Ứng dụng nấm men saccharomyces cerevisiae cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước trong phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kì và lên men liên tục

Nhiệm vụ và nội dung Nhiệm vụ  Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men ethanol sử dụng nấm men cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước  Tái sử dụng nấm me

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

TRẦN VĂN NGUYÊN

ỨNG DỤNG NẤM MEN SACCHAROMYCES

CEREVISIAE CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BẸ LÁ

DỪA NƯỚC TRONG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN TĨNH

NHIỀU CHU KÌ VÀ LÊN MEN LIÊN TỤC

Chuyên ngành: Thực phẩm và đồ uống

Mã số: 12110207

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Cán bộ chấm nhận xét 1:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: CN Thực Phẩm & Đồ Uống Mã số: 605402

I Tên đề tài

ỨNG DỤNG NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE CỐ ĐỊNH

TRÊN CHẤT MANG BẸ LÁ DỪA NƯỚC TRONG PHƯƠNG PHÁP LÊN

MEN TĨNH NHIỀU CHU KÌ VÀ LÊN MEN LIÊN TỤC

II Nhiệm vụ và nội dung

Nhiệm vụ

 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men

ethanol sử dụng nấm men cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước

 Tái sử dụng nấm men cố định để lên men ethanol theo phương pháp chu kỳ ở

qui mô phòng thí nghiệm

 Khảo sát khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp liên tục

chemostate

Nội dung

 Xác định tỉ lệ giống cấy thích hợp cho quá trình lên men ethanol sử dụng nấm

men cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước

 Xác định khả năng lên men ethanol của nấm men cố định khi tái sử dụng theo

phương pháp chu kì ở qui mô phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -

 Xác định khả năng ứng dụng của nấm men cố định khi lên men ethanol theo phương pháp liên tục

III Ngày giao nhiệm vụ

14/01/2013

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ

01/12/2013

V Cán bộ hướng dẫn

PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

Tp Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2013

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

em tự tin bước vào đời

Cuôi cùng, tôi xin ơn bạn bè đã quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

TP Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 12 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Trần Văn Nguyên

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên chất

mang từ bẹ lá dừa nước được dùng để lên men ethanol theo phương pháp chu kì và phương pháp liên tục Khi so sánh với tỉ lệ giống cấy truyền thống (1.0×107

cfu/mL), tỉ lệ giống cấy cao sẽ làm giảm sự sinh trưởng của nấm men cố định, rút ngắn thời gian lên men, tăng hiệu suất sinh tổng hợp ethanol Tỉ lệ giống cấy thích hợp là 6.0×107 cfu/mL Trong phương pháp lên men tĩnh, nấm men cố định có thể tái sử dụng không ít hơn 20 chu kì lên men và hiệu suất sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định luôn cao hơn nấm men tự do Khi thử nghiệm ứng dụng nấm men

cố định để lên men ethanol ở qui mô pilot, hàm lượng đường sót giảm và hàm lượng cồn cuối tăng dần qua 3 chu kì tái sử dụng Khi ứng dụng nấm men cố định lên men ethanol theo phương pháp liên tục với nồng độ đường ban đầu 200 g/L, hệ thống hoạt động ổn định trong 20 ngày với tốc độ pha loãng 0.03 h-1, hàm lượng đường sót xấp xỉ 10 g/L và hàm lượng cồn không thấp hơn 10% (v/v)

ABSTRACT

The immobilized yeast Saccharomyces cerevisiae on Nypa fruticans leaf

sheath pieces was used in the repeated batch and continuous ethanol fermentation Compared to the conventional pitching rate of 1.0×107 cfu/mL, higher inoculum size decreased the yeast growth, reduced the fermentation time and improved the ethanol yield The suitable inoculum size for ethanol fermentation was 6.0×107cfu/mL In the repeated batch ethanol fermentation, the fixed cells was not less than

20 cycles and ethanol yield was always higher than that of the free cells The application of immobilized yeast to ethanol fermentation in pilot scale showed that the residual sugar level was gradually reduced and the final ethanol concentration was increased during the reuse of the biocatalyst for 3 cycles The immobilized yeast was also tested for continuous ethanol fermentation using medium with initial sugar concentration of 200 g/L The system stably ran for a period of 20 days at the dilution rate of 0.03 h-1; the residual sugar level in the culture outlet was approximately 10 g/L and the ethanol concentration was not less than 10% (v/v)

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận án

Trần Văn Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về nấm men cố định trên chất mang giàu cellulose 3

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về cố định tế bào 3

2.2.2 Chất mang giàu cellulose để cố định tế bào nấm men 5

2.2.3 Dừa nước và khả năng cố định nấm men trên bẹ lá dừa nước 6

2.2 Ứng dụng của nấm men cố định trong lên men ethanol 7

2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình lên men ethanol 7

2.2.2 Khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong lên men ethanol theo phương pháp chu kì 9

2.2.3 Ứng dụng của nấm men cố định trong quá trình lên men ethanol theo phương pháp liên tục 10

Chương 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Nguyên liệu 13

3.3.1 Nấm men 13

3.3.2 Chất mang 13

3.3.3 Môi trường nhân giống, môi trường cố định, môi trường lên men 13

3.2 Nội dung nghiên cứu 14

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 14

3.3.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 15

3.3 Phương pháp phân tích, tính toán và xử lý số liệu 20

3.3.1 Các phương pháp phân tích 20

3.3.2 Các công thức tính toán 21

3.3.3 Phương pháp xử lý kết quả thí nghiệm 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

4.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men ethanol sử dụng nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 24

4.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình sinh trưởng của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 24

4.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình sử dụng cơ chất của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 26

4.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 28

4.2 Khả năng tái sử dụng của nấm men cố định 30

4.2.1 Khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định trong quá trình tái sử dụng 30

4.2.2 Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước trong quá trình tái sử dụng 35

4.2.3 Khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước ở qui mô pilot 38

4.3 Khảo sát khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp liên tục chemostate 41

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến mật độ tế bào tự do trong quá trình lên men 41

4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến quá trình sử dụng đường trong lên men liên tục 43

4.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định trong lên men liên tục 44

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Một số chất mang giàu cellulose từ thực vật dược nghiên cứu để lên men

sản xuất ethanol với nấm men cố định Saccharomyces cerevisiae 5

Bảng 2.2: Thành phần chất khô trong của bẹ lá dừa nước (Tamunaidu và cộng sự,

2011) 7

Bảng 3.1: Thành phần môi trường nhân giống, môi trường cố định và môi trường

lên men ethanol 13

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến tốc độ sinh trưởng trung bình của

nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 25

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến thời gian lên men và tốc độ sử dụng

đường trung bình của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 27

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến nồng độ ethanol cuối, tốc độ sinh

tổng hợp ethanol trung bình và hiệu suất chuyển hóa đường thành ethanol của nấm men cố định trên bẹ lá dừa nước 29

Bảng 4.4: Hàm lượng đường sót trong canh trường với nấm men cố định và nấm

men tự do khi tái sử dụng nấm men 30

Bảng 4.5: Thời gian lên men trong quá trình tái sử dụng nấm men cố định 32 Bảng 4.6: Tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định và nấm men tự do 34 Bảng 4.7: Hàm lượng ethanol cuối trong canh trường với nấm men cố định và nấm

men tự do trong quá trình tái sử dụng 35

Bảng 4.8: Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol của nấm men cố định và nấm men tự do

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây dừa nước (Nypa fruticans) 6

Hình 2.2: a): Bẹ lá dừa nước vừa được cắt khỏi cây dừa nước; (b): Bẹ lá dừa nước

đã qua quá trình bóc vỏ ngoài và tạo hình để làm chất mang cố định nấm men 7

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu 14

Hình 3.2: Quy trình cố định nấm men trên chất mang bẹ lá dừa nước (môi trường

nhân giống và môi trường cố định đều đã qua tiệt tùng) 15

Hình 3.3: Chất mang bẹ lá dừa nước đã được cắt thành khối hình hộp chữ nhật 16

Hình 3.4: Sơ đồ lên men liên tục 19

Hình 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình sinh trưởng của nấm men cố

định trên chất mang bẹ lá dừa nước 24

Hình 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy (đơn vị đo: 106 cfu/mL) đến sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men với nấm men cố định trên chất mang bẹ

lá dừa nước 26

Hình 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy (đơn vị đo: 106 cfu/mL) đến sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men với nấm men cố định trên chất mang bẹ

lá dừa nước 28

Hình 4.4: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men ở 3 chu kì 38

Hình 4.5: Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong quá trình lên men ở 3 chu kì 40

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến mật độ tế bào tự do trong

quá trình lên men 41

Hình 4.7: : Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến quá trình sử dụng cơ chất

của nấm men cố định 43

Hình 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu đến quá trình sinh tổng hợp

ethanol của nấm men cố định 44

Chương 1 GIỚI THIỆU

Hiện nay, các nguồn năng lượng hóa thạch đang cạn kiệt dần nên nhu cầu tìm ra nguồn năng lượng thay thế trở thành mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới Ethanol sinh học là được xem là nguồn năng lượng sạch, có khả năng tái tạo nên đáp ứng được nhu cầu này Do đó, việc nâng hiệu quả và giảm chi phí cho quy trình sản xuất ethanol sinh học đã trở thành hướng nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học (Outlaw và cộng sự, 2005; Sanchez và Cardona, 2008; Wall

và cộng sự, 2008; Vertes và cộng sự, 2010)

Trong số các phương pháp làm tăng hiệu quả kỹ thuật của quá trình lên men ethanol thì sử dụng nấm men cố định được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm hơn cả Hầu hết các nghiên cứu trước đây đều kết luận rằng nấm men cố định có tốc

độ sử dụng cơ chất cao hơn, thời gian lên men ngắn hơn, hoạt tính ổn định hơn so với nấm men tự do Các chất mang tác dụng bảo vệ tế bào chống lại những ảnh hưởng bất lợi của môi trường Ngoài ra, các nhà sản xuất dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, tái sử dụng nấm men cố định nhiều lần trong phương pháp lên men tĩnh hoặc sử dụng trong phương pháp lên men liên tục để làm tăng năng suất (Kourkoutas và cộng sự, 2004) Chính vì những ưu điểm trên mà việc nghiên cứu để tìm ra những chất mang mới đem lại hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao hơn là rất cần thiết

Từ thập kỷ 70 đến nay, rất nhiều loại chất mang đã được sử dụng để cố định nấm men, từ những chất mang vô cơ (như hạt thủy tinh xốp, oxit titan, oxit kẽm), chất mang hữu cơ tổng hợp (như gel alginate, polyinylalcohol) cho đến các chất mang hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên (chủ yếu là các chất mang giàu cellulose như miếng trái cây, mẫu thân cây, mùn cưa) Những chất mang tổng hợp thường đắt tiền

do chi phí sản xuất cao, đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật cố định khá phức tạp, một số chất mang không thân thiện với môi trường Gần đây, nhóm chất mang giàu cellulose từ thực vật được quan tâm nghiên cứu rộng rãi để cố định nấm men (như

vỏ trấu, vỏ cam, vỏ dưa hấu, vỏ nho, thân mía, thân ngô, thân lúa miến) do có nhiều

ưu điểm nổi trội như đa dạng về hình dạng chất mang, dễ tìm kiếm và thu nhận, giá

thành thấp, thân thiện với con người và môi trường, kỹ thuật cố định đơn giản, khá bền về mặt cơ lý (Kourkoutas và cộng sự, 2004)

Bẹ lá dừa nước (Nypa fruticans) cũng là một nguyên liệu giàu cellulose có cấu

trúc xốp Đến thời điểm hiện nay vẫn chưa có công bố khoa học nào về cố định nấm men trên loại chất mang này

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Ứng dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước trong phương pháp lên men tĩnh

nhiều chu kì và lên men liên tục ” Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào:

 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men ethanol với nấm men cố định

 Khảo sát khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong phương pháp lên men chu kì

 Thử nghiệm ứng dụng nấm men cố định để lên men ethanol ở qui mô pilot

 Khảo sát khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp liên tục Chúng tôi hy vọng rằng hướng nghiên cứu ứng dụng nấm men cố định trên chất mang giàu cellulose để sản xuất ethanol sinh học sẽ thu hút sự quan tâm nhiều hơn của các nhà khoa học trong nước, tạo tiền đề cho việc ứng dụng nấm men cố định

để sản xuất ethanol sinh học tại Việt Nam

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về nấm men cố định trên chất mang giàu cellulose

2.2.1 Giới thiệu sơ lược về cố định tế bào

Ngày nay, kĩ thuật cố định tế bào giữ vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp lên men và được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Một số quá trình lên men với tế bào cố định đã được ứng dụng ở quy mô công nghiệp (Puligundla và cộng sự, 2011)

Cố định tế bào có thể được hiểu là kỹ thuật nhốt tế bào vào trong một vùng không gian nhất định để hạn chế khả năng di chuyển song vẫn duy trì hoạt tính xúc tác của tế bào Như vậy, tế bào cố định có thể được ứng dụng trong các hệ lên men liên tục hoặc sử dụng nhiều lần trong hệ lên men chu kì Kỹ thuật cố định tế bào cần phải đạt được một số yêu cầu chung như sau:

 Quy trình cố định phải đơn giản, chất mang dễ tìm thấy trong tự nhiên, dễ thực hiện ở quy mô công nghiệp với chi phí thấp

 Hoạt tính tế bào sau quá trình cố định không được giảm, tỷ lệ tế bào thoát ra khỏi chất mang phải thấp trong quá trình sử dụng

 Chất mang chứa tế bào cố định phải có cấu trúc thuận lợi cho quá trình truyền khối, tế bào trên chất mang phải dễ dàng tiếp xúc với cơ chất trong môi trường

 Tế bào cố định có thể được tái sử dụng nhiều lần nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính của tế bào ổn định (Chandel và cộng sự, 2009; Kourkoutas và cộng sự, 2006; Mallios và cộng sự, 2004; Readdy và cộng sự, 2006; Tsakiris và cộng sự, 2004) Hiện nay, kỹ thuật cố định tế bào được chia thành bốn nhóm chính dựa theo cơ chế cố định, bao gồm:

 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn: hấp phụ tế bào lên chất mang bằng các tương tác vật lý hoặc tạo liên kết cộng hóa trị giữa tế bào và bề mặt chất mang

 Cố định trong chất mang dạng gel

 Kết bông tế bào: cố định tế bào không sử dụng chất mang bằng phương pháp

tự nhiên (tự kết bông) hoặc phương pháp sử dụng tác nhân hóa học tạo liên kết ngang giữa các tế bào

 Nhốt tế bào bằng phương pháp cơ học bên trong các màng bao (Kourkoutas

và cộng sự, 2004)

Trong sản xuất ethanol, sử dụng phương pháp cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn là phổ biến nhất vì kỹ thuật cố định đơn giản, dễ ứng dụng trong sản xuất

ở qui mô lớn và chi phí thấp

Kỹ thuật cố định này dựa vào các tương tác vật lý như: liên kết tĩnh điện, lực ion, tương tác kị nước, lực mao quản hoặc liên kết cộng hóa trị giữa tế bào và chất mang (Kourkoutas và cộng sự, 2004; Souza và cộng sự, 1986) Yếu tố quan trọng trong quá trình cố định bằng phương pháp hấp phụ là độ xốp của chất mang và kích thước của lỗ mao quản trong cấu trúc chất mang (Branyik và cộng sự, 2004) Khi cố định trên chất mang, tế bào sẽ xâm nhập vào trong cấu trúc rỗng xốp của chất mang cho đến khi sự cố định của chúng bị ngăn cản bởi sự có mặt của những tế bào khác (Martynenko và Gracheva, 2003)

Sự phát triển của tế bào trong mạng lưới rỗng xốp này tùy thuộc vào độ rỗng xốp của chất mang Hàm lượng oxy thâm nhập vào mạng lưới xốp này giảm theo chiều từ bên ngoài vào bên trong Mật độ tế bào ở gần bề mặt chất mang thường cao hơn, do đó hoạt tính trao đổi chất của những tế bào ở bên trong và ở gần bề mặt có thể rất khác nhau Ngoài ra, những tế bào được định vị trên mặt ngoài của chất mang sẽ sinh sản và dễ dàng thoát khỏi chất mang Điều này dẫn tới canh trường lên men bao gồm cả những tế bào đã được cố định và những tế bào ở dạng tự do (Martynenko và Gracheva, 2003)

Để cố định nấm men trên chất mang bằng phương pháp hấp phụ, người ta dùng phương pháp cổ điển là ngâm chất mang trong huyền phù vi sinh vật (Martynenko và Gracheva, 2003) Vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ lên chất mang đó Để hỗ trợ cho quá trình cố định, người ta có thể dùng cánh khuấy (Nikolaos và cộng sự, 2007) hay bơm hồi lưu huyền phù vi sinh vật qua cột chứa chất mang (Tsakiris và cộng sự, 2004) Khi đó điều kiện tiếp xúc giữa chất mang và vi sinh vật tốt hơn nên hiệu suất cố định được cải thiện đáng kể

Chất mang được sử dụng trong kĩ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men ethanol cần thõa mãn những yêu cầu sau:

 Chất mang phải có bề mặt lớn với nhiều nhóm chức để kết gắn với tế bào

 Độ xốp của chất mang phải tương đối đồng đều, cho phép sự trao đổi tự do của cơ chất, sản phẩm, cofactor và các chất khí giữa tế bào cố định và dịch lên men

 Chất mang phải giữ được độ ổn định về cơ lý, hóa học, sinh học và không bị phá hủy dễ dàng bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất hay lực cắt

 Chi phí chất mang và kỹ thuật cố định phải thấp (Chandel và cộng sự, 2009; Kourkoutas và cộng sự, 2006; Mallios và cộng sự, 2004; Readdy và cộng sự, 2006; Tsakiris và cộng sự, 2004)

2.2.2 Chất mang giàu cellulose để cố định tế bào nấm men

Từ những năm 1970 đến nay đã có rất nhiều chất mang được nghiên cứu, bao gồm cả chất mang vô cơ, chất mang hữu cơ và gần đây nhất là các chất mang từ thực vật giàu cellulose Chất mang giàu cellulose từ thực vật có một số ưu điểm và nhược điểm như sau:

- Ưu điểm:

 Rẻ và đa dạng về hình dạng so với những chất mang khác

 Có nguồn gốc từ nhiên nên thân thiện với môi trường và con người, là chất mang thích hợp nhất trong sản xuất thực phẩm

 Độ bền cơ học cao hơn so với một số chất mang hữu cơ (như gel alginate, carrargeenan…)

- Nhược điểm: thành phần hóa học của chất mang có thể không ổn định

Bảng 2.1: Một số chất mang giàu cellulose từ thực vật dược nghiên cứu để lên men

sản xuất ethanol với nấm men cố định Saccharomyces cerevisiae

Chất mang Cơ chất lên men Sản phẩm Tác giả

Vỏ trấu Glucose, saccharose Ethanol Edita và cộng sự, 2010

Thân lúa miến Glucose, saccharose Ethanol Jianliang và cộng sự, 2010

Bã quả điều Dịch ép quả điều Ethanol Pacheco và cộng sự, 2010

Thân mía lau Dịch thủy phân mía lau Ethanol Chandel và cộng sự, 2009

Thân mía Mật rỉ Ethanol Liang và cộng sự, 2008

Thân ngô Glucose Ethanol Vucurovic và cộng sự, 2008

Vỏ cam Glucose Ethanol Plessas và cộng sự, 2007

Do có nhiều ưu điểm nên trong những năm gần đây, nhiều loại chất mang giàu cellulose mới đã được nghiên cứu để sử dụng trong lên men ethanol Hầu hết chất mang giàu cellulose đều có nguồn gốc từ thực vật (thân cây, bẹ lá, quả, cuống quả) Một số chất mang giàu cellulose được trình bày trong bảng 2.1

2.2.3 Dừa nước và khả năng cố định nấm men trên bẹ lá dừa nước

Dừa nước có tên khoa học là Nypa fruticans, còn được gọi là Attap palm

(Singapore), Nipa palm (Philippines), Mangrove palm hoặc Nipah palm (Malaysia),

là loài duy nhất trong họ Cau sinh sống trong đầm lầy Loài dừa nước là loài duy nhất trong chi Nypa, sinh trưởng tại miền nam châu Á và phía bắc châu Úc Hóa thạch của phấn hoa dừa nước đã được xác định cách nay khoảng 70 triệu năm về trước

Dừa nước thuộc khóa phân loại thực vật như sau:

Hình 2.1: Cây dừa nước (Nypa fruticans)

Thành phần hóa học của bẹ lá dừa nước được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần chất khô trong của bẹ lá dừa nước (Tamunaidu và cộng sự, 2011)

Hình 2.2: a): Bẹ lá dừa nước vừa được cắt khỏi cây dừa nước; (b): Bẹ lá dừa nước

đã qua quá trình bóc vỏ ngoài và tạo hình để làm chất mang cố định nấm men

2.2 Ứng dụng của nấm men cố định trong lên men ethanol

2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình lên men ethanol

Tỷ lệ giống cấy cao gần đây đã được coi là một phương pháp kỹ thuật để cải thiện hiệu quả quá trình lên men ethanol Ưu điểm điển hình nhất của phương pháp

sử dụng tỷ lệ giống cấy cao là rút ngắn thời gian lên men Trong sản xuất ethanol

truyền thống, tỷ lệ giống cấy thường dao động từ 5-20 triệu tế bào/ml dịch nha (Erten và cộng sự, 2007) Với phương pháp sử dụng tỷ lệ giống cấy cao, các nhà nghiên cứu đã tăng tỷ lệ giống cấy lên 4 đến 5 lần so với tỷ lệ cấy truyền thống, để làm tăng tốc độ lên men

Đối với quá trình lên men ethanol sản xuất bia, kết quả của Nguyen và cộng sự (2009) cho thấy tỷ lệ giống cấy cao làm tăng tốc độ sử dụng đường lên 24-67% và tốc độ sinh tổng hợp ethanol lên 32 -73% so với tỷ lệ giống cấy truyền thống

Nghiên cứu của Verbelen (2008) cho thấy số tế bào cực đại trong canh trường sẽ gia tăng khi tỷ lệ giống cấy tăng, tuy nhiên lượng nấm men được sinh ra trong quá trình lên men là như nhau và không phụ thuộc vào tỷ lệ giống cấy Tỷ lệ

tế bào sống cũng được khảo sát trong quá trình lên men khi sử dụng tỷ lệ giống cấy cao Và tỷ lệ tế bào sống luôn đạt trên 93% so với tổng số tế bào trong dịch lên men

Tỷ lệ tế bào sống tăng cao trong canh trường chứng tỏ nấm men co hoạt tính trao đổi chất mạnh

Ngoài ra, O'Connox Cox và Ingledew (1991) cho rằng ở tỷ lệ giống cấy cao, tốc độ sinh tổng hợp ethanol không phụ thuộc vào cân bằng dinh dưỡng trong môi trường Như vậy, khi sử dụng tỷ lệ giống cấy cao, hàm lượng các hợp chất vi dinh dưỡng như vitamin, khoáng có thể bị giới hạn nhưng nấm men vẫn lên men tốt Kết quả nghiên cứu còn cho thấy, ở tỷ lệ giống cấy thông thường, hàm lượng ethanol thu được chỉ đạt từ 4.9 đến 5.3 % w/v, trong khi đó hàm lượng ethanol thu được từ 5.4 đến 6.1 % w/v ở tỷ lệ giống cấy cao Tương tự, một nghiên cứu gần đây của Nguyen và cộng sự (2009) kết luận rằng hàm lượng ethanol cũng tăng từ 9.20 ở tỷ

lệ giống cấy truyền thống lên đến 10.05 % (v/v) ở tỷ lệ giống cấy cao Như vậy, tăng tỷ lệ giống cấy còn góp phần làm tăng hàm lượng ethanol trong canh trường lên men

Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Nikolic (2009), nồng độ ethanol cực đại, cũng như hiệu suất sinh tổng hợp ethanol đạt cực đại ở tỷ lệ giống cấy 2% (w/v), cao hơn nhiều so với tỷ lệ giống cấy 10 đến 20% (w/v) Theo tác giả này nếu tăng

tỷ lệ giống cấy cao hơn một ngưỡng giá trị nhất định sẽ không làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp ethanol

2.2.2 Khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong lên men ethanol theo

So với quá trình lên men bằng nấm men tự do thông thường, việc tái sử dụng nấm men cố định sẽ rút ngắn đáng kể thời gian lên men Reddy và cộng sự (2006)

đã cố định nấm men trên chất mang là những miếng ổi và tái sử dụng nấm men qua

15 chu kỳ Tốc độ lên men của nấm men cố định được xác định trong quá trình tái

sử dụng để lên men ở các nhiệt độ khác nhau Kết quả cho thấy, sau 3 chu kỳ tái sử dụng, thời gian lên men của nấm men cố định sẽ giảm 2 - 3 lần so với các chu kì lên men đầu tiên

Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong các nghiên cứu khác về tái sử dụng nấm men cố định như nghiên cứu của Mallouchos và cộng sự (2002) cố định nấm men trên vỏ nho, của Bekatorou và cộng sự (2002) cố định nấm men trên quả sung khô, của Kourkoutas và cộng sự (2003), của Tsakiris và cộng sự (2003) cố định nấm men trên nho khô

Liang (2008) đã tái sử dụng nấm men cố định trên thân mía để lên men ethanol

từ mật mía Quá trình thực hiện thành công với 10 chu kì mà không có sự suy giảm hoạt tính lên men của nấm men cố định Số lượng tế bào cố định trên chất mang sẽ tăng dần trong quá trình tái sử dụng nấm men Ngược lại, các tế bào nấm men thoát

ra khỏi chất mang vào dịch lên men sẽ giảm dần Ariyajaroenwong và cộng sự

(2012), đã sử dụng thân cây lúa miến để cố định nấm men S cerevisiae và cũng thu

được kết quả tương tự Môi trường lên men ethanol là dịch thủy phân từ hạt lúa miến chứa 230 g đường/ lít Nấm men cố định có thể được sử dụng ít nhất là 8 chu

6 chu kỳ lên men Kết quả cho thấy rằng hàm lượng ethanol tạo thành trong chu kỳ đầu ít hơn so với các chu kì sau So với tế bào cố định, lượng ethanol được tạo thành bởi các tế bào tự do trong chu kỳ đầu tiên cao hơn, nhưng giảm dần và thấp hơn ở các chu kì sau Các tác giả cho rằng đó là do các tế bào cố định có tỷ lệ acid béo bão hòa cao hơn so với các tế bào tự do Độ bão hòa acid béo của tế bào cố định

sẽ tăng lên dần trong quá trình tái sử dụng và giúp cho chúng thích nghi với điều kiện lên men ethanol tốt hơn so với tế bào tự do Do đó, hiệu suất lên men trong chu

kỳ tiếp theo của nấm men cố định cao hơn so với các tế bào tự do

Nghiên cứu của Laopaiboon (2012) cho thấy S cerevisiae TISTR 5048 cố

định trên lõi ngô cho nồng độ ethanol cuối, hiệu suất, tốc độ sinh tổng hợp cồn cao hơn đáng kể so với nấm men cố định trong calcium alginate (P < 0,05) Kết quả còn cho thấy lõi ngô có độ bền cơ học và độ ổn định tốt để cố định tế bào nấm men Không có sự thay đổi về cấu trúc của lõi ngô sau 8 chu kỳ lên men Ngược lại, một

số hạt Ca-alginate đã bị vỡ sau 3 chu kỳ sử dụng, và sau 8 chu kỳ lên men, số lượng hạt alginate chỉ còn lại 60% so với ban đầu Hiện tượng vỡ hạt khi tái sử dụng Ca-alginate trong quá trình lên men ethanol cũng đã được Phisalaphong và cộng sự (2007) và Ellaiah và cộng sự (2004) ghi nhận trong các nghiên cứu trước đây Độ bền hay độ cứng của gel alginate có thể được cải thiện bằng cách tăng nồng độ alginate trong hạt gel hoặc tăng nồng độ CaCl2trong dung dịch ngâm hạt gel khi tạo hạt Tuy nhiên, các chất dinh dưỡng và các sản phẩm khuếch tán gặp nhiều khó khăn hơn, kết quả là giảm tốc độ lên men (Najafpour và cộng sự 2004; Idris và Suzana 2006) Như vậy nấm men cố định trên các chất mang giàu cellulose có những ưu điểm vượt trội so với chất mang dạng gel như gel alginate trong quá trình tái sử dụng để lên men ethanol

2.2.3 Ứng dụng của nấm men cố định trong quá trình lên men ethanol theo

phương pháp liên tục

Quá trình lên men liên tục được sử dụng trong nhiều lĩnh vực của công nghiệp lên men Do hệ thống lên men làm việc trong một thời gian dài không bị gián đoạn nên năng suất sản xuất của phương pháp liên tục thường cao hơn phương pháp lên men chu kỳ Quá trình lên men liên tục thường có tốc độ sinh tổng hợp sản

phẩm cao hơn và chi phí thấp hơn so với lên men chu kỳ, từ đó làm tăng hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp lên men (Kourkoutas và cộng sự 2002)

Najafpour và cộng sự (2003) đã sử dụng nấm men S cerevisiae cố định trong

gel alginate để sản xuất ethanol trong một thiết bị lên men liên tục Môi trường lên men chứa 150 g glucose/lít Tốc độ sinh tổng hợp cồn của quá trình lên men liên tục

là 2.8 g/L.h cao hơn so với quá trình lên men chu kì xấp xỉ 10 lần (0.29 g/Lh) Nồng

độ ethanol trong cột lên men liên tục cũng cao hơn xấp xỉ 10 lần so với canh trường của quá trình lên men theo phương pháp chu kì

Trước đó, Sheoran (1998), đã sử dụng phương pháp lên men liên tục để sản xuất ethanol từ rỉ đường với nấm men cố định trong calcium alginate Khi sử dụng môi trường chứa 10% w/v sucrose với tốc độ pha loãng là 0,20 h-1

thì tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm là 60,4 gl-1h-1

Vasconcelos (2004) đã sử dụng thân cây mía để cố định nấm men sản xuất ethanol liên tục từ môi trường mật rỉ đường Tốc độ sinh tổng hợp ethanol và hiệu suất lên men tương ứng là 29,64 g/Lh và 86,40 %, ở tốc độ pha loãng 0,83h-1 Hệ thống lên men được duy trì ổn định cho trong 60 trong ngày

Dựa trên những vấn đề liên quan đến luận văn, sau khi thực hiện xong phần Tổng quan tài liệu, chúng tôi có một số nhận định như sau đây:

 Đối với nhóm chất mang từ thực vật giàu cellulose đến nay đã có nhiều nghiên cứu về cố định nấm men và ứng lên men ethanol theo phương pháp tĩnh nhiều chu kì và phương pháp liên tục Tuy nhiên chưa có công bố khoa học nào về việc sử dụng bẹ lá dừa nước làm chất mang để cố định nấm men theo tài liệu ở trong và ngoài nước

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra những nội dung nghiên cứu như sau:

 Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men ethanol với nấm men cố định

 Khảo sát khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong phương pháp lên men chu kì

 Thử nghiệm ứng dụng nấm men cố định để lên men ethanol ở qui mô pilot

 Khảo sát khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp liên tục

Chương 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu

3.2.2 Nấm men

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng trong nghiên cứu này do

phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa – Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được giữ giống trên môi trường thạch nghiêng

và được bảo quản ở nhiệt độ 4oC

3.2.3 Chất mang

Bẹ lá dừa nước (Nypa fruticans) sử dụng trong nghiên cứu này được thu

nhận từ khu vực quận 7, TP Hồ Chí Minh Đầu tiên, bẹ lá dừa nước được cắt khỏi thân cây dừa nước, tách bỏ phần vỏ cứng bên ngoài Sau đó, phần còn lại sẽ được cắt thành khối hình hộp chữ nhật có kích thước 3.5cm x 3.5cm x 0.5 cm

3.2.4 Môi trường nhân giống, môi trường cố định, môi trường lên men

Bảng 3.1: Thành phần môi trường nhân giống, môi trường cố định và môi trường

lên men ethanol

Thành phần

Hàm lượng (g/L)

Môi trường nhân giống

Môi trường

cố định

Môi trường lên men ethanol

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến động học quá trình lên men ethanol, khả năng tái sử dụng nấm men cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước khi lên men theo phương pháp chu kỳ và khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp liên tục Nội dung nghiên cứu được trình bày chi tiết như hình 2.1

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu

Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ

lệ giống cấy đến động học

quá trình lên men ethanol với

nấm men cố định

Khảo sát khả năng tái sử dụng

của nấm men cố định trong

phương pháp lên men chu kì

Thử nghiệm ứng dụng nấm

men cố định để lên men

ethanol ở qui mô pilot

Khảo sát khả năng lên men

của nấm men cố định theo

Số chu kì tái sử dụng nấm men cố định

Lượng ethanol được tạo thành Lượng đường sót

Khả năng sinh tổng hợp ethanol của nấm men trong quá trình lên men

Khả năng sử dụng cơ chất của nấm men trong quá trình lên men

Thời gian lên men liên tục

3.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu

Quy trình cố định Saccharomyces cerevisiae trên chất mang bẹ lá dừa nước

được mô tả như trong hình 2.2

Hình 3.2: Quy trình cố định nấm men trên chất mang bẹ lá dừa nước (môi trường nhân

giống và môi trường cố định đều đã qua tiệt tùng) Nhân giống nấm men

Nấm men trước khi sử dụng cần được nhân giống hai cấp:

Bẹ lá dừa nước

Nước cất vô trùng

Nhân giống cấp 2

Nước

Dịch lỏng

Nước thải, chất bẩn

 Lấy 1 vòng que cấy sinh khối từ ống thạch nghiêng cho vào erlen 250 mL chứa

10 mL môi trường, nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 28 - 30oC để thu nhận giống cấp 1

 Lấy 10 mL canh trường cấp 1 cho vào erlen chứa 90 mL môi trường cấp 2, nuôi cấy trong 24h ở nhiệt độ 28 - 30o

C để thu nhận giống cấp 2

Chuẩn bị chất mang

Hình 3.3: Chất mang bẹ lá dừa nước đã được cắt thành khối hình hộp chữ nhật Rửa chất mang

Chất mang sau khi được cắt thành khối khối hình hộp chữ nhật có kích thước phù

hợp sẽ được rửa lại với nước thủy cục

Tiệt trùng chất mang

Cho các miếng chất mang vào Erlen 500mL và hấp tiệt trùng trong autoclave ở

121oC, 1 atm trong 20 phút Sau đó, các miếng chất mang được làm nguội về nhiệt độ phòng

Cố định nấm men

Pha huyền phù nấm men với mật độ 40×106 cfu/mL trong môi trường cố định Sau

đó, tiến hành phối trộn 150 mL huyền phù nấm men với 30 g chất mang đã hấp tiệt trùng trong Erlen, rồi lắc đảo hỗn hợp ở 30o

3.2.2.2 Nội dung thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến động học của quá trình lên men ethanol của nấm men cố định

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của các tỉ lệ giống cấy khác nhau đến quá trình lên men của nấm men cố định trên chất mang bẹ lá dừa nước Thí nghiệm được thực hiện trong các erlen 500mL chứa 300mL môi trường lên men và ở nhiệt độ 30oC, tỉ lệ giống cấy được thay đổi lần lượt là 10, 20, 40, 60, 80×106 cfu/mL Quá trình lên men được thực hiện trong 72h Sau mỗi 12 giờ lên men, chúng tôi lấy mẫu để phân tích:

- Sự thay đổi mật độ tế bào trong canh trường

- Sự thay đổi hàm lượng glucose trong dịch lên men

- Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Dựa trên các kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi suy ra các số liệu sau đây:

- Mật độ tế bào cực đại trong quá trình lên men

- Tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men cố định

- Số tế bào nấm men được sinh ra trong quá trình lên men (Hiệu số giữa mật độ tế bào cực đại trong canh trường và mật độ giống cấy ban đầu)

- Độ lên men

- Tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men cố định

- Thời gian lên men

- Nồng độ ethanol cuối

- Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình

- Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol

Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong phương pháp lên men chu kì

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tái sử dụng của nấm men cố định trong phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kì Quá trình lên men được thực hiện ở 30oC trong những erlen 500mL chứa 300mL môi trường lên men Mật độ giống cấy là 60×106 cfu/mL và nhiệt độ lên men là 30oC Quá trình lên men

được xem là kết thúc khi lượng đường trong dịch lên men không thay đổi trong 12 giờ lên men liên tiếp Khi kết thúc mỗi chu kì lên men, nấm men cố định sẽ được vớt ra, rửa lại với nước vô khuẩn và tiến hành lên men chu kì tiếp theo Sau mỗi 12 giờ lên men, chúng tôi lấy mẫu để phân tích:

- Sự thay đổi hàm lượng glucose trong dịch lên men

- Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Dựa trên các kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi suy ra các số liệu sau đây:

- Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol

Ngoài ra chúng tôi còn đánh giá:

- Sự thay đổi hàm lượng đường sót qua các chu kỳ lên men

- Sự thay đổi hàm lượng ethanol cuối qua các chu kỳ lên men

- Số chu kỳ có thể tái sử dụng của nấm men cố định

Thí nghiệm 3: Ứng dụng nấm men cố định để lên men ethanol ở qui mô pilot

Chúng tôi tiến hành lên men ethanol thử nghiệm tại nhà máy với nấm men cố định theo phương pháp lên men chu kì, tái sử dụng nấm men cố định 3 chu kì Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị chứa 1m3 môi trường Nhà máy sử dụng môi trường lên men là mật rỉ đường có nồng độ đường tổng là 160 g/L Mật độ giống cấy là 60×106 cfu/mL Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ phòng Sau mỗi 12 giờ lên men, chúng tôi lấy mẫu phân tích hàm lượng đường sót và nồng độ ethanol trong dịch lên men

Dựa trên các số liệu thu được chúng tôi suy ra các số liệu sau đây:

- Hàm lượng đường sót

- Nồng độ ethanol cuối

- Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol

Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng lên men của nấm men cố định theo phương pháp lên men liên tục chemostate

- Trong thí nghiệm này, quá trình lên men liên tục được thực hiện trong cột lên men cao 1m và đường kính 5 cm, nấm men cố định được cho vào thiết bị với mật độ là 60×106 cfu/mL Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 30oC Khi hàm lượng đường sót trong dịch lên men không thay đổi trong 12 giờ liên men liên tiếp, chúng tôi tiến hành tháo canh trường ra khỏi thiết bị tại cửa đỉnh và nạp môi trường vào thiết bị tại cửa đáy với lưu lượng bằng nhau (Thể tích làm việc của bình lên men là không thay đổi) Lưu lượng nạp môi trường vào thiết bị và lưu lượng tháo canh trường ra khỏi thiết bị sẽ được hiệu chỉnh sao cho hàm lượng đường sót trong dòng canh trường tháo ra khỏi thiết bị lên men là không thay đổi Quá trình lên men được thực hiện trong 20 ngày Trong quá trình lên men liên tục, sau mỗi 12 giờ, chúng tôi lấy mẫu để phân tích:

- Sự thay đổi mật độ tế bào thoát ra trong canh trường

- Sự thay đổi hàm lượng glucose trong dịch lên men

- Sự thay đổi hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Hình 3.4: Sơ đồ lên men liên tục

Dựa trên kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi sẽ suy ra:

Đối với tế bào tự do: lắc đều canh trường, tiến hành lấy mẫu và pha loãng Mật

độ tế bào được xác định bằng phương pháp nuôi cấy khuẩn lạc trong môi trường thạch Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở 35oC trong 48h Mật độ tế bào nấm men tự do được tính bằng cfu/mL môi trường lên men

Đối với tế bào cố định: Tổng số tế bào trong canh trường nấm men định bao gồm các tế bào cố định trên chất mang và các tế bào tự do thoát vào môi trường lên men Để định lượng của các tế bào hấp thụ trên chất mang, cân 10 g chất mang đã cố định nấm men và 90 ml nước cất, xay ở tốc độ 3.500 vòng /phút trong 5 phút để tạo huyền phù vi sinh vật Xác định số tế bào nấm men tự do thoát vào môi trường lên men, phần chất lỏng trong canh trường được lấy mẫu và số lượng tế bào được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch ở 35oC trong 48 giờ Tổng số tế bào trong canh trường nấm men cố định được tính bằng cfu/ml môi trường lên men (Vasconcelos và cộng sự, 2004)

2.3.1.2 Hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu được xác định bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử DNS DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam