Xác định một số biến thể glucose 6 phosphate dehydrogenase ở trẻ sơ sinh tại bệnh viện phụ sản quốc tế sài gòn bằng phương pháp multiplex pcr và giải trình tự gen

Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử, trong đó có Multiplex PCR và giải trình tự gen có khả năng phát hiện các đột biến cao giúp chẩn đoán bệnh đạt hiệu quả hơn so với các phương pháp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM HOÀNG ANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ BIẾN THỂ GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE Ở TRẺ SƠ SINH TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN QUỐC TẾ SÀI GÒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 420 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 05 năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM HOÀNG ANH

IDENTIFICATION OF GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE VARIANTS IN NEWBORNS AT SAI GON INTERNATIONAL OBSTETRICS AND GYNAECOLOGY HOSPITAL BY MULTIPLEX PCR AND DNA SEQUENCING METHODS

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60 420 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 05 năm 2017

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI ĐƠN VỊ DI TRUYỀN HỌC - BỆNH VIỆN PHỤ SẢN QUỐC TẾ SÀI GÕN VÀ PHÕNG SINH HỌC PHÂN TỬ - CÔNG TY CỔ PHẦN CÔNG NGHỆ

SINH HỌC BIONET (HÀ NỘI)

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ hướng dẫn khoa học 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: PHẠM HOÀNG ANH MSHV: 1570251

Ngày tháng năm sinh: 05/12/1990 Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số:

I TÊN ĐỀ TÀI:

“Xác định một số biến thể Glucose-6-phosphate dehydrogenase ở trẻ sơ sinh

tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn bằng phương pháp Multiplex PCR và

giải trình tự gen”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xác định tỷ lệ thiếu men G6PD ở trẻ sơ sinh tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài

Gòn

Phân tích và xác định một số dạng biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh mắc bệnh bằng

phương pháp Multiplex PCR

Kiểm định, đánh giá sự tương đồng các kết quả phân tích đột biến của phương

pháp Multiplex PCR bằng kỹ thuật giải trình tự gen và xác định các trường hợp

đồng và dị hợp tử - ý nghĩa trong tư vấn tiền hôn nhân

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.BS NGUYỄN MINH HÙNG, TS LUYỆN

Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến CN Trần Thị Ánh Nguyệt, ThS Trần Quang Vinh, CN Lê Thị Loan, KTV Hồ Thị Ngọc Nga, KTV Huỳnh Thanh Gioãn, CN

Đỗ Thị Thu Mai và CN Vũ Thị Thanh Hoan cùng với toàn thể nhân viên Khoa Xét Nghiệm - Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và chia sẻ không chỉ về mặt chuyên môn mà còn về các khía cạnh khác của cuộc sống Xin cảm ơn đến các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 2015

đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, Con thành kính khắc ghi công ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

TÓM TẮT

Thiếu men G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) là một căn bệnh ở hồng cầu phổ biến nhất ở châu Phi, các nước Đông Nam Á và vùng Địa Trung Hải Bệnh thiếu men G6PD là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, do vậy tỷ lệ mắc bệnh của nam giới thường cao hơn nữ giới Hiện nay, căn bệnh này đã ảnh hưởng đến khoảng 400 triệu người trên toàn thế giới với tỷ lệ từ 0,1% đến 30% tùy thuộc vào từng đất nước, dân tộc Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh thiếu men G6PD

từ 0,5% đến 31% dao động theo vùng miền, dân tộc Có hơn 160 dạng biến thể đột biến G6PD khác nhau gây ra mức độ thiếu men và biểu hiện bệnh lý khác nhau Phương pháp Multiplex PCR được sử dụng để xác định một số biến thể G6PD sau khi đã trải qua giai đoạn sàng lọc ban đầu cho 5.034 trẻ sơ sinh (dân tộc Kinh) tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn từ 1/1/2015 đến 30/11/2016 DNA từ các mẫu máu khô của trẻ mắc bệnh được tách chiết, sau đó thực hiện phản ứng Multiplex allele specific PCR dùng bộ kit đa mồi được thiết kế đặc hiệu để phát hiện 8 dạng đột biến cơ bản ở khu vực Đông Nam Á Sản phẩm PCR sẽ được chạy điện di để xác định các dạng đột biến trên gel agarose 3% Sau đó, tiếp tục giải trình

tự gen cho 5/27 ca có đột biến để kiểm định kết quả giữa hai phương pháp Ngoài

ra, kết quả giải trình tự gen còn giúp xác định các trường hợp đồng và dị hợp tử, điều này rất có ý nghĩa cho tư vấn tiền hôn nhân sau này

Từ kết quả sàng lọc cho thấy có tổng cộng 38/5.034 (0,8%) ca có nguy cơ cao thiếu men G6PD gồm 34 bé trai và 4 bé gái Trong 33 mẫu đồng ý tham gia nghiên cứu phân tích gen G6PD đã xác định 15 ca đột biến Viangchan, 5 ca đột biến Kaiping, 3 ca đột biến Canton, 3 ca đột biến Union, 1 ca đột biến Mahidol và 6 ca không tìm thấy đột biến trong 8 dạng đột biến hay gặp ở khu vực Đông Nam Á Mặt khác, khi tiến hành giải trình tự gen thì cho kết quả hoàn toàn tương đồng với phương pháp Multiplex PCR Ngoài ra còn xác định được kiểu gen ở các trường hợp thiếu men đã xác định được đột biến Trong đó, 2 mẫu có đột biến G6PD Canton ở 2 bé gái đều có kiểu gen dị hợp, không có trường hợp đồng hợp

SUMMARY

G6PD deficiency is the most common erythrocyte enzyme deficiency disease in Africa, Southeast Asia and the Mediterranean region It is an X-linked recessive hereditary disease, which has difference between its severe by race or gender Currently, it is reported that 400 million people have G6PD deficiency from 0,1% to 30% according to the country In Viet Nam, the prevalence of it varies from 0,5% to 31% in different ethnic groups and areas There are many variants that cause different levels of enzyme deficiency and various disease manifestations

The G6PD variants were identified in dried blood spot samples collected from 5.034 newborns (2.632 males and 2.402 females, Kinh ethnic) at Sai Gon International Obstetrics and Gynaecology Hospital used Multiplex PCR method after the screening tests were done DNA of the deficient samples were extracted, and then Multiplex allele specific PCR reactions were done using the primers were designed to specifically detection Southeast Asia region types of eight G6PD mutations PCR products were analyzed by using 3% agarose gel electrophoresis After DNA sequencing was completed, we would assess the correlations between the results of the two methods In addition, DNA sequencing results also help to identify homozygous and heterozygous cases, this is significant for premarital counseling later

Five G6PD variants were observed in 33 deficient subjects agreed to join this research with prevalence of 0,8% (38 cases included 34 males and 4 females) The results showed that Viangchan mutation (15/33) was the most common variant detected, followed by Kaiping (5/33), Canton (3/33), Union (3/33) and Mahidol (1/33) We found not mutations in 6 cases among 8 common variants in Southeast Asia and these cases need further study By using DNA sequencing, we confirmed the similar results between the two methods Besides, the genotype of G6PD deficiency cases also were identified Especially, two Canton samples of females have heterozygous genotypes without the homozygous case

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, dưới sự hướng dẫn của TS.BS Nguyễn Minh Hùng - Trưởng khoa Cận Lâm Sàng kiêm Trưởng đơn vị Di truyền tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn và TS Luyện Quốc Hải - Giám đốc Công ty cổ phần Sinh học Bionet Việt Nam (Hà Nội)

Các số liệu, hình ảnh và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Danh sách các chữ viết tắt i

Danh sách các bảng ii

Danh sách các hình iii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Chương trình sàng lọc sơ sinh 3

2.1.1 Khái niệm sàng lọc sơ sinh 3

2.1.2 Mục đích 3

2.1.3 Quy trình xét nghiệm 3

2.1.4 Chương trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới và ở Việt Nam 4

2.1.4.1 Chương trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới 4

2.1.4.2 Chương trình sàng lọc sơ sinh ở Việt Nam 4

2.2 Bệnh thiếu men G6PD 4

2.2.1 Khái niệm 4

2.2.2 Dịch tễ học 6

2.2.3 Cơ chế gây bệnh 6

2.2.4 Phân loại 8

2.2.5 Triệu chứng lâm sàng 9

2.2.6 Quy trình chẩn đoán 11

2.2.7 Phương pháp phòng tránh và điều trị 11

2.3 Di truyền bệnh thiếu men G6PD 12

2.4 Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen 13

2.4.1 Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần 13

2.4.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 13 2.4.3 So sánh phương pháp Multiplex allele specific PCR và giải trình tự gen 13

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

2.5.1 Các nghiên cứu trong nước 14

2.5.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 20

3.2 Vật liệu nghiên cứu 21

3.2.1 Cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang 21

3.2.2 Phương pháp lấy mẫu máu gót chân trên thẻ giấy Whatman 903 21

3.2.3 Dữ liệu gen G6PD 22

3.2.4 Phân tích thống kê 22

3.2.5 Dụng cụ, sinh phẩm - hóa chất và trang thiết bị 22

3.2.5.1 Dụng cụ 22

3.2.5.2 Sinh phẩm - hóa chất 22

3.2.5.3 Trang thiết bị 23

3.3 Phương pháp phân tích 23

3.3.1 Xét nghiệm sàng lọc thiếu men G6PD 23

3.3.1.1 Mục đích 23

3.3.1.2 Nguyên lý của kỹ thuật 23

3.3.1.3 Thành phần hóa chất 24

3.3.1.4 Chuẩn bị thuốc thử 24

3.3.1.5 Quy trình xét nghiệm 24

3.3.1.6 Phân tích kết quả 25

3.3.2 Kỹ thuật Multiplex PCR 25

3.3.2.1 Quy trình tách chiết DNA 25

3.3.2.2 Quy trình Multiplex PCR 27

3.3.2.3 Quy trình điện di 29

3.3.3 Phương pháp giải trình tự gen (DNA squencing) 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả 31

4.1.1 Kết quả sàng lọc bệnh thiếu men G6PD 31

4.1.2 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu khô trên thẻ Whatman 903 31 4.1.3 Kết quả xác định các biến thể G6PD bằng phương pháp Multiplex PCR 32

4.1.4 Kết quả giải trình tự gen G6PD 34

4.2 Thảo luận 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 52

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA : DeoxyriboNucleic Acid

ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

G6PD : Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase

NADP+ : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NCBI : National Center for Biotechnology Information

SPSS : Statistical Package for the Social Sciences

SSCP : Single-Strand Conformation Polymorphism

TAE : Tris-Acetate-EDTA

UV : UltraViolet

WHO : World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Các biến thể G6PD phổ biến được phân tích 8

Bảng 2.2: Phân nhóm bệnh thiếu men G6PD theo WHO 9

Bảng 2.3: So sánh phương pháp Multiplex PCR và giải trình tự gen 14

Bảng 3.1: Cỡ mẫu trẻ sơ sinh trong nghiên cứu cắt ngang 21

Bảng 3.2: Các thành phần hóa chất được sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc 24

Bảng 3.3: Thành phần phản ứng Multiplex PCR 28

Bảng 3.4: Chu trình nhiệt chạy Multiplex PCR 28

Bảng 4.1: Kết quả phân tích hoạt tính enzyme G6PD (U/g Hb) 31

Bảng 4.2: Tỷ lệ giữa nam và nữ bị bệnh thiếu men G6PD 31

Bảng 4.3: Các biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh thiếu men tại bệnh viện 32

Bảng 4.4: Kiểu gen của 2 đột biến Canton ở 2 bé gái thiếu men G6PD 39

Bảng 4.5: Tỷ lệ thiếu men và các biến thể G6PD ở Việt Nam so với một số nước

như Myanmar, Campuchia, Malaysia, Trung Quốc và Thái Lan 45

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Bé sơ sinh đang được lấy máu làm xét nghiệm SLSS 3

Hình 2.2: Cấu trúc enzyme Glucose-6-phosphate dehydrogenase 5

Hình 2.3: Bé sơ sinh đang được chiếu đèn 5

Hình 2.4: Bản đồ tỷ lệ phân bố bệnh thiếu men G6PD ở nam giới 6

Hình 2.5: G6PD xúc tác NAPD+ thành NAPDH trong con đường pentose phosphate 7

Hình 2.6: Vị trí gen G6PD trên NST giới tính X 7

Hình 2.7: Bản đồ vị trí phân bố 13 exons của gen G6PD 7

Hình 2.8: Một số thực phẩm cần tránh đối với bệnh nhân thiếu men G6PD 10

Hình 2.9: Quy trình chẩn đoán bệnh thiếu men G6PD 11

Hình 2.10: Sơ đồ di truyền bệnh thiếu men G6PD 12

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 20

Hình 3.2: Quá trình lấy máu gót chân ở trẻ sơ sinh 21

Hình 3.3: Mẫu máu khô của bệnh nhân 22

Hình 3.4: Các đột biến G6PD phổ biến ở Đông Nam Á được phân tích 30

Hình 4.1: Điện di sản phẩm PCR để xác định các dạng biến thể G6PD 33

Hình 4.2: Hình điện di của 5 dạng biến thể G6PD được phân tích 33

Hình 4.3: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 6 của một bé trai (BG6_150103) có đột biến G6PD Mahidol 34

Hình 4.4: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé trai (BG6_160303) có đột biến G6PD Kaiping 35

Hình 4.5: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé trai (BG6_160202) có đột biến G6PD Canton 36

Hình 4.6: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé gái (BG6_150201) có đột biến G6PD Canton 37

Hình 4.7: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé gái (BG6_150303) có đột biến G6PD Canton 38

Chương 1 MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Thiếu men G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) là một bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X [4, 29, 32] Trên thế giới hiện nay có khoảng 400 triệu người mắc phải với tần suất mắc bệnh từ 0,1%-30% Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh là khoảng 0,5%-31% và có thể cao hơn ở các nhóm dân tộc thiểu số miền núi phía Bắc [3, 12, 19, 21] Người bị thiếu men G6PD sẽ có hiện tượng tán huyết khi ăn đậu tằm hoặc sử dụng một số sản phẩm, dược phẩm chứa các chất có tính oxy hóa mạnh [4, 38, 42] Thiếu máu do tán huyết gây vàng da sơ sinh kéo dài, nếu nặng hơn có thể gây ra những biến chứng ở thần kinh, chậm phát triển tâm thần, vận động là các vấn đề lớn gặp phải khi trẻ bị thiếu men G6PD Tuy nhiên, người bệnh cũng có thể hoàn toàn không có biểu hiện gì về mặt lâm sàng (thể nhẹ) và bệnh thiếu men G6PD này hiếm khi dẫn đến tử vong [38, 42, 43]

Các nghiên cứu cho thấy, căn nguyên gây bệnh thiếu men là do các đột biến trên gen G6PD, tuy nhiên, không phải bất kỳ biến đổi trên gen nào cũng gây bệnh Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử, trong đó có Multiplex PCR và giải trình tự gen

có khả năng phát hiện các đột biến cao giúp chẩn đoán bệnh đạt hiệu quả hơn so với các phương pháp khác

Có nhiều dạng đột biến gen G6PD khác nhau và tùy từng loại biến thể mà gây ra

các mức độ thiếu men và biểu hiện bệnh lý khác nhau [4] Do đó, đề tài “Xác định

một số biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn bằng phương pháp Multiplex PCR và giải trình tự gen” được thực hiện Hiểu rõ cơ chế

phân tử của bệnh tật để phòng ngừa, tiên lượng và điều trị hiệu quả luôn là mơ ước của giới y khoa để từng bước tiến tới cá nhân hóa trong điều trị bệnh Đối với trẻ bị thiếu men G6PD nếu được phát hiện sớm và kết hợp với việc phòng tránh những thức ăn và các tác nhân gây tán huyết thì trẻ hoàn toàn có một cuộc sống khỏe mạnh bình thường [1, 41, 42]

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Chương trình sàng lọc sơ sinh

2.1.1 Khái niệm sàng lọc sơ sinh

SLSS là chương trình thực hiện xét nghiệm thường qui cho tất cả trẻ sơ sinh nhằm phát hiện sớm các bệnh lý nội tiết và chuyển hóa ảnh hưởng đến sự phát triển thể chất và tâm thần của trẻ [1] Các bệnh lý này thường rất khó phát hiện trên lâm sàng khi trẻ mới sanh, do đó cần phải thực hiện xét nghiệm sàng lọc để phát hiện Nếu được phát hiện sớm và điều trị ngay trong vài tuần đầu sau sanh thì bé có thể phục hồi và phát triển bình thường [1, 41, 42]

2.1.2 Mục đích

Chương trình SLSS nhằm phát hiện, chẩn đoán và điều trị sớm các bệnh lý được sàng lọc giúp các bé bị bệnh phát triển khỏe mạnh bình thường, nâng cao chất lượng dân số Việt Nam [41]

2.1.3 Quy trình xét nghiệm

Các bé sơ sinh sau 48 giờ tuổi sẽ được lấy 3 giọt máu ở gót chân nhỏ lên giấy thấm máu chuyên dụng, để khô và thực hiện xét nghiệm Thời gian tốt nhất để lấy máu làm xét nghiệm SLSS cho bé là từ 48-72 giờ sau sanh Kết quả xét nghiệm sàng lọc sẽ có sau 2-3 ngày làm việc Những trường hợp bé mắc bệnh, cha mẹ bé sẽ được mời đến bệnh viện tham vấn để biết rõ tình trạng bệnh lý và các bước tiếp theo

để chẩn đoán, điều trị hoặc phòng ngừa

Hình 2.1: Bé sơ sinh đang được lấy máu làm xét nghiệm SLSS

(Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn)

2.1.4 Chương trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới và ở Việt Nam

2.1.4.1 Chương trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới

Chương trình SLSS bắt đầu từ năm 1960 tại Mỹ do bác sĩ Robert Guthrie và

nhóm bác sĩ nhi – sản khoa khởi xướng, sau đó nhanh chóng lan rộng qua châu Âu, châu Úc, Nhật Bản và thực sự mang lại những hiệu quả đáng kể Ở châu Âu, từ năm

1970, SLSS trở thành chương trình quốc gia để phát hiện 6-8 bệnh lý rối loạn chuyển hóa và di truyền Đến nay có nước đã thực hiện SLSS hơn 50 loại bệnh lý

Ở châu Á, nước đầu tiên là Nhật Bản thực hiện chương trình SLSS từ năm 1965, đến nay gần như 100% trẻ sơ sinh được SLSS 5 loại bệnh lý bẩm sinh Đài Loan đến nay đã thực hiện SLSS được 11 loại bệnh lý Chương trình SLSS đã nhanh chóng trở thành chương trình quốc gia ở hầu hết các nước châu Á và trên thế giới vì lợi ích thiết thực của nó Từ những số liệu thống kê kết quả triển khai SLSS ở các nước tiên phong này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ghi nhận ý nghĩa tuyệt vời

của SLSS và kêu gọi triển khai thành chương trình quốc tế: “SLSS nên được trở thành một chương trình bắt buộc vì việc chẩn đoán sớm và điều trị mang lại những lợi ích to lớn cho trẻ sơ sinh” Hưởng ứng lời kêu gọi đó, phần lớn các quốc gia trên

thế giới đã triển khai SLSS như một chương trình quốc gia Số bệnh được sàng lọc

từ 2-5 bệnh ở các nước Đông Nam Á và lên tới trên 50 bệnh ở các nước phát triển

2.1.4.2 Chương trình sàng lọc sơ sinh ở Việt Nam

Do điều kiện kinh tế và xã hội nên chương trình SLSS ở nước ta phát triển chậm hơn các nước tiên tiến trên thế giới Đến thời điểm hiện nay, nước ta đã thực hiện được xét nghiệm sàng lọc 3 loại bệnh lý có tỷ lệ cao là bệnh thiếu men G6PD, suy giáp bẩm sinh và tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh [41]

2.2 Bệnh thiếu men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

2.2.1 Khái niệm

G6PD có mã số E.C.1.1.1.49 là enzyme xúc tác nội bào, có tính không đồng nhất

và đa dạng phân tử, được cấu tạo bởi nhiều monomer với cấu trúc bậc bốn rất phức tạp [30] G6PD xúc tác trong con đường chuyển hoá pentose phosphate, tạo ra NADPH có vai trò trong chống oxy hóa ở hồng cầu [3, 4, 33]

Bệnh thiếu men G6PD là một bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính X [4,

29, 32] Bệnh phát sinh do đột biến gen G6PD trên cánh dài vùng 2 băng 8 của nhiễm sắc thể X tại vị trí Xq28, vì vậy tần số mắc bệnh này ở nam giới thường cao

hơn nữ giới [4, 33, 38, 42] Gen G6PD là gen có chức năng mã hóa enzyme G6PD giữ cho màng tế bào hồng cầu ổn định khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa Đột biến trên gen này làm cho cơ thể không sản xuất đủ hoặc làm giảm hoạt tính enzyme G6PD thấp hơn so với người bình thường, dẫn đến tế bào hồng cầu bị phá hủy, kéo theo đó là triệu chứng thiếu máu tán huyết và vàng da bệnh lý Người mắc bệnh thiếu men G6PD thường không có các biểu hiện như thiếu máu tán huyết hay vàng

da cho đến khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa được hấp thu từ một số loại thuốc, thực phẩm, hoặc tác nhân bệnh truyền nhiễm và hiếm khi dẫn đến tử vong [4, 42]

Hình 2.2: Cấu trúc enzyme Glucose-6-phosphate dehydrogenase

Hình 2.3: Bé sơ sinh đang được chiếu đèn

2.2.2 Dịch tễ học

Thiếu men G6PD xảy ra với tần suất tăng ở những chủng tộc châu Phi, Nam châu

Á, vùng Địa Trung Hải và Trung Đông Ngược lại, bệnh ít gặp ở một số dân tộc như Bắc Âu, Mỹ da đỏ, Nhật Bản, Exkimô [42] Tần suất mắc bệnh có liên quan đến sự phân bố của bệnh sốt rét [33, 43] Giả thiết cho rằng những người thiếu men G6PD

có sự bảo vệ một phần trước sự tấn công của ký sinh trùng sốt rét Một số những trường hợp đột biến gen rải rác có thể xảy ra ở tất cả mọi người

Hình 2.4: Bản đồ tỷ lệ phân bố bệnh thiếu men G6PD ở nam giới

2.2.3 Cơ chế gây bệnh

Về mặt sinh học, enzyme G6PD giữ cho màng tế bào hồng cầu ổn định khi cơ thể tiếp xúc với tác nhân oxy hóa và giảm khi hồng cầu già Cấu trúc enzyme G6PD gồm 515 acid amin, trọng lượng phân tử 59.257 dalton [32, 38] G6PD xúc tác nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+) thành dạng NADPH trong con đường chuyển hóa pentose phosphate và NADPH bảo vệ tế bào chống lại những xâm hại do các tác nhân oxy hóa [32, 33] Vì hồng cầu không tạo ra được NADPH bằng bất cứ con đường nào khác nên chúng dễ bị phá hủy hơn những tế bào khác khi bị tình trạng oxy hóa [43] Sự thiếu men G6PD ở mức độ khác nhau được phân vào những mức độ lâm sàng nặng nhẹ tương ứng khác nhau (Bảng 2.2)

Hình 2.5: G6PD xúc tác NAPD + thành NAPDH trong con đường pentose phosphate

Về mặt cấu trúc di truyền, gen G6PD nằm trên cánh dài NST X (Xq28), từ cặp base thứ 154.531.390 đến 154.547.586, gen có 13 exons, dài khoảng 16 kb [37] Bệnh G6PD do di truyền theo định luật Mendel hay bất thường gen trên NST giới tính X [43] Sự đột biến ảnh hưởng đến sự mã hóa enzyme G6PD trên nhánh xa của NST X Khi xảy ra đột biến trên gen G6PD sẽ dẫn tới không tổng hợp được hoặc làm giảm quá trình tổng hợp enzyme, hoặc sai hỏng trên gen gây sai hỏng chức năng enzyme, hậu quả là tích tụ các chất oxy hóa trong tế bào và hồng cầu, gây phá hủy hồng cầu, làm cho cơ thể bị thiếu máu [4, 33, 43]

Hình 2.6: Vị trí gen G6PD trên NST giới tính X

Hình 2.7: Bản đồ vị trí phân bố 13 exons của gen G6PD

(Nguyễn Thị Huệ và cộng sự, 2013, Common mutations in G6PD of Vietnamese-Kinh

deficient patients)

Các nghiên cứu cho thấy, hiện nay có trên 400 vị trí đột biến đã được xác định

trên gen G6PD [43] (Phần phụ lục 4 trang 62 – Bảng một số loại đột biến được nghiên cứu trên gen G6PD) Ở nước ta đã xác định có hơn 140 vị trí đột biến trên

gen G6PD [42] Tuy nhiên, với điều kiện kinh tế còn khó khăn nên hiện nay chỉ có thể phân tích trên 8 vị trí đột biến gen phổ biến nhất ở Đông Nam Á

Bảng 2.1: Các biến thể G6PD phổ biến được phân tích

Tên biến thể Vị trí đột biến Thay đổi acid amin Exon Phân nhóm

II

III

2.2.4 Phân loại

Theo WHO, bệnh thiếu men G6PD được chia làm 5 nhóm (lớp) chính dựa theo

sự hoạt động của enzyme G6PD so với bình thường trong tế bào hồng cầu (Bảng 2.2), có biểu hiện lâm sàng như sau:

Nhóm I: mức độ bệnh nghiêm trọng (hoạt tính enzyme <1%) kết hợp với thiếu máu tán huyết mãn tính Nhóm I hiếm gặp trên thế giới và bao gồm hai loại đột biến

là G6PD Buenos Aires và G6PD Durham

Nhóm II: mức độ bệnh nghiêm trọng, hoạt tính enzyme ít hơn 10% so với bình thường, kết hợp với thiếu máu tán huyết cấp tính Bệnh thiếu men G6PD thuộc nhóm này gặp ở khắp mọi nơi trên thế giới và phổ biến ở các quần thể châu Á và Địa Trung Hải Một số đột biến thuộc nhóm II bao gồm G6PD Mediterranean, G6PD Cassano, G6PD Santamaria

Nhóm III: mức độ bệnh trung bình, hoạt tính enzyme từ 10-60% so với bình thường, chỉ xảy ra thiếu máu tán huyết khi tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa Bệnh

thiếu men G6PD thuộc nhóm này thường gặp ở những khu vực bị bệnh sốt rét, bao gồm một số đột biến như G6PD AG6PD Seattle, G6PD Rignano

Nhóm IV: mức độ bệnh nhẹ, hoạt tính của enzyme từ 60-90% so với bình thường, bệnh hiếm gặp trên thế giới Một số các đột biến thuộc nhóm IV bao gồm G6PD Mantalbano, G6PD Orissa

Nhóm V: không tán huyết, hoạt tính của enzyme lớn hơn 110% so với bình thường, bệnh hiếm gặp Về loại đột biến hiện nay còn chưa được báo cáo

Bảng 2.2: Phân nhóm bệnh thiếu men G6PD theo WHO

sơ sinh gấp hai lần ở những trẻ nam và trẻ nữ thể đồng hợp tử có thiếu men G6PD Hiếm khi xảy ra ở trẻ nữ thể dị hợp tử Enzyme G6PD rất cần thiết để xúc tác cho phản ứng sinh hóa trong tế bào hồng cầu giúp cho màng tế bào bền vững Nếu cơ thể thiếu enzyme này, màng tế bào hồng cầu sẽ kém bền, dễ bị vỡ và dẫn đến hiện tượng tán huyết Nếu tán huyết kéo dài sẽ đưa đến thiếu máu Mặt khác nó còn gây tăng hàm lượng bilirubin trong máu ở trẻ sơ sinh Tình trạng tăng bilirubin trong máu có lẽ xảy ra do sụt giảm bilirubin kết hợp và khả năng thanh lọc của gan làm tăng bilirubin gián tiếp [42] Vàng da sơ sinh trong thiếu men G6PD xảy ra trong vòng 24 giờ đầu, có tiền sử anh chị vàng da trước đó, bilirubin tăng cao có thể gây

vàng da nhân Do đó, khi trẻ sơ sinh vàng da cần theo dõi sát và điều trị chiếu đèn hay truyền máu sớm để tránh gây vàng da nhân

Người thiếu men G6PD có thể có triệu chứng thiếu máu tán huyết cấp tính là do nhiễm trùng, ăn đậu tằm hay sử dụng thuốc có chất oxy hóa [42, 44] Những bệnh nhiễm trùng thường gặp mà gây ra tình trạng tán huyết bao gồm viêm gan A và B, cytomegalovirus, viêm phổi và sốt thương hàn [42] Trường hợp người thiếu men G6PD tiếp xúc với thuốc có chất oxy hóa mạnh thì hồng cầu sẽ bị hư hại và cuối cùng là bị phá hủy Sau thời gian từ vài giờ đến 2-3 ngày, quá trình tán huyết bắt đầu, bệnh nhân có biểu hiện vàng da và nước tiểu đậm màu (màu xá xị) do haemoglobin niệu Trường hợp tán huyết cấp tính điển hình xảy ra vào khoảng 24-

72 giờ sau khi tiếp xúc và giảm dần trong vòng 4-7 ngày Nếu chức năng gan bình thường thì vàng da sẽ không xảy ra cho tới khi 50% số hồng cầu bị phá hủy

Thiếu máu do tán huyết mãn tính ở người thiếu men G6PD ở mức độ nghiêm trọng chỉ chiếm một số rất ít các trường hợp [42] Hiện tượng tán huyết này xảy ra trong sự chuyển hóa hồng cầu bình thường và mức độ thay đổi có thể nhẹ hay nặng

Hình 2.8: Một số thực thẩm cần tránh đối với bệnh nhân thiếu men G6PD

(1- Đậu Fava, 2- Rượu vang đỏ, 3- Dâu blueberries, 4- Đậu nành.)

Có thể nói, phương pháp điều trị chính đối với bệnh thiếu men G6PD là tránh những tác nhân gây ra oxy hóa [4, 38, 42] (tham khảo chi tiết ở Phụ lục 5 trang 66

– Danh sách thuốc và thực phẩm cần tránh khi thiếu men G6PD)

Xét nghiệm sàng lọc thiếu men G6PD Dưới ngưỡng bình thường lần 2

Phương pháp chiếu đèn được dùng khi trẻ bị vàng da, thậm chí trong trường hợp trẻ bị tán huyết nặng cần phải tiến hành truyền máu

2.3 Di truyền bệnh thiếu men G6PD

Ở người có 46 NST được chia thành 23 cặp, trong đó cặp NST cuối cùng xác định giới tính Ở nữ có 2 NST X, trong khi nam giới có 1 NST X và 1 NST Y Thông thường, sự thiếu men G6PD chỉ gây bệnh cho con trai do di truyền từ mẹ mang gen bệnh trên NST X

Giả sử kí hiệu gen a là gen đột biến gây thiếu men G6PD Sự di truyền lại cho con cái tùy thuộc vào bố hoặc mẹ mắc bệnh hay mẹ mang gen bệnh theo sơ đồ sau:

Hình 2.10: Sơ đồ di truyền bệnh thiếu men G6PD

Bệnh thiếu men G6PD là bệnh lý di truyền lặn liên kết với NST giới tính X, do vậy, nam giới có tỷ lệ mắc bệnh cao gấp hai lần nữ giới Nguyên nhân gây bệnh G6PD do di truyền từ bố mẹ theo định luật Mendel hay đột biến gen trên NST giới tính X [43] Vì vậy trước khi kết hôn nên đi kiểm tra tình trạng enzyme G6PD trong

cơ thể của cả hai người để hạn chế sinh con mắc bệnh Những cặp vợ chồng có

B

Bố bình thường

XY

Mẹ thiếu G6PD

XaY

Mẹ bình thường

XaY

Mẹ mang gen bệnh

XaY

Mẹ thiếu G6PD

người vợ mắc bệnh, nếu con sinh ra là con trai thì nguy cơ mắc bệnh là 100% [42] Thực hiện xét nghiệm bệnh này tốt nhất nên tiến hành với cả người thân gần kề của bệnh nhân, cụ thể là anh chị em ruột hoặc cha mẹ, vì có thể người vợ hoặc chồng bình thường nhưng mang gen bệnh, sự kết hợp giữa hai vợ chồng rất có thể sinh ra con bị bệnh

2.4 Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen

2.4.1 Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần

Polymerase Chain Reaction (PCR) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân

tử nhằm khuếch đại một đoạn DNA đích Nguyên tắc của phương pháp PCR là tạo lượng lớn các bản sao từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhạy và nhanh Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm 3 bước: biến tính, bắt cặp và kéo dài Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp)

Hiện nay, người ta đã phát triển một số kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR đơn thuần này để xác định chính xác kiểu đột biến của DNA như Multiplex allele specific PCR, PCR-SCCP, Real-time PCR,…

2.4.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing)

Trước tiên, mẫu DNA được thực hiện phản ứng PCR để đảm bảo lượng mẫu cần thiết cho việc giải trình gen Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của máy giải trình tự gen tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger có cải biên Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G

2.4.3 So sánh phương pháp Multiplex allele specific PCR và giải trình tự gen

Multiplex allele specific PCR là kỹ thuật khuếch đại gen đa mồi đặc hiệu allele với cặp mồi được thiết kế đặc biệt ở đầu 3’ Sau khi thực phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 3% Với 8 cặp mồi tương ứng với 8 kiểu đột biến gen

G6PD khác nhau sẽ cho các băng điện di có kích thước đặc trưng Dựa vào đó, ta có thể dễ dàng xác định được kiểu đột biến gen G6PD của các mẫu Do đó, việc thiết

kế các cặp mồi trong trường hợp này là hết sức quan trọng

Đối với kỹ thuật giải trình tự gen, khâu phân tích và xử lý dữ liệu sau cùng sẽ giúp chúng ta xác định được vị trí đột biến gen Dựa vào kết quả so sánh, ta có thể phát hiện được đột biến gen ở vị trí nào, loại đột biến cũ hay mới,…

Bảng 2.3: So sánh phương pháp Multiplex allele specific PCR và giải trình tự

gen trong xác định các đột biến trên gen G6PD

Giải trình tự gen Multiplex allele specific PCR

Giải trình tự gen trên máy tự động nhằm

so sánh trình tự chuỗi DNA Thiết kế cặp mồi đặc hiệu allele

Máy móc, trang thiết bị kỹ thuật cao Máy phản ứng PCR đơn thuần

Phát hiện các đột biến gen mới và cũ Áp dụng cho các đột biến gen đã biết trước

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Các nghiên cứu trong nước

Hầu hết các trường hợp thiếu men G6PD là do sự thay đổi của một acid amin gây

ra bởi một đột biến trên gen G6PD Do G6PD là bệnh di truyền nên việc sử dụng các đột biến để tìm nguồn gốc tổ tiên chung của các nhóm dân tộc mang nhiều ý nghĩa về mặt nhân chủng học [4] Nước ta có 54 nhóm dân tộc khác nhau, thiếu G6PD là tương đối phổ biến ở các dân tộc đã được điều tra Tỷ lệ thiếu men G6PD dao động từ 0,5%-31% tùy theo dân tộc và các khu vực vùng miền khác nhau [3,

12, 19, 21] Tuy nhiên, nghiên cứu G6PD ở mức độ phân tử mới chỉ dừng lại ở 8 nhóm dân tộc Kinh, K’Ho, Châu Mạ, Nùng, Tày, Raglai, Pako và Khơ Mú

Matsuoka và cộng sự (2007) đã tiến hành một cuộc khảo sát thiếu men G6PD sử dụng mẫu máu của bệnh nhân nam ngoại trú tại một bệnh viện địa phương ở miền nam Việt Nam Trong đó, số lượng mẫu của người Kinh chiếm 88,9%, với một số lượng nhỏ (11,1%) đến từ K’Ho, Châu Mạ, Nùng và Tày Kết quả của nghiên cứu phát hiện 25 trường hợp thiếu men G6PD trong 1.104 mẫu (2,3%) Một đột biến mới 352T→C dẫn đến sự thay đổi acid amin 118Tyr→His được tìm thấy ở một cậu

bé người Kinh 1 tuổi Hoạt tính men G6PD được ước tính ít hơn 10%, mặc dù không cho thấy thiếu máu tán huyết mãn tính Do đó, tác giả phân loại biến thể này

thuộc nhóm II và đặt tên nó là G6PD Bao Loc Ở người Kinh, G6PD Viangchan là một trong những biến thể phổ biến nhất trong quần thể khu vực Đông Nam Á chiếm cao nhất là (6/19), tiếp theo là các biến thể có nguồn gốc từ Trung Quốc như G6PD Canton (5/19), G6PD Kaiping (3/19), G6PD Gaohe (1/19) và G6PD Quing Yuan (1/19) Ngoài ra, G6PD Union (2/19) có nguồn gốc từ châu Đại Dương cũng đã được phát hiện Những phát hiện này cho thấy rằng, người Kinh có nguồn gốc từ các chủng tộc gốc khác nhau từ lục địa Đông Nam Á, Trung Quốc và châu Đại Dương Ngược lại, tất cả 5 trường hợp thiếu men G6PD ở dân tộc K’Ho là G6PD Viangchan, cho thấy rằng họ đã tiến rất gần đến Đông Nam Á như người Khmer ở Campuchia và người Lào tại Lào Điều thú vị là G6PD Mahidol, một biến thể phổ biến trong quần thể Đông Nam Á ở các nước Myanmar, Thái Lan và Malaysia đã không được phát hiện ở Việt Nam

Vào năm 2009, Nguyễn Thị Huệ và cộng sự đã thực hiện sàng lọc bệnh thiếu men G6PD trên 82 bệnh nhân haemoglobinuria và 524 người khỏe mạnh bằng cách

sử dụng các test methylene blue reduction, bộ kit G-6-PDH hoặc test methaemoglobin reduction Các biến thể G6PD đã được phân tích và xác định bằng phương pháp Single-strand conformation polymorphism (SSCP) kết hợp với giải trình tự DNA Nghiên cứu này đã xác định 6 biến thể G6PD hiện diện trong dân số Việt Nam Trong đó, G6PD Viangchan là biến thể phổ biến khắp Đông Nam Á, chiếm 77% số các biến thể được phát hiện

micro-Cũng vào năm 2009, Nguyễn Minh Hùng và cộng sự tiến hành các cuộc điều tra dựa vào cộng đồng để phát hiện bệnh thiếu men G6PD tại ba ngôi làng ở miền Trung và miền Bắc từ năm 2001-2006 Tổng cộng 799 cá nhân nam thuộc ba nhóm dân tộc (dân tộc Raglai, Pako và Khơ Mú) đã được thử nghiệm hoạt tính enzyme G6PD và phát hiện 32 cá nhân thiếu G6PD Tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở Raglai, Pako và Khơ Mú tương ứng là 2,1% (9/438), 7,7% (16/208) và 4,6% (7/153) Ở Raglai, biến thể G6PD Viangchan đã được tìm thấy (8/9, 88,9%), tiếp theo là G6PD Canton (1/9, 11,1%) Ở Pako, tổng cộng 16 trường hợp thiếu men G6PD là G6PD Viangchan Tất cả các mẫu phân tích (7/7, 100%) đều là các biến thể G6PD Union tại các nhóm dân tộc Khơ Mú Nghiên cứu này cho thấy rằng người Raglai và Pako chia sẻ một

tổ tiên chung với Campuchia, Lào và Thái Lan Mặt khác, sự xuất hiện của G6PD Union của người Khơ Mú cho thấy rằng họ có nguồn gốc từ một tổ tiên khác Tiếp

tục thực hiện một nghiên cứu khác về đột biến gen G6PD ở 3 nhóm dân tộc Mường, Tày và Thái thì hai biến thể G6PD Viangchan và G6PD Union thường hay gặp nhất với tỷ lệ tương ứng là 25,7% và 53,8% Cùng với kết quả của các nghiên cứu trước đây cho thấy, G6PD Viangchan và G6PD Union là hai biến thể G6PD chủ yếu tại Việt Nam [3, 19]

Tiếp theo đó, Nguyễn Thị Huệ và cộng sự (2013) tiếp tục tiến hành nghiên cứu xác định các đột biến thường xảy ra trong gen G6PD Phương pháp PCR với 7 bộ mồi được sử dụng để khuếch đại trình tự 13 vùng mã hóa của gen G6PD Kết quả

có 7 loại biến thể đã được xác định Mỗi bệnh nhân có ít nhất một đột biến ở gen G6PD Trong đó, đi kèm với các đột biến trên là đột biến im lặng 1311C→T với tần

số 56,66% Với tần số cao, đột biến 1311C→T được cho là dấu hiệu tiềm năng thiếu men G6PD ở dân số Việt – Kinh

2.5.2 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Theo Nuchprayoon và cộng sự (2002), thông qua một nghiên cứu trên quần thể dân số thiếu hụt men G6PD bằng xét nghiệm định lượng G6PD trong máu ở Bangkok thì tỷ lệ thiếu men G6PD ở bé trai là 11,1% (N=350) và 5,8% ở bé gái (N=172) Còn ở những trẻ sơ sinh có tăng lượng bilirubin trong máu, tỷ lệ thiếu men G6PD là 22,1% ở bé trai (N=140) và 10,1% ở bé gái (N=89) Phương pháp PCR kết hợp với enzyme cắt giới hạn được sử dụng để xác định các dạng biến thể đột biến G6PD Viangchan và 9 dạng đột biến khác trên gen G6PD từ các mẫu máu thiếu hụt G6PD Trong đó, đột biến G6PD Viangchan là đột biến phổ biến nhất (54%), tiếp theo là G6PD Canton (10%), G6PD Mahidol (8%), G6PD Kaiping (5%), G6PD Union (2,6%) và Chinese-5 (2,6%) Trong số 20 trẻ sơ sinh có tăng bilirubin trong máu, G6PD Viangchan cũng là đột biến thường gặp nhất (60%), tiếp theo là G6PD Canton (10%), G6PD Mahidol, G6PD Union và G6PD Kaiping (mỗi biến thể chiếm 5%) Do vậy, G6PD Viangchan cùng với G6PD Mahidol và G6PD Canton chiếm hơn 70% sự thiếu hụt G6PD trong nghiên cứu này ở người Thái Vào năm 2005, Laosombat và cộng sự đã nghiên cứu trên 225 trẻ sơ sinh thiếu men G6PD tại Bệnh viện Songklanagarind ở phía nam Thái Lan gồm 210 nam và

15 nữ cũng cho thấy G6PD Viangchan, G6PD Kaiping, G6PD Mahidol và G6PD Canton là các biến thể phổ biến và chiếm khoảng 78% các trường hợp Các phân tích phân tử được thực hiện trên 134 cá nhân thiếu men G6PD bởi sự kết hợp của kỹ

thuật PCR-RFLP và giải trình tự DNA đã xác định 10 biến thể đột biến G6PD khác nhau và 3 biến thể phổ biến nhất là G6PD Viangchan (31,3%), G6PD Kaiping (20,1%) và G6PD Mahidol (17,2%), tiếp theo là các dạng biến thể G6PD Canton (9,7%), G6PD Union (2,2%), G6PD Gaohe (1,5%), G6PD Quing Yuan (0,7%), G6PD Mediterranean (0,7%), G6PD Songklanagarind (0,7%), đột biến im lặng (1311C→T; 6,7%) và các biến thể chưa xác định (9%)

Tiếp đó, Ninokata và cộng sự (2006) cũng đã thực hiện nghiên cứu về tỷ lệ thiếu men G6PD trên 345 tình nguyện viên (123 nam và 222 nữ) ở đảo Phuket, miền Nam Thái Lan bằng phương pháp WST-8/1-methoxy Cơ sở phân tử của sự thiếu hụt G6PD được xác định bằng các phương pháp giải trình tự gen hoặc PCR kết hợp với enzyme cắt giới hạn Số lượng đối tượng thiếu men G6PD ở thể nặng và nhẹ tương ứng là 14 và 21 Tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở người Moken là 15,4% và ở dân tộc Thái là 15,5% Kết quả đột biến gen bao gồm G6PD Mahidol (N=14), G6PD Viangchan (N=11), G6PD Gaohe (N=2), G6PD Kaiping (N=1) và G6PD Kerala-Kalyan (N=1) Như vậy, G6PD Mahidol phổ biến hơn so với G6PD Viangchan Và điều này lại khác với các nghiên cứu trước đó Tuy nhiên, có thể giải thích sự khác biệt này là do một vài nhóm người của lục địa châu Á như Myanmar, Lào, Campuchia, Thái Lan và Trung Quốc đã tham gia vào việc thành lập bản sắc dân tộc của các nhóm dân tộc hiện nay ở đảo Phuket

Ở Malaysia, Ainoon và cộng sự (2002) thực hiện phân tích DNA sử dụng mẫu máu trên 86 trẻ sơ sinh nam được chẩn đoán là thiếu hụt men G6PD bởi sự kết hợp của kỹ thuật PCR, phân tích SSCP và giải trình tự DNA Các dạng biến thể G6PD được tìm thấy là G6PD Viangchan (37,2%), G6PD Mediterranean (26,7%) và G6PD Mahidol (15,1%), tiếp theo là G6PD Canton (4,7%), G6PD Vanua Lava (3,5%), G6PD Coimbra (3,5%), G6PD Kaiping (2,3%), G6PD Union (2,3%), G6PD Chatham (2,3%), G6PD Orissa (1,2%) và G6PD Andalus (1,2%) Như vậy, các đột biến G6PD Viangchan, Mahidol và Mediterranean chiếm ít nhất 80% các trường hợp Do các biến thể G6PD Viangchan và Mahidol phổ biến ở khu vực Đông Nam

Á và sự hiện diện của chúng ở Malaysia cho thấy có nguồn gốc tổ tiên chung với người Campuchia, Lào và Thái Lan Kết quả này tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của Yusoff và cộng sự (2003) Theo đó, G6PD Viangchan and G6PD Mediterranean là các biến thể chính ở Malaysia

Ở Myanmar, Matsuoka và cộng sự (2004) đã thu thập 1.000 mẫu máu và tỷ lệ thiếu men G6PD trên quần thể nghiên cứu là 11% (121 ca) Giải trình tự gen G6PD của các đối tượng này và phát hiện 45 trường hợp G6PD Mahidol, 2 ca G6PD Coimbra, 2 ca G6PD Union, và 1 ca là G6PD Canton Cùng với dữ liệu của các báo cáo trước đó, G6PD Mahidol là biến thể chiếm đa số ở Myanmar Phát hiện này còn cho thấy rằng, dân tộc Myanmar có nguồn gốc từ chủng tộc gốc đồng nhất và khác với Thái Lan, Malaysia và các quần đảo Indonesia

Thiếu men G6PD rất phổ biến ở Đông Nam Á Đột biến gen G6PD có liên quan đến các nhóm dân tộc cụ thể trong khu vực Đông Nam Á Mon là một nhóm dân tộc thiểu số ở Myanmar, có ngôn ngữ nói là Monic, một ngôn ngữ riêng biệt của phân loại ngôn ngữ Mon-Khmer Vào năm 2008, Nuchprayoon và cộng sự đã nghiên cứu các đột biến G6PD ở Mon và tỉnh Samut Sakhon ở miền nam Myanmar Tỷ lệ thiếu G6PD được xác định là 12% ở nam giới Mon (19/162) và 10% ở nam giới Myanmar (17/178), và sau đó xác định đột biến gen G6PD Trong số 19 người Mon thiếu G6PD thì có 12 người có đột biến Mahidol; các biến thể còn lại là G6PD Jammu, G6PD Kaiping, G6PD Mediterranean, một đột biến mới 94C→G (mỗi một trường hợp chiếm 1 ca) và ba loại đột biến vẫn chưa được xác định Ở Myanmar có

17 người thiếu men G6PD thì 12 trường hợp là đột biến Mahidol, 1 ca G6PD Coimbra, 1 ca G6PD Kerala-Kalyan, 1 ca G6PD Valladolid và 2 ca vẫn chưa được xác định G6PD Mahidol là đột biến phổ biến nhất ở Mon và tỉnh Samut Sakhon Nghiên cứu này cho thấy rằng những người Mon chia sẻ một tổ tiên chung với Myanmar hơn là người Campuchia

Còn ở Campuchia, vào năm 2005, Louicharoen và Nuchprayoon nghiên cứu các đột biến G6PD trên 215 đối tượng (108 người lao động Camphuchia di trú ở tỉnh Chanthaburi và 107 trẻ sơ sinh) Tỷ lệ thiếu men G6PD là 31 ca (26,1%) trong số

119 nam giới và 3 ca (3,1%) trong số 96 nữ giới Sau đó, các mẫu thiếu men G6PD được thử nghiệm tìm đột biến gen Biến thể G6PD Viangchan chiếm đa số trong hầu hết người Campuchia thiếu men G6PD (28/34 ca; 82,4% ); 1 ca G6PD Union

và 1 ca G6PD Coimbra Từ đó có thể kết luận rằng, G6PD Viangchan là đột biến phổ biến nhất ở Campuchia Phát hiện này tương tự như thiếu men G6PD ở người Thái và Lào Điều này cho thấy một tổ tiên chung của ba quốc gia này

Cũng trong năm 2005 ở Campuchia, nghiên cứu của Matsuoka trên 670 người cũng có kết quả tương tự Ở Khmer, tỷ lệ thiếu men G6PD của nam giới là 12,6% (25/199), trong khi chiếm thiểu số ở Pun Tum và Cha Ray tương ứng là 1,1% (1/93)

và 3,2% (2/63) Trong các đối tượng thiếu men G6PD, 97,9% (46/47) là G6PD Viangchan và chỉ có 1 trường hợp (2,1%) là G6PD Union Ở Myanmar, G6PD Mahidol là biến thể phổ biến nhất Với kết quả hiện tại cho thấy rằng, người dân Campuchia có nguồn gốc từ chủng tộc gốc đồng nhất và khác với Myanmar

Tỷ lệ thiếu hụt G6PD dao động từ 0,5-4,08% trong dân số khác nhau của Trung Quốc Ở Tây Nam Trung Quốc, theo nghiên cứu của Chun Deng và cộng sự (2007), các đột biến gen G6PD phổ biến nhất ở trẻ sơ sinh là đột biến G6PD Kaiping, G6PD Canton và G6PD Gaohe Trong số 240 trẻ sơ sinh thiếu G6PD, bằng phương pháp PCR đặc hiệu, đã xác định 190 bé có đột biến G6PD Kaiping, 48 bé có đột biến G6PD Canton và 2 trường hợp đã có đột biến G6PD Gaohe

Tiếp đó, tại miền nam Trung Quốc, Hu và cộng sự (2016) đã sàng lọc sự thiếu hụt men G6PD trên 2.331 đối tượng liên quan bằng một xét nghiệm huỳnh quang để điều tra các đặc điểm dịch tễ học phân tử của gen G6PD ở phía nam tỉnh Giang Tây DNA từ các cá nhân thiếu hụt men G6PD được phân tích bởi Gen-chip cho 13 đột biến G6PD phổ biến ở Trung Quốc Tổng cộng có 3,6% (82/2.331) mẫu đã được tìm thấy là thiếu G6PD Tám đột biến đã được tìm thấy từ 80 mẫu Tuy nhiên, đột biến ở hai mẫu còn lại vẫn chưa được tìm thấy Những đột biến thường gặp nhất là G6PD Canton và G6PD Kaiping, và các đột biến còn lại sau đây: 1311 polymorphism (1311C→T), G6PD Gaohe, G6PD Chinese-5, G6PD Maewo, G6PD Shunde, G6PD Viangchan và Chinese-3

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Giai đoạn

sàng lọc

Dưới ngưỡng bình thường Dưới ngưỡng bình thường

Xét nghiệm

chẩn đoán

Phân tích đột biến gen

Mẫu máu gót chân

Tách chiết DNA

Phương pháp Multiplex PCR

Kết quả phân tích đột biến Phương pháp

giải trình tự gen

Trên ngưỡng bình thường

Thu mẫu máu gót chân lên giấy thấm lần 1

Trên ngưỡng bình thường

Trẻ sơ sinh sau sanh

từ 48-72 giờ

Xét nghiệm sàng lọc thiếu men G6PD lần 1 bình thường Kết quả

Kết quả nghi ngờ

Xét nghiệm sàng lọc thiếu men G6PD lần 2

Kết quả thiếu men G6PD

Kết quả bình thường

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang (Cross-sectional study)

Công thức ước tính cỡ mẫu trong điều tra tỷ lệ hiện hành của một bệnh cần nghiên cứu như sau:

Trong đó: n là cỡ mẫu cần phân tích; Z score tương ứng với mức ý nghĩa thống

kê mong muốn, thường lấy 95% (Z = 1,96); P là tỷ lệ ước tính (P = 1,37% - Theo Nguyễn Minh Hùng và cộng sự, 2015); d là sai số mong muốn Vậy cỡ mẫu n được ước tính là 1.060 mẫu (với d = 7‰)

Để đảm bảo số lượng mẫu và số liệu phân tích có ý nghĩa nên dữ liệu cỡ mẫu được thu thập trong khoảng thời gian từ ngày 1 tháng 1 năm 2015 đến ngày 30 tháng 11 năm 2016, với tổng số mẫu N=5.034 mẫu Với số cỡ mẫu thu thập lớn hơn

cỡ mẫu ước tính ở trên nên vẫn đảm bảo tính chính xác của nghiên cứu Tất cả các mẫu nghiên cứu trong thí nghiệm đều được sự đồng ý của gia đình bệnh nhân và được ủng hộ bởi Hội đồng Y đức của bệnh viện

Bảng 3.1: Cỡ mẫu trẻ sơ sinh trong nghiên cứu cắt ngang

3.2.2 Phương pháp lấy máu gót chân trên thẻ giấy Whatman 903

Yêu cầu mẫu máu phải thấm đều và phủ khắp vòng tròn, tránh thấm máu nhiều lần Không chạm hoặc dàn giọt máu trên mẫu giấy thấm

Hình 3.2: Quá trình lấy máu gót chân ở trẻ sơ sinh

Hình 3.3: Mẫu máu khô của bệnh nhân

3.2.3 Dữ liệu gen G6PD

Trình tự gen chuẩn của gen G6PD được lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI có mã số NM_001042351.2 Từ đó có thể khai thác các thông tin quan trọng như: trình tự chuỗi DNA dạng FASTA format và kích thước của gen G6PD, trong đó có chứa trình tự cũng như kích thước chuỗi DNA của 13 exons của gen G6PD

3.2.4 Phân tích thống kê

Dữ liệu được thu thập và phân tích bằng phần mềm thống kê SPSS version 20.0

3.2.5 Dụng cụ, sinh phẩm – hóa chất và trang thiết bị

3.2.5.1 Dụng cụ

Micropipette đơn và đa kênh

Kìm bấm khoanh giấy có đường kính 1/8’’ (3mm)

Cột ly tâm silica (spin-column)

Phiến vi lượng 96 giếng đáy phẳng

Lược 3*3 mm (13 giếng)

Eppendorf, tube đáy nhọn 15ml, đầu côn, kéo, panh, chai thủy tinh 1.000 ml,…

3.2.5.2 Sinh phẩm – hóa chất

Kit sàng lọc QuantaseTM Neonatal G6PD Deficiency Screening

Kit tách chiết G-spinTM

Total DNA Extraction

Kit chẩn đoán DiaPlexCTM G6PD Genotyping Kit (Asian type)

Giấy thấm Whatman 903

Agarose và metaphore

Dung dịch đệm TAE 1X (Tris-Acetate-EDTA), pH =8,0

DNA Loading dye buffer

Dung dịch Ethidium bromide (0,5 mg/ml)

Chai nước cất pha tiêm; nước khử ion (dH2O); ethanol 70°, 90° và 96°

3.2.5.3 Trang thiết bị

Máy PCR PTC-100® Thermal Cycler

Máy ly tâm ống eppendorf /vortex

Máy ELISA microplate reader

Máy rửa ELISA microplate washer

Máy điện di Mupid – eXU

Máy soi gel bằng đèn UV

Máy đo nồng độ DNA Quawell Q3000

Máy lắc phiến vi lượng GYRO-ROCKER STR9

Máy ủ nhiệt lắc Thermo-Shaker TS-100

Máy vortex V-1plus

3.3.1.2 Nguyên lý của kỹ thuật

Xét nghiệm sàng lọc Quantase™ Neonatal G6PD Deficiency sử dụng các mẫu phẩm máu khô đã được tách rửa bằng dung dịch đệm

Mẫu sau khi đã tách rửa được ủ trong dung dịch có chứa glucose-6-phosphate, NADP+ và muối tetrazolium Nếu có G6PD trong mẫu sẽ chuyển NADP+ thành NAPDH Muối tetrazolium sẽ chuyển sang màu nhuộm formazan và màu này được phát hiện bằng phương pháp đo mật độ quang (OD/min) ở bước sóng 405nm hoặc 550nm Một đơn vị hoạt tính được xác định bằng lượng G6PD xúc tác để hình thành nên 1µmole NADPH/ phút/gram haemoglobin

(Reagent Vial) NADP

+ và Glucose-6-phosphate đông khô

C|c chứng Blood Spot M|u người to{n phần được phết lên giấy Whatman 903

Hoạt tính G6PD cao, bình thường v{ suy giảm

3.3.1.4 Chuẩn bị thuốc thử

Chất thử coenzyme: Hoàn nguyên 1 lọ Reagent Vial đông khô với 2 ml nước cất

pha tiêm (hoặc nước khử ion) Nhẹ nhàng lắc tròn để hoàn nguyên và phải được ủ

ấm đến 30 C hay 37 C trước khi sử dụng Chất thử đã hoàn nguyên sẽ ổn định trong 5 ngày ở nhiệt độ 2-8°C hay 10 ngày ở -20°C

Chất thử màu: Chuẩn bị chất thử màu bằng cách trộn Color Reagent Booster với

Color Reagent theo tỷ lệ tương ứng là 1:10 Nhẹ nhàng lắc tròn để trộn Chất thử màu sẽ ổn định trong vòng 8 giờ ở điều kiện tránh ánh sáng

Trong quá trình thực hiện không nên trộn lẫn chất thử mới pha và cũ vào nhau Tất cả các chất thử phải được đưa về nhiệt độ phòng (18-25°C) trước khi sử dụng Bảo quản tất cả các chất thử lỏng ở nhiệt độ 2-8°C và Blood Spot Controls ở -20°C

3.3.1.5 Quy trình xét nghiệm

a Giai đoạn tách rửa

Bấm 2 khoanh có đường kính 1/8’’ từ các Blood Spot Control cho vào mỗi giếng của phiến vi lượng đáy phẳng Bấm 2 khoanh các mẫu phẩm của bệnh nhân cho vào các giếng còn lại của phiến, đánh dấu vị trí của chúng

Nhỏ 75 µl dung dịch đệm tách rửa vào mỗi giếng, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 37°C) và lắc nhẹ trong vòng 35 phút Phải chắc chắn các khoanh mẫu bệnh phẩm được nhúng hẳn trong đệm tách rửa

(18-b Giai đoạn chuyển mẫu và hiển thị màu

Sau khi ủ 35 phút, lấy phiến vi lượng ra khỏi máy lắc Sử dụng micropipette đa kênh để trộn và chuyển 15 µl dung dịch đã tách rửa vào phiến vi lượng mới

Nhỏ 75 µl chất thử phản ứng đã được ủ ấm vào mỗi giếng và trộn đều

Sau đó thêm 100 µl chất thử màu đã chuẩn bị và trộn đều

Đặt phiến vào máy đọc và đo độ hấp thụ ở bước sóng 550nm (đọc lần đầu)

Ủ phiến trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng 18-37°C, không cần lắc

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 405nm hoặc 550nm (đọc lần cuối)

c Yêu cầu về kiểm tra chất lượng

Cần phải phân tích Blood Spot Controls trên mỗi phiến xét nghiệm

3.3.1.6 Phân tích kết quả

Kiểm tra chất lượng: mỗi xét nghiệm phải bao gồm chứng cao, chứng thường và chứng suy giảm Xét nghiệm chỉ có giá trị khi hoạt tính G6PD của các chứng Blood Spot Controls nằm trong giới hạn của các nhãn chứng

Tính toán kết quả

Hoạt tính G6PD trong U/g Hb trên các mẫu phẩm của bệnh nhân được tính như sau:

Giá trị của mẫu (U/g Hb) = Giá trị Control x

Trong đó OD là sự thay đổi độ hấp thụ (OD/min) được tính theo công thức:

OD 550nm = (ODcuối 550nm – ODđầu 550nm ) / time

Phương pháp xét nghiệm định lượng enzyme G6PD cho phép xác định số lượng hoạt độ enzyme G6PD dựa vào tốc độ tạo thành NADPH được đo bằng máy đo mật

Khử trùng kéo, panh trên ngọn lửa đèn cồn

Cắt khoảng 1,5 vòng tròn máu trên thẻ giấy, sau đó cắt thành sợi nhỏ, lấy panh gắp mẫu cho vào eppendorf

Sau khi cắt mẫu cần khử trùng lại kéo, panh

Bước 2: Bổ sung hóa chất tách chiết

Bổ sung 20 µl Proteinase + 5 µl RNAse + 350 µl CL vào mỗi ống eppendorf chứa mẫu (nếu có nhiều mẫu cần tính toán lượng hóa chất mỗi loại cần dùng rồi mix chung vào lọ hóa chất CL sau đó chia 375 µl hóa chất vào mỗi ống)

Vortex trộn đều hóa chất, spin khoảng 5 giây

Bước 3: Ủ mẫu

Mẫu được ủ ở 56 C trong khoảng 30 phút trên máy ủ lắc với tốc độ khoảng

500-600 rpm

Spin 5 giây

Bổ sung 350 µl BL + 2 µl carrier RNA

Đảo đều (không vortex mạnh), spin khoảng 5 giây

Tiếp tục ủ ở 70 C trong 10 phút trên máy ủ lắc với tốc độ 500-600 rpm

Spin 20 giây

Để mẫu trên rack lạnh trong khoảng 2 phút để làm lạnh mẫu

Bước 4: Kết tủa và tinh sạch DNA

Chuẩn bị ống eppendorf mới ghi đầy đủ ký hiệu mẫu và loại mẫu

Chuyển dịch trong ống eppendorf chứa mẫu sang ống eppendorf mới chuẩn bị

Bổ sung 400 µl ethanol lạnh, đảo đều, spin

Để trong tủ -20 C khoảng 20 phút nhằm tăng khả năng tủa DNA

Chuẩn bị cột, ghi ký hiệu mẫu và loại mẫu

Chuyển dịch trong ống eppendorf sang cột spin-column (vì lượng dịch nhiều nên chia làm 2 lần ly tâm, lần 1 chuyển 600 µl và lần 2 thì chuyển lượng còn lại) Trước khi hút đảo đều dịch bằng micropippet

Ly tâm 12.000 rpm/45 giây, sau đó loại bỏ dịch ở ống collection tube Lặp lại một lần nữa

Bổ sung 500 µl WA Ly tâm 12.000 rpm/45 giây ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ dịch ở ống collection tube