Nghiên cứu quá trình trích ly và định lượng xanthone trong vỏ quả măng cụt (garcinia mangostana l ) bằng kỹ thuật trích ly với sự hỗ trợ vi sóng

Theo các nhà nghiên cứu, các hợp chất xanthone trong vỏ quả măng cụt có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hệ thống miễn dịch, ức chế tế bào ung thư … Các công trình nghiên cứu y khoa đã

-

NGUYỄN THỊ NGỌC TUYẾT

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRÍCH LY VÀ ĐỊNH LƯỢNG

XANTHONE TRONG VỎ QUẢ MĂNG CỤT (Garcinia mangostana L.) BẰNG KỸ THUẬT TRÍCH LY VỚI SỰ HỖ

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: ………

(Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1: ………

(Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2: ………

(Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày …… tháng …… năm ……

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: (Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị và chữ ký của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ) 1 ………

2 ………

3 ………

4 ………

5 ………

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ NGỌC TUYẾT MSHV: 12050174 Ngày, tháng, năm sinh: 14/12/1989 Nơi sinh: TP.HCM

I TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu quá trình trích ly và định lượng xanthone trong vỏ

quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) bằng kỹ thuật trích ly với sự hỗ trợ vi

sóng”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

- Xây dựng quy trình định lượng xanthone từ dịch trích của vỏ quả măng cụt

- So sánh khả năng trích ly xanthone bằng các phương pháp trích ly khác nhau

- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly

- Tối ưu hóa quá trình trích ly xanthone bằng kỹ thuật trích ly với sự hỗ trợ vi sóng

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 1 năm 2013

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11 năm 2013

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Lê Thị Kim Phụng

LỜI CẢM ƠN

Con kính gửi đến ba, mẹ lòng biết ơn sâu sắc Sự động viên, chăm sóc của

ba, mẹ và những thành viên trong gia đình là điểm tựa cho con vững bước trên con đường học vấn cũng như công việc và cuộc sống sau này

Em xin chân thành cảm ơn cô PGS.TS Lê Thị Kim Phụng cùng quý thầy cô Khoa Kỹ thuật hóa học - Trường Đại học Bách Khoa đã tận tình vun đắp kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn đang làm việc tại phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ hóa học và Dầu khí đã tạo mọi điều kiện, động viên, tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng không thể tránh khỏi sai sót và do thời gian nghiên cứu có hạn nên tôi rất mong sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô và các bạn

để nội dung nghiên cứu thêm hoàn chỉnh

Cuối cùng kính gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đã xem xét và góp ý tận tình cho đề tài của tôi

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2013

Nguyễn Thị Ngọc Tuyết

Bên cạnh đó, quy trình định lượng α-mangostin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng được đưa ra với độ chính xác, độ lặp lại, độ đúng cùng với khả năng phân tách tốt Các điều kiện phân tích được xác định như sau: chương trình rửa giải đẳng dòng với thành phần pha động MeOH: H2O (0,1% AcOH) với tỉ

lệ 85:15 (v/v); bước sóng phân tích 320nm; nhiệt độ buồng cột 350C với thời gian rửa giải là 15 phút

Ba yếu tố công suất (50 – 100 W), tỉ lệ dung môi: nguyên liệu (15 – 25 mL/g), tỉ lệ EtOH: H2O (900 – 100%) với thời gian trích ly 20 phút được khảo sát

để đánh giá hiệu quả của quá trình trích ly Kết quả cho thấy, công suất và tỉ lệ dung môi: nguyên liệu ảnh hưởng đến hàm lượng α-mangostin trích được

Quá trình tối ưu hóa được thực hiện dựa trên hàm mục tiêu – hàm lượng mangostin Kết quả phương án tối ưu cho hàm mục tiêu là hàm lượng α-mangostin khả thi nhất vì điều kiện trích ly dễ thực hiện (công suất 100 W, tỉ lệ dung môi:

α-nguyên liệu 25 mL/g, tỉ lệ EtOH: H2O 90%), phù hợp với yêu cầu thực tế là hàm lượng α-mangostin và khả năng đáp ứng của hàm mục tiêu là cao nhất

ABSTRACT

Some recently researches have also found the presence of 40 types of xanthone in mangosteen fruit rind with antioxidant effects, stimulates the immune system, inhibit cancer cell This helped mangosteen is a fruit that contains many xanthones Xanthone increasingly attracted the attention of the scientific world by value pharmacology and its potential in medicine

Xanthone well as α-mangostin is usually extracted by conventional extraction methods such as soaking beams, Soxhlet using common solvents, supercritical fluid extraction and a new method – microwave-assisted extraction (MAE) This study compared the effectiveness of the extraction method on evaluation of the factors that influence and optimize the extraction process of α-mangostin with microwave-assisted Results showed that microwave-assisted extraction (MAE) has several advantages over other methods such as high extraction yield and short extraction time

Besides, the process of α-mangostin quantitative method of high performance liquid chromatography is also given with accuracy, repeatability with good separation ability The analysis conditions are defined as follows: elution program is playing with the mobile phase composition MeOH: H2O (0.1% AcOH) with 85:15 (v/v), 320nm - wavelength analysis; column temperature 350C with an elution time of 15 minutes

Three factors: extraction power (50-100 W), ratio of solvent: materials

(15-25 mL/g), ratio of EtOH: H2O (900-100%) for 20 minutes extraction time were examined to assessment process The results show that the extraction power and ratio of solvent: material affect on the content of α-mangostin

Optimization is performed based on the objective function is defined Results optimal solution for the objective function is the content of α-mangostin most feasible for implementation deducted conditions (power 100W, ratio of solvent: material 25 mL/g, ratio of EtOH: H2O 90%), consistent with the fact that the required levels of α-mangostin was extracted and the ability to meet the objective function is the highest

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ công trình nghiên cứu trình bày trong luận văn Thạc sĩ này là do tôi thực hiện thí nghiệm và tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về kết quả nghiên cứu này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 11 năm 2013

Nguyễn Thị Ngọc Tuyết

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC 3

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 3

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY MĂNG CỤT (Garcinia mangostana L.) 5

2.1.1 Đặc điểm thực vật 5

2.1.2 α-mangostin 15

2.1.3 Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về cây măng cụt (Garcinia mangostan L.) 15

2.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) 18

2.2.1 Phân loại sắc ký 18

2.2.2 Định nghĩa 19

2.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 19

2.2.4 Bộ dụng cụ của HPLC 21

2.2.5 Ứng dụng trong phân tích định tính 22

2.2.6 Ứng dụng trong phân tích định lượng 23

2.3 TRÍCH LY VỚI SỰ HỖ TRỢ VI SÓNG – MICROWAVE-ASSISTED EXTRACTION (MAE) 24

2.3.1 Lý thuyết về vi sóng 24

2.3.2 Nguyên tắc trích ly 26

2.3.3 Cấu tạo thiết bị 27

2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 29

2.4 PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 32

2.4.1 Khái niệm về quy hoạch thực nghiệm 32

2.4.2 Quy hoạch thực nghiệm đa mục tiêu 33

2.4.3 Xây dựng mô hình kiểm định 35

2.4.4 Phương pháp bề mặt đáp ứng biểu diễn bằng đa thức bậc hai 38

Chương 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 41

3.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 41

3.1.1 Nguyên vật liệu 41

3.1.2 Trang thiết bị 41

3.1.3 Hóa chất 41

3.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM 42

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA MANGOSTIN BẰNG HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 42

3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 42

3.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 42

3.3.3 Thẩm định quy trình định lượng cho hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao 43

3.4 KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY ALPHA MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT 45

3.4.1 Phương pháp ngâm 45

3.4.2 Phương pháp Soxhlet 45

3.4.3 Phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng 45

3.4.4 Phương pháp trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn 46

3.5 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRÍCH LY LÊN HÀM LƯỢNG ALPHA MANGOSTIN 46

3.5.1 Khảo sát thời gian trích ly 46

3.5.2 Khảo sát các điều kiện trích ly và đưa ra các thông số tối ưu 46

Chương 4: KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALPHA MANGOSTIN 49

4.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ 49

4.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALPHA MANGOSTIN 50

4.2.1 Tìm bước sóng hấp thu cực đại của α-mangostin 50

4.2.2 Khảo sát các điều kiện sắc ký 50

4.2.3 Thẩm định quy trình định lượng 53

4.3 ĐỊNH TÍNH ALPHA MANGOSTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI HAI TẦNG TỨ CỰC 58

Chương 5: KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY ALPHA MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT 62

5.1 KẾT QUẢ 62

5.1 NHẬN XÉT 63

Chương 6: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRÍCH LY ĐẾN HÀM LƯỢNG ALPHA MANGOSTIN 66

6.1 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TRÍCH LY SƠ BỘ 66

6.1.1 Khảo sát thời gian trích ly 66

6.1.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ EtOH: H2O 67

6.1.3 Kết quả khảo sát công suất trích ly 69

6.1.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi: nguyên liệu trích ly 70

6.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ LÊN HÀM LƯỢNG ALPHA MANGOSTIN 72

6.2.1 Kết quả thí nghiệm 72

6.2.2 Phân tích biến (ANOVA) 73

6.2.3 Ảnh hưởng các yếu tố lên hàm lượng α-mangostin 73

6.3 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY DỰA TRÊN PHƯƠNG TRÌNH HỒI QUY THỰC NGHIỆM 75

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại khoa học 5

Bảng 2.2 Các chất xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt 7

Bảng 2.3 Tính chất kháng oxi hóa của măng cụt 12

Bảng 2.4 Tính kháng ung thư của các xanthone phân lập từ măng cụt 13

Bảng 2.5 Tính kháng viêm và chống dị ứng của măng cụt 13

Bảng 2.6 Tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus của măng cụt 14

Bảng 2.7 Sự phân loại các phương pháp sắc ký 18

Bảng 2.8 Hằng số điện môi và hệ số hấp thu của một số dung môi 25

Bảng 2.9 Bảng quy hoạch thực nghiệm 34

Bảng 2.10 Bảng quy hoạch thực nghiệm 35

Bảng 3.1 Các điều kiện pha động được khảo sát 43

Bảng 3.2 Dãy dung dịch chuẩn α-mangostin 45

Bảng 3.3 Khoảng khảo sát của các biến 46

Bảng 3.4 Các điều kiện trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng 47

Bảng 4.1 Độ ẩm của nguyên liệu 49

Bảng 4.2 Màu sắc và mật độ quang của các dịch ngâm trong các dung môi 49

Bảng 4.3 Bảng khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động 51

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của α-mangostin chuẩn 53

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của α-mangostin trong mẫu thử 54

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại 55

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát độ đúng của α-mangostin 56

Bảng 4.8 Bảng kết quả xây dựng đường chuẩn α-mangostin 56

Bảng 4.9 Bảng kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 57

Bảng 4.10 Bảng kết quả xác định các điều kiện vận hành với đầu dò MS/MS 59

Bảng 4.11 Sự phân mảnh ion con của α-mangostin 60

Bảng 5.1 Kết quả hàm lượng α-mangostin, % α-mangostin và độ chọn lọc của các phương pháp khác nhau 62

Bảng 6.1 Kết quả hàm lượng α-mangostin theo các khoảng thời gian khác nhau 66 Bảng 6.2 Kết quả hàm lượng α-mangostin ở các tỉ lệ dung môi EtOH: H2O khác nhau 68

Bảng 6.3 Kết quả hàm lượng α-mangostin ở các công suất khác nhau 69

Bảng 6.4 Kết quả hàm lượng α-mangostin ở các tỉ lệ dung môi: nguyên liệu khác nhau 71

Bảng 6.5 Bảng kết quả thí nghiệm 72

Bảng 6.6 Kết quả phân tích biến 73

Bảng 6.7 Kết quả phân tích hàm lượng α-mangostin 74

Bảng 6.8 Kết quả tối ưu quá trình trích ly α-mangostin 76

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Mô tả lá, hoa và quả măng cụt 7

Hình 2.2 Minh họa các lực tương tác trong quá trình sắc ký 20

Hình 2.3 Minh họa quá trình tách chất trong sắc ký 20

Hình 2.4 Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 21

Hình 2.5 Sơ đồ hai hệ vi sóng 27

Hình 2.6 Mô hình quy hoạch đa mục tiêu 33

Hình 2.7 Mô hình kiểm định 35

Hình 3.1 Nguyên liệu: măng cụt trái và bột vỏ măng cụt 41

Hình 4.1 Phổ UV của α-mangostin 50

Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu phân tích ở các tỉ lệ pha động MeOH: H2O khác nhau 51

Hình 4.3 Sắc ký đồ mẫu phân tích ở các nhiệt độ buồng cột khác nhau 52

Hình 4.4 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử 55

Hình 4.5 Đường biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của α-mangostin 57

Hình 4.6 Sắc ký đồ của các chuẩn α-mangostin với các nồng độ khác nhau 57

Hình 4.7 Phổ MS – ion phân tử của α-mangostin chuẩn 59

Hình 4.8 Phổ MS – ion con của α-mangostin chuẩn 59

Hình 4.9 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử khi phân tích trên hệ HPLC 61

Hình 4.10 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử khi phân tích trên hệ LC-MS/MS 61

Hình 5.1 Kết quả hàm lượng α-mangostin, độ chọn lọc và % α-mangostin của các phương pháp khác nhau 63

Hình 5.2 Hình chụp SEM của các mẫu ban đầu và sau khi trích ly với các phương pháp khác nhau 65

Hình 6.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng

α-mangostin 67

Hình 6.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ EtOH: H2O đến hàm lượng α-mangostin 69

Hình 6.3 Khảo sát ảnh hưởng của công suất trích ly đến hàm lượng α-mangostin 70

Hình 6.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng α-mangostin 71

Hình 6.5 Giá trị thực nghiệm so với giá trị dự đoán hàm lượng α-mangostin 73

Hình 6.6 Hàm lượng α-mangostin theo P, R 75

Hình 6.7 Tối ưu hóa ưu hóa trích ly α-mangostin 76

DANH MỤC VIẾT TẮT

SFE Supercritical fluid extraction (trích ly sử dụng lưu chất siêu tới

hạn) MAE Microwave-assisted extraction (trích ly với sự hỗ trợ vi sóng) DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ABTS 2,20-azino-bis-(2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) acid

SC-CO2 CO2 siêu tới hạn

LC-MS Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

HPLC/ESI-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ với nguồn ion hóa

điện tử

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UV-Vis Phổ tử ngoại – khả kiến

SEM Kính hiển vi quét điện tử

PTFE Polytetrafloroethylene

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Xanthone được biết như là chất có khả năng chống ung thư khá mạnh Theo các nhà nghiên cứu, các hợp chất xanthone trong vỏ quả măng cụt có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hệ thống miễn dịch, ức chế tế bào ung thư … Các công trình nghiên cứu y khoa đã tìm thấy khoảng 40 loại xanthone hiện diện trong vỏ quả măng cụt Điều này đã giúp cho măng cụt trở thành một loại trái cây có chứa nhiều xanthone nhất Xanthone ngày càng thu hút được sự chú ý của giới khoa học bởi giá trị dược học và tiềm năng của nó trong nền y học hiện đại Xanthone có những tính chất đáng quý như sau [4, 5]:

- Tác dụng chống oxy hóa: xanthone là hợp chất hóa học có hoạt tính chống oxy hóa rất cao, trên cả dâu tây rừng (blueberry)

- Kháng nấm: nhiều loại xanthone và những dẫn xuất của chúng được chứng minh

là có tính kháng nấm và vi khuẩn bao gồm cả những vi khuẩn có khả năng đề kháng kháng sinh

- Kích thích hệ thống miễn dịch cơ thể nhằm giúp cơ thể chống lại những vi sinh vật lạ xâm nhập

- Ức chế sự oxy hóa của LDL (low-density lipoprotein) có tác động làm giảm cholesterol

- Có tác dụng bảo vệ tế bào gan

- Có tác dụng ức chế những tế bào ung bướu và vì vậy được xem là một chất có tác dụng kháng ung thư

- Tác dụng giảm đau: một số xanthone có khả năng ức chế các hoạt động của men cyclo-oxygenase

- Xanthone được xem là “ứng viên tiềm năng” trong chữa trị những chứng bệnh Parkinson và Alzheimer

Hiện nay tại Việt Nam, măng cụt được trồng khá nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long với diện tích khoảng 4,9 nghìn ha, cho sản lượng khoảng 4,5 nghìn tấn/năm Theo dự án sản xuất và xuất khẩu rau, hoa, quả tươi của Việt Nam dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở đồng bằng sông Cửu Long và Nam Bộ lên 11,3

nghìn ha, cho sản lượng 24 nghìn tấn Từ những đặc tính vốn quý của măng cụt và hơn thế nữa tiềm năng nguồn nguyên liệu này rất phong phú tại nước ta mà tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quá trình trích ly và định lượng xanthone trong

vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) bằng kỹ thuật trích ly với sự hỗ trợ vi

sóng”

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Để đáp ứng yêu cầu của đề tài này, đối tượng nghiên cứu bao gồm:

- Vỏ quả măng cụt được sấy khô và nghiền nhỏ, bảo quản trong tối đến khi sử dụng

- Quy trình trích ly một số hợp chất thiên nhiên với sự hỗ trợ vi sóng

- Phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tìm điều kiện tối ưu

- Quy trình phân tích sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng ghép nối hai tầng tứ cực

- Quy trình tách chiết, làm giàu mẫu bằng phương pháp trích ly lỏng - lỏng

1.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Dựa vào đối tượng của đề tài, mục tiêu nghiên cứu bao gồm:

- Đưa ra quy trình phân tích xanthone từ vỏ quả măng cụt với độ chính xác, độ lặp

lại, độ đúng cao cùng với khả năng phân tách tốt

- Đưa ra quy trình trích ly hoàn thiện trên quy mô phòng thí nghiệm các xanthone đạt hiệu suất cao Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trích ly lên hiệu suất trích ly xanthone Từ đó đưa ra các thông số tối ưu cho quá trình trích ly xanthone với

phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng để xác định các điều kiện phân tách α-mangostin tốt nhất cho quá trình phân tích, đảm bảo độ đúng, độ chính xác và độ lặp lại cao

- Thực nghiệm so sánh hiệu quả trích ly - mangostin của các phương pháp trích ly khác nhau: ngâm dầm, Soxhlet, trích ly với hỗ trợ vi sóng, trích ly sử dụng CO2 siêu tới hạn

- Phương pháp quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm DESIGN-EXPERT 7 xác định các yếu tố ảnh hưởng và tác động qua lại giữa chúng lên hàm lượng α-mangostin khi trích ly bằng phương pháp trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC

Gần đây, công nghệ trích ly với sự hỗ trợ vi sóng được ứng dụng ngày càng nhiều trong một số lĩnh vực nhưng chỉ có số ít các công trình khoa học được công

bố trên thế giới cũng như tại Việt Nam Đồng thời, với sự phát triển của khoa học

kỹ thuật, các phương pháp phân tích hiện đại nói chung và phương pháp phân tích sắc ký nói riêng nhận được nhiều sự quan tâm hơn và các kỹ thuật này ngày càng được nâng cao

Hiện nay, công nghệ trích ly với sự hỗ trợ vi sóng hợp chất α-mangostin – một hoạt chất có khả năng chống ung thư, kháng oxy hóa – từ vỏ quả măng cụt chưa nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học Bên cạnh đó, việc xác định và hoàn thiện quy trình trích ly, định lượng các hợp chất xanthone nói chung và α-mangostin nói riêng góp phần nâng cao độ nhạy, độ chọn lọc dựa trên các kỹ thuật phân tích hiện đại Vì thế, nghiên cứu này liên quan đến việc đưa ra một phương pháp định lượng có giá trị nhằm đánh giá hiệu quả quá trình trích ly α-mangostin Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thành kỹ thuật phân tích và trích ly hoạt chất này

Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam, phương pháp trích ly α-mangostin với sự hỗ trợ vi sóng được tiến hành nghiên cứu Nói chung, nghiên cứu này bổ sung thêm một phân đoạn mới cho việc trích ly các hoạt chất có nguồn sản phẩm tự nhiên từ các nguồn dược liệu phong phú ở Việt Nam

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN

Nhu cầu về các hợp chất dược liệu từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên, ví dụ như α-mangostin, ngày càng tăng cao trong khi nguồn nguyên liệu ban đầu cho sản

xuất phong phú Cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) được trồng tại miền Nam

là nguồn cung cấp nguyên liệu phong phú Cho nên việc đưa ra một quy trình trích

ly và định lượng α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) là rất

cần thiết

Hiện nay, ở Việt Nam, tất cả công nghệ trích ly thường dùng là các phương pháp trích ly sử dụng dung môi thông thường Các kỹ thuật này thường có các vấn

đề về sức khỏe và môi trường Phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng là phương pháp đang được chú ý và được dùng giải quyết được các nhược điểm này

Lần đầu tiên ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu chúng tôi đưa ra quy trình định lượng và trích ly α-mangostin từ vỏ quả măng cụt Các kết quả nghiên cứu cung cấp tiềm năng cho việc ứng dụng trên quy mô pilot Bên cạnh đó, Việt Nam phải nhập khẩu một lượng lớn thuốc điều trị ung thư mỗi năm Do đó, kết quả của nghiên cứu

có thể được ứng dụng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp, đáp ứng nhu cầu trong nước và hướng đến xuất khẩu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đưa ra phương pháp phân tích tối ưu và trích ly hiệu quả hoạt chất này.Vì thế, nghiên cứu này có tầm quan trọng và cần thiết để đưa ra quy trình tối ưu đáp ứng nhu cầu hiện nay

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CÂY MĂNG CỤT (Garcinia mangostana L.)

2.1.1 Đặc điểm thực vật

2.1.1.1 Phân loại, phân bố sinh thái

Bảng 2.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum) Plantae (không phân hạng) Angiospermae (không phân hạng) Eudicots (không phân hạng) Rosids

Họ (familia) Clusiaceae

Loài (species) G mangostana

Cây măng cụt nguồn gốc Mã Lai, Nam Dương, từ Malacca qua Moluku, ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, ở Ấn Độ, Myanma cũng như ở Sri Lanka, Philippines, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam [5]

, rồi trồng nhiều ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định, Thủ Dầu Một Hiện nay, măng cụt được trồng nhiều ở Thái Lan, Philipin, Myanmar, Sri Lanka Ở đây khí hậu cũng nóng ấm nên cây dễ mọc, vì vậy nó không tiến được lên miền Bắc xứ lạnh, xa lắm là đến Huế

Cây măng cụt có thể sinh trưởng trên nhiều loại đất khác nhau, có khả năng chịu được đất hơi chua nhưng tốt nhất là đất sét giàu hữu cơ, tầng canh tác dày, gần nguồn nước tưới và thoát nước tốt Tại miền Nam, măng cụt trổ hoa vào tháng 1 – 2 dương lịch, bắt đầu thu trái từ tháng 5 – 8 dương lịch, có khuynh hướng cho quả cách năm

2.1.1.2 Mô tả thực vật [4, 5]

Măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana L là loài cây thuộc họ

bứa (Clusiaceae), cũng là một loại cây ăn quả nhiệt đới Cây gỗ vừa, có thể cao đến

20 – 25 m, phân nhiều nhánh đối chéo nhau và nằm ngang Thân cây non màu xanh lục, mặt ngoài có nhiều khía dọc tiết diện hình chữ nhật Thân cây trưởng thành có

màu xám đen, sần sùi, có nhiều rãnh nứt dọc tiết diện tròn

Lá đơn mọc đối không có lá kèm Phiến lá bóng, dày và dai, hình elip thuôn dài Mặt trên lá màu xanh lục đậm hơn mặt dưới Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ ở hai mặt, gân phụ dày 40 – 50 cặp song song xếp khít nhau Cuống lá màu

xanh, hình trụ phẳng mặt trên và hơi phình ở đáy Lá non có màu hồng

Hoa mọc riêng rẽ hoặc 2 – 3 hoa mọc ở nách lá hay ngọn cành Hoa đực và hoa lưỡng tính có thể ở cùng một cây Hoa đa tính thường là hoa cái Cuống hoa có đốt Hoa có 4 cánh, hình bầu dục, phiến dày ở gốc mỏng dần ở đỉnh Cánh hoa màu xanh với những đốm đỏ bên ngoài, màu vàng đỏ bên trong Lá đài rời, không đều; 2

lá ngoài đường kính 2 – 2,5 cm có màu xanh mặt ngoài, màu đỏ tía ở mặt trong, 2 lá trong màu đỏ tía đường kính 3 – 3,5 cm Bộ nhị có 16 – 17 nhị, bầu noãn có 5 – 8 ô, vòi nhụy rất ngắn gần như không có Đầu nhụy to, nằm trên đỉnh bầu, dạng khối màu vàng hơi lõm ở giữa, chia thành 6 – 8 thùy, bề mặt có nhiều vân Cuống hoa,

đế hoa, đài hoa, cánh hoa và bầu noãn thường có chất nhựa mủ màu vàng tiết ra

thành từng chấm nhỏ

Quả hình cầu, đường kính 4 – 7 cm, có mang đài hoa và đầu nhụy vẫn còn tồn tại Vỏ quả màu tím đỏ, dai và xốp Phần ăn được (áo hạt) có màu trắng tuyết, vị chua ngọt Quả thường có 5 – 8 hạt Hạt hình trứng, thuôn dài và hơi dẹt Như các loại quả khác, măng cụt ngọt nhờ có nhiều chất đường: sucroza, fructoza và có thể

có cả maltoza

Hình 2.1 Mô tả lá, hoa và quả măng cụt 2.1.1.3 Thành phần hóa học

Những nghiên cứu về các hợp chất hóa học liên quan đến măng cụt chủ yếu hướng về vỏ quả Thành phần nghiên cứu chủ yếu là hợp chất xanthone Hơn 200 loại xanthone được biết đến trong tự nhiên thì có tới 50 loại xanthone được tìm thấy trong vỏ măng cụt Một số nghiên cứu đã xác định được một số loại xanthone từ các

bộ phận của măng cụt được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chất xanthone được phân lập từ vỏ quả măng cụt [20]

α-Mangostin

Schmid (1855) Yates, Stout (1958) Stout và Krahn (1968)

β-Mangostin

Dragendorff (1930) Yates, Bhat (1968) Mahabusarakam và cộng sự (1987)

γ-Mangostin

Jefferson và cộng sự (1970) Mahabusarakam và cộng sự

(1987) Jinsart và cộng sự (1992)

Mangostanol

Chairungsrilerd (1996a) Suksamrarn và cộng sự (2002, 2003) Huang và cộng sự (2001)

(1987)

3-Isomangostin

Huang và cộng sự (2001) Mahabusarakam và cộng sự

(1987)

(1987) 1,6-Dihydroxy-7-methoxy-8-isoprenyl-60,60-

Demethylcalabaxanthone

Mahabusarakam và cộng sự

(1987) Suksamrarn và cộng sự (2003)

Suksamrarn và cộng sự (2002, 2003) Matsumoto và cộng sự (2003)

Gartanin

Govindachari và cộng sự (1971) Mahabusarakam và cộng sự

(1987) Asai và cộng sự (1995)

8-Deoxygartanin

Gopalakrishnan và cộng sự (1997) Govindachari và cộng sự (1971) Huang và cộng sự (2001)

Garcinone B

Sen và cộng sự (1980, 1982) Huang và cộng sự (2001) Suksamrarn và cộng sự (2002, 2003)

Garcinone D

Sen và cộng sự (1986) Gopalakrishnan và cộng sự (1997) Huang và cộng sự (2001)

Garcinone E

Dutta và cộng sự (1987) Sakai và cộng sự (1993) Asai và cộng sự (1995)

Suksamrarn và cộng sự

(2002, 2003)

1,5-dihydroxy-2-isoprenyl-3-methoxyxanthone

Asai và cộng sự (1995) Iinuma và cộng sự (1996) Huang và cộng sự (2001) Mangostingone 7-methoxy-2-(3- isoprenyl)-8-

methoxyxanthone

Mahabusarakam và cộng sự

(1987) 2,8-Bis(c,c-dimethylallyl)-1,3,7-

trihydroxyxanthone

Mahabusarakam và cộng sự

(1987) 1,3,7-Trihydroxy-2,8-di-(3-methylbut-2-enyl)

xanthone

Mahabusarakam và cộng sự

(1987) 1,7-Dihydroxy-2-isoprenyl-3-

methoxyxanthone

Asai và cộng sự (1995) Iinuma và cộng sự (1996) Huang và cộng sự (2001) 2,7-Diisoprenyl-1,3,8-trihydroxy 4-

methylxanthone

Gopalakrishnan, Balaganesan

(2000) 2,8-Diisoprenyl-7-carboxy-1,3

dihydroxyxanthone

Gopalakrishnan, Balaganesan

(2000) 2-Isoprenyl-1,7-dihydroxy-3 methoxyxanthone Matsumoto và cộng sự (2003) 1,3,6,7-Tetrahydroxy-8-(3 methyl-2-buthenyl)-

Măng cụt có mùi hương nhờ một số các chất dễ bay hơi Phổ sắc ký tinh dầu trích ly phát hiện khoảng 50 hợp chất hữu cơ, trong số đó có hơn 30 chất đã được xác định [33] Nhiều nhất là hexenol (27,27%), tương đối ít hơn là octan

(14,76%), đứng trước hexyl acetat (7,87%), α-copaen (7,28%), aceton (5,65%), furfural (4,89%), hexanol (4,38%), methyl butenon (4,34%) Những chất khác đều dưới 2% nhưng góp phần với các chất trên cấu thành hương vị của măng cụt Ngoài hexyl acetat và hexenyl acetat đặc biệt của măng cụt, mùi trái cây là do các chất hexenal, hexanol, α-bisabolen, thêm vào mùi xoài với α-copaen, mùi hoa lài với furfuryl methylceton, mùi huệ dạ hương với phenyl acetaldehyd, mùi cỏ với hexenol, hexanal, mùi cỏ héo với pyridin, mùi lá ướt với xylen, mùi hoa khô với benzaldehyd, mùi hồ đào với δ-cadinen Aceton, ethyl cyclohexan đóng góp tính chất dịu ngọt trong lúc toluen, α-terpinol đem lại mùi đường thắng, methyl butenol, guaien mùi dầu, valencen đặc biệt mùi mứt cam Đáng để ý là nếu furfural methylceton là đặc trưng hương thơm dễ chịu thì furfural lại cho thoáng vào một mùi hôi khó ngửi

Thành phần chính của vỏ quả măng cụt đã được xác định là một loạt xanthone mà những chất chính là mangostin [18, 24, 38], α-mangostin[12, 36], β-mangostin [18, 24, 38], γ-mangostin [18, 36], các isomangostin [34], normangostin [24], bên cạnh trioxyxanthon [13, 41], pyranoxanthon [45], dihydroxy methyl butenyl xanthon [12], trihydroxy methyl butenyl xanthon [36], pyrano xanthenon [39] Các garcinon A, B, C, D, E [40, 42], mangostinon [12], garcimangoson A, B,

C [30], gartanin [24, 25, 43], egonol [36], epicatechin, procyanidin từ măng cụt nguồn gốc Việt Nam [51], benzophenon glucosid [17] tuy số lượng ít nhưng đã được tìm ra Cũng có một vài báo cáo trình bày thành phần hóa học của lá măng cụt Bên cạnh protein (7,8 %), tanin (11,2 %), đã xác định được các chất như các trihydroxy methoxy methyl butenyl xanthon [43], ethyl methyl maleimid glucopyranosid [31], cùng các triterpenoid như cycloartenol, friedlin, β-sitosterol, betulin, mangiferadiol, mangiferolic acid, cyclolanostendiol [46], hydroxy cyclolanostenon [44]

Từ ruột thân cây, tetrahydroxy xanthon và dẫn xuất O-glucosid của nó cùng pentahydroxy xanthon, maclurin, cũng đã được tìm ra [27] Còn tử y thì chứa đựng mangostin, các calaba xanthon, dihydroxy và trihydroxy dimethyl allyl xanthon [34]

2.1.1.4 Dược tính [20]

* Hoạt chất kháng oxi hóa

Các hoạt tính kháng oxi hóa của xanthone đã được chứng minh bằng các phương pháp như phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), phương pháp ABTS (2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), phương pháp ferric thiocyanate

Bảng 2.3 Tính chất kháng oxi hóa của măng cụt

Dịch trích methanol của vỏ quả măng cụt thể hiện hoạt

tính bắt giữ gốc tự do với thuốc thử DPPH

Yoshikawa et al (1994) α-mangostin kiểm soát quá trình khử đồng của chất oxi

hóa LDL trong môi trường ống nghiệm

Williams và cộng

sự (1995) α- và γ-mangostin thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa khi

dùng phương pháp ferric thyicyanate Fan and Su (1997) Dịch chiết methanol của thịt quả măng cụt thể hiện hoạt

tính kháng oxi hóa khi thử nghiệm bằng phương pháp

DPPH và ABTS

Mahabusarakam (2000) Leong and Shui (2002) Dịch chiết methanol thô từ vỏ măng cụt cải thiện quá trình

sản xuất các ROS nội bào trong các tế bào SKBR3

Moongkarndi và cộng sự (2004) Dịch chiết vỏ măng cụt có thể khử nhóm HO- và có hiệu

quả đối với sự ức chế peoxy hóa lipid

Garcia và cộng sự (2005) α-mangostin thể hiện tác dụng bảo vệ, chống lại sự khử

isoproterenol- gây ra sự oxi hóa và tổn thương cơ tim ở

biểu bì gan, SKBR3 ung thư vú ở người, bệnh bạch cầu ở người đã được dùng cho việc thử nghiệm khả năng kháng ung thư của các hoạt chất này

Bảng 2.4 Tính kháng ung thư của các xanthone phân lập từ măng cụt

Garcinone E có tác dụng đầu độc trên các tế bào ung thư

gan cũng giống như trên các tế bào ung thư dạ dày và phổi

Ho và cộng sự (2002)

6 loại xanthone trong vỏ măng cụt thể hiện tính kháng sinh

chống lại tế bào ung thư bạch cầu ở người HL60

Matsumoto và cộng sự (2003) Trị liệu bằng α- mangostin trong chế độ ăn uống giúp hạn

chế các tế bào tăng sinh trong ruột kết bị tổn thương ở chuột

được tiêm 1,2-dimethylhydrazine

Nabandith và cộng

sự (2004) Dịch trích bằng nước của vỏ măng cụt thể hiện hoạt tính

kháng bệnh bạch cầu trên 4 dòng tế bào

Chiang và cộng sự (2004) α-mangostin gây ra sự tự hoại của các tế bào ung thư bạch

α-mangostin làm ức chế 7,12-dimethylbenz (a) anthracene-

nguyên nhân gây ra các tổn thương tiền ung thư trên vú

chuột

Matsumoto và cộng sự (2005) α-mangostin thể hiện hoạt tính kháng ung bướu đối với tế

bào DLD-1

Nakagawa và cộng

sự (2007) Các kết quả trên cho thấy α-mangostin và các dẫn xuất là những dược chất tiềm năng trong các ứng dụng phòng ngừa và điều trị ung thư

* Tính kháng viêm và chống dị ứng

Trong nhiều mô hình thí nghiệm khác nhau, tính chất kháng viêm và chống

dị ứng của măng cụt đã được chứng minh, kết quả được trình bày trong bảng 2.5

Bảng 2.5 Tính kháng viêm và chống dị ứng của măng cụt

α-mangostin, 1-isomangostin và mangostin triacetate thể

hiện hoạt tính kháng viêm ở chuột trong một vài nghiên

Shankaranarayan và cộng sự (1979)

cứu thực nghiệm

α-mangostin có hiệu quả kháng viêm trên một vài thử

nghiệm tình trạng viêm ở chuột

Gopalakrishnan và cộng sự (1980) α-mangostin cải thiện quá trình khử histamine gây ra sự co

động mạch chủ và khí quản ở chuột đực

Chairungsrilerd và cộng sự (1996) α- và γ-mangostin gây ức chế lypopolisaccharide nguyên

nhân kích thích sự đầu độc tế bào, sự hình thành NO-,

prostaglandin-E2, sự cảm ứng iNOs trong tế bào RAW

264.7; α-mangostin ức chế mạnh sự phù nề ở chân chuột

Chen và cộng sự (2008)

α-mangostin ức chế 12- lipoxygenase ở người Deschamps và cộng

sự (2007)

* Tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus

Một số công trình nghiên cứu đã chứng minh tính chất kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus của các xanthone trong măng cụt

Bảng 2.6 Tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus của măng cụt

α-mangostin ức chế mạnh các khuẩn S aureus, P

aeruginosa, S thypimurium, B Subillis

Sundaram và cộng

sự (1983) α-mangostin thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trên 49 loài

khuẩn MRSA, α-mangostin thể hiện hoạt tính trên 50 loài

MRSA và 13 loài Enterococcus spp

Phongpaichit và cộng

sự (1994) α-mangostin, garcinone E, gartanin, and γ-mangostin thể

hiện hoạt tính kháng MRSA

Iinuma và cộng sự (1996) Polysaccharides trong vỏ măng cụt làm tăng cường khả

năng tiêu hủy của thực bào đối với khuẩn viêm ruột hình

que trong ống nghiệm

Chanarat và cộng

sự (1997) α-mangostin, BR-xanthone A, gartanin, 8-deoxygartanin,

garcinone D, γ-mangostin, and euxanthone có tính chất đối

kháng với các loại nấm F oxysprum vasinfectum, A tenuis

Gopalakrishnan và cộng sự (1997)

and D oryzae

Dịch trích ethanol của măng cụt, α- và β-mangostin có tính

ức chế mạnh đối với HIV-1 protease (một loại enzym thủy

phân protein)

Chen và cộng sự (1996), Vlietinck

và cộng sự (1998)

2.1.2 α-mangostin

Công thức phân tử C24H26O6

Công thức cấu tạo

Tên theo danh pháp IUPAC

3,6,8-Trihydroxy-2-methoxy-1,7-bis(3-methylbut-2-enyl)xanthen-9-one Khối lượng phân tử 410,45 g/mol

Điểm nóng chảy 182 °C, 455 K, 360 °F

Mangostin là xanthonoid tự nhiên, một loại hợp chất hữu cơ được phân lập

từ các phần khác nhau của cây măng cụt; chúng là tinh thể rắn màu vàng với cấu trúc vòng xanthone Mangostin và các xanthone khác từ cây măng cụt đã được nghiên cứu các đặc tính sinh học như khả năng kháng oxy hóa, kháng khuẩn … và hoạt tính chống ung thư [22] Trong các nghiên cứu trên động vật, mangostin đã được tìm thấy là một hệ thống thần kinh trung ương gây trầm cảm, an thần, giảm hoạt động của cơ [37]

2.1.3 Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước về cây măng cụt (Garcinia

mangostan L.)

2.1.3.1 Các nghiên cứu trong nước

Trong thập niên 1970 – 1980, một số nhà nghiên cứu nước ta tìm cách sử dụng tinh chất trích ly từ vỏ măng cụt để pha làm nước nhuộm vải không bị phai màu [9] Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Phượng - Bộ môn

Hữu cơ của trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã khảo sát quy trình nhuộm vải cotton, polyamide, tơ tằm và len với dịch chiết từ vỏ quả măng cụt và đạt được các chỉ tiêu về độ bền màu [9]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu trường Đại học Đà Nẵng đã thực hiện chiết tách và xác định xanthone từ vỏ măng cụt Kết quả đạt được là những tính chất vật

lý của vỏ măng cụt, so sánh điều kiện và các yếu tố ảnh hưởng quá trình trích xanthone trong ethanol bằng phương pháp ngâm dầm và Soxhlet Phương pháp xác định các xanthone là IR và LC – MS [2]

Từ dịch ethanol của vỏ măng cụt, nhóm tác giả trường Đại học Cần Thơ đã

cô lập được hai hợp chất α-mangostin và γ-mangostin Nhận danh cấu trúc của các chất bằng các phương pháp phổ hiện đại Các hoạt tính chống oxi hóa và kháng khuẩn của hai xanthone cũng được khảo sát [10]

Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây của Trung tâm Sâm và dược liệu, đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, Viện hóa học,… [6, 7] hướng đến những tính chất dược lý của măng cụt đã nêu ở phần trên trong việc tạo ra một loại dược phẩm mới hổ trợ điều trị một số bệnh phổ biến hiện nay như ung thư, tiểu đường, cao huyết áp,…

2.1.3.2 Các nghiên cứu ngoài nước

6 hợp chất xanthone (3-isomangostin, 8-desoxygartanin, gartanin, mangostin, 9-hydroxycalabaxanthone and β-mangostin) từ đã được Ji, Avula và cộng sự nghiên cứu phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng cột pha đảo với RSD≤4,6%, độ thu hồi trong khoảng 96,58% - 113,45%, LOD ≤ 0,248µg/mL [19] Các hợp chất xanthone cũng được Destandau và cộng sự trích ly với ethanol

α-và bán tinh chế bằng sắc ký với hỗn hợp pha động heptane/ethyl acetate/methanol/water (2:1:2:1, v/v/v/v) [16] Phenolics được Naczk và cộng sự trích từ các phần khác nhau của măng cụt bằng dung dịch acetone 70% (v/v) Hiệu suất trong khoảng 5,8% - 7,9% Tổng số phenolics quy về acid galic nằm trong khoảng 9,3 – 250 mg/g [35]

Mô hình Box-Behnken được Gan và cộng sự sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện trích ly: nhiệt độ (50-800C), thời gian trích (2-4 giờ) và pH (2-4) để thu được

hiệu suất pectic-polysaccharide cao nhất với hàm lượng acid uronic và hoạt tính kháng oxy hóa cao từ vỏ quả măng cụt [23] Cheok và cộng sự đã tối ưu hóa các điều kiện thời gian trích, tỉ lệ rắn: dung môi, nồng độ methanol trong quá trình trích

tổng phenolic từ vỏ quả măng cụt (G mangostana L.) bằng phương pháp đáp ứng

bề mặt Kết quả nhận được cho điều kiện tối ưu như sau: thời gian trích 2 giờ với tỉ

lệ rắn lỏng 0,05 và nồng độ methanol là 69,77% để đạt được hiệu suất cao nhất là 140,66 mg acid galic/g bột nguyên liệu [15]

Nhóm nghiên cứu của Zarena đã nghiên cứu trích ly một số kháng thể có

trong vỏ quả măng cụt (G mangostana L.) với điều kiện có và không có ethanol ở

30c và 500C với CO2 làm dung môi siêu tới hạn Khả năng kháng oxy hóa của dịch trích SC-CO2 được xác định bằng thuốc thử 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) với kết quả khá cao (IC50=41,8mg/mL), lipid peroxy (IC50=21,5mg/mL), gốc hydroxyl (IC50=23,1mg/mL) [54]

Zarena và Udaya Sankar đã dùng chất lỏng siêu tới hạn để trích xanthone từ

vỏ quả măng cụt với các điều kiện: áp suất (20, 25 và 30 MPa) và nhiệt độ (40, 50

và 600C) Hiệu suất trích ly 7,56% thu được dưới điều kiện 30MPa và 600C Đồng thời, Zarena đã dùng HPLC/ESI-MS với pha động acetonitril: methanol: acid acetic

để định lượng các xanthone Cấu trúc của các xanthone được xác định thông qua các nghiên cứu trên phổ NMR và MS [55] Đồng thời, Zarena cũng đã tối ưu trích

ly các xanthone bằng chất lỏng siêu tới hạn ở các điều kiện: áp suất (180, 280 và

380 bar), nhiệt độ (40, 50 và 600C) và thời gian trích (2-8 giờ) Hiệu suất cao nhất 15% đạt được ở 280 bar, 500C và 8 giờ; trong khi không có đồng dung môi thì hiệu suất chỉ đạt được 7,5% Zarena đã dùng phương pháp đáp ứng bề mặt để xác định các điều kiện tối ưu [52] Cũng trong năm 2012, Zarena đã phân lập và định danh được pelargonidin 3-glucoside từ vỏ quả măng cụt [53]

Huang và cộng sự đã khảo sát độ hòa tan của xanthone và xanthene trong

CO2 siêu tới hạn được xác định bằng phương pháp động lực học dòng chảy kết hợp với phân tích khối lượng ở các điều kiện 308,15 và 328,15K trong khoảng áp suất

80 đến 300 bar Kết quả nhận được, xanthene dễ tan hơn trong CO2 siêu tới hạn hơn xanthone gấp 10 lần vì nó dễ bay hơi hơn Độ tan được mô tả bằng phương trình

Peng-Robinson và tỷ trọng thực nghiệm dựa trên mô hình Chrastil trong khoảng áp suất và nhiệt độ khảo sát [28, 29]

2.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

Năm 1906, nhà bác học Nga Michael Tvest đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ [1] Đến năm

1952, Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge đã đạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách

2.2.1 Phân loại sắc ký

Bảng 2.7 Sự phân loại các phương pháp sắc ký [8]

Sắc ký khí - lỏng Khí Lỏng

Được hấp thụ trên chất rắn xốp trong ống hay trên bề mặt bên trong của ống mao quản

Sắc ký khí - pha rắn Khí Chất rắn Được giữ trong cột đã được làm đầy

theo từng lớp

Sắc ký phân bố Chất lỏng Chất lỏng

Được hấp thụ trên chất mang rắn, xốp trong cột với sự làm đầy theo từng lớp

Sắc ký giấy Chất lỏng Chất lỏng Được giữ bằng các lỗ mao quản

của giấy sắc ký

Sắc ký bản mỏng Chất lỏng

Chất lỏng hay chất rắn

Chất mang rắn được nghiền nhỏ được giữ trên bản thủy tinh

Chất lỏng có thể được hấp thụ trên các phần tử

Sắc ký gel Chất lỏng Chất lỏng Được giữ trong các lỗ polime rắn

Sắc ký trao đổi ion Chất lỏng Chất rắn

Nhựa trao đổi ion được nghiền nhỏ, giữ trong cột với sự làm đầy theo từng lớp

2.2.2 Định nghĩa

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh Sắc ký cũng là quá trình trao đổi chất như các phương pháp hóa lý khác (chưng cất, chiết, kết tinh …) nhưng khác với các phương pháp đó ở sự phân chia sắc ký được thực hiện do quá trình hấp phụ - giải hấp phụ được lặp đi lặp lại trong suốt quá trình tách Vì vậy, sắc ký là một kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực của một cấu tử đối với pha tĩnh và pha động

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performace liquid chromatography - HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ [8, 11] HPLC dựa vào pha động để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau Những thành phần này đầu tiên được hòa tan vào trong dung môi và sau đó dưới tác dụng của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột hỗn hợp sẽ được phân tách thành những cấu tử của chúng

2.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột [11]

Pha tĩnh là một yếu tố quan trong quyết định bản chất của quá trình sắc ký và phân loại sắc ký:

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha đảo và pha thuận

- Nếu pha tĩnh là các chất đã được liên kết với một nhóm chức khác ta có sắc ký pha liên kết (pha thuận, pha đảo, trao đổi ion)

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử

Cùng với pha tĩnh, để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có

một pha động Như vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B,

C … vào cột tách, kết quả là các chất A, B, C… sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác: tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh, tương tác giữa chất phân tích và pha động, tương tác giữa pha tĩnh và pha động

Hình 2.2 Minh họa các lực tương tác trong quá trình sắc ký

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được tạo thành bởi 3 lực thành phần: F1, F2, F3 Trong đó, F1, F2 là quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây, F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo nó đi ra khỏi cột Như vậy, các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột

Hình 2.3 Minh họa quá trình tách chất trong sắc ký

2.2.4 Bộ dụng cụ của HPLC [1, 11]

Hình 2.4 Sơ đồ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

1-Bình chứa dung môi; 2-Bơm cao áp; 3-Bộ tiêm mẫu;

4-Cột sắc ký; 5-Detector; 6-Máy ghi tín hiệu

* Bình chứa dung môi

Thường làm bằng thủy tinh, đôi khi làm bằng thép không gỉ, trong phương pháp rửa giải thông thường chỉ cần một hay hai bình chứa dung môi, trong phương pháp rửa giải gradient thường dùng 2, 3, 4 bình chứa các dung môi khác nhau và hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp các loại dung môi trên trộn lẫn với nhau theo tỉ lệ đã được xác định Cần loại các hạt và các khí hòa tan trong dung môi để tránh ảnh hưởng đến cột và quá trình sắc ký trong cột

* Hệ thống bơm

Bơm trong HPLC được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất trong hệ thống sắc ký lỏng Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ dòng ổn định liên tục gắn trong injector, cột và detector Có 2 loại bơm cơ bản: bơm áp suất liên tục và bơm dòng liên tục

Bơm dùng trong phương pháp phải tạo được áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 - 500 at), lưu lượng bơm khoảng 0,1 - 10 mL/phút, phải trơ với các dung môi Hệ bơm này phải có khả năng bơm pha động qua cột ở áp suất cao mà không bị ngắt quãng hay tạo nhịp sóng có thể làm sai lệch các lực thu được Có nhiều kiểu bơm

đã dùng trong các máy HPLC nhưng kiểu phông xoay chiều hiện nay được dùng phổ biến nhất

* Hệ bơm mẫu hay hệ tiêm mẫu

Mẫu được bơm nhờ vào cột nhờ hệ thống van mẫu Người ta bơm mẫu vào vòng mẫu với thể tích thường từ 5 - 20 μL

* Detector

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và ghi nhận các tín hiệu ghi trên sắc đồ

Một số loại detector thường được sử dụng như:

- Detector tử ngoại UV: dùng đèn thủy ngân

- Detector UV/Vis (thường được sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ): dùng phổ quang kế ngọn lựa chọn bước sóng từ 195 – 750nm

- Detector điện hóa và detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao dùng trong phân tích vết Dùng detector điện hóa có thể phát hiện được những hàm lượng picrogam

- Và một số detector khác như: photodiode array (PDA), detector điện dẫn …

* Xác định độ tinh khiết: khi tiến hành HPLC phân tích, trong các điều kiện sắc ký

khác nhau, nếu một chất chỉ cho một đỉnh đối xứng, tách riêng biệt, không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì có khả năng đó là một chất tinh khiết

* Định tính với chất đánh dấu và chất chuẩn: khi thời gian lưu tR của các đỉnh quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và của chất đối chiếu phù hợp với nhau thì có thể kết luận dương tính Tuy nhiên, để đảm bảo kết quả khi dựa vào thời gian lưu cần phải tiến hành trên nhiều mẫu thử và trên ít nhất hai điều kiện thực nghiệm khác nhau Nếu hệ thống sắc ký có trang bị các detector cung cấp dữ liệu về cấu trúc chất cần quan tâm như phổ UV, IR, MS … thì sẽ góp phần khẳng định chắc chắn kết quả

* Định tính bằng phương pháp dấu vân tay: thường áp dụng cho nguyên liệu có

thành phần chưa biết rõ Phương pháp này dựa trên cơ sở tiến hành phân tích HPLC một dịch chiết hay một phân đoạn chiết trong điều kiện sắc ký phù hợp đã xác định, sao cho thành phần cấu tạo thể hiện tối đa trên sắc ký đồ Nếu sắc ký đồ thu được có các đỉnh và dữ kiện sắc ký khớp với sắc đồ của nguyên liệu hay phân đoạn đối chiếu, như khi so dấu vân tay với nhau, có thể kết luận được nguyên liệu hay phân đoạn phân tích phù hợp với mẫu đối chiếu

2.2.6 Ứng dụng trong phân tích định lượng [47]

Về mặt kỹ thuật, việc định lượng các chất bằng HPLC có thể dựa vào sự so sánh chiều cao của đỉnh hay so sánh diện tích đỉnh của chất cần xác định với một hay nhiều mẫu chuẩn

Các phương pháp định lượng:

* Quy về 100% diện tích: ứng dụng hạn chế, đòi hỏi tất cả các chất tan trong hỗn

hợp mẫu thử cần phân tích đều phải được rửa giải và phát hiện

* Dùng chuẩn ngoại: so sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích đỉnh của mẫu thử

với chiều cao hoặc diện tích đỉnh của một dung dịch chất chuẩn tương ứng có nồng

độ đã biết Phương pháp được áp dụng phổ biến trong HPLC để định lượng các chất

Ưu điểm: chính xác, chỉ cần lưu ý đến sự phân tách của hợp chất cần xác định nên

việc thực hành định lượng khá đơn giản

Nhược điểm: các sai số có thể xảy ra khi tiêm sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả

định lượng