Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại đồng bằng sông cửu long

phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể phân lập được - Nghiên cứu khả năng ức của các thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và trong môi

-o0o -MAI HOÀNG YẾN

SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN THỰC KHUẨN THỂ NHẰM TRỊ BỆNH TRÊN CÁ TRA TẠI ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, tháng 1 năm 2018

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS.HOÀNG ANH HOÀNG

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS.NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS.TRẦN TRUNG HIẾU

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 12 tháng 01 năm 2018

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS.NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2 Phản biện 1: PGS.TS.NGUYỄN THÚY HƯƠNG

3 Phản biện 2: TS.TRẦN TRUNG HIẾU

4 Ủy viên: TS.PHAN THỊ HUYỀN

5 Ủy viên, thư ký: TS.HOÀNG MỸ DUNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I.Tên Đề Tài

Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại Đồng

bằng Sông Cửu Long

II.Nhiệm vụ và nội dung

mẫu gan-thận cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long

phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể phân lập được

- Nghiên cứu khả năng ức của các thực khuẩn thể đối với vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và trong môi trường nước ao nuôi cá

tra

III.Ngày giao nhiệm vụ: 06/02/2017

IV.Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 05/01/2018

V.Cán bộ hướng dẫn: TS.Hoàng Anh Hoàng

TP.HCM, ngày 04 tháng 01 năm 2018

TS.Hoàng Anh Hoàng

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh,

em đã được học tập và nhận được sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cô, điều đó đã giúp em trang bị được nhiều kiến thức để có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa Tp

Hồ Chí Minh, các thầy cô khoa Kỹ thuật Hóa học và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, đã nhiệt tình chỉ dạy và tạo mọi điều kiện để em có thể tiến hành luận văn thuận lợi

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy hướng dẫn - TS Hoàng Anh Hoàng đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn đến chị Nhung, bạn Xuân, Ngoan, Trâm và các thành viên phòng

hiện đề tài luận văn

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 01 năm 2018 Mai Hoàng Yến

khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra chính là bước đầu tiên trong việc

ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong thực tế

Trong luận văn này, 29 mẫu gan-thận được thu nhận từ Đồng Bằng Sông Cửu Long được sử dụng để phân lập thực khuẩn thể xâm nhiễm chủng vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra Kết quả phân lập được 3 thực khuẩn thể

pGA1, pGA2 và pGA3 Các chủng thực khuẩn thể này được tiến hành khảo sát hoạt tính với hai thông số quan trọng trong đánh giá hoạt tính xâm nhiễm thực khuẩn thể

là chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) Chu kỳ xâm nhiễm thuộc khoảng 55 – 65 phút Hệ số nhân thuộc khoảng từ 18-77 Tiếp theo, các phage được khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn đích trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn Khả năng ức chế được khảo sát riêng rẽ hoặc kết hợp các phage với nhau Bằng việc đo giá trị OD 600nm, khả năng ức chế được thể hiện trong khoảng 13-14 giờ Ngoài ra khả năng ức chế của các thực khuẩn thể cũng được thử nghiệm trong nước ao nuôi cá tra Khả năng ức chế vi khuẩn của thực khuẩn thể được thể hiện tốt trong 51 giờ khảo sát Đây là những bước đầu tiên nhưng quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh gan thận mủ cho cá tra

Striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) farmed in the Mekong Delta

Vietnam (MKDVN) importantly contributes to national aqua export Currently, however, aqua diseases occur more frequently across the entire MKDVN region One of the most common types is the white spots in internal organs caused by

Edwardsiella ictaluri In this study, phage therapy was investigated its possibility to

treat Edw ictaluri in vitro Firstly, isolation and characteristics of phages specific to

Edw ictaluri from striped catfish farms in the MKDVN were conducted Lytic

activity of three phages pGA1, pGA2 and pGA3 isolated from 29 samples was clarified Latent period of three phages were about 55 to 65 minutes Burst size of these phages were about 18-77 Secondly, inactivation of host bacteria by single phage or cocktail of phages were evaluated By measuring OD600nm, inactivation was shown for 13-14 hours In addition, the challenge was conduted in sterilize pond water and inactivation was well shown for 51 hours Some prelimilary and

important data was obtained to achieve strategies to control Edw ictaluri in vivo in

prospective studies

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn khoa học, hướng dẫn thực nghiệm của TS.Hoàng Anh Hoàng

Các số liệu, kết quả mà tôi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng

được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đây

Tác giả

Mai Hoàng Yến

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam 3

1.2 Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) 4

1.3 Dịch bệnh trên cá tra 5

1.4 Bệnh gan thận mủ 6

1.5 Các phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra 9

1.5.1 Sử dụng thuốc kháng sinh 9

1.5.2 Sử dụng vaccine 11

1.6 Thực khuẩn thể (bacteriophage) 12

1.6.1 Lịch sử phát hiện phát hiện thực khuẩn thể 12

1.6.2 Phân loại thực khuẩn thể 13

1.6.3 Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn: 14

1.6.4 Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Hóa chất và môi trường 20

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thu và xử lý mẫu 21

2.2.2 Tăng sinh và phân lập thực khuẩn thể 22

2.2.3 Tạo stock 23

2.2.4 Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) 23

2.2.5 Khảo sát thời gian ức chế vi khuẩn trong môi trường chuẩn 25

2.2.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edw.ictaluri trong môi trường nước ao 26

2.2.7 Khảo sát phổ xâm nhiễm của thực khuẩn thể 27

2.2.8 Xử lý số liệu 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28

3.1 Kết quả phân lập thực khuẩn thể 28

3.2 Kết quả tạo stock thực khuẩn thể 29

3.3 Chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size) 29

3.4 Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng thực khuẩn thể riêng lẻ 32

3.5 Thời gian duy trì ức chế vi khuẩn trong điều kiện môi trường dinh dưỡng chuẩn sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể 37

3.6 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Edw.ictaluri trong môi trường nước ao 38

3.7 Khảo sát phổ xâm nhiễm 42

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BHI: Môi trường Brain Heart Infusion

MOI: Multiplicity of infection - Tỷ lệ giữa số lượng

thực khuẩn thể và số lượng vi khuẩn

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm 3

Hình 1.2 Hình thái cá tra 4

Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 7

Hình 1.4 Biểu hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra 8

Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn 13

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm thực khuẩn thể lên vi khuẩn 14

Hình 3.1 Hình thái vòng sinh tan của các phage pGA1, pGA2, pGA3 28

Hình 3.2 Tỉ lệ thực khuẩn thể pGA1 tương đối theo thời gian 29

Hình 3.3 Tỉ lệ thực khuẩn thể pGA2 tương đối theo thời gian 30

Hình 3.4 Tỉ lệ thực khuẩn thể pAG3 tương đối theo thời gian 31

Hình 3.5 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA1 theo thời gian khảo sát 33

Hình 3.6 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA2 theo thời gian khảo sát 34

Hình 3.7 A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA3 theo thời gian khảo sát 35

Hình 3.8 (A) Biến thiên OD600 và (B) Biến thiên nồng độ hỗn hợp thực khuẩn thể pGA1, pGA2, pGA3 theo thời gian khảo sát 37

Hình 3.9 A) Biến thiên OD600 của các nghiệm thức theo thời gian khảo sát 39

Hình 3.10 (A) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA1, (B) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA2, (C) Biến thiên nồng độ thực khuẩn thể pGA3 theo thời gian khảo sát 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng một số loài cá 5

Bảng 1.2 Một số bệnh thường gặp ở cá tra 6

Bảng 1.3 Tình hình kháng kháng sinh của 30 chủng Edw.ictaluri 10

Bảng 1.4 Bảng phân loại thực khuẩn thể 13

Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trên các bệnh thủy sản 17

Bảng 2.1 Bảng tính số lượng thực khuẩn sinh ra theo thời gian 24

Bảng 2.2 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát thời gian ức chế khuẩn trong môi trường chuẩn 26

Bảng 2.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát thời gian ức chế khuẩn trong môi trường nước ao 26

Bảng 2.4 Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát phổ xâm nhiễm 27

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát chu kì xâm nhiễm và hệ số nhân của 3 thực khuẩn thể 31 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phổ xâm nhiễm của 3 phage pGA1, pGA2, pGA3 42

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng Sông Cửu Long đang là ngành rất phát triển và có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu Cá tra là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của Đồng bằng Sông Cửu Long Theo thống kê của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), kim ngạch xuất khẩu cá tra 10 tháng đầu năm 2013 chiếm 26% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cả nước Tuy nhiên, cùng với sự phát triển ngành nuôi cá tra và xu hướng thâm canh thì dịch bệnh trên cá tra cũng tăng theo, gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi cá tra thâm canh Nhiều bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây Chính vì thế việc nhận biết và kiểm soát tốt dịch bệnh có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nâng cao chất lượng cá tra, mang lại hiệu quả kinh tế cho người nông dân

Một trong những bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng trong nghề nuôi cá tra đó chính là bệnh gan thận mủ Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1988 Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn nuôi, lây lan nhanh và có thể gây hao hụt từ 70-90% (Từ Thanh Dung, 2008) Bệnh được ghi nhận nguyên nhân do vi

khuẩn Edw.ictaluri gây ra Hiện nay việc điều trị bệnh gan thận mủ trên cá tra ở

Đồng bằng Sông Cửu Long vẫn chủ yếu dựa vào kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ dẫn đến xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn kháng một hoặc thậm chí nhiều loại kháng sinh, gây nhiều khó khăn trong quá trình điều trị Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị an toàn và hiệu quả lâu dài thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay

Với nhiều ưu điểm về độ đặc hiệu và an toàn Liệu pháp thực khuẩn thể đã

và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra (Richards GP, 2014) Những năm gần đây, việc nghiên

cứu Edw.ictaluri và tìm kiếm các giải pháp trong phòng và trị bệnh gan thận mủ

trên cá tra ở ĐBSCL đã được thực hiện khá nhiều và đạt được nhiều kết quả đáng ghi nhận Tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể trong phòng và điều trị bệnh này vẫn còn bỏ ngỏ và chưa có những kết quả cụ thể Đây vừa là thách thức

và cũng chính là động lực để nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Sàng lọc và tuyển

chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh trên cá tra tại Đồng bằng Sông Cửu Long”

Mục tiêu của đề tài:

Sàng lọc và tuyển chọn thực khuẩn thể nhằm trị bệnh gan thận mủ trên cá tra

do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra tại Đồng bằng Sông Cửu Long

Nội dung nghiên cứu

ictaluri từ mẫu gan-thận cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long.

xác định phổ xâm nhiễm của các thực khuẩn thể phân lập được

Edwardsiella ictaluri trong môi trường dinh dưỡng chuẩn và trong mô

hình nước ao nuôi cá tra

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam

Ngành nuôi trồng thủy sản đang ngày một phát triển và trở thành một ngành

có đóng góp đáng kể trong kim ngạch xuất khẩu Cá tra là một trong những đối tượng cá nuôi nước ngọt chủ lực của Đồng bằng Sông Cửu Long Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa và cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu Theo tổng cục Thủy Sản Việt Nam, diện tích

đi ̣nh từ 2014 đến nay

Hình 1.1 Diện tích – sản lượng cá tra qua các năm (tongcucthuysan.gov.vn)

Kim ngạch xuất khẩu cá tra năm 2015 đạt trên 1,5 tỉ USD Trong đó, kim ngạch thị trường Mỹ đạt 315 triệu USD, kim ngạch thị trường EU đạt 285 triệu USD; kim ngạch thị trường Trung Quốc và Hồng Kông đạt 161 triệu USD

Hình 1.2 Hình thái cá tra (vi.wikipedia.org)

1.2 Cá tra (Pangasianodon hypopthalmus)

Cá tra là loài cá kinh tế phổ biến nhất khu vực châu Á, là một trong 30 loài

cá thuộc họ Pangasiidae Tên loài Pangasianodon hypopthalmus được Rainboth

W.J sử dụng lần đầu tiên vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả sử dụng phổ biến đến nay (Nguyễn Văn Thường, 2008)

Đặc điểm hình thái:

Đặc điểm sinh trưởng:

Cá Tra tăng trưởng tương đối nhanh, lúc nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài; ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài 10 - 12 cm (14 - 15 g) Từ khoảng 2,5

kg trở đi, cá tăng trọng nhanh hơn tăng chiều dài cơ thể Trong tự nhiên cá trên 10

hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m

ao năm đầu cá đạt 1 - 1,5 kg/con, những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 - 6 kg/năm tùy thuộc môi trường sống, sự cung cấp thức ăn và hàm lượng đạm (Nguyễn Tường Anh, 2004)

Giá trị dinh dưỡng cá tra:

Cá tra là loài có giá trị dinh dưỡng cao vì thành phần dinh dưỡng chứa nhiều chất đạm, ít béo, nhiều EPA và DHA, ít cholesterol

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng một số loài cá (nutrineat.com)

Tên loài Tên khoa học Nước(%) Protein(%) Lipid(%) Khoáng(%)

Từ bảng trên cho thấy lượng protein trong cá tra vào khoảng 17,8% cao hơn các loài cá khác như cá tuyết (17,3%), Cá trích (17,3%), Cá chép (16%) và chỉ thấp hơn cá Hồi (22,5%), thành phần các protein trong cá tra dễ tiêu hóa và hấp thu hơn thịt, vừa có chứa đầy đủ các acid amin cần thiết cho cơ thể lại vừa có tỷ lệ các acid amin thiết yếu (EAA) rất cân bằng và phù hợp với nhu cầu EAA của con người Cá Tra có nhiều acid béo chưa no hoạt tính cao chiếm từ 50% đến 70% tổng hàm lượng lipid, đây là các acid béo chúng ta không thể tự tổng hợp được mà phải được cung cấp từ thức ăn

1.3 Dịch bệnh trên cá tra

Với xu hướng thâm canh trong nghề nuôi cá tra thì bệnh cá xảy ra là điều khó có thể tránh khỏi Cá tra dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bênh cho cá gồm 2 nhóm: Bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng)

và bệnh không truyền nhiễm do môi trường

Một số bệnh thường gặp ở cá tra:

Bảng 1.2 Một số bệnh thường gặp ở cá tra (Từ Thanh Dung, 2008)

Da bị mất màu, bụng căn to và mắt hơi lồi, khi mổ ra thì gan, thận, tỳ tạng có nhiều đốm trắng

quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng

colummaris

Đầu tiên xuất hiện một đốm trắng ở đuôi, sau đó lan về phía trước thân và cuối cùng

cả đoạn thân sau đều có màu trắng

nhợt nhạt Trắng

tái nhạt hoặc vàng nghệ

1.4 Bệnh gan thận mủ

Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998 và có tên gọi là bệnh do vi khuẩn hình que gây hoại tử trên cá tra Bệnh có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn nuôi, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% Trong những năm gần đây đã trở thành một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về kinh tế ở các vùng nuôi cá tra thâm canh (Từ Thanh Dung, 2008)

gian này là mùa lũ do đó hàm lượng cao của phù sa trong nước, biến động tình trạng nước, tác động mạnh của nước chảy làm cho cá dễ bị stress, sức đề kháng

kém dẫn đến dễ bị bệnh và sau đó bùng phát dịch Tuy nhiên, ngày nay bệnh này còn xảy ra ở những thời điểm khác trong năm do việc tăng diện tích và tăng mức độ thâm canh, cũng như việc không sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước khi thải ra môi trường

Nguyên nhân: do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, đây là nhóm vi

khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, kích thước

- Loài: Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edw.ictaluri không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi trường glucose Có 1 - 3 plasmid liên kết với Edw.ictaluri những plasmid có thể đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh

Edw.ictaluri là một trong những loài khó tính nhất của chủng Edwarsiella

triển mọc thành khuẩn lạc nhỏ trên môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHIA)

thể được phân lập từ mẫu cá bệnh (gan, thận, lách) trên môi trường Trytone Soya

thành khuẩn lạc màu trắng đục Edw.ictaluri phát triển tốt trong môi trường có pH =

6 và giảm dần ở pH = 7 và 8 (Crumlish M, 2002)

Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (chungvisinh.com)

Dấu hiệu bệnh lý bệnh gan thận mủ và các biến đổi mô học:

Hình 1.4 Biểu hiện bệnh gan thận mủ trên cá tra (thuysanvietnam.com.vn)

Bệnh gan thận mủ thường khó được phát hiện sớm do cá bệnh ít có biểu hiện

bên ngoài Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo bệnh

nhẹ hay nặng Ở giai đoạn chớm bệnh, cá vẫn bắt mồi nhưng ăn giảm, một số trường hợp có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên da

và hậu môn Sự lây lan của bệnh rất nhanh, trong điều kiện thí nghiệm, chỉ khoảng

Nghiên cứu của Nguyễn Quốc Thịnh và cs (2004) cho thấy nhiều thay đổi về

cấu trúc, đặc biệt là gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng sung huyết, xuất huyết và hoại tử xuất hiện ở các vùng chức năng của các cơ quan kể trên Ngoài ra, ở cá bệnh

có hiện tượng dính lại của các tia mang nhưng không tìm thấy các biến đổi ở cơ và

tim của cá bệnh Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Ferguson và cs (2001) cho thấy ngoài hiện tượng hoại tử ở gan, thận và tỳ tạng thì vi khuẩn Edw ictaluri còn gây hoại tử trên cơ của cá Các đặc điểm về mô học cá tra nhiễm vi khuẩn E ictaluri

cũng được mô tả và báo cáo tương tự qua các nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2009), Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) Nhìn chung, qua kết quả nghiên cứu của các tác giả này cho thấy khi

bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri thì các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng thường dễ bị

thay đổi và các biểu hiện thường gặp là sung huyết, xuất và hoại tử Trong khi đó, các cơ quan như mang, da-cơ ít hay không bị biến đổi

1.5 Các phương pháp phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra

1.5.1 Sử dụng thuốc kháng sinh

Kháng sinh (antibiotic) là 1 hợp chất được sản xuất bởi sinh vật mà ở nồng

độ thấp có thể ức chế hoặc giết chết sinh vật khác Thuật ngữ kháng sinh đôi khi được sử dụng với tên gọi khác là chất kháng khuẩn (antimicrobial agents) Kháng sinh có thể là các chất tự nhiên, bán tổng hợp hoặc là các chất hoàn toàn tổng hợp nhưng chúng gây ít hoặc không làm tổn thương tế bào chủ Các kháng sinh có tác dụng làm ngừng sự sinh trưởng của vi khuẩn hoặc nấm được gọi là chất kiềm khuẩn

agents) (Prescott và cs, 2000; Walsh, 2003)

Cơ chế tác động của kháng sinh

Theo Tenover (2006) và Levy, Marshall (2004) kháng sinh tác động lên tế bào vi khuẩn theo 1 số cơ chế chủ yếu sau:

- Can thiệp vào quá trình tổng hợp vách tế bào (nhóm β-lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin, monobactams; nhóm glycopeptide: vancomycin, teicoplanin)

- Ức chế sinh tổng hợp protein (nhóm macrolide, chloramphenicol, clindamycin, quinupristin-dalfoppristin, linezolid)

- Can thiệp vào quá trình tổng hợp acid nucleic (nhóm flouroquinolone và rifampin)

- Ức chế quá trình biến dưỡng acid folic (nhóm sulfonamide, trimethoprim và nhóm đồng phân của acid folic)

- Kháng sinh có thể phá hủy cấu trúc màng tế bào vi khuẩn Gram âm (các kháng sinh polymyxin và daptomycin)

Một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến hiện nay: Amoxicillin, Ampicillin, Cephalosporin, Tetracylin, Quinolon…(Vũ Tiến Dũng, 2013)

Cho đến nay, thuốc kháng sinh vẫn còn sử dụng một các phổ biến để phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới Tuy

nhiên, vẫn còn thiếu những quy định chặt chẽ trong giấy phép sử dụng kháng sinh

và cần có sự thống nhất quốc tế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản Việc hóa trị không phải lúc nào cũng thành công vì đa số các thuốc kháng sinh đều được kết hợp với thức ăn mà thủy sản mắc bệnh thì thường kém ăn Hơn nữa, các nghiên cứu cho thấy ngày càng có nhiều vi khuẩn kháng được một hay nhiều loại kháng sinh gây khó khăn hơn trong quá trình điều trị Bên cạnh đó, vi khuẩn còn có khả năng truyền ngang các gen kháng thuốc giữa các dòng cùng loài và khác loài với nhau thông qua tiếp hợp, nguy cơ truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn gây bệnh ở người rất cao, đây là mối đe dọa rất lớn đối với cộng đồng (Từ Thanh Dung, 2010)

Tình trạng kháng kháng sinh của khuẩn Edw.ictaluri

Nghiên cứu gần đây của Quách văn Cao Thi và cs, (2014) về khả năng kháng

thuốc của 30 chủng vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ các ao nuôi ở ĐBSCL được

thể hiện trong bảng 1.3 dưới đây:

Bảng 1.3 Tình hình kháng kháng sinh của 30 chủng Edw.ictaluri

Thuốc kháng

sinh

Kháng (%)

Nhạy (%)

Nhạy trung bình (%)

Kết quả kháng sinh đồ cho thấy đa số các dòng vi khuẩn Edw.ictaluri nhạy

cao với kháng sinh ampicillin và amoxicillin; kháng cao với các kháng sinh tetracyclin, enrofloxacin, streptomycin và kháng sinh nhóm fenicol; kháng hoàn

toàn với trimethoprim/sunfamethoxazol Đặc biệt hầu hết tất cả 15 chủng vi khuẩn trong nghiên cứu đều thể hiện sự kháng đa thuốc

Ngoài ra, sự kháng thuốc của vi khuẩn Edw ictaluri trên cá tra ở khu vực

ĐBSCL cũng được nhiều tác giả nghiên cứu Crumlish và cs, (2002) đã tiến hành

kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ cá tra nuôi ở tỉnh An Giang và Cần Thơ Kết quả cho thấy vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập trên cá tra ở

tỉnh An Giang chỉ kháng với oxolinic acid trong khi vi khuẩn được phân lập từ Cần Thơ thì kháng với oxytetracyline và sulfonamide Nghiên cứu của Từ Thanh Dung

và cs, (2004) cho thấy vi khuẩn Edw.ictaluri phân lập từ cá tra bệnh tại An Giang,

Cần Thơ, Đồng Tháp và Vĩnh Long cũng kháng với oxytetracyline, oxolinic acid và sulfonamide Tuy nhiên, đến năm 2008, ngoài 2 loại kháng sinh oxytetracyline và sulfonamide thì vi khuẩn này đã kháng thêm với streptomycin, trimethoprim, flumequine và enrofloxacin (Từ Thanh Dung và cs, 2008) Điểm nổi bật trong nghiên cứu này là đã xác định có trên 73% chủng vi khuẩn E ictaluri biểu hiện sự

đa kháng thuốc Gần đây nhất, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và

cs, (2010) cho thấy hầu hết vi khuẩn Edw.ictaluri kháng với streptomycin,

chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%) và doxycycline (67,5%) Đặc biệt, nghiên cứu này đã xác định 97,5% chủng vi khuẩn biểu hiện sự đa kháng thuốc Các nghiên cứu trên cho thấy việc sử dụng kháng sinh tuy vẫn đang là phương pháp phổ biến trong điều trị bệnh gan thận mủ nhưng đây không phải là giải pháp lâu dài Vì vậy việc tìm một liệu pháp điều trị thay thế kháng sinh đang ngày càng trở nên cấp bách hiện nay

1.5.2 Sử dụng vaccine

Nhiều nghiên cứu cho thấy triển vọng sản xuất ra được vaccine cho bệnh

gan th ận mủ trên cá Tra là khả thi Viện NCNTTS II kết hợp với NAVETCO đã

thịt cá, áp dụng kỹ thuật kháng nguyên bất hoạt toàn bộ tế bào bằng formaline của chủng vi khuẩn Edw.ictaluri để làm kháng nguyên chế tạo vaccine và tìm ra được

được tiêm vaccine có tỉ lệ sống tương đối (Relative Percent Survival) sau ngày 21 đạt 96,7% Cchủng ngừa bằng cách kết hợp phương pháp ngâm/cho ăn để gây miễn

dịch ban đầu và cho ăn tăng cường cho kết quả bảo hộ tương đối tốt khi cá bị nhiễm

vi khuẩn Edw.ictaluri Lặp lại việc cho ăn tăng cường có thể sẽ là một phương pháp

tác nhân gây bệnh có độc lực cao (Nguyễn Mạnh Thắng, 2009) Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa có một sản phẩm vaccine cụ thể phòng bệnh có mặt trên thị trường Việt Nam Ngoài ra, phương pháp tăng khả năng kháng bệnh cho cá bằng vaccine có một

thời mà không di truyền được cho đời sau

1.6 Thực khuẩn thể (bacteriophage)

1.6.1 Lịch sử phát hiện phát hiện thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể là những thể phong phú nhất trên trái đất, thực khuẩn thể là một phần quan trọng góp phần ổn định quần thể vi sinh vật, chúng cũng rất linh hoạt và có khả năng thích nghi với rất nhiều ứng dụng Thực khuẩn thể là loại virus xâm nhiễm vi khuẩn, sự sao chép của chúng phụ thuộc vào việc sử dụng các vật liệu

di truyền từ tế bào vi khuẩn bị xâm nhiễm Thực khuẩn thể được phát hiện một cách độc lập bởi Frederick Twort năm 1915 và Félix d'Herelle năm 1917 (Irshad Ul Haq

và cs, 2012) Twort đã quan sát thấy xuất hiện các khuẩn lạc trong suốt phát triển trên bề mặt nuôi cấy vi khuẩn Khi chuyển các khuẩn lạc trong suốt sang bề mặt vi khuẩn mới cũng tạo ra các khuẩn lạc trong suốt tương tự Sau khi kiểm tra vi khuẩn

từ các khuẩn lạc trong suốt, Twort nhận thấy rằng vi khuẩn đã phân hủy thành những mảnh nhỏ và ông đã đưa ra giả thuyết rằng các virus truyền nhiễm nhỏ hơn

vi khuẩn đã gây ra sự phân hủy vi khuẩn (Summers, 2005) D'Herelle quan sát thấy những gì mà ông gọi là "bacteriophage" đã gây ra sự ly giải, hoặc vỡ vi khuẩn trong chất lỏng cũng như trong các đốm rõ ràng trên thạch, ông cho rằng bacteriophage là

ký sinh trùng của vi khuẩn Các nghiên cứu của ông cũng cho thấy rằng các tế bào bacteriophage cần các tế bào chủ (vi khuẩn) để tăng sinh Sáng chế của kính hiển vi điện tử trong những năm 1940 cho phép các nhà khoa học quan sát các vi khuẩn và quan hệ giữa các thực khuẩn thể và vi khuẩn, chứng minh rằng các loài thực khuẩn thể có các hình thái khác nhau và các tế bào thực khuẩn thể chứa DNA Năm 1952, Hershey và Chase cho thấy rằng khi một tế bào chủ gắn vào một tế bào chủ, DNA

của nó sẽ được tiêm vào tế bào và lớp protein của chúng không vào tế bào chủ (Summers, 2005)

Hình 1.5 Thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn (news-medical.net)

1.6.2 Phân loại thực khuẩn thể

Dựa vào kiểu gen và hình thái, Ủy ban quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of Viruses hay ICTV) đã xếp thực khuẩn thể vào 10 họ

Bảng 1.4 Bảng phân loại thực khuẩn thể (talk.ictvonline.org)

Họ Hình thái vỏ

capsid

1.6.3 Cơ chế xâm nhiễm của thực khuẩn thể lên vi khuẩn:

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm thực khuẩn thể lên vi khuẩn

(Shigenobu Matsuzaki và cs, 2005)

Hình trên minh họa cơ chế chung của quá trình thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn Bước đầu tiên là liên kết với các thụ thể, thường là một protein hoặc đường trên bề mặt vi khuẩn Sau khi liên kết, DNA thực khuẩn thể được tiêm vào tế bào chất của vi khuẩn và được nhân lên, tổ hợp nhiều ban sao DNA cùng các phần khác của thực khuẩn thể bằng cách sử dụng vật liệu di truyền từ tế bào chủ Sau đó DNA được đưa vào vỏ capsid và gắn đuôi thành một thực khuẩn thể hoàn chỉnh Cuối cùng, thực khuẩn thể thế hệ con cháu được phóng thích bởi hoạt động phối hợp của

2 loại protein là holin và endolysin được mã hóa bởi bộ gen thực khuẩn thể (endolysin là một enzyme thủy phân vách peptidoglycan, protein holin tạo một lỗ hổng trong màng tế bào cho phép endolysin tiếp xúc với vách peptidoglycan) (Shigenobu Matsuzaki và cs, 2005) Các bước cụ thể của một chu kỳ xâm nhiễm như sau:

Hấp phụ (adsorption): Thực khuẩn thể bám trên bề mặt tế bào vi khuẩn qua

các receptor đặc hiệu Người ta nhận thấy trên bề mặt vi khuẩn có khoảng 300 điểm hấp phụ, và các thực khuẩn thể khác nhau có các vị trí khác nhau về điểm hấp phụ Một số thực khuẩn thể có thể bám trên tiêm mao hay pili của vi khuẩn

Xâm nhập (penetration): Sau khi hấp phụ, phần đuôi thực khuẩn thể co lại

còn một nửa chiều dài và đâm ống đuôi qua thành tế bào và màng tế bào chất Enzyme lysozyme tiết ra từ đuôi phá hủy thành tế bào vi khuẩn DNA của thực khuẩn thể được bơm vào nguyên sinh chất tế bào vi khuẩn, bỏ lại vỏ capsid ngoài thành tế bào Nếu có từ 2 thực khuẩn thể khác nhau trở lên xâm nhập vào cùng một

tế bào vi khuẩn thì chỉ có một thực khuẩn thể được nhân lên

Tổng hợp (synthesis): Bộ máy di truyền thực khuẩn thể rất nhỏ để chúng có

thể tự tổng hợp Vì vậy, khi đã xâm nhập vào tế bào chủ, bằng nhiều cách khác nhau, chúng kiểm soát bộ máy trao đổi chất của tế bào chủ nhằm sản xuất các vật liệu để tổng hợp thực khuẩn thể mới DNA và các protein của thực khuẩn thể được tổng hợp

Trưởng thành (maturation): Đây là quá trình các phần tử của thực khuẩn

thể hợp nhất, tạo thành thực khuẩn thể hoàn chỉnh

Phóng thích (release): Enzyme lysozome mã hóa bởi DNA thực khuẩn thể

phá hủy thành tế bào, cho phép các thực khuẩn thể được giải phóng Tế bào vi khuẩn lúc này bị phá vỡ Những thực khuẩn thể có vỏ, quá trình phóng thích là một phần của quá trình lắp ráp cuối cùng Chúng được giải phóng theo cơ chế xuất bào nên không làm ảnh hưởng tế bào chủ

1.6.4 Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh trên thủy sản

Liệu pháp thực khuẩn thể là việc sử dụng thực khuẩn thể để điều trị bệnh do

vi khuẩn Liệu pháp thực khuẩn thể có nhiều ứng dụng tiềm năng trong y học con người cũng như trong thú y và nông nghiệp Chỉ số điều trị của phương pháp thực khuẩn thể rất cao vì ít có tác dụng phụ So với việc sử dụng liệu pháp kháng sinh, liệu pháp thực khuẩn thể có nhiều ưu điểm (Richards GP, 2014):

(1) Tính đặc hiệu, thực khuẩn thể tấn công một cách đặc hiệu cao với từng loài, thậm chí từng chủng vi khuẩn riêng biệt, giúp giảm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong ruột cá cũng như các vi khuẩn tự nhiên không phải chủng đích

(2) Hạn chế sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Việc phân lập được các chủng thực khuẩn thể mới trong tự nhiên dễ thực hiện hơn việc điều chế một loại kháng sinh mới bởi mối quan hệ mật thiết của chúng với vi khuẩn đích Có thể sử

dụng hỗn hợp thực khuẩn thể khác nhau tránh sự phát sinh của một chủng vi khuẩn đột biến trong suốt quá trình điều trị bằng thực khuẩn thể

(3) Một ưu điểm khác của thực khuẩn thể so với kháng sinh là chúng có thể

tự nhân lên, cũng như tự hạn chế số lượng Chúng nhân lên nhanh chóng theo cấp

số mũ như vi khuẩn và giảm dần khi lượng vi khuẩn giảm Tùy trường hợp điều trị đôi khi chỉ cần dùng 1 liều nhỏ ban đầu, chúng sẽ nhân lên thông qua các tế bào vi khuẩn mà không cần tiêm nhắc lại

(4) Bởi thực khuẩn thể có nguồn gốc tự nhiên, rất đa dạng và phong phú nên hạn chế đáng kể khó khăn trong việc phê chuẩn và cấp giấy phép sử dụng so với kháng sinh

(5) Khả năng chống chịu cao của thực khuẩn thể với điều kiện môi trường khác nhau Thực khuẩn thể được tìm thấy trong môi trường có sự hiện diện của vi khuẩn đích, kể cả những nơi có điều kiện khắc nhiệt như nhiệt độ cao, hay môi trường có tính acid cao Ngoài ra, khả năng thích nghi của chúng còn cao hơn vi khuẩn

(6) Thực khuẩn thể giảm dần sau khi tiêu diệt chủng vi khuẩn đích, và được thải ra ngoài môi trường mà không gây bất kì rủi ro nào

qua quá trình lây nhiễm vào các tế bào vi khuẩn đặc hiệu chỉ trong vài giờ, và không cần sử dụng hóa chất đắt tiền

Liệu pháp thực khuẩn thể đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong phòng

và điều trị bệnh trên thủy sản do nhiều loại vi khuẩn gây ra Bảng 1.5 dưới đây là một số các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể:

Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trên bệnh thủy sản (Richards GP, 2014)

Vi khuẩn Tên bệnh thủy sản Thủy sản được

khảo sát

Hiệu quả điều trị

Tác giả

Aeromonas

hydrophila

Bệnh xuất huyết (Hemorrhagicsepticemia)

Thối đuôi-thối vảy (tail and fin rot) Bệnh đỏ vảy (red-fin disease)

Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus)

Cá hồi chấm hồng

(Salvelinus fontinalis)

Cá hồi cầu vồng

(Oncorhynchus mykiss)

Cá hồi Đại Tây

Dương (Salmo salar)

Cá chạch (Misgurnus anguillicaudatus)

Có Wu và cs (1981)

Flavobacterium

columnare

Bệnh Columnaris (Columnaris disease)

Cá trê trắng (Clarias batrachus)

Có

Prasad và cs (2011)

Flavobacterium

psychrophilum

Bệnh lở loét trên cá hồi vân (Rainbow trout fry syndrome)

quinqueradiata)

Pseudomonas

aeruginosa

Bệnh tổn loét da (Ulcerative lesions on skin)

Cá bơn Nhật Bản

(Paralichthys olivaceus)

Có Vinod và cs (2006)

Karunasagar và cs (2007)

Nghiên cứu ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và trị bệnh gan thận mủ trên cá tra:

Năm 1979, Hawke và cộng sự đã có những phân tích đầu tiên về nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra ở Đồng bằng Sông Cửu Long Nghiên cứu đã

xác định bệnh do vi khuẩn Edw.ictaluri gây ra, đồng thời cũng có những xác định

trị bệnh trong giai đoạn sớm với kháng sinh Teramycin với kết quả khá tốt

Những năm gần đây, với sự phát triển của nghề nuôi cá tra ngày càng cao Các dịch bệnh trên cá được nghiên cứu ngày càng nhiều hơn và nhất là bệnh gan thận mủ, một bệnh nguy hiểm với tỉ lệ chết rất cao Các thông tin tổng quan về định loại cá tra phân bố ở khu vực hạ lưu sông Mê Kông cùng rất nhiều thông tin chi tiết

về cấu tạo cá tra đã được thực hiện bởi Nguyễn Văn Thường (2008) Các phương

pháp phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Edw.ictaluri như PCR, LAMP cũng

được nghiên cứu và phát triển bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2010), Trần Nguyễn Diễm Tú và cs (2012), Trần Thị Thanh Huyền và cs (2010)

Các nghiên cứu về phương pháp điều trị bệnh trên cá tra cũng rất được chú trọng, Đặng Thị Hoàng Oanh và cs (2012) đã thử nghiệm điều trị bệnh gan thận mủ

do Edw.ictaluri với kháng sinh Erythromycin thiocyanate với kết quả khả quan Tuy

nhiên, tình trạng kháng kháng sinh ngày càng tăng ở vi khuẩn này, có nhiều nghiên

cứu cho thấy khả năng kháng của nhiều chủng vi khuẩn Edw.ictaluri với những loại

kháng sinh đang được sử dụng phổ biến hiện nay, và một số chủng có khả năng kháng đa kháng sinh (Quách văn Cao Thi và cs, 2014; Từ Thanh Dung và cs 2004,2008; Nguyễn Thiện Nam,2010) Vì vậy, việc tìm ra những phương pháp phòng và trị bệnh hiệu quả hơn cần được nghiên cứu Một số chủng vi khuẩn probiotic có đặc tính tốt như Lactobacillus cũng được nghiên cứu trong những năm

gần đây trong việc ức chế vi khuẩn Edw.ictaluri cũng đã được nghiên cứu bởi

Nguyễn Văn Thành và cs (2012) Nhưng phương pháp này có ý nghĩa phòng bệnh nhiều hơn chữa bệnh Một nghiên cứu gần đây nhằm xác định khả năng sinh kháng

thể đặc hiệu của cá tra cảm nhiễm Edw.ictaluri nhược độc đã được thực hiện, kết quả cho thấy cá tra trong điều kiện thí nghiệm khi ngâm Edw.ictaluri nhược độc

Kết quả này hứa hẹn sẽ có thể tạo được vaccine phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh và cs, 2014) Đây sẽ là tiền đề hứa hẹn cho các nghiên cứu tiếp theo ứng dụng phương pháp thực khuẩn thể trong điều trị bệnh do vi khuẩn

Edw.ictaluri

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

- Chủng vi khuẩn

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhận từ trường ĐH Cần Thơ, TP.Cần Thơ

- Mẫu gan-thận cá tra tại các ao nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

2.1.1 Hóa chất và môi trường

- Môi trường LB

- Môi trường TSB (Tryptone Soya Broth)

- Đệm SM 2% gelatin

- PBS 20% glycerol

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Tăng sinh và phân lập thực khuẩn thể

Tạo Stock thực khuẩn thể

Khảo sát hoạt tính xâm nhiễm

Khảo sát khả năng ức chế

Khảo sát khả năng

ức chế Edw.ictaluri

trên mô hình môi trường nước ao

2.2.2 Tăng sinh và phân lập thực khuẩn thể

Thực khuẩn thể trong mẫu gan-thận (nếu có) được tăng sinh bằng cách bổ sung vi khuẩn đích và môi trường TSB Sau đó, sử dụng phương pháp Plaque Assay

để phát hiện sự có mặt của thực khuẩn thể trong mẫu

Phương pháp Plaque assay: Plaque assay là một kỹ thuật rất hữu ích được

sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực khuẩn thể Ví dụ như để phân lập, tinh sạch, định lượng thực khuẩn thể…Trong kỹ thuật này, thực khuẩn thể phân tán đều trong một vùng tế bào vi khuẩn phát triển trên một lớp môi trường mỏng và mềm Các vòng trong được tạo ra do sự xâm nhiễm và phá vỡ tế bào vi khuẩn của các thực khuẩn thể Mỗi vòng trong là tập hợp các thực khuẩn thể tăng sinh từ một thực khuẩn thể ban đầu (D Lillehaug, 1997)

Thí nghiệm phân lập thực khuẩn thể dựa trên kỹ thuật Plaque assay được thực hiện như sau:

Tăng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong 100mL môi trường TSB

Bổ sung mẫu gan-thận (được nghiền nhỏ) vào dịch khuẩn Edwardsiella

ictaluri, lắc qua đêm tại 300C, 150 rpm

Hút 1,5mL dịch tăng sinh cho vào eppendorf, ly tâm lạnh (10000 rpm trong 5

Thực hiện Plaque Assay với dịch lọc: Hút 100 μL dịch lọc và 200 μL vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri nuôi qua đêm vào ống nghiệm chứa môi trường BHI

Kiểm tra sự hiện diện các vòng sinh tan trên đĩa thạch

Với mỗi mẫu có xuất hiện vòng sinh tan, chọn một dòng thực khuẩn thể cho vòng sinh tan trong và có kích thước lớn để tiến hành tinh sạch

Tinh sạch thực khuẩn thể

Với mỗi mẫu có sự hiện diện của thực khuẩn thể, ta lựa chọn thực khuẩn thể tạo vòng sinh tan trong, có đường kính lớn và tách rời

Ủ qua đêm trong dung dịch đệm SM, tiến hành ly tâm trong máy ly tâm lạnh

hợp Quá trình trên được lặp lại 3 lần để thu được các thực khuẩn thể hoàn toàn tinh sạch

2.2.3 Tạo stock

Sau quá trình tinh sạch thực khuẩn thể, ta thực hiện Plaque Assay với dịch

Chọn đĩa có mật độ vòng sinh tan cao, bổ sung 2.5mL đệm SM ủ qua đêm ở

Phần thạch TSB (0,5% agar) được làm nhuyễn và đồng nhất với 2 ml đệm

đó ly tâm tại 10.000 rpm trong 5 phút và thu phần dịch nổi Lọc dịch nổi với màng

Kiểm tra nồng độ thực khuẩn thể trong dịch thu được Stock có nồng độ

2.2.4 Khảo sát chu kỳ xâm nhiễm (latent period) và hệ số nhân (burst size)

Chu kỳ xâm nhiễm (latent period): là khoảng thời gian được tính từ khi

thực khuẩn thể bắt đầu xâm nhiễm vào vi khuẩn đến khi tế bào bị ly giải và phage giải phóng ra ngoài Đối với từng thực khuẩn thể khác nhau sẽ có thời gian chu kỳ xâm nhiễm là đặc trưng không đổi Thời gian chu kỳ xâm nhiễm có thể được xác định dựa vào sự giải phóng các thực khuẩn thể sau mỗi chu kỳ (Hyman P và

cs ,2009)

Hệ số nhân (burst size): là tỉ số lượng thực khuẩn thể được giải phóng với

lượng thực khuẩn thể xâm nhiễm ban đầu thể hiện hoạt tính xâm nhiễm của từng thực khuẩn thể Hệ số nhân được xác định tại thời điểm có sự gia tăng đột biến thực khuẩn thể trong thời gian ngắn (Hyman P và cs, 2009)