh vận chuyển clo qua màng tế bào [6, 65, 66] Giáo sư đã tiêm chất độc này vào chuột và quan sát hiện tượng biến đổi điện thế màng tế bào Điện thế màng tăng lên, từ -90 mV đến -20 mV và kéo dài trong khoảng 6 giây, điều này được giải thích là do sự ức chế kênh Cl- gây ra và có

ý nghĩa lâm sàng lớn [41, 66] Dựa trên cở sở này, đã có những nghiên cứu phân lập

chlorotoxin từ nọc bò cạp Leiurus quinquestritus và đã được sử dụng để điều trị

bệnh ung thư não [66]

Từ nọc bò cạp xanh Rhppalurus junceus, các nhà khoa học Cuba đã bào chế ra

thuốc điều trị ung thư Vidatox, có tính kháng tế bào ung thư và kháng viêm cao [7] Dưới tác động của chất này, khối u không phát triển được do bị ngăn chặn sự nuôi dưỡng từ mạch máu và đưa đến các chất gây miễn dịch tại khối u Điều này đã mở

ra hi vọng mới cho các bệnh nhân ung thư [5, 7]

Trang 33

Sự thay đổi cấu trúc bậc một của toxin bò cạp có thể sử dụng để chế tạo ra những loại thuốc mới với những hoạt tính riêng Như nghiên cứu cấu trúc của charybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất những protein nhỏ nhưng ổn định có những hoạt tính mới trong y dược [9]

Ngoài chức năng ngăn ngừa và điều trị ung thư, thì nọc độc bò cạp còn có tính kháng khuẩn và kháng nấm [59], nên cũng có thể dùng làm thuốc trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây nên; dùng trong chế phẩm thuốc hạ sốt, chống viêm và giảm đau [9, 56, 67, 68] Với các neurotoxin chứa các hoạt tính dược lý và một số protein, đã được nghiên cứu và khảo sát, chứng minh nọc bò cạp có tác động kháng viêm [67], giảm đau [68, 69]

Bên cạnh tác động gây độc thần kinh đã được nghiên cứu và khảo sát thì tác động gây rối loạn đông máu của nọc bò cạp cũng đã mở ra nhiều triển vọng mới y học để điều trị tình trạng rối loại đông máu gây ra các bệnh có tỷ lệ tử vong cao [8] Các nhà khoa học đã xác định được những protein, enzyme phospholipase có tác động lên quá trình đông – chảy máu và đang tiếp tục nghiên cứu để đưa vào ứng dụng [8]

1.4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU

Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thực phẩm hằng ngày, chất đạm tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm protein, đạm vô cơ (amoniac hay các muối amonium) [70]

Có rất nhiều phương pháp xác định khác nhau phụ thuộc vào đối tượng khảo sát và tùy theo chiều hướng khảo sát loại chất đạm nào sẽ lựa chọn phương pháp thích hợp như: phương pháp li tâm siêu tốc, phương pháp đo độ hấp thụ của dung dịch protein ở vùng tia tử ngoại, hoặc dựa vào các phản ứng so màu đặc trưng (Lowry, Biure, …) hay có thể xác định bằng phương pháp gián tiếp Kjeldahl thông qua xác định N-protein [70]

Trong luận văn này, sử dụng phương pháp so màu Lowry để xác định hàm

lượng protein hòa tan trong nước của nọc bò cạp đen H.laoticus

Trang 34

1.4.1 Phương pháp Biuret

Các hợp chất Hữu cơ nói chung, peptide và protein nói riêng chứa từ hai liên kết peptide (-CO-NH-) trở lên đều có khả năng tạo phức chất có màu tím đỏ đến tím xanh với CuSO4 trong môi trường kiềm mạnh Phức chất này có độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 540 nm [70]

Cường độ màu tỉ lệ với số lượng liên kết peptide (-CO-NH-); nghĩa là tỷ lệ với hàm lượng của lượng protein [71] Do vậy, dựa vào máy quang phổ để suy ra hàm lượng protein của một hợp chất bất kỳ

Phương pháp này dễ dàng thực hiện và cho kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp Biuret là có độ nhạy kém, và các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn (≥ vài mg/mL) [70]

1.4.2 Phương pháp Lowry

Tương tự như phương pháp Biuret, xác định hàm lượng protein dựa vào cường

độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphovolphramat tại bước sóng 750 nm (bước sóng có độ hấp thu cực đại) [70]

Phương pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biuret (tác động lên liên kết peptide) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc Tyrozin, Tryptophan) tạo ra phức màu xanh đặc trưng

Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy tương đối cao, có thể xác định mẫu chứa hàm lượng khoảng vài chục µg protein; nhưng bị ảnh hưởng mạnh bởi (NH4)2SO4 (> 15%), glycine ( > 0,5%), và mercaptan [70, 71, 72]

1.4.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein trong môi trường acid [71] Bước sóng thay đổi từ 465 nm (của thuốc nhuộm) lên 595 nm (của phức chất liên kết với protein) [71]

Phương pháp xác định này có độ nhạy cao (cho phép phát hiện tới vài chục µg protein/mL), dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian (màu xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong 1 giờ); trong dung dịch mẫu nếu có Triton X-100, sodium dodecyl

Trang 35

sulfate sẽ gây nhiễu kết quả [70]

1.5.1 Khái niệm

Sắc kí lọc gel (sắc kí rây phân tử) là phương pháp tách dựa trên sự khác nhau

về kích thước phân tử của các chất Một số vật liệu rắn xốp có khả năng tạo ra bộ khung gel hay rây phân tử khi gặp dung môi tách Pha tĩnh trong sắc kí lọc gel là dung môi trong các lỗ của hạt gel, còn pha động chính là dung môi chạy qua [73] Khi dung dịch cần phân tích đi qua bộ khung gel hay rây phân tử do có kích thước phân tử khác nhau nên sẽ có khả năng khác nhau khi qua gel

Hình 1.4: Tách các phân tử bằng phương pháp sắc ký lọc gel [73]

1.5.2 Nguyên tắc

Phương pháp sắc ký lọc gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng được phủ đầy các dung môi dùng làm pha động [73] Các lỗ rỗng phải có kích thước đồng nhất vì chính nó giữ vai trò quan trọng trong quá trình phân tách chất Mẫu phân tích qua cột gel gồm các cấu tử có kích thước phân tử khác nhau, các cấu

tử lớn hơn kích thước lỗ rỗng, không bị hấp thu lên gel mà chỉ khuếch tán giữa các khe hở của các hạt gel và theo pha động đi ra khỏi cột sớm hơn với thời gian lưu thấp [73] Ngược lại, các cấu tử nhỏ hơn có thể thông qua các lỗ rỗng đi sâu vào bên trong các hạt gel, bị lưu giữ tạm thời trong các lỗ rỗng này và đi ra khỏi cột chậm hơn với thời gian lưu dài Như vậy trong sắc kí lọc gel, các cấu tử trong dung dịch

Trang 36

phân tích sẽ được phân tách theo thứ tự giảm dần về kích thước phân tử [73]

1.5.3 Một số thông số vật lý của sắc ký lọc gel

‾ Giới hạn tách (exclution limit): là khối lượng của phân tử nhỏ nhất không

chui vào bên trong hạt gel [74]

‾ Phạm vi tách (fractionatinon range): là khoảng giới hạn mà gel dễ dàng

phân tách chất được [74]

‾ Độ ngậm nước (water ragain): là lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút

nước, không tính đến lượng nước bao quanh hạt [75]

‾ Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng khi 1 gam gel khô hấp thu

khi trương nở trong nước [75]

‾ Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiều lỗ

Kích thước hạt được xác định bằng đường kính hạt (bead diameter) tính theo

µm Hạt có kích thước lớn (100 – 300 µm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng khả năng phân tách hợp chất thấp Ngược lại, những hạt mịn (10 – 40 µm) có khả năng phân tách hợp chất tốt nhưng tốc độ dòng thấp Thường lựa chọn hạt gel có kích thước 50 – 150 µm để nhồi cột sắc ký, vì cho tốc độ dòng chảy trung bình và khả năng tách tương đối tốt [73, 75]

‾ Thể tích rửa (elution volume): là thể tích đệm cần thiết làm pha động để đưa

chất cần tách ra khỏi cột [75]

‾ Thể tích trống (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel

trong cột [75]

1.5.4 Pha tĩnh của sắc ký lọc gel

Việc tách trong sắc ký lọc gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất Các hạt gel có dạng hình cầu, hạt gel có kích thước càng nhỏ càng tốt vì như thế đảm bảo dòng chảy [73, 75]

Cỡ hạt gel thường được sử dụng là 10 – 40 µm hay 20 – 80 µm Hạt nhỏ hơn cho kết quả tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện dài hơn [74] Các loại gel phổ biến nhất hiện nay như dextran, polyacryamit, polyvinyacetate, polystyrol…hoặc các rây

Trang 37

phân tử vô cơ như zeolit tổng hợp, thủy tinh xốp, silicagel [73]…

Việc chọn gel, yêu cầu quan trọng nhất là phải chọn gel có khả năng tách được các chất có kích thước phân tử hoặc khối lượng phân tử trong vùng chúng ta cần, do

đó phải hết sức cẩn thận chọn kích thước của gel (nếu cần, phải tiến hành thí nghiệm thăm dò trước) [73, 75]

1.5.6 Dung môi và tốc độ dòng chảy

Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào tính tan của hỗn hợp tách; dung môi có thể

là nước, toluene, chloroform,…

Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy

tự do Đối với gel có kích thước lỗ nhỏ thì tốc độ khoảng 8 – 12 mL/cm2 mặt cắt ngang (15 – 25 mL/h), đối với gel lỗ lớn thì 2 – 5 mL/cm2 (5 – 10 mL/h) [74] Dòng chảy có thể chảy theo cách chảy tự do hoặc dùng bơm nén tùy vào loại gel sử dụng [74]

1.5.7 Ứng dụng của sắc ký lọc gel

‾ Xác định khối lượng phân tử của một hợp chất, ví dụ hợp chất đại phân tử [74, 75]

‾ Phân lập mẫu hỗn hợp nhiều chất thành các nhóm hợp chất riêng rẽ [75]

‾ Tách muối ra khỏi hợp chất hoặc dung dịch [75]

Trang 38

phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm để làm khô các sản phẩm sinh học như: enzyme, protein, tế bào… mà không ảnh hưởng đến những tính chất và hoạt tính của sản phẩm [73, 75]

tinh thể; và làm khô ở điều kiện lạnh trong chân không [75]

1.6.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khô

Nguyên tắc của phương pháp đông khô là loại đệm ra khỏi nguyên liệu bằng cách chuyển mẫu đông khô từ trạng thái rắn sang trạng thái khí, mà không qua giai đoạn lỏng trong điều kiện hút chân không ở nhiệt độ thấp Quá trình được thực hiện

ở nhiệt độ và áp suất thấp nên nguyên liệu không bị hỏng hay biến tính [73, 75]

1.6.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô

Sau khi mẫu đem đi sấy thăng hoa thì tính chất lý, hóa, sinh của nguyên liệu không thay đổi [75]:

‾ Duy trì tạo hương, vị và các chất dễ bị phân hủy như vitamin, protein

‾ Màu sắc và hình dạng của mẫu được giữ nguyên

‾ Kéo dài thời gian sử dụng nhờ vào nguyên liệu có độ ẩm thấp

1.7.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng cao áp gọi tắt là HPLC (High Performance Liquid Chromatography) là phương pháp tách chất hoạt động theo nguyên tắc của sắc ký nhưng được hoàn thiện ở mức độ cao [73] Khác với phương pháp sắc ký cổ điển, sắc ký lỏng cao áp đạt hiệu quả phân tách cao nhờ sử dụng các chất nhồi cột có kích thước rất nhỏ (5 đến 10 µm)

Phương pháp này còn có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác như: hoạt động ở áp suất cao, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy nhanh, dễ thu hồi mẫu [73]…

Trang 39

Hình 1.5: Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 1.7.2 Các bộ phận chính của máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Máy HPLC là một hệ thống gồm nhiều thiết bị được lắp ráp với nhau thành một khối hay nhiều khối riêng biệt ráp lại [73] Bơm cao áp và detector là hai bộ phận quan trọng nhất của hệ thống máy HPLC

1.7.2.1 Bình chứa dung môi giải ly cột

Bình chứa dung môi được làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh, luôn có một nắp đậy để bảo vệ dung môi tránh bị bụi bẩn [73] Hệ dung môi dùng để giải ly cột chứa trong những bình này Một hệ thống của máy HPLC thường có 4 bình dung môi

1.7.2.2 Máy bơm

Hệ thống dùng bơm đặc biệt tương ứng với áp suất cao lên đến 7000 psi (48,3 Mpa) để bơm một dung môi (còn gọi là pha động) đi qua lớp pha tĩnh trong cột với vận tốc không đổi (khoảng 0,5 – 4,0 mL/phút) [73]

1.7.2.3 Cột sắc ký

Cột sắc ký dùng trong máy HPLC được làm bằng thép không gỉ, có đường kính trong từ 2,1 – 4,6 mm, chiều dài từ 10 – 25 cm Bên trong cột được nhồi thật chặt bởi các hạt nhỏ thật mịn [73]

Trang 40

Bảng 1.1: Các loại cột sắc ký lỏng cao áp dùng trong các kỹ thuật sắc ký [73]

pha, pha tạo nối

‾ Khối lượng phân tử nhỏ (< 2000)

‾ Không mang điện tích

‾ Có tính phân cực hoặc không có

‾ Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hay nước

‾ Khối lượng phân tử nhỏ (< 2000)

‾ Phân tử có mang điện tích

‾ Hòa tan được trong nước

‾ Khối lượng phân tử nhỏ hay lớn

‾ Không có mang điện tích

‾ Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước

Các loại nguyên liệu dùng để nhồi cột sắc ký HPLC là những hạt có kích thước siêu nhỏ (microporous particle) với kích thước, hình dạng và độ rỗng khác nhau [73] Các loại nguyên liệu như: silica (loại được sử dụng nhiều nhất), alumin, zirconium, nguyên liệu trao đổi ion [73], …

1.7.2.4 Bộ phận tiêm mẫu vào máy

Cho mẫu vào pha động là một vấn đề kỹ thuật của máy HPLC, vì khi đó hệ thống đang ở áp suất cao [73] Bộ phận tiêm mẫu có cấu tạo đặc biệt giúp định hướng dòng chảy của pha động đưa mẫu vào cột sắc ký

1.7.2.5 Detector

Trong hệ thống HPLC, loại đầu dò thường được sử dụng nhiều nhất là đầu do hấp thu tia tử ngoại UV, vì loại detector này không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứng tuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất [73, 75] Đầu dò UV hoạt động dựa trên sự hấp thụ tia tử ngoại của cấu tử trong mẫu phân tích mà dung môi phân tích không có sự xuất hiện của cấu tử này [73, 75]

1.7.3 Dung môi dùng trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Hệ thống HPLC thường sử dụng hỗn hợp hai loại dung môi, đôi khi cũng có những quá trình phân tách sử dụng hệ bốn dung môi

Định dạng
Số trang	124
Dung lượng	4,04 MB