BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng nano g
Trang 1BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG
Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng nano graphene oxide phát triển phương
pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase
Mã số đề tài: 20/1.5CNH02
Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Đình Vũ
Đơn vị thực hiện: Khoa Công nghệ Hóa học
Trang 2
để chúng tôi hoàn thành các mục tiêu mà đề tài đã đặt ra
Đặc biệt, nhóm tác giả trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về mặt tài chính của Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh để chúng tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ nghiên cứu này
Trang 3MỤC LỤC
PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1
I Thông tin tổng quát 1
II Kết quả nghiên cứu 1
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục tiêu 3
3 Phương pháp nghiên cứu 3
4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu 4
5 Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận 4
6 Tóm tắt kết quả 4
III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo 6
3.1 Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) 6
3.2 Kết quả đào tạo 6
IV Tình hình sử dụng kinh phí 6
V Kiến nghị 7
VI Phụ lục 7
PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 8
1 Giới thiệu 8
2 Thực nghiệm 10
2.1 Hóa chất 10
2.2 Tổng hợp và kiểm tra tính chất của GO 11
3 Độ đặc hiệu của phương pháp 12
3.1 Phân tích điên di gel chứng minh hoạt tính của ezymes 13
3.2 Tính đặc hiệu của phương pháp bằng phân tích huỳnh quang 15
4 Tối ưu hóa các điều kiện phương pháp phân tích hoạt chất MGMT 16
4.1 Nồng độ tối ưu của GO 16
4.2 Thời gian tối ưu của phản ứng enzyme 18
5 Thông số đặc trưng của phương pháp 19
6 Kết luận 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO 23
Trang 4DANH MỤC HÌNH
Hình 1.Ứng dụng hiệu ứng tắt quang của GO để phân tích enzym ExoIII 8
Hình 2.Cơ chế phản ứng loại bỏ nhóm methyl tại vị trí O6-guanine 9
Hình 3 Mô phỏng nguyên lý của phương pháp 10
Hình 4.Ảnh TEM của nanosheet GO 12
Hình 5.Ảnh AFM của GO trên tấm mica 13
Hình 6.Phổ FT-IR của GO 13
Hình 7.Hình ảnh phân tích Gel electrophoresis 14
Hình 8.Phổ huỳnh quang trong dãi bước sóng 505 nm tới 600 nm 15
Hình 9.Sự phụ thuộc của cường độ huỳnh quang đáp ứng ở 519nm vào nồng độ GO 17
Hình 10.Đường tắt huỳnh quang Stern−Volmer 18
Hình 11.Tối ưu hóa thời gian phản ứng của MGMT trong phương pháp 18
Hình 12.Phổ huỳnh quang đáp ứng ở các mức nồng độ khác nhau của MGMT 20
Hình 13.Cường độ huỳnh quang tại 519 nm khi phản ứng được thực hiện trong huyết thanh 20
Trang 5DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MGMT: O6-methylguanine-DNA methyltransferase
O6MeG: O6-methylguanine
GO: Graphene oxide
MSP: Methylation-specific polymerase chain reaction MS-HRM:Methylation-sensitive high-resolution melting ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
MS: Mass spectroscopy
TEM: Transmission electron microscopy
AFM:Atomic force microscopy
IR: Infrared spectroscopy
LOD: Limit of detection
LOQ: Limit of quantitation
Trang 6PHẦN I THÔNG TIN CHUNG
I Thông tin tổng quát
1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng nano graphene oxide phát triển phương
pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase
TS Lê Đình Vũ Khoa Công nghệ Hóa học Chủ nhiệm đề tài
CH Nguyễn Văn Hiệp Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm
1.5 Thời gian thực hiện:
1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2020 đến tháng 3 năm 2021
1.5.2 Gia hạn (nếu có): Không
1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 3 năm 2020 đến tháng 8 năm 2020
1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): không có
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)
1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 50 triệu đồng
II Kết quả nghiên cứu
1 Đặt vấn đề:
Hiện nay, vật liệu nano nói chung và vật liệu nano graphene oxit (GO) nói riêng trong Hóa phân tích đang được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ với mục tiêu tạo ra các phương pháp định tính và định lượng đơn giản, nhanh chóng nhưng có
Trang 7Vật liệu nano dựa trên graphene đã thể hiện các ứng dụng rộng rãi trong công nghệ nano, khoa học vật liệu, khoa học phân tích và kỹ thuật y sinh do các tính chất cơ học, nhiệt, điện, quang và đặc tínhxúc tác tuyệt vời của chúng Khả năng tương thích sinh học cao của graphene là một tiềm năng chính đối với việc xây dựng các cảm biến sinh học dựa trên graphene Tập trung vào đặc điểm này, hầu hết các công trình đều dựa vào việc sử dụng graphene oxit, có thể bao gồm các nhóm chức phản ứng và ưa nước phong phú, với khả năng hòa tan cao và linh hoạt
để liên hợp hóa trị của các phân tử sinh học Ngoài ra, graphene oxit tan trong nước có cấu trúc một mặt phẳng các vòng thơm cơ bản cho phép tương tác xếp chồng mạnh mẽ và làm tắt huỳnh quang của các nhóm phát quang, tạo thành một nền tảng hữu ích cho sự phát triển của cảm biến sinh học dựa trên hiệu ứng này Những cải tiến đáng kể đã được thực hiện trong nhiều ứng dụng sinh học, đáng chú
ý là ứng dụng để phát triển các phương pháp phân tích DNA , phân tích hoạt tính enzym, dược phẩm , tuy nhiên, việc sử dụng GO để xác định hoạt tính của ezyme
O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) trên cơ sở tắt huỳnh quang của GO vẫn chưa có công trình nào công bố
O6-methylguanine-DNA methyltransferase là một trong những enzym sửa lỗi ADN quan trọng nhất, có liên quan đến việc sửa chữa các tổn thương alkyl bằng cách trực tiếp loại bỏ nhóm alkyl khỏi O6-guanine trong DNA Việc xác định hoạt tính của MGMT là một bước thiết yếu trong việc nghiên cứu cơ chế chết tế bào do
O6MeG gây ra, biến sai nhiễm sắc thể, đột biến và ung thư
Để xác định lượng MGMT, phương pháp phóng xạ đóng một vai trò quan trọng bằng cách sử dụng alkyl có chứa đồng vị 3H trong DNA làm cơ chất Ngoài
ra còn có các phương pháp định lượng khác như: MSP, MS-HRM, ELISA, khối phổ (MS) hoặc huỳnh quang đã được phát triển và ứng dụng cho nghiên cứu hoạt tính của MGMT
Trong đề tài này, chúng tôi đã xây dựng kế hoạch nghiên cứu, phát triển một phương pháp dựa trên đặc tính tắt quang của nano graphene oxit để phân tích hàm lượng enzym O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) với tính đặc hiệu cao
Trang 8Kết hợp tính chất chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) từ nhóm phát quang 6-carboxyfluorescein-FAM (donor) tới nhóm nhận quang GO (acceptor), đặc tính hấp thụ mạnh các chuỗi đơn oligonucleotide trên bề mặt của
GO sheet và kỹ thuật kích hoạt hoạt tính của enzym phân cắt đặc hiệu ADN, chúng tôi sẽ thiết kế một cơ chất AND cho hoạt tính của MGMT Từ đó phát triển một phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả cho phân tích hoạt tính của MGMT Kỹ thuật phân tích này có thể triển khai trong hệ đồng thể, ưa nước và chỉ cần thiết bị
đo quang phổ huỳnh quang đơn giản, nhanh chóng dễ thực hiện nhưng có độ nhạy
và độ chọn lọc cao
2 Mục tiêu
Nghiên cứu ứng dụng thành công nano graphene oxide để phát triển phương pháp xác định ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase
Đăng tải kết quả nghiên cứu trên tạp chí khoa học uy tín (ISI)
3 Phương pháp nghiên cứu
3.1 Tổng hợp thành công graphene oxit và nano graphene oxit
Các đặc tính của GO được xác định qua hình ành TEM, AFM Các liên kết của nhóm carbonyl trên bề mặt graphene được xác định bằng phép đo phổ IR
3.2 Chứng minh tính đặc hiệu của phương pháp xác định bằng tín hiệu quang phổ huỳnh quang và điện di gel
Phản ứng của enzym được chứng minh bằng phép phân tích điện di Tín hiệu phân tích của cảm biến sinh học được chứng minh qua phép đo phổ huỳnh quang
3.3 Xác định điều kiện tối ưu của phương pháp:
Nồng độ tối ưu của GO được xác định thông qua khà năng tắt quang trên cùng một lượng DNA cơ chất, thời gian của phản ứng enzym được khảo sát
3.4 Xác định các thông số đặc trưng của phương pháp
Các thông số như: khoảng đáp ứng nồng độ, đường hiệu chuẩn, LOD, LOQ của phương pháp định lượng MGMT, độ lặp, độ chọn lọc của phương pháp được
Trang 9thông qua các thí nghiệm khảo sát trên cơ chất với môi trường chuẩn hoặc môi trường giả định (huyết tương)
4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu
- Kết quả nghiên cứu được đăng tải trên tạp chí Microchimica Acta được xếp ISI (IF = 6.2, Q1 lĩnh vực Hóa phân tích)
5 Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận
- Kết quả đáp ứng được mục tiêu đã đặt ra
6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phát triển một phương pháp phân tích
huỳnh quang mới để định lượng enzym O6-methylguanine-DNA methyltransferase
(MGMT) đặc hiệu sửa lỗi methyl hóa DNA tại vị trí O6 của guanine Nguyên lý của phương pháp dựa trên sự kích hoạt enzym thủy phân đặc hiệu PvuII tại vị trí 5’-CAG⁞CTG-3’ của DNA và tính chất hấp thu mạnh cơ chất DNA được đính nhóm phát quang trên bề mặt của graphene oxide nanosheet Hoạt tính của ezyme
MGMT loại bỏ nhóm methyl tại O6-methylguanine trên cơ chất DNA giải phóng vị trí phản ứng thủy phân chọn lọc trên DNA của ezyme endonuclease PvuII Phản ứng thủy phân này phân cắt và giải phóng nhóm huỳnh quang, do GO không hấp thụ nhóm huỳnh quang này nên tin hiệu huỳnh quang được khuếch đại tỉ lệ trực tiếp với hoạt tính của enzym MGMT Vơi điều kiện tối ưu của phương pháp, tại bước sóng kích thích 494 nm và phép đo ánh sáng phát xạ tại 519 nm, hoạt tính của MGMT có thể được xác định trong khoảng từ 0.5-35 ng/mL, giới hạn phát hiện là 0.15 ng/mL Các giá trị này chứng minh phương pháp có độ nhạy rất cao Thời gian phân tích chỉ trong vòng 2 giờ là một tiến bộ vượt trội so với nhiều phương pháp khác Bằng việc thay đổi cấu tạo cơ chất cho phù hợp với các ezyme khác, nguyên lý của phương pháp này có thể ứng dụng để phát triển các phương pháp khác trên cùng kỹ thuật tắt huỳnh quang của GO đối với DNA gắn huỳnh quang Tổng hợp lại, đề tài đã cung cấp một công cụ hữu ích cho nghiên cứu chuẩn đoán
và phát triển thuốc
We have developed a fluorescence method for the determination of the
activity of O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) It is based on the
Trang 10activation of restriction endonuclease PvuII and the adsorbing a labelled DNA onto the surface of graphene oxide (GO) MGMT activity removes
fluorophore-the methyl group from O6-methylguanine (O6MeG) in the fluorophore-labelled DNA to unblock the specific recognition site for further hydrolysis reaction of restriction endonuclease PvuII The endonuclease catalytic reaction releases fluorophores (5-carboxyfluorescein) from fluorophore-labelled DNA, which can avoid fluorescence quenching by GO, creating an abundance of the fluorescence signal The fluorescence increases in the assay is thus directly dependent on the MGMT activity Under the optimal conditions with the emission wavelength of
519 nm (exitation at 494 nm), the activity of the MGMT can be determined in the range 0,5 to 35 ng/mL with a detection limit of 0’15 ng/mL This is extremely sensitive for the determination of MGMT The short time of analysis (2 h) is superior to many reported strategies The method can also be extended for the rapid and sensitive activity assay of another DNA repair enzyms by designing a proper substrate DNA Conceivably, the technique represents a powerful tool for diagnosis and drug exploitation
Trang 11III Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
3.1 Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)
đã cấp kính phí thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định
- Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối báo cáo (đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang cuối kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)
3.2 Kết quả đào tạo
TT Họ và tên
Thời gian thực hiện đề tài
IV Tình hình sử dụng kinh phí
T
Kinh phí được duyệt
(triệu đồng)
Kinh phí thực hiện
(triệu đồng)
Ghi chú
A Chi phí trực tiếp
Trang 122 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con… 33.00 33.00
V Kiến nghị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)
Nghiên cứu mở rộng áp dụng nguyên lý của phương pháp cho các loại ezyme sửa
lỗi DNA hoặc các enzym thủy phân DNA, thủy phân peptide
VI Phụ lục ( liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)
- Bài báo khoa học được xếp hạng ISI
Tp HCM, ngày… tháng…năm 2020
Trưởng (đơn vị)
(Họ tên, chữ ký)
Trang 13PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
(báo cáo tổng kết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ý của hội đồng nghiệm thu)
1 Giới thiệu
Vật liệu nano dựa trên graphene đã thể hiện các ứng dụng rộng rãi trong công nghệ nano, khoa học vật liệu, khoa học phân tích và kỹ thuật y sinh do các tính chất cơ học, nhiệt, điện, quang và xúc tác tuyệt vời của chúng [1-3] Khả năng tương thích sinh học cao của graphene là một tiềm năng chính đối với việc xây dựng các cảm biến sinh học dựa trên graphene Tập trung vào đặc điểm này, hầu hết các công trình đều dựa vào việc sử dụng graphene oxit, có thể bao gồm các nhóm chức phản ứng và ưa nước phong phú, với khả năng hòa tan cao và linh hoạt
để liên hợp hóa trị của các phân tử sinh học [4, 5] Ngoài ra, graphene oxit tan trong nước có cấu trúc một mặt phẳng các vòng thơm cơ bản cho phép tương tác xếp chồng mạnh mẽ và làm tắt huỳnh quang của các nhóm phát quang, tạo thành một nền tảng hữu ích cho sự phát triển của cảm biến sinh học dựa trên hiệu ứng này Những cải tiến đáng kể đã được thực hiện trong nhiều ứng dụng sinh học, đáng chú ý là ứng dụng để phát triển các phương pháp phân tích DNA [6, 7], phân tích hoạt động enzym [8, 9], dược phẩm [10] , tuy nhiên, việc sử dụng GO để xác định hoạt động của ezyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) trên cơ sở tắt huỳnh quang của GO vẫn chưa có công trình nào công bố
Hình 1: Ứng dụng hiệu ứng tắt quang của GO để phân tích enzym ExoIII
[8]
Trang 14O6-methylguanine-DNA methyltransferase là một trong những enzym sửa lỗi ADN quan trọng nhất, có liên quan đến việc sửa chữa các tổn thương alkyl
bằng cách trực tiếp loại bỏ nhóm alkyl khỏi O6-guanine trong DNA [11-13] Việc xác định hoạt động của MGMT là một bước thiết yếu trong việc nghiên cứu cơ chế
chết tế bào do O6MeG gây ra, biến sai nhiễm sắc thể, đột biến và ung thư [14-16]
Cơ chế xúc tác của MGMT được mô phỏng theo Hình 1
Hình 2: Cơ chế phản ứng loại bỏ nhóm methyl tại vị trí O6-guanine
Để xác định lượng MGMT, phương pháp phóng xạ đóng một vai trò quan trọng bằng cách sử dụng alkyl có chứa đồng vị 3H trong DNA làm cơ chất [17, 18] Ngoài ra còn có các phương pháp định lượng khác như: MSP [19, 20], MS-HRM [21-23], ELISA [24], khối phổ (MS) [25, 26] hoặc huỳnh quang [27, 28] đã được phát triển và ứng dụng cho nghiên cứu hoạt tính của MGMT
Trong đề tài này, chúng tôi đã xây dựng kế hoạch nghiên cứu, phát triển một phương pháp dựa trên đặc tính tắt quang của nano graphene oxit để phân tích hàm
lượng enzym O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) với tính đặc hiệu cao Kết hợp tính chất chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)
từ nhóm phát quang 6-carboxyfluorescein-FAM (donor) tới nhóm nhận quang GO (acceptor), đặc tính hấp thụ mạnh các chuỗi đơn oligonucleotide trên bề mặt của
Trang 15tôi sẽ thiết kế một cơ chất DNA cho hoạt tính của MGMT Từ đó phát triển một phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả cho phân tích hoạt tính của MGMT Kỹ thuật phân tích này có thể triển khai trong hệ đồng thể, ưa nước và chỉ cần thiết bị
đo quang phổ huỳnh quang đơn giản, nhanh chóng dễ thực hiện nhưng có độ nhạy
và được cung cấp bởi Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Shanghai, China) Các dung dịch được pha chế bằng nước cất hai lần (có điện trở >18.3 MΩ⋅cm) được cất từ máy cất siêu tinh khiết Millipore Milli Q system (Billerica, MA, USA) Các oligonucleotides được tổng hợp bới công ty Takara Biotechnology Co.Ltd (Dalian, China) Tính chất nhiệt động của các DNA này được tính toán dựa vào
