Khảo sát ảnh hưởng của đường và amino acid lên sự sinh tổng hợp glucosinolate của rễ bất định cây bông cải xanh (brassica oleracea l var italica)

--- HUỲNH THỊ KIM KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ðƯỜNG VÀ AMINO ACID LÊN SỰ SINH TỔNG HỢP GLUCOSINOLATE CỦA RỄ BẤT ðỊNH CÂY BÔNG CẢI XANH Brassica oleracea L... TÊN ðỀ TÀI: Khảo sát ảnh hưởng

-

HUỲNH THỊ KIM

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ðƯỜNG VÀ AMINO ACID LÊN SỰ SINH TỔNG HỢP GLUCOSINOLATE

CỦA RỄ BẤT ðỊNH CÂY BÔNG CẢI XANH

(Brassica oleracea L var italica)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ NGÀNH : 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2013

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ tại Trường ðại Học Bách Khoa, ðHQG Tp.HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội ñồng ñánh giá Luận văn thạc sĩ gồm: (ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội ñồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội ñồng ñánh giá LV và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn ñã ñược sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG TRƯỞNG KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: HUỲNH THỊ KIM MSHV: 11310611

Ngày, tháng, năm sinh: 18 – 03 – 1986 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.80

I TÊN ðỀ TÀI: Khảo sát ảnh hưởng của ñường và amino acid lên sự sinh tổng hợp

glucosinolate của rễ bất ñịnh cây bông cải xanh (Brassica oleracea L var italica)

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nâng cao hàm lượng glucosinolate của rễ bất ñịnh

cây bông cải xanh (Brassica oleracea L var italica) bằng cách khảo sát ảnh hưởng

của nguồn carbon, tiền chất hữu cơ, và tác nhân cảm ứng

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19 – 08 – 2013

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 22 – 11 – 2013

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN

Trong quá trình học tập tại trường ðại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh và hoàn thành luận văn thạc sĩ, tôi ñã nhận ñược nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ chân thành

Lời ñầu tiên tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên, cô ñã tận tình hướng dẫn, ñịnh hướng, sửa chữa, góp ý và ñộng viên tinh thần ñể tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn ñến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, cô ñã tận tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian học cao học, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện tốt nhất ñể tôi hoàn thành luận văn

Cám ơn các cô quản lí phòng thí nghiệm ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi sử dụng cơ sở vật chất, máy móc thiết bị trong các phòng thí nghiệm của bộ môn Cám ơn chị Nga, chị Thủy, anh Bình, anh Nhựt ñã giúp ñỡ tôi và ñộng viên tinh thần ñể tôi vượt qua khó khăn

Cám ơn bạn Dân, Phúc, các em Duy, Trung, Văn, Vân, Thiện, Nhã ñã giúp

ñỡ tôi hết mình và ñồng hành cùng tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Cám ơn ba mẹ và anh chị ñã luôn bên cạnh tôi, ủng hộ và ñộng viên tinh thần giúp tôi vượt qua những khó khăn Gia ñình mãi luôn là chỗ dựa và là ñộng lực ñể cho tôi phấn ñấu và trưởng thành

Cuối cùng tôi xin chân thành cám ơn và gửi lời chúc sức khỏe, thành công

và hạnh phúc ñến tất cả mọi người

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013

Huỳnh Thị Kim

ngày tuổi ñược sử dụng làm nguyên liệu tạo rễ bất ñịnh trên môi trường MS bổ sung saccharose 30 g/l, agar 7 g/l và IBA nồng ñộ thay ñổi 1,4; 1,6; 1,8 và 2,0 mg/l Kết quả cho thấy trên môi trường có IBA 1,6 mg/l rễ bất ñịnh hình thành và tăng sinh tốt nhất từ mẫu cấy tử diệp với tỉ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,40%) và không có sự hình thành mô sẹo Rễ bất ñịnh từ tử diệp ñược chuyển sang nuôi cấy trong môi trường lỏng với thành phần tương tự như môi trường tạo rễ Trong môi trường lỏng, rễ bất ñịnh tăng sinh tốt nhất với trọng lượng rễ khởi ñầu 1,2 g/30 ml môi trường nuôi cấy, chỉ số tăng trưởng của rễ và hàm lượng glucosinolate cao nhất ở tuần thứ 3 lần lượt là 3,998 và 0,617 µmol/g Sự kết hợp saccharose với glucose, saccharose với fructose trong môi trường nuôi cấy ñã thúc ñẩy tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh (tổ hợp ñường có hiệu quả cao nhất là saccharose 30 g/l kết hợp glucose 10 g/l) Trong số các amino acid (cystein, phenylalanin, methionin, tyrosin

và tryptophan) ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp glucosinolate, chỉ có phenylalanin nồng ñộ 40 mg/l có hiệu quả tốt nhất trong mục ñích này Sự cảm ứng bằng sorbitol và sự thiếu hụt nước và dinh dưỡng ñều làm tăng sự sinh tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh cao gần 3 lần so với ñối chứng

were used as explant for to obtain adventitious rooting on MS medium supplement with sucrose 30 g/l, 7 g/l agar and concentration IBA of different (1.4; 1.6; 1.8 and 2.0 mg/l) Results indicating that on medium with IBA 1.6 mg/l adventitious roots from cotyledons initiated and proliferated the best with the highest ratio (98.40%) and without callus initiation Adventitious roots from cotyledons were moved in the liquid medium with the same components as rooting medium The highest proliferation of adventitious roots were found in liquid medium containing 1.2 g roots in fresh weight in 30 ml MS medium, growth and glucosinolate concentration

of roots was highest at the third week respectively 3.998 and 0.617 µmol/g The combination sucrose with glucose, sucrose with fructose in medium promoted proliferation and glucosinolates synthesis of adventitious roots (the combinations was sucrose 30 g/l and glucose 10 g/l) The amino acids (cysteine, phenylalanine, methionine, tyrosine and tryptophane) were supplemented in medium to increased glucosinolate biosynthesis Phenylalanine 40 mg/l was the best factor for this purpose Induction by sorbitol and shortages of water and nutrients were increased glucosinolates biosythesis was 3 times higher than controls

trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong công trình nào khác

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC ẢNH iv

CHƯƠNG 1 MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây bông cải xanh 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 3

2.1.3 ðặc ñiểm hình thái 4

2.1.4 Thành phần hóa học 5

2.1.5 Công dụng của bông cải xanh 7

2.1.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 7

2.2 Giới thiệu về glucosinolate 9

2.2.1 Sự phân bố glucosinolate trong thực vật 9

2.2.2 Glucosinolate và cấu trúc hóa học 11

2.2.3 Phân loại glucosinolate 12

2.2.4 Sinh tổng hợp glucosinolate 14

2.2.5 Thủy phân glucosinolate 16

2.2.6 Vai trò của glucosinolate thông qua các isothiocyanate 16

2.2.6.1 Ngăn chặn ung thư 16

2.2.6.2 Bảo toàn chu trình tế bào 17

2.2.6.3 Kháng viêm 17

2.2.6.4 Kháng Helicobacter pylori 18

2.3 Ứng dụng 18

2.4.3 Nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận HCTC 20 2.4.4 Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC trong nuôi cấy rễ bất ñịnh 23

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu 25 3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Tạo cây mầm in vitro 27

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ IBA và nguồn gốc mẫu cấy lên sự tạo

rễ bất ñịnh 28 3.2.3 Khảo sát sự tăng sinh và tổng hợp GLS của rễ bất ñịnh trong môi trường lỏng 29

3.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của trọng lượng rễ ban ñầu ñến sự tăng sinh của rễ bất ñịnh 29 3.2.3.2 Khảo sát sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh theo thời gian 30 3.2.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon và amino acid lên sự tăng sinh

và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh 30 3.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và glucose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 30 3.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và fructose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 31 3.2.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các amino acid lên sự sinh tổng hợp

glucosinolate 32 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol ñến khả năng sinh tổng hợp

glucosinolate 32 3.2.6 Ảnh hưởng của ñiều kiện thiếu nước và dinh dưỡng lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 32 3.2.7 Trích ly và ñịnh lượng glucosinolate 33 3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

4.1.2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ IBA và nguồn gốc mẫu cấy lên sự tạo rễ bất

ñịnh 38

4.1.3 Sự nuôi cấy rễ bất ñịnh trong môi trường lỏng 40

4.1.3.1 Ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi ñầu ñến sự tăng sinh của rễ bất ñịnh 41

4.1.3.2 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh theo thời gian42 4.1.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 43

4.1.4.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và glucose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 43

4.1.4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và fructose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 44

4.1.4.3 Ảnh hưởng của cystein lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 45

4.1.4.4 Ảnh hưởng của phenylalanin lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 45

4.1.4.5 Ảnh hưởng của methionin lên quá trình sinh tổng hợp GLS 46

4.1.4.6 Ảnh hưởng của tyrosin lên quá trình sinh tổng hợp glucosinolate 47

4.1.4.7 Ảnh hưởng của tryptophan lên quá trình sinh tổng hợp GLS 48

4.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 49

4.1.5.1 Ảnh hưởng của sự hạn chế về nước và dinh dưỡng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh 50

4.2 Thảo luận 51

4.2.1 Ảnh hưởng của auxin lên sự tạo rễ bất ñịnh 51

4.2.2 Về sự tăng sinh của rễ trong môi trường lỏng 52

4.2.3 Ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi ñầu ñến sự tăng sinh của rễ 52

4.2.4 Vai trò của ñường trong sự tăng sinh và tổng hợp GLS của rễ bất ñịnh53 4.2.5 Ảnh hưởng của các amino acid 54

4.2.6 Ảnh hưởng của ñiều kiện thiếu nước và dinh dưỡng lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 56

5.2 Kiến nghị 58

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ATIC Allyl isothiocyanate

BAP (BA) 6-benzylaminopurine (benzyladenime)

BDT 1,3-benzodithiole-2-thione

BITC Benzyl isothiocyanate

CðHSTTV Chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

NAA 1-naphthalene acetic acid

PEITC Phenethyl isothiocyanate

UGT UDP-glucuronosyl transferase

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong bông cải xanh tươi 6

Bảng 2.2 Một số thực vật chứa glucosinolate 9

Bảng 2.3 Hàm lượng glucosinolate ở một số loài Brassica 12

Bảng 2.4 Cấu trúc và phân loại một số glucosinolate 13

Bảng 2.5 Glucosinolate và các isothiocyante tương ứng 16

Bảng3.1 Các nghiệm thức khác nhau về ảnh hưởng của trọng lượng rễ ban ñầu ñến sự tăng sinh của rễ bất ñịnh 29

Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và glucose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 31

Bảng3.3 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và fructose lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất ñịnh 31

Bảng 4.1 Kết quả sự tạo cây mầm bông cải xanh 37

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ IBA và nguồn gốc mẫu cấy lên sự hình thành rễ bất ñịnh 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của sorbitol lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolatecủa rễ bất ñịnh sau 3 tuần nuôi cấy 49

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của sự hạn chế nước và dinh dưỡng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của glucosinolate 11

Hình 2.2 Các giai ñoạn trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate 15

Hình 2.4 Cơ chế ngăn chặn ung thư của glucosinolate 18

Hình 3.1 Sơ ñồ nghiên cứu chung 26

Hình 3.2 Sơ ñồ tạo cây mầm bông cải xanh 27

Hình 3.3 Phản ứng ngưng tụ vòng giữa isothiocyanate và 1,2-benzenedithiol 33

Hình 3.4 Sơ ñồ quy trình thủy phân glucosinolate thành isothiocyanate 34

Hình 3.5 Sơ ñồ quy trình phản ứng ñịnh lượng isothicyanate 35

Hình 4.3 Ảnh hưởng trọng lượng rễ khởi ñầu lên sự tăng sinh của rễ bất ñịnh sau 3 tuần nuôi cấy 41

Hình 4.4 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh qua 4 tuần nuôi cấy 42

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ saccharose và glucose lên sự tích lũy glucosinolate của rễ bất ñịnh 43

Hình 4.7 Ảnh hưởng của cystein lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 45

Hình 4.8 Ảnh hưởng của phenylalanin lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 46

Hình4.9 Ảnh hưởng của methionin lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 47

Hình 4.10 Ảnh hưởng của tyrosin lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñinh bông cải xanh 48

Hình 4.11 Ảnh hưởng của tryptophan lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 49

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 2.1 Cây bông cải xanh 3

Ảnh 2.2 Hoa cây bông cải xanh 4

Ảnh 2.3 Sản phẩm glucosinolate trên thị trường 19

Ảnh 2.4 Quy trình nuôi cấy rễ bất ñịnh Echinace purpurea 21

Ảnh 3.1 Hạt giống bông cải xanh Brassica oleracea L var italica 25

Ảnh 3.2 Hạt giống củ cải trắng Raphanus sativus 25

Ảnh 4.1 Cây mầm bông cải xanh in vitro 7 ngày tuổi 37

Ảnh 4.2 Rễ bất ñịnh hình thành từ các mẫu cấy khác nhau sau 2 tuần nuôi cấy 38

Ảnh 4.3 Rễ bất ñịnh từ tử diệp ñược nuôi trong môi trường MS lỏng có bổ sung IBA 1.6 mg/l 40

Ảnh 4.4 Sự tăng sinh của rễ bất ñịnh sau 3 tuần nuôi cấyvới các trọng lượng rễ khởi ñầu khác nhau 42

Ảnh 4.5 Ảnh hưởng của sorbitol lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh 50

CHƯƠNG 1

MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Thực vật là nguồn cung cấp rất nhiều hợp chất giá trị cao ñược sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm và bảo vệ thực vật [63] Việc thu nhận các hợp chất này trong tự nhiên gặp nhiều khó khăn và phụ thuộc nhiều yếu tố (thời tiết, thổ nhưỡng…) Hợp chất thứ cấp (HCTC) thường bị giới hạn theo từng loài, chi thực vật, có thể chỉ sinh ra trong một giai ñoạn tăng trưởng và phát triển nhất ñịnh hoặc theo từng mùa, khi thực vật bị stress hay phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng cung cấp

Chính vì những nguyên nhân ñó, từ những thập niên trước, nhiều nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật ñể thu nhận hợp chất thứ cấp ñã ñược tiến hành [42, 49] Tuy nhiên, năng suất thu ñược còn thấp mặc dù ñã có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường tăng sinh và tổng hợp hợp chất thứ cấp của tế bào cũng như chọn lựa các dòng tế bào có khả năng sản xuất cao nhất Nguyên nhân có thể do quá trình sinh tổng hợp HCTC chịu ảnh hưởng bởi kiểu phân hóa của tế bào, mức ñộ phân hóa của tế bào dẫn ñến khả năng sản xuất hợp chất thứ cấp không ổn ñịnh Chính vì vậy, việc nuôi cấy rễ, phôi và chồi ñược tập trung nghiên cứu như một phương pháp

có thể thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào nhằm sản xuất hợp chất thứ cấp [42]

Rễ bất ñịnh nuôi cấy in vitro có khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp cao

và hoạt tính khá ổn ñịnh [22] Rễ bất ñịnh có thể phát triển mạnh trên môi trường bổ sung hormone thực vật và tích lũy lượng lớn các hợp chất thứ cấp có giá trị Ngày nay, việc mở rộng quy mô nuôi cấy rễ bất ñịnh trong các thiết bị phản ứng sinh học (bioreactor) thể tích lớn cho thấy khả năng sản xuất HCTC trên quy mô công nghiệp

là hoàn toàn khả thi [38]

Bông cải xanh (Brassica oleracea L var italica) ñược xem như một loại

thực phẩm chức năng vì là nguồn cung cấp dồi dào vitamin, chất xơ và giàu chất chống oxy hóa ðặc biệt là glucosinolate - tiền chất của isothiocyanate – là những hợp chất có khả năng phòng chống ung thư mạnh

Bông cải xanh là món ăn ưa thích, tuy nhiên khi ñược chế biến ở nhiệt ñộ cao, vitamin và nhóm các chất có tác dụng ngăn ngừa ung thư bị giảm hoặc mất hoàn toàn

Chính vì vậy việc khảo sát ảnh hưởng của ñường và amino acid lên sự sinh

tổng hợp glucosinolate của rễ bất ñịnh bông cải xanh (Brassica oleracea L var

italica) là cần thiết ñể tạo nguồn nguyên liệu lớn và ổn ñịnh có chứa glucosinolate sẵn sàng cung cấp cho ngành dược phẩm

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nâng cao hàm lượng glucosinolate của rễ bất ñịnh Brassica oleracea L var

italica bằng cách sử dụng phương pháp thay ñổi nguồn cung cấp carbon, bổ sung tiền chất hữu cơ và tác nhân cảm ứng

1.3 Nội dung nghiên cứu

• Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng ñộ IBA và nguồn gốc mẫu cấy lên sự tạo rễ bất ñịnh

• Khảo sát ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi ñầu ñến sự tăng sinh của rễ bất ñịnh trong môi trường lỏng

• Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cung cấp carbon lên sự sinh tổng hợp glucosinolate ở rễ bất ñịnh

• Khảo sát ảnh hưởng của các amino acid lên khả năng tổng hợp glucosinolate

ở rễ bất ñịnh

• Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol và ñiều kiện thiếu nước và dinh dưỡng lên khả năng tổng hợp glucosinolate ở rễ bất ñịnh

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây bông cải xanh

2.1.1 Phân loại

Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Hạt kín) Lớp : Magnoliosida (Hai lá mầm)

năm Từ thời ựế chế La Mã, bông cải xanh ựã ựược xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và cho ựến nay vẫn thường có mặt trong các món ăn Ý Bông cải xanh ựược du nhập sang Mỹ bởi những người di cư và trở nên phổ biến từ những

năm 1920 [63] Từ broccoli ựược dịch ra từ tiếng Latin brachium, có nghĩa là cành

hoặc cánh tay, giống như hình dạng của cây bông cải xanh [62]

Ngày nay, bông cải xanh ựược trồng khắp nơi trên thế giới, ựiển hình như ở Trung Quốc, Ấn độ, Pakistan, Mỹ, Mexico, Ý, Tây Ban Nha, Anh, Pháp, Ba Lan [63]

Bông cải xanh thắch hợp với nơi có khắ hậu mát, nhiệt ựộ thắch hợp từ 18 Ờ

230C Tại Việt Nam, bông cải xanh ựược trồng nhiều ở các vùng cao nguyên như

đà Lạt Ờ Lâm đồng, ở miền Bắc thì thường trồng vào mùa đông

Ảnh 2.2 Hoa cây bông cải xanh [24]

Thân bông cải xanh thường không chia nhánh Từ thân phát sinh ra lá và những ñầu hoa

Cây bông cải xanh có một rễ cái và nhiều rễ bên khi cây ở giai ñoạn mầm, trong quá trình chuyển cây ra ñồng, rễ cái bị tổn thương dẫn ñến việc phát sinh nhiều rễ bất ñịnh Rễ mọc tương ñối nông vào lúc ñầu và rễ bên phát triển theo chiều ngang Các rễ này có thể lan rộng gần 1 m Sau vài tháng, một số rễ sẽ ñâm thẳng xuống ñất tới các tầng ñất sâu hơn

2.1.4 Thành phần hóa học

Bông cải xanh chứa nhiều loại vitamin thiết yếu như vitamin C, K và A, ñồng thời cũng là loại thực phẩm giàu chất xơ Bông cải xanh có hàm lượng carotenoid cao nhất trong chi Brassica, ñặc biệt giàu lutein và β-carotene (bảng 2.1) [63]

Bông cải xanh còn chứa nhiều chất dinh dưỡng với tiềm năng chống ung thư như diindolylmethane và selenium [60]

3,3’-diindolylmethane trong bông cải xanh có khả năng ñiều khiển hệ thống ñáp ứng miễn dịch chống lại virus, vi khuẩn và bệnh ung thư[59]

Bông cải xanh còn chứa các hợp chất glucoraphanin (thuộc nhóm chất glucosinolate), có thể chuyển hóa thành sulforaphane – một hợp chất chống ung thư

và indole-3-carbinol, một chất hóa học góp phần vào quá trình sửa sai DNA trong các tế bào và ngăn chặn sự tăng trưởng của tế bào ung thư Tuy nhiên, những hợp chất có giá trị này của bông cải xanh sẽ giảm ñi rất nhiều qua quá trình chế biến do ảnh hưởng của nhiệt ñộ, áp suất cao [16, 46]

B ảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong bông cải xanh tươi

Dinh dưỡng trong 100g bông cải xanh tươi

2.1.5 Công dụng của bông cải xanh

Bông cải xanh là một loại rau có giá trị dinh dưỡng cao và ngon nên ñược sử dụng thường xuyên trong các món ăn Phần ăn ñược là toàn bộ ñầu hoa chưa nở, bông cuộn tròn, ñầu hoa vẫn còn xanh Gần ñây người ta còn sử dụng rau mầm bông cải xanh trong chế biến các món ăn như trong các món salad, sandwich và trong các món xào

Bông cải xanh chứa nhiều chất sắt và acid folic giúp chống lại chứng thiếu máu, hỗ trợ phụ nữ mang thai hạn chế sinh con bị di chứng nứt ñốt sống [61]

Nhiều nghiên cứu khác nhau cũng ñã khẳng ñịnh bông cải xanh là nguồn giàu chất chống oxi hóa, các vitamin và chất xơ, những chất này có thể phòng chống bệnh ung thư Tuy nhiên khi chế biến bông cải xanh ở nhiệt ñộ cao, nhiều nghiên cứu ñã cho thấy những thành phần vitamin, ñặc biệt là nhóm chất có tác dụng ngăn ngừa ung thư bị giảm [31]

Trong bông cải xanh có các hợp chất glucosinolate không những góp phần tạo nên hương vị và mùi thơm ñặc trưng của các loại rau họ cải mà còn ñóng vai trò như một chất hoạt ñộng sinh học giúp thực vật tự bảo vệ khi bị thương hoặc bị vi sinh vật tấn công [21]

2.1.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Các nghiên cứu theo hướng nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận glucosinolate trên ñối tượng bông cải xanh rất ít Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật vi nhân giống qua các giai ñoạn kích thích tạo chồi và tạo rễ bất ñịnh từ chồi

Viện Rau Quả và Cây Trồng Serbia ñã tiến hành nhân giống bông cải xanh

với các mẫu cấy từ rễ, tử diệp và trụ hạ diệp của cây mầm in vitro và chứng minh

trụ hạ diệp là mẫu cấy thích hợp với tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi là 84% và số chồi trung bình/mẫu cấy là 5,2 ± 0,1 trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l và IBA 0,1 mg/l Tuy nhiên, khi sử dụng riêng lẻ BA mà không kết hợp với IBA thì tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi thấp hơn (57%) nhưng số chồi/mẫu cấy nhiều hơn (7,4 ± 0,3) [40]

Nghiên cứu sự tái sinh chồi từ trụ hạ diệp và chồi ngọn của ðại Học Putra Malaysia cho kết quả 96,67% trụ hạ diệp phát sinh chồi với số lượng 6,03 chồi/mẫu trên môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l Với mẫu cấy là chồi ngọn, môi trường thích hợp là môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l, tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi là 100%, số chồi/mẫu là 3,76 Khi chuyển sang môi trường MS kích thích tạo rễ thì môi trường

bổ sung IBA nồng ñộ 0.2 mg/l cho kết quả cao nhất với 100% số chồi phát sinh rễ, trung bình 6,5 rễ/chồi Chiều dài rễ lớn nhất là 2,46 cm ñược thu nhận trên môi trường MS cơ bản [46]

Theo kết quả của Viện Công Nghệ Bandung Indonesia thì môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi là môi trường MS bổ sung BA 10,0 µM Kết quả thu ñược 16–20 chồi/chồi ngọn và ña số chồi phát sinh nhiều rễ trên môi trường MS bổ sung NAA 1.0µM [50]

Theo nghiên cứu của Phạm Văn Lộc (2010), mẫu cấy trụ hạ diệp từ cây mầm bông cải xanh có khả năng tạo mô sẹo cao, tỷ lệ tạo sẹo cao ở các môi trường MS

có bổ sung BA nồng ñộ 2,0 mg/l kết hợp với NAA 1,0 và 2,0 mg/l; Kin 0,1 mg/l kết hợp 2,4-D 0,15 và 0,2 mg/l Môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo là môi trường MS bổ sung BA 2,0 mg/l và NAA 1,0 mg/l ðồng thời dịch treo tế bào trong môi trường MS bổ sung saccharose 30 g/l có khả năng sinh tổng hợp glucosinolate cao (0,0287 ± 0,0017µmol/g) [2]

Nguyễn Ngọc Quỳnh Trang và cộng sự (2013) ñã khảo sát sự nuôi cấy rễ bất ñịnh bông cải xanh (Bassica oleracea var italica) có khả năng sinh tổng hợp glucosinolate Rễ bất ñịnh hình thành và tăng sinh tốt nhất trên môi trường có IBA 1,4 mg/l Trong môi trường lỏng, rễ bất ñịnh từ lá mầm và rễ mầm tăng sinh tốt nhất khi khối lượng rễ khởi ñầu là 1,5 g/30 ml môi trường cùng với sự hiện diện của IBA 1,4 mg/l và saccharose 40 g/l Ở tuần thứ 3 nuôi cấy hàm lượng glucosinolate ñạt cao nhất và giảm sau ñó Sự bổ sung methionine, phenylalanine và tyrosine vào môi trường với nồng ñộ 40; 50 và 60 mg/l ñều làm tăng sự tổng hợp glucosinolate trong

rễ bất ñịnh [4]

2.2 Giới thiệu về glucosinolate

2.2.1 Sự phân bố glucosinolate trong thực vật

Glucosinolate là hợp chất thứ cấp chỉ xuất hiện trong một số họ thực vật hai

lá mầm Ở các loài thực vật ăn ñược, glucosinolate có chủ yếu ở họ Brassicaceae (họ cải) và Capparaceae (họ màn màn) và ñôi khi ở một số loài thuộc họ

Caricaceae (họ ñu ñủ) và Tropaeolaceae (họ sen cạn) (Bảng 2.2)

Tuy nhiên, hàm lượng GLS có sự khác biệt giữa các loài và không phải thực vật nào cũng chứa ñầy ñủ các loại GLS mà chỉ chứa một số loại chính

var millecapitata (Lev) Thell

var medullosa Thell

var selensia

var sabellica

Brassica alboglabra Bailey

Brassica pekinensis (Lour) Rupr

Cải Kohrabi Cải bắp ñỏ/ trắng Cải Savoy

Cải Brussel Bông cải xanh

Bông cải (Súp lơ) Bông cải Calabrese

Cải xoăn kale Cải xoăn Marrowstem Cải xoăn curly

Cải xoăn Collard Cải xoăn Trung Quốc Cải bắp Trung Quốc

Brassica chinensis L

Brassica campestris L

ssp rapifera (Metzg.) Sinsk

ssp oleijera (Metzg.) Sinsk

Brassica napus L

var napobrassica (L.) Peterm

hay ssp rapifera (Metzg.) Sinsk

var napus

Brassica nigra (L.L) Koch

Brassica juncea (L.) Czern et Coss

Brassica carinata A Br

Sinapis alba L

Crambe maritima L

Raphanus sativus L

Armoracia lapathifolia Gilib

Wasabi japonica Matsum

Eruca sativa (Miller) Thell

Lepidium sativum L

Nasturtium officinalis R Br

Cải bắp trắng Trung Quốc

Cải củ tròn Cải củ dầu Cải củ Thụy ðiển

Cải dầu mùa xuân thu Cải mù tạt ñen

Cải cay Cải bắp Ethiopia Cải mù tạt trắng Cải biển

Cải củ Cải củ cay dại Cây Wasabi Cải dại Cải xoong

2.2.2 Glucosinolate và cấu trúc hóa học

Glucosinolate (GLS) có cấu trúc bao gồm một nhóm isothiocyanate bị sulfat hóa kết hợp với nhóm β-D-thioglucose và gốc R là dẫn xuất của các amino acid Cả glucose và nguyên tử carbon trung tâm của isothiocyanate ñều có thể biến ñổi, do

ñó cấu trúc của glucosinolate rất ña dạng [12].

Hình 2.1 C ấu trúc hóa học của glucosinolate [63]

Glucosinolate và các sản phẩm thủy phân của chúng từ lâu ñã ñược biết ñến với tên gọi chung là dầu mù tạc (mustard oil) [21]

Glucosinolate là một nhóm nhỏ nhưng bao gồm nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau chứa lưu huỳnh, ñặc trưng cho họ cải và chỉ có ở một số loài thực

vật khác như Arabidopsis thaliana [21, 60]

B ảng 2.3 Hàm lượng glucosinolate ở một số loài Brassica [47]

< LOD: limit of detection: nhỏ hơn ngưỡng phát hiện

2.2.3 Phân loại glucosinolate

Có khoảng 120 loại hợp chất glucosinolate ñược tìm thấy trong tự nhiên ở nhiều loài thực vật khác nhau Dựa vào cấu trúc của gốc R, glucosinolate ñược chia thành 3 nhóm chính:

• Aliphatic glucosinolate: tiền chất là methionin, alanin, leucin, isoleucin, valin

• Aromatic glucosinolate: tiền chất là phenylalanin, tyrosin

• Indole glucosinolate: tiền chất là tryptophan [27]

B ảng 2.4 Cấu trúc và phân loại một số glucosinolate [28]

7 4-hydroxy- glucobrassicin 4-hydroxy-3-indolylmethy1

8 4-methoxy glucobrassicin 4-methoxy -3-indolylmethy1

9 Neoglucobrassicin 1-methoxy-3indolylmethy1

2.2.4 Sinh tổng hợp glucosinolate

Quá trình sinh tổng hợp glucosinolate gồm 3 giai ñoạn:

- Kéo dài chuỗi amino acid

- Hình thành cấu trúc glucosinolate

- Biến ñổi mạch bên, hoàn tất quá trình sinh tổng hợp

Hình 2.2 Các giai ñoạn trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate [21]

2.2.5 Thủy phân glucosinolate

Glucosinolate bị thủy phân bởi enzyme nội sinh myrosinase ở thực vật Myrosinase là một glycoprotein cùng tồn tại song song với glucosinolate nhưng ñược nằm tách biệt ở những ngăn khác nhau của tế bào, khi tế bào bị stress hoặc hư hại chúng mới tiếp xúc với nhau Khi có nước, myrosinase xúc tác tách nhóm glucose ra khỏi GLS Sản phẩm thủy phân là các hợp chất isothiocyanate, nitrile và thiocyanate, ñây là các hợp chất bảo vệ cho thực vật Sản phẩm chính của phản ứng thủy phân là isothiocyante, hai chất còn lại chỉ xuất hiện khi có mặt một số protein ñặc biệt trong cây làm biến ñổi kết quả của phản ứng [17]

ở người không tồn tại enzyme myrosinase nhưng vẫn có thể chuyển hóa glucosinolate nhờ hoạt ñộng của hệ vi sinh vật ñường ruột [17]

Hiện nay, các nhà khoa học quan tâm ñến các hoạt ñộng phòng chống ung thư của các loại rau có chứa nhiều glucosinolate nói chung, cũng như isothiocyanate nói riêng [60]

B ảng 2.5 Glucosinolate và các isothiocyante tương ứng [60]

Glucotropaeolin Benzyl Isothiocyante (BITC)

Gluconasturtiin Phenethyl-Isothiocyanate (PEITC)

Glucoraphanin Sulforaphane (SFN)

Glucobrassicin Indole-3-carbinol (I3C)

2.2.6 Vai trò của glucosinolate thông qua các isothiocyanate

2.2.6.1 Ngăn chặn ung thư

Glucosinolate tác dụng lên enzyme chuyển hóa tham gia tạo thành chất gây ung thư Enzyme chuyển hóa ñóng vai trò quan trọng trong chyển hóa hoặc loại bỏ các hóa chất, bao gồm thuốc, ñộc tố và chất gây ung thư [60]

Một số procarcinogen (tiền thân của chất gây ung thư ) ñược chuyển hóa bởi enzyme phase I, như cytochrome P450 (CYP), trở thành chất gây ung thư có khả năng gắn kết với DNA và gây ñột biến Nếu ức chế enzyme CYP thì có thể ngăn ngừa sự phát triển của bệnh ung thư Isothiocyanate, bao gồm Phenethyl-Isothiocyanate (PEITC) và Benzyl Isothiocyanate (BITC), ñã ñược chứng minh là

có khả năng ức chế enzyme CYP ở ñộng vật [13]

Nhiều isothiocyanate, ñặc biệt là sulforaphane (SFN), là chất cảm ứng mạnh của enzyme phase II trong việc phục hồi tế bào [19] Các enzyme phase II, gồm glutathione S-transferase (GST), UDP-glucuronosyl tranferase (UGT), quinone reductase và glutamate cysteine, ñóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ DNA tế bào không bị tổn thương bởi chất gây ung thư và chất oxy hóa (hình 2.4)

2.2.6.2 Bảo toàn chu trình tế bào

Sau giai ñoạn phân chia, tế bào ñi qua một chuỗi các giai ñoạn gọi là chu kì

tế bào trước khi phân chia lại Nếu DNA bị tổn thương, chu trình tế bào có thể bị tạm ngừng ñể sửa chữa DNA Nếu DNA không thể sửa chữa, tế bào sẽ chết Việc chu kỳ tế bào bị khiếm khuyết có thể dẫn ñến ñột biến, là tiền ñề của ung thư

Một số isothiocyanate, bao gồm ATIC, BITC, PEITC, và SFN có khả năng giảm thiểu khiếm khuyết diễn ra trong chu kì tế bào [57]

2.2.6.4 Kháng Helicobacter pylori

Vi khuẩn H.pylori làm gia tăng ñáng kể nguy cơ ung thư dạ dày [40] Thử

nghiệm trong ống nghiệm, SFN có khả năng ức chế sự tăng trưởng và giết chết

nhiều chủng H.pylori, bao gồm cả chủng kháng kháng sinh [18]

2.3 Ứng dụng

Các hoạt chất từ glucosinolate ñã ñược các nhà khoa học của các trường ñại học và viện nghiên cứu từ nhiều nước trên thế giới khẳng ñịnh có tác dụng kháng oxy hóa, phòng chống ung thư dạ dày, ung thư ñường ruột, ung thư tuyến tiền liệt Trong ñó 2 hoạt chất quan trọng chứa lưu huỳnh là sulforaphane và indol-3-carbinol

còn có tác dụng phòng chống và tiêu diệt vi khuẩn Helicobacteria pylori (H.P) là

nguyên nhân chủ yếu gây viêm loét dạ dày, tá tràng ðiều ñặc biệt là tác dụng tiêu diệt vi khuẩn H.P của các hoạt chất này rất cao cho dù các vi khuẩn ñó nằm trong

Trung hòa

Giảm phân chia tế

bào ung thư

ung thư

Giảm hư tổn DNA

Chất ñã giải ñộc O2*

hay ngoài tế bào niêm mạc dạ dày và ngay cả khi chúng ñã kháng lại một số kháng sinh thông thường

Bước ñầu, các nhà khoa học Việt Nam ñã tạo ra ñược một số chế phẩm tiêu biểu như Sulcuvina có khoảng 20% Sulforaphane, Sulfovina có khoảng 10% sulforaphane; Sulfocream có 0,5% Sulforaphane ñược chiết xuất từ các loại rau cải

Với sulcuvina chủ yếu dùng làm sạch ñường tiêu hóa, hỗ trợ phòng chống viêm loét dạ dày, tá tràng do nhiễm vi khuẩn HP, phòng ngừa ung thư dạ dày, phòng chống ung thư tuyến tiền liệt, ñặc biệt phòng chống việc thoái hóa hoàng ñiểm, rất tốt cho lứa tuổi trung niên

Sulfovina có tác dụng tương tự Sulcuvina nhưng thiên về việc phòng chống ung thư tuyến tiền liệt, chống các tác ñộng của bức xạ, ñặc biệt là tia cực tím ñối với mắt, chống sự lão hóa hoàng ñiểm – nguyên nhân chủ yếu gây mù lòa ở người cao tuổi

Sulfocream là loại kem xoa (mỹ phẩm), không có tác dụng phụ, chống ung thư da, làm ñẹp da [64]

Trên thế giới, rất nhiều thực phẩm chức năng, dược phẩm ñược sản xuất từ hạt và mầm các loại cây họ cải ñã ñược áp dụng trong ñời sống ñể phòng chống các loại ung thư nói trên Một số sản phẩm tiêu biểu [58]:

Ảnh 2.3 Sản phẩm glucosinolate trên thị trường

2.4 Nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận hợp chất thứ cấp (HCTC)

2.4.1 Rễ bất ñịnh

Chức năng chính của tất các loại rễ là giúp cây bám chặt vào giá thể, hấp thu

và vận chuyển nước, chất khoáng, dự trữ các chất dinh dưỡng hữu cơ trong cây

Rễ cây còn ñược xem là một nguồn thức ăn có giá trị về mặt kinh tế Các loại

củ như củ sắn, cà rốt, khoai lang… là các loại thực phẩm ñiển hình có bản chất là rễ

và rễ bất ñịnh Một vai trò khác của rễ bất ñịnh ñã ñược biết ñến từ rất lâu nhưng vẫn chưa ñược ñánh giá ñúng mức, ñó là khả năng sản sinh ra các hợp chất thứ cấp

ở thực vật có giá trị cao và ñược ứng dụng trong ngành dược liệu Ví dụ như rễ cây

ñể ra rễ IBA và NAA là 2 loại auxin hiệu quả nhất trong sự kích thích ra rễ

Rễ có khả năng hấp thu nước, các thành phần khoáng và dinh dưỡng diễn ra nhanh, sự tích lũy của các hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở rễ ñóng vai trò quan trọng cho toàn bộ cơ thể thực vật [5] Do ñó, các nghiên cứu con ñường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp chủ yếu khảo sát trên ñối tượng rễ [42]

2.4.3 Nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận HCTC

Quá trình nuôi cấy rễ bất ñịnh thu nhận HCTC bao gồm 4 giai ñoạn:

• Giai ñoạn 1: Cảm ứng phát sinh rễ bất ñịnh từ mẫu cấy ( qua trung gian mô sẹo hoặc cảm ứng trực tiếp)

• Giai ñoạn 2: Nuôi rễ trong môi trường lỏng trong bình tam giác hoặc bioreactor thể tích nhỏ và thiết lập ñường cong sinh trưởng (xác ñịnh các thành phần môi trường thích hợp nhằm gia tăng sinh khối và tích lũy HCTC)

• Giai ñoạn 3: Giai ñoạn tích lũy HCTC (bổ sung chất cảm ứng hoặc tiền chất)

• Giai ñoạn 4: Nuôi cấy rễ trên quy mô lớn trong bioreactor (xác ñịnh phương pháp thích hợp ñể nuôi cấy trên quy mô lớn)

Giai ñoạn cuối của quá trình trên là thu hồi HCTC từ lượng sinh khối thu ñược [38]

Ảnh 2.4 Quy trình nuôi cấy rễ bất ñịnh Echinace purpurea [38]

A Mô s ẹo phát sinh từ mẫu lá; B Cảm ứng rễ bất ñịnh từ mô sẹo; C Nuôi cấy trong bình

tam giác; D, E, F Nuôi c ấy trong bioreactor 20L, 500L 1000L; G Rễ bất ñịnh sau khi

nuôi c ấy trong bioreactor

Cho tới nay, rễ bất ñịnh ñược cảm ứng thành công ở nhiều loài thực vật và một số ñã ứng dụng thành công trong sản xuất quy mô lớn Một số nghiên cứu có thể kể ñến:

Ở loài nhân sâm núi Panax gingseng [11], rễ bất ñịnh ñược cảm ứng thành công trên môi trường dành cho cây thân gỗ (Wood plant medium WPM) bổ sung IBA 14,8 µmol/l và ñược nuôi cấy trong bioreactor dung tích 5 lít chứa môi trường

WPM bổ sung IBA 24,6 µmol/l và sucrose 30g/l Yu (2001) [55], nuôi rễ trong bioreactor nhỏ sử dụng môi trường MS và nghiên cứu tác ñộng của nồng ñộ muối

và áp lực thẩm thấu lên sự tăng trưởng và sinh tổng hợp ginsenoside của rễ bất ñịnh Jeong và cs (2006) [30] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của O2, CO2 và ethylene lên sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ bất ñịnh nhân sâm và so sánh với khi nuôi cấy trong ñiều kiện không khí có thành phần bình thường (78% N2, 20,8% O2, 0,9% Ar, 0,03% CO2, Ne, He) Nghiên cứu cho thấy CO2 và C2H4 làm tăng sinh khối rễ, tuy nhiên chúng lại làm giảm sự tích lũy ginsenoside Mặt khác, nồng ñộ O2

cao (40%) là nồng ñộ tối ưu cho sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ Trong ñiều kiện nuôi cấy thích hợp, lượng ginsenoside tích lũy trong rễ là 12,4 mg/g trọng lượng khô

Min và cộng sự (2007) [36] cảm ứng rễ bất ñịnh từ củ Scopolia parviflora và

nuôi cấy trên môi trường B5 bổ sung IBA 0,1 mg/l và sucrose 50mg/l trong bình tam giác/bioreactor và thiết lập ñường cong sinh trưởng Các thông số như thời gian nuôi cấy, sự thông khí ñược khảo sát khi nuôi cấy rễ trong bioreactor Ở ñiều kiện nuôi cấy lý tưởng, hàm lượng scopolamine tích lũy cao nhất là 1,8 mg/g trọng lượng khô và hàm lượng hyoscyamine là 3,3 mg/g

Ở loài củ cải Raphanus sativus, Betsui và cộng sự (2004) [9] ñã cảm ứng rễ bất ñịnh từ ñoạn rễ củ cải trong môi trường MS ½ bổ sung IBA 0,5 mg/l nhằm thu nhận anthocyanin trong ñiều kiện tối

Rễ bất ñịnh còn ñược cảm ứng thành công ở loài Echinacea angustifolia trên

môi trường MS ½ bổ sung IBA 2 mg/l và sucrose 50 g/l ðiều kiện nuôi cấy thích hợp ñể thu nhận các hợp chất phenol và flavanoid là môi trường MS ½ bổ sung IBA 2 mg/l, sucrose 50 g/l, nồng ñộ amoni : nitrate là 5:25 mmol/l, pH 6,0, khối lượng rễ nuôi cấy là 10g/l (trọng lượng tươi) [53]

Wu và cộng sự (2007) [52] cũng ñã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ và thời gian chiếu sáng lên sự tăng trưởng và sản xuất acid caffeic của rễ bất ñịnh

E.purpurea Dãy nhiệt ñộ ñược khảo sát là 10, 15, 20, 25 và 300C Nhiệt ñộ tối ưu

cho sự gia tăng sinh khối và sản xuất acid caffeic là 200C và thời gian chiếu sáng là 3/21h (sáng/tối).

Ana và cộng sự (2010) [6] ñã nuôi cấy rễ bất ñịnh cây Brugmansia candida

trong bioreactor nhằm tăng khả năng thu nhận scopolanine, anisdamine và hyoscyamine, ñây là những hợp chất thứ cấp ở thực vật thuộc nhóm alkaloid có ý nghĩa trong ngành dược phẩm

Các nghiên cứu cho thấy tiềm năng phát triển của các hệ thống nuôi cấy rễ bất ñịnh trong thu nhận hợp chất tự nhiên ở thực vật là vô cùng to lớn Việc thu nhận các hợp chất này ở qui mô công nghiệp vẫn còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: (1) sự phát triển của công nghệ dẫn ñến sự mở rộng qui mô nuôi cấy; (2) kiến thức

ñể tối ưu hóa quá trình sản xuất nhằm tạo ra hàm lượng sản phẩm mong muốn cao nhất; (3) nhận biết các hợp chất có giá trị ñược tổng hợp trong rễ bất ñịnh [24]

Hiện nay, phương pháp nuôi cấy rễ tơ - kết quả của sự biến ñổi kiểu gen nhờ

plasmid Ri của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes - có nhiều ñặc tính nổi bật trong

nuôi cấy thu nhận HCTC như thời gian cảm ứng nhanh, không cần bổ sung chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật, sản xuất HCTC với sản lượng cao Tuy nhiên, ñể cảm ứng biến ñổi gen người ta sử dụng các gen marker Gen marker ñược sử dụng phổ biến nhất bao gồm neomycin phosphotransferase II (nptII) mã hóa cho ñặc tính kháng kháng sinh kanamycin Việc sử dụng các ñoạn gen marker khiến các nhà khoa học ñặt ra nghi vấn liệu nó có ảnh hưởng ñến sức khỏe con người không khi sản phẩm ñích là các thực phẩm chức năng

Chính vì vậy, phương pháp nuôi cấy rễ bất ñịnh trong các bioreactor ñược kỳ vọng là phương pháp ñáng tin cậy hơn ñể sản xuất các hợp chất có giá trị dùng trong dược phẩm và dinh dưỡng [38]

2.4.4 Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC trong nuôi cấy rễ bất ñịnh

Bổ sung chất cảm ứng và tiền chất hữu cơ là 2 phương pháp hữu hiệu nhằm tăng cường sản xuất HCTC trong nuôi cấy rễ bất ñịnh Ngoài ra còn có các phương pháp khác như: tạo ñiều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt ñộ, ánh sáng, bổ sung