Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và β anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng mannich và thử hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và

β-anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử hoạt tính sinh học

trên một số dòng tế bào ung thư ở người

Mã số đề tài: 171.4201

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Sơn

Đơn vị thực hiện: Khoa Công Nghệ – Cơ sở Thanh Hóa

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và

β-anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người

1.2 Mã số: 171.4201

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia th ực hiện đề tài

TT Họ và tên

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

TS Nguyễn Văn Sơn Khoa Công Nghệ –

Cơ sở Thanh IUH

1.4 Đơn vị chủ trì: Khoa Công Nghệ – Cơ sở Thanh Hóa

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018

1.5.2 Gia hạn (nếu có): Không

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng12 năm 2016 đến tháng 12 năm 2017

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực

hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: bốn mươi hai triệu đồng PHẦN II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Đặt vấn đề

Flavonoid là những chất chuyển hóa thứ cấp của phenol, được phân bố rộng rãi khắp trong vương quốc thực vật Chúng đã được phân lập từ các lớp thực vật khác nhau và chúng là m ột lớp các sản phẩm tự nhiên quan trọng Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học và các ứng dụng y

dược, như hoạt động chống khối u và ngừa ung thư, hoạt tính kháng khuẩn

và kháng virut, ch ống bệnh tim mạch, hoạt động ức chế enzym, hoạt động

chống gốc tự do và chống oxy hóa, vv

Prenyl flavonoids là một lớp của flavonoids có trong tự nhiên duy nhất

có đặc trưng bởi sự có mặt của một chuỗi bên prenyl trên bộ khung

flavonoid Các prenyl flavonoid có thể làm tăng sự liên kết gắn kết với

p-glycoprotein và tăng khả năng thấm qua màng tế bào, điều này có thể cải thiện đáng kể hoạt tính sinh học của prenyl flavonoid Do đó, flavonoids được thay thế nhóm prenyl hứa hẹn như là hợp chất duy trì để phát triển các dưỡng chất dinh dưỡng trong thực vật và nó như là các tác nhân dược

lý mới để điều trị các bệnh ở người Mặt khác, tài nguyên thiên nhiên c ủa flavonoids và prenylflavonoid bị hạn chế do hàm lượng thấp trong vương quốc thực vật Chúng đã ảnh hưởng tiêu cực đến việc đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng của chúng Do đó, tổng hợp hóa học của flavonoid

và prenylflavonoid sẽ là một cách tiếp cận thay thế rất quan trọng để giải quyết vấn đề về sự sẵn có của nó

Phản ứng Mannich là một phản ứng hữu cơ bao gồm một alkyl hóa của một proton có tính axit đặt bên cạnh một nhóm chức cacbony bằng formaldehyde và amin bậc nhất hoặc bậc hai hoặc amoni Sản phẩm cuối

cùng là một hợp chất β-amino-cacbonyl còn được gọi là các bazơ Mannich Phản ứng giữa amin và cacbonic α-methylen cũng được coi là phản ứng

Mannich bởi vì các amin này tạo thành giữa amin và aldehyd Phản ứng này được đặt tên theo nhà hoá học Carl Mannich

Phản ứng Mannich còn là một phương pháp hiệu quả để tổng hợp các

hợp chất O-amin liên kết nitơ với các hợp chất xeton và các hợp chất

phenol, nó được sử dụng rộng rãi trong quá trình tổng hợp các sản phẩm tự nhiên cũng như các phân tử thuốc hữu cơ Cấu trúc cơ bản dẫn xuất bazơ Mannich có chứa nitơ là một nhóm quan trọng của các nhóm hoạt chất dược học có thể cải thiện hiệu quả hoạt động sinh học, khả dụng sinh học,

và hòa tan trong nước của các hợp chất Việc tổng hợp dựa trên phản ứng Mannich tạo ra dẫn xuất thế với các amin trên bộ khung flavonoid có ý nghĩa rất lớn Vì vậy, trên cơ sở của phản ứng Mannich có thể thế các

amin bậc một và bậc hai vào vị trí 6 trên vòng A của hợp chất icaritin và

β-anhydroicaritin, nó có thể tạo ra một lớp hợp chất thiên nhiên mới có

chứa nitơ mà những nghiên cứu gần đây đã trở nên rõ ràng hơn rằng, hầu hết các lớp quan trọng của thuốc, đặc biệt là những hợp chất chứa nitơ có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên Các phản ứng Mannich là một phản ứng linh hoạt dẫn đến sự kết hợp của các amin thành các phân tử hữu cơ có chứa nitơ Mà những nghiên cứu gần đây cho thấy sự hiện diện của nitơ trong nhiều sản phẩm tự nhiên có thể làm tăng hiệu lực sinh học do số lượng lớn các lớp phân tử có thể tấn công các điện tử vào thành mao mạch của các tế bào bệnh và nó cũng làm cho dễ bị xạ trị trong điều trị các khối

u Các hợp chất có chứa nitơ trong loại thuốc này cũng có thể tăng cường các tính chất hóa lý (ví dụ: độ tan trong nước) và tăng cường khả năng hoạt tính sinh học so với các hợp chất không có chứa nitơ

Những hợp chất dẫn xuất thế các amin bậc hai vào vị trí 6 trên vòng A

của hợp chất icaritin và β-anhydroicaritin ở Việt Nam và trên thế giới cho

đến nay chưa được nghiên cứu

Với những ý nghĩa nêu trên ‘’ Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới

của icaritin và β-anhydroicaritin trên cơ s ở phản ứng Mannich và thử

hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người’’ là rất quan

trọng và cần thiết nhằm tổng hợp những hợp chất mới và thử các hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người từ đó tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học tốt giới thiệu chúng như những loại thuốc mới trong tương lai

2 Mục tiêu

-Tổng hợp khoảng 15-20 dẫn xuất mới của icaritin và β-anhydroicaritin

trên cơ sở phản ứng Mannich

- Thử hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người như: ung thư vú MCF-7, MDA-MB-453s, ung thư tử cung Hela, ung thư biểu

mô HCC1954 và ung thư buồng trứng SK-OV-3 , từ đó tìm kiếm một số

hợp chất mới có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng làm thuốc chữa một số bệnh ung thư trên người trong tương lai

- Viết được một bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành Hóa hữu Cơ hoặc Hóa dược thuộc hạng ISI/Scopus

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu tổng quan về tài liệu liên quan tới đề tài

3.2 Nghiên cứu thực nghiệm

3.2.1 Điều kiện thiết bị và hóa chất

3.2.1.1 Điều kiện thiết bị

Các điểm nóng chảy được xác định bởi thiết bị XRC-1 và không được điều chỉnh khi đo Phổ IR được ghi lại trên một quang phổ tensor-27 của máy quang phổ Phổ cộng hưởng từ 1H và 1 3C-NMR được ghi lại trên một quang phổ Bruker-AV400, sử dụng tetrametylsilan làm tiêu chuẩn nội bộ,

sự dịch chuyển hoá học (δ) trong ppm và hằng số liên kết (J) trong Hz

(Hz) Phổ khối lượng (MS) hoặc (HRMS) được xác định bằng phương pháp

EI hoặc ESI với VG Autospec-3000 hoặc Mat 95 XP spectrometer Lò vi sóng chiếu xạ được thực hiện với lò phản ứng vi sóng XH-MC-1 (Công ty Phát triển Khoa học và Công nghệ Bắc Kinh Xinghu, Trung Quốc)

3.2.1.2 Điều kiện hóa chất

Sắc ký cột được thực hiện trên silica gel (200-300 µm) của Trung Quốc Các thuốc thử tinh khiết AR hoặc hóa chất tinh khiết hóa học của Sigma và dung môi khan đã đư ợc loại bỏ nước bằng cách cất lại

Icaritin đã được chuẩn bị từ 2,4,6-trihydroxyacetophenone được cung cấp từ quá trình tổng hợp trong báo cáo trước đây của chúng tôi [76]

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật như môi trường E’MEM (Eagle’s minimum essential medium), MTT (3 -(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), AO (acridine orange), EB (ethidium bromide), proteinase K, RNase A, trypsin, amphotericin B, penicillin, streptomycin được mua từ Sigma (St Louis, MO) Huyết thanh được mua từ Biowest (Pháp) Các d ụng cụ dùng trong

nuôi cấy tế bào như bình Roux, đĩa nuôi c ấy 24 và 96 giếng được mua từ Nunc (Roskilde, Đức)

3.2.1.3 Nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy ba dòng tế bào ung thư ở người (HeLa, HCC1954 và OV-3) do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa K ỳ (NCI – Frederick, MD, USA) cung cấp Tế bào được nuôi trong môi trường E’MEM có bổ sung Lglutamine (200 mM), HEPES (1M), amphotericin B (0.1%), penicillin -streptomycin 200X và 10% ( v/v) FBS và ủ ở 37 oC, 5% CO2

để thu được bột màu vàng 2 (1,3 g, năng suất: 89%)

3.2.1.4.2 Quy trình tổng hợp chung đối với các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoid 3-20

Một hỗn hợp formaldehyde (0.22 mmol) và amine b ậc hai (0.22 mmol) trong 10 mL methanol và 0.02 mL HCl (aq) 15% đư ợc khuấy ở 80 °C cho đến khi đồng nhất hoàn toàn Dung dịch thu được đã được đưa từ từ vào

dung dịch (70 mg, 0,19 mmol) icaritin (1) hoặc β-anhydroicaritin (2) trong

methanol, và hỗn hợp phản ứng đã được đun hồi lưu trong 1-3 giờ Sau khi hoàn thành, hỗn hợp phản ứng đã được quay chân không đ ể cất dung môi Sau đó thêm nước, pha dung dịch nước được chiết xuất ba lần với EtOAc, làm khan dich chiết EtOAc bằng Na2SO4 khan Dung môi sau đó đã đư ợc loại bỏ dưới áp suất giảm bằng máy quay chân không Ph ần cặn thô thu đã

được kết tinh trong EtOAc/ete dầu hỏa thu được các hợp chất 3-20 là các

tinh thể màu vàng với hiệu suất 63-93%

3.2.1.4.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Quá trình thử hoạt tính sinh học của các hợp chất 1-20 đối với ba dòng

tế bào ung thư của con người (Hela, HCC1954 và SK-OV-3) được đánh giá bằng phương pháp MTT [ 93] Có thể tóm tắt như sau: Lấy 5x103 tế bào / giếng đã được gieo trong 96 giếng trong môi trường tăng trưởng (100 μL)

và ủ ở 37 oC trong 5% khí CO2 Sau 24 giờ, môi trường đã được loại bỏ, và sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của hợp chất (100, 25, 6.25, 1.56, 0.39, 0.0976, 0.0244, 0.0061 μM) trong 48 giờ Sau đó thêm 5% MTT vào mỗi giếng và ủ ở độ ẩm 95% và 5% khí CO2 trong khoảng 1-3 giờ Các lớp phủ đã được loại bỏ và 0,1 mL DMSO đã đư ợc thêm vào để giải quyết lượng dư Hỗn hợp được rung lên trên máy vi xử lý trong vòng 5 phút và độ hấp thụ được đo tại bước sóng 570 nm bằng quang phổ quang học với đầu tự dò Microxplated EL×800 (Bio -Rad 680) để xác định nồng

độ giết chết 50% tế bào (IC5 0) [94] Đường cong đáp ứng liều sẽ thu được trên máy tính Các phép đo cùng với các chất có khả năng kiểm soát tích

cực được thực hiện với cis-Platin và Paclitaxel Giá tr ị IC5 0 được định nghĩa là nồng độ gây ức chế 50% tế bào thử nghiệm

Để ngăn chặn phản ứng màu tiếp tục bằng cách thêm 10 μL 1% Sodium dodecyl sulfate (SDS) [(hòa tan 0,1 g SDS v ới dung dịch đệm phosphate buffer (PBS) để tạo thành dung dịch 10 mL)] hoặc thêm 10 μL 0,1 mol / L acid như axit clohiđric vào

4 Kết quả nghiên cứu

4.1 Tổng hợp β-anhydroicaritin (2)

Hợp chất icaritin (1,5g, 4,07 mmol) trong axit formic 30 mL đư ợc khuấy dưới bức xạ bằng lò vi sóng (600W, 2450 MHz) và đư ợc bảo vệ bằng nitơ ở 120 oC trong 30 phút, sau đó đổ vào nước đá Chất rắn thu được sau đó được tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Ete dầu hỏa/EtOAc,

v/v, 10:1) để thu được bột màu vàng 2 (1,3 g, năng suất: 89%) nhiệt độ

nóng chảy 221-222 oC (lit[ 9 5 ] 223 oC); 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 11.88 (s, 1H, 5-OH), 7.78 (d, J = 7.9 Hz, 2H, 2’-H and 6’-H), 6.95 (d, J =

7.8 Hz, 2H, 3’-H and 5’-H), 6.20 (s, 1H, 6-H), 3.82 (s, 3H, 4’-OCH3), 2.77

(t, J = 6.2 Hz, 2H, 2’’-H), 1.80 (t, J = 6.3 Hz, 2H, 1’’-H), 1.30 (s, 6H,

4’’-CH3 and 5’’-CH3); 1 3C- NMR (100 MHz, CDCl3): δ 175.9, 162.0, 160.6,

159.4, 155.8, 154.1, 131.2, 129.8, 122.2, 114.3, 105.2, 100.5, 99.8, 76.1, 55.5, 31.7, 26.6, 16.3; EIMS: m/z 368 [M]+.

4.2 Quy trình thí nghiệm chung tổng hợp đối với các dẫn xuất Mannich của flavonoid (3-20)

Một hỗn hợp formaldehyt (0.22 mmol) và amin b ậc hai (0.22 mmol) trong 10 ml methanol và 0.02 mL 15% HCl (aq) đư ợc khuấy ở 80 °C cho đến khi đồng nhất hoàn toàn Dung dịch thu được đã được đưa từ từ vào

dung dịch (70 mg, 0,19 mmol) icaritin (1) ho ặc β-anhydroicaritin (2) trong

methanol và hỗn hợp phản ứng đã được đun hồi lưu trong 1-3 giờ Sau khi hoàn thành, hỗn hợp phản ứng đã được quay chân không đ ể chưng cất dung môi Sau đó thêm nước, pha dung dịch được chiết xuất ba lần với EtOAc, thu pha hữu cơ và làm khan bằng Na2SO4 khan Sau đó dung môi đã đư ợc loại bỏ dưới áp suất giảm bằng máy quay chân không Ph ần cặn thô đã được kết tinh trong EtOAc/ete dầu hỏa thu được các hợp chất 3-20 là các tinh thể màu vàng với hiệu suất 63-93%

O OH

O

OCH3

OH a

4.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học

Table 4.1 Nồng độ chết một nửa [IC 5 0 (μM)] của các hợp chất 1-20 trên

ba dòng tế bào ung thư ở người

cực

Hình 3.1: Đường cong đáp ứng liều đối với thử hoạt tính sinh học bằng

phương pháp MTT đối với các hợp chất 19, 20 và cis-Platin trên tế bào

Hela, hợp chất 4 trên dòng tế bào HCC1954 và 8, 20 đối với dòng tế bào SK-OV-3

5 Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận

5.1 Đánh giá các kết quả đã đạt được

Các con đường tổng hợp được thông qua để tổng hợp các dẫn bazơ

Mannich của icaritin và β-anhydroicaritin được minh họa trong sơ đồ 4.1

Icaritin (1) được tổng hợp thông qua một chuỗi phản ứng gồm 8 bước, bắt đầu từ 2,4,6-trihydroxy acetophenone và 4-hydroxybenzoic acid với năng suất tổng thể là 23% Các icaritin khi cho ph ản ứng trong axit formic dưới

sự hỗ trợ của vi sóng thu được β-anhydroicaritin (2), do ph ản ứng cycliza

hóa của nhóm prenyl với nhóm OH bên cạnh trong các đi ều kiện axit chỉ cho sản phẩm, trong đó tạo thành một Xyclo ete như được mô tả nó đặc

cách phản ứng của icaritin hoặc β-anhydroicaritin với các amin bậc hai

khác nhau như: (dimethylamin, dietylamin, dipropylamin, diisopropylamin, pyrrolidin, piperidin, morpholin, piperzine hoặc N-

methylpiperzin) và formaldehyt Các điều kiện cổ điển của phản ứng Mannich đối với các hợp chất của phenol thu được dựa trên chất nền, amin

và tỷ lệ formaldehyt trong rư ợu với sưởi ấm kéo dài [98-103] Trong

trường hợp của chúng tôi, icaritin hoặc β-anhydroicaritin, formaldehyt và

các amin bậc hai lần lượt ở tỷ lệ 1: 1.2: 1.2 và khuấy hồi lưu ở 80 oC trong

1-3 giờ Chúng tôi đã aminomethyl hóa t ại vị trí C-6 của icaritin tạo ra

3-11 và aminomethyl hóa tại C-6 của β-anhydroicaritin thu đư ợc các hợp

chất 12-20

Nghiên cứu này được bắt đầu với giả thuyết cho rằng việc đưa nitơ vào một phân tử flavonoid sẽ cải thiện hoạt tính sinh học của phân tử Do đó chúng tôi đã khởi xướng nghiên cứu này với sự tổng hợp của một loạt các dẫn xuất của flavonoid chứa nitơ bằng cách thực hiện phản ứng Mannich

đối với icaritin và β-anhydroicaritin

Các cấu trúc của các dẫn xuất cơ bản Mannich đã đư ợc khẳng định bằng các phân tích phổ IR, 1H-NMR, 1 3C-NMR, IR và MS Trong phổ 1H-

NMR của 3-20 chỉ rõ sự vắng mặt của tín hiệu ở δ (ppm) 6.30 đối với

proton H-6 của hệ vòng icaritin (1) ho ặc ở δ 6.17 đối với proton H-6 của

β-anhydroicaritin (2) Trong vòng A, và một tín hiệu ở δ 3.6-4.1 chỉ ra sự

hiện diện của một nhóm amino methyl trên h ợp chất icaritin tại C-6 (1)

hợp chất 19, 20 và cis-Platin đối với tế bào Hela, hợp chất 4 trên các tế

bào HCC1954 và 8, 20 đối với sự gia tăng tế bào SK-OV-3 được thể hiện trong hình 4.1 Nhìn chung, ph ần lớn các hợp chất dẫn xuất bazơ Mannich này hiển thị bằng hoặc cao hơn (giá trị thấp hơn IC5 0) hoạt tính gây độc tế bào hơn thuốc kiểm soát dương tính cis-platin Một số hợp chất có giá trị

IC5 0 dưới 10 μM

Đối với dòng tế bào Hela, trong lo ạt các dẫn xuất bazơ Mannich c ủa icaritin, dữ liệu của chúng tôi cho th ấy rằng nhóm piperazinyl ho ặc (4-

metylpiperazin-1-yl) methyl trong hợp chất 8 hoặc 11 cho thấy hoạt tính mạnh nhất so với hợp chất gốc icaritin, hợp chất 8 và 11 với (IC5 0 8.179-

9.752 μM) mạnh hơn icaritin (1) hai lần (IC5 0 17.952 μM) Trong loạt các

dẫn xuất bazơ Mannich của β-anhydroicaritin, dữ liệu của chúng tôi cho

thấy nhóm (4-metylpiperazin-1-yl) methyl cho thấy hoạt tính mạnh hơn so

với hợp chất gốc β-anhydroicaritin (2), hợp chất 20 với (IC5 0 5,776 μM )

mạnh hơn hai lần β-anhydroicaritin (2) có (IC50 9.803 μM)

Trong trường hợp dòng tế bào HCC1954, hợp chất 4, 12 và 17 có hoạt

tính ức chế mạnh nhất có giá trị IC5 0 dưới 10 μM, đối với chuỗi dẫn xuất bazơ Mannnich của icaritin, sự thay thế của (dietylamino) metyl (ở hợp

chất 4) cho thấy hoạt tính cao hơn với giá trị IC5 0 là 5.396 μM so với hợp

chất cha mẹ icaritin (1) (IC5 0 8.004 μM) Đối với chuỗi dẫn xuất bazơ

Mannich của β-anhydroicaritin, dữ liệu của chúng tôi cho thấy khi thế

nhóm (dimethylamino) metyl ho ặc (piperazinyl) metyl có ho ạt tính cao nhất có giá trị IC5 0 là 9.508 hoặc 8.749 μM so với hợp chất gốc β-

anhydroicaritin (2) (IC5 0 10.508 μM)

Trong trường hợp dòng tế bào SK-OV-3, các hợp chất 8, 11, 17 và 20

là những chất hoạt động mạnh nhất có giá trị IC5 0 dưới 10 μM, đối với các

dẫn xuất bazơ Mannich 5, 6 và 8-11 đã biểu hiện hoạt tính cao hơn với

IC5 0 4.352-11.263 μM so với hợp chất cha mẹ icaritin (1) (IC5 0 16.042

μM) Đối với chuỗi dẫn xuất bazơ Mannich của β-anhydroicaritin, 12, 13,

17, 18 và 20 cho thấy hoạt tính cao hơn (IC5 0 7.714-19.620 μM) so với hợp

SK-nhóm diisopropylamino methyl, cho th ấy có độc tính ức chế chống lại

dòng tế bào HCC1954, hợp chất 19, khi thế nhóm (morpholinyl)methyl,

cho thấy các ức chế chọn lọc đối với tế bào Hela, và không ảnh hưởng đến

sự gia tăng của hai tế bào khác ở mức tối đa nồng độ thử nghiệm (100 μM

Quá trình thử hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất 15 và 19 có thể làm

thuốc chống ung thư tiềm năng và chọn lọc, nó xứng đáng phát triển hơn nữa

5.2 Kết Luận

Quá trình nghiên c ứu đề tài này chúng tôi đã thu đư ợc những kết quả sau:

1 Đã tổng hợp được sản phẩm tự nhiên β-anhydroicaritin (2) xuất phát từ

incaritin (1) bằng sự hỗ trợ vi sóng trong axit formic với năng suất 89%

2 Dựa trên phản ứng Mannich của các hợp chất flavonoids (1) và (2), đã tổng hợp được 18 chất dẫn xuất bazơ Mannich mới là: 3-11 và 12-20 Tất

cả các hợp chất đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 1 3C-NMR và phổ MS

3 Hơn nữa, qua quá trình thử hoạt tính sinh học trên ba dòng tế bào ung thư ở người (Hela, HCC1954 và SK-OV-3) bằng phương pháp chuẩn MTT Các kết quả cho thấy hầu hết các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoid hiển thị bằng hoặc cao hơn (giá trị IC5 0) về hoạt động gây độc tế bào so

với thuốc kiểm soát tích cực cis-platin Trong đó một số hợp chất có giá trị

các nồng độ IC5 0 tương ứng 5.776, 6.543, 7.330, 8.179 và 9.803 µM, các hợp chất 4,7,12 gây độc tế bào HCC1954 ở các nồng độ IC5 0 tương ứng 5.396, 8.749 và 9.508 µM, các h ợp chất 8, 20 và 11 gây độc tế bào SK-OV-3 ở các nồng độ IC5 0 tương ứng 4.352, 7.714 và 8.934 µM

4 Trong đó đáng chú ý là hợp chất 15 và hợp chất 19 cho thấy độc tính

chọn lọc đối với dòng tế bào HCC1954 và dòng tế bào Hela, chúng có th ể làm các thuốc chống ung thư tiềm năng và nó xứng đáng được phát triển hơn nữa

6.Tóm tắt kết quả (Tiếng anh và tiếng việt)

6.1 Tóm tắt bằng tiếng việt

Sản phẩm tự nhiên β-anhydroicaritin (2) đư ợc tổng hợp từ incaritin (1)

bằng sự hỗ trợ vi sóng trong axit formic D ựa trên phản ứng Mannich của 1

và 2, hai loạt 18 chất flavonoid mới của các dẫn xuất bazơ Mannich của các hợp chất 3-11 và 12-20 đã được tổng hợp Hơn nữa, các hoạt động

chống lại sự gia tăng chống lại ba dòng tế bào ung thư ở người (Hela, HCC1954 và SK-OV-3) đã được đánh giá bằng phương pháp chuẩn MTT Kết quả cho thấy hầu hết các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoids đều có giá trị bằng hoặc thấp hơn (giá trị thấp hơn IC5 0) so với thuốc kiểm soát

dương tính cis-platin Một số hợp chất có giá trị IC5 0 dưới 10 μM Hợp

chất 15 và hợp chất 19 cho thấy có khả năng gây độc tính tế bào chọn lọc

đối với dòng tế bào HCC1954 và dòng tế bào Hela, chúng có thể là các thuốc chống ung thư tiềm năng trong tương lai và x ứng đáng phát triển hơn nữa

Từ khóa: Icaritin; β-anhydroicaritin; Các dẫn xuất bazơ Mannich; Tổng

hợp; Hoạt tính sinh học

6.2 Tóm tắt bằng tiếng anh

The natural product β-anhydroicaritin (2) was synthesized from

incaritin (1) by microwave assistance in formic acid Based on Mannich reaction of 1 and 2, two series eighteen new flavonoids Mannich base derivatives 3-11 and 12-20 were synthesized Furthermore, their anti -

proliferative activities against three human cancer cell lines (Hela, HCC1954 and SK-OV-3) were evaluated by the standard MTT method The results showed that most of these flavonoid Mannich base derivatives displayed equal or higher (lower IC5 0 values) cytotoxic activities than the

positive control drug cis-Platin Some compounds possess the IC5 0 value

below 10 μM Compound 15 and compound 19 showed selective

cytotoxicity against HCC1954 cell lines and Hela cell lines respectively,

they are potential and selective anticancer agent and worthy of further

development

Keywords: Icaritin; β-anhydroicaritin; Mannich base derivatives;

Synthesis; Cytotoxic activity

III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo

3.1 Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)

giảng dạy (bài giảng)

Bài giảng trong môn tổng hợp Hữu

cơ trong chương

trình KOSEN

Bài giảng trong môn tổng hợp Hữu cơ trong chương trình KOSEN

…

3.2 Kết quả đào tạo

TT Họ và tên

Thời gian thực hiện đề tài

IV Tình hình sử dụng kinh phí

T

T Nội dung chi

Kinh phí được

duyệt

(triệu

đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu

đồng)

Ghi chú

1 Thuê khoán chuyên môn 6.000.000 6.395.000

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con… 19.000.000 19.000.000

V Kiến nghị ( về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)

Quá trình nghiên cứu đề tài này chúng tôi mới chỉ thử nghiệm hoạt tính sinh học trên ba dòng tế bào ung thư người: Hela, HCC1954 và SK-OV-3 còn nhiều dòng tế bào ung thư khác chưa thử nghiệm nên đề tài có thể tiếp tục thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào bệnh khác nhằm tìm kiếm những hoạt tính sinh học mới

Đề tài có thể tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt (có giá trị IC5 0˂ 10 µM) như: hoạt tính sinh học và độc tính trên động vật sống

VI Phụ lục ( liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Mục Lục

Trang

Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt 20

MỞ ĐẦU 22

1 Lý do chọn đề tài 22

2 Mục tiêu đề tài 23

1.1 Tổng quan về Flavonoids 25

1.1.1 Cấu trúc của flavonoid và các sản phẩm tự nhiên liên quan26 1.1.2.Hoạt tính dược lý của flavonoid………27

1.2 Prenyl flavonoids 28

1.3 Tổng hợp flavonoid 29

1.4 Phản ứng Mannich 33

1.5 Vài nét về các dòng tế bào thử nghiệm 35

1.5.1 Dòng tế bào Hela 36

1.5.2 Dòng tế bào SK-OV-3 (dòng tế bào ung thư buồng trứng ở người) 37

1.5.3 Dòng tế bào HCC1954 (dòng tế bào ung thư vú) 38

1.6 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 39

Chương 2: THỰC NGHIỆM 40

2.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 40

2.1.1 Dụng Cụ và thiết bị 40

2.1.2 Hóa chất 40

2.2 Phương pháp thực nghiệm 41

2.2.1 Điều kiện thiết bị và hóa chất 42

2.2.1.1.Điều kiện thiết bị 42

2.2.3 Phương pháp thực nghiệm 43

2.2.3.1 Tổng hợp β-anhydroicaritin (2) 44

2.2.3.2 Quy trình tổng hợp chung đối với các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoid 3-20 44

2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học 44

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Tổng hợp β-anhydroicaritin (2) 46

3.2 Quy trình thí nghiệm chung tổng hợp đối với các dẫn xuất

Mannich của flavonoid (3-20) 46

3.3 Các dự liệu cấu trúc của các hợp chất dẫn xuất bazơ Mannich của icaritin và β-anhydroicaritin (3-20) 47

3.4 Kết quả thử hoạt tính sinh học 52

3.5 Thảo luận 53

KẾT LUẬN 58

Tài Liệu Tham Khảo 59

Publication 69

PHỤ LỤC BỔ SUNG 70

Một Số Phổ Của Các Hợp Chất Đã Tổng Hợp 71

Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt

Mối quan hệ cấu trúc hoạt động

µL, mL, L, µM Microliter, milliliter, liter, micromole

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon

H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hật nhân hydro

Phổ khối phân giải cao ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Quang phổ khối lượng ion hóa điện tử EI-MS Electron ionized mass spectrometry

Phổ khối electron ion hóa

Half maximal inhibitory concentration Nồng độ lớn nhất ức chế 1/2

Phenazine methosulphate

Nicotinamide adenine dinucleotide

Vòng thơm Hela

SK-OV-3

HCC1954

Human cervical cancer Ung thư cổ tử cung ở người Human Ovarian Cancer Cell Ung thư buồng trứng người

Human breast carcinoma cell lines Dòng tế bào ung thư vú của con người

Ung thư vú ở người

carcinoma cell line Dòng Androgen-responsive ung thư vú ở người

Ung thư máu ở người

Ung thư phổi A549 cells Adenocarcinomic human alveolar basal

epithelial cells

Tế bào biểu mô tế bào ung thư trực tràng của người

E’MEM Eagle’s minimum essential medium

Môi trường tối thiểu cần thiết của Eagle MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

AO Acridine orange

EB Ethidium bromide

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Flavonoid là những chất chuyển hóa thứ cấp của phenol, được phân bố rộng rãi khắp trong vương quốc thực vật Chúng đã được phân lập từ các lớp thực vật khác nhau và chúng là m ột lớp các sản phẩm tự nhiên quan trọng Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học và các ứng dụng y dược, như hoạt động chống khối u và ngừa ung thư, hoạt tính kháng khuẩn

và kháng virut, ch ống bệnh tim mạch, hoạt động ức chế enzym, hoạt động

chống gốc tự do và chống oxy hóa, vv

Prenyl flavonoids là một lớp của flavonoids có trong tự nhiên duy nhất

có đặc trưng bởi sự có mặt của một chuỗi bên prenyl trên bộ khung

flavonoid Các prenyl flavonoid có thể làm tăng sự liên kết gắn kết với

p-glycoprotein và tăng khả năng thấm qua màng tế bào, điều này có thể cải thiện đáng kể hoạt tính sinh học của prenyl flavonoid Do đó, flavonoids được thay thế nhóm prenyl hứa hẹn như là hợp chất duy trì để phát triển các dưỡng chất dinh dưỡng trong thực vật và nó như là các tác nhân dược

lý mới để điều trị các bệnh ở người Mặt khác, tài nguyên thiên nhiên c ủa flavonoids và prenylflavonoid bị hạn chế do hàm lượng thấp trong vương quốc thực vật Chúng đã ảnh hưởng tiêu cực đến việc đánh giá hoạt tính sinh học và ứng dụng của chúng Do đó, tổng hợp hóa học của flavonoid

và prenylflavonoid sẽ là một cách tiếp cận thay thế rất quan trọng để giải quyết vấn đề về sự sẵn có của nó

Phản ứng Mannich là một phản ứng hữu cơ bao gồm một alkyl hóa của một proton có tính axit đặt bên cạnh một nhóm chức cacbony bằng formaldehyde và amin bậc nhất hoặc bậc hai hoặc amoni Sản phẩm cuối

cùng là một hợp chất β-amino-cacbonyl còn được gọi là các bazơ Mannich Phản ứng giữa amin và cacbonic α-methylen cũng được coi là phản ứng

Mannich bởi vì các amin này tạo thành giữa amin và aldehyd Phản ứng này được đặt tên theo nhà hoá học Carl Mannich