Xác định chỉ thị phân tử ssr liên kết với gen chịu nóng và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa chịu nóng

Khảo sát 6 chỉ thị phân tử SSR tập trung ở các vùng giả định thuộc nhiễm sắc thể số 3 và số 4, xác định được 2 chỉ thị phân tử là RM3586 trên nhiễm sắc thể số 3 và RM6089 trên nhiễm sắc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

**********************

NGUYỄN THỊ HOÀNG DIỆP

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR LIÊN KẾT VỚI GEN CHỊU NÓNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHỌN TẠO

GIỐNG LÚA CHỊU NÓNG

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG–HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

ThS Trương Quốc Ánh Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

2 Thư ký: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

3 Phản biện 1: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên

4 Phản biện 2: TS Võ Đình Lệ Tâm

5 Ủy viên: PGS.TS Nguyễn Đức Lượng

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và của Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập-Tự do -Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

I TÊN ĐỀ TÀI

Xác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen chịu nóng và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa chịu nóng

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

Nội dung 1: Xây dựng quần thể lai tạo giữa dòng cho gen và dòng tái tục

Nội dung 2: Lựa chọn phương pháp đánh giá kiểu hình chịu nóng

Nội dung 3: Lựa chọn và ứng dụng marker cho PCR để xác định con lai chứa gen của quần thể lai tạo

Nội dung 4: Ứng dụng chọn dòng bằng marker liên kết trên quần thể con lai

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/08/2013

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 15/01/2014

- Ban giám hiệu trường ĐH Bách Khoa, các thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh học đã tận tình chỉ dạy tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức hết sức quý báu

Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên động viên, hỗ trợ cho con vượt qua nhiều khó khăn trong quá trình học tập

TÓM TẮT

Tại Việt Nam, lúa (Oryza sativa) được xem là cây trồng quan trọng nhất

Tuy nhiên, biến đổi khí hậu mà biểu hiện rõ nhất là sự gia tăng nhiệt độ tác động đến sự sinh trưởng, phát triển và làm giảm năng suất lúa trồng đã và đang ảnh hưởng lớn đến tình hình an ninh lương thực ở nước ta Do đó, nghiên cứu và phát triển những giống lúa cho năng suất cao và chống, chịu được nhiệt độ cao trở nên cần thiết Mục tiêu của đề tài là xác định chỉ thị phân tử liên kết với gen chịu nóng ở cây lúa để ứng dụng các chỉ thị phân tử này vào chọn, tạo giống lúa chịu nóng

Sử dụng kết hợp phương pháp đánh giá chất lượng hạt phấn thông qua tỉ lệ hạt phấn bất dục và xác định tỉ lệ hạt hữu thụ dưới hai điều kiện tự nhiên ở nhà lưới

và điều kiện nóng nhân tạo trong tủ sinh trưởng, đề tài đã xác định được 4 dòng lúa lai là 3, 4, 6, 12 có triển vọng chịu nóng trong số 11 dòng lúa lai thí nghiệm và hai giống bố mẹ là giống chịu nóng N22 và giống tái tục AS996 nhạy nhiệt Khảo sát 6 chỉ thị phân tử SSR tập trung ở các vùng giả định thuộc nhiễm sắc thể số 3 và số 4, xác định được 2 chỉ thị phân tử là RM3586 trên nhiễm sắc thể số 3 và RM6089 trên nhiễm sắc thể số 4 liên kết với gen chịu nóng, thể hiện ở đa hình giữa giống chịu nhiệt và giống nhạy nhiệt Ứng dụng các chỉ thị phân tử này trong chọn các dòng lúa lai chịu nhiệt cho thấy sự phù hợp với kết quả đánh giá kiểu hình

Kết quả của đề tài góp phần vào công tác chọn và tạo các giống lúa mới với

sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử nhằm tạo được giống lúa cho năng suất cao và chống chịu tốt với điều kiện nhiệt độ cao của môi trường trong tương lai

ABSTRACT

Rice (Oryza sativa) is Vietnam's most important crop However, climate

change causing the air temperature to rise, has had a negative impact on the productivity of rice and is now affecting the food security in our country Therefore, research and development of new rice breeds which have a higher productivity and heat tolerance is becoming essential The goal of this project is to identify molecular markers that link heat tolerant genes in rice and to then use these markers to try to develop a heat-tolerant rice plant

Combining the pollen quality assessment method using the pollen sterility ratio and spikelet fertility (seed set rate) under normal temperature in natural conditions and high temperature in a growth chamber, we identified 4 rice breeding lines that have heat tolerance in total 13 rice varieties/lines Surveying the 6 SSR marker on chromosome 3 and 4, we identified the RM3586 and RM6089 marker which has links to the heat tolerance genes These markers showed polymorphism between heat-tolerant and heat-sensitive lines The result of selecting heat-tolerant rice lines using RM3586 and RM6089 markers was accordant with that of phenotyping

These results will contribute to developing new rice breeds with the assistance of molecular markers to create varieties having high productivity and good tolerance to high temperature conditions of the environment in the future

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Ký tên

Nguyễn Thị Hoàng Diệp

MỤC LỤC

TÓM TẮT i

ABSTRACT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU .1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3

2.1 Tổng quan về cây lúa 3

2.1.1 Phân loại thực vật cây lúa 3

2.1.2 Tìm hiểu về genome cây lúa 3

2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam 4

2.3 Tình hình diễn biến khí hậu thế giới và Việt Nam 6

2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của cây lúa 7

2.5 Tính chịu nóng ở cây lúa 9

2.5.1 Đặc điểm thích nghi chịu nóng ở cây lúa 9

2.5.2 Cơ chế của tính chịu nóng 12

2.6 Phương pháp PCR 14

2.6.1 Giới thiệu 14

2.6.2 Nguyên tắc chung 15

2.7 Chỉ thị di truyền 16

2.7.1 Khái niệm 16

2.7.2 Phân loại 17

2.7.3 Chỉ thị phân tử 17

2.8 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 20

2.9 Giới thiệu về microsatellite 21

2.9.1 Khái niệm 21

2.9.2 Các loại microsatellite 21

2.9.3 Vai trò của microsatellite 22

2.9.4 Ưu khuyết điểm của phương pháp SSR 24

2.9.5 Ứng dụng của microsatellite 25

2.10 Tình hình nghiên cứu tính chịu nóng ở cây lúa 25

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 31

3.2 Vật liệu nghiên cứu 31

3.3 Phương pháp nghiên cứu 32

3.3.1 Lai tạo các dòng lúa từ giống chịu nhiệt và giống tái tục 32

3.3.2 Chuẩn bị quần thể thí nghiệm 34

3.3.3 Đánh giá kiểu gen quần thể thí nghiệm 36

3.3.4 Đánh giá kiểu hình giống lúa chịu nóng 40

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN .42

4.1 Đánh giá kiểu gen 43

4.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 43

4.1.2 Tuyển chọn các SSR primer cho phản ứng PCR 47

4.1.3 Kết quả kiểm tra đa hình các chỉ thị phân tử trên vật liệu bố mẹ 50

4.1.4 Sản phẩm PCR của quần thể các dòng lúa lai với các chỉ thị phân tử 50

4.2 Kết quả đánh giá kiểu hình tính chịu nóng của các giống/dòng lúa nghiên cứu

55

4.2.1 Kết quả đánh giá độ hữu thụ hạt phấn 56

4.2.2 Đánh giá tỉ lệ hạt hữu thụ (tỉ lệ hạt chắc) 58

4.3 So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể thí nghiệm 62

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .65

5.1 Kết luận 65

5.2 Kiến nghị 65

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các loại chỉ thị DNA 18

Bảng 3.1: Thiết lập nhiệt độ cho tủ sinh trưởng 35

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 40

Bảng 4.1: Kết quả định lượng DNA bằng máy quang phổ kế 45

Bảng 4.2: Trình tự các mồi SSR sử dụng trong thí nghiệm 49

Bảng 4.3: Kết quả đánh giá hạt phấn của các giống/dòng lúa thí nghiệm 56

Bảng 4.4: Kết quả đánh giá tỉ lệ hạt chắc lép của 2 giống lúa bố mẹ và 11 dòng lai trồng ngoài nhà lưới và trong tủ sinh trưởng 59

Bảng 4.5: Kết quả phân loại 11 dòng lai dựa vào tỉ lệ hạt hữu thụ 62

Bảng 4.6: So sánh kiểu gen và kiểu hình quần thể thí nghiệm 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây lúa 3

Hình 2.2 Chỉ thị đồng hợp trội (a) và chỉ thị trội hoàn toàn (b) 19

Hình 3.1 Gieo hạt trong các đĩa petri 34

Hình 3.2 Lúa 30 ngày tuổi trồng tại nhà lưới 35

Hình 3.3 Lúa được chuyển vào trồng trong tủ sinh trưởng 36

Hình 3.4 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR 39

Hình 3.5 Đánh giá chất lượng hạt phấn 41

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm DNA tổng số 46

Hình 4.3 Kết quả kiểm tra đa hình các chỉ thị phân tử trên vật liệu bố mẹ 50

Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM3586 51

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM1278 52

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM5320 53

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6089 53

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6148 54

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR với chỉ thị RM6507 55

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified fragment length polymorphism

AFP: Amplicon length polymorphism

ALP: Amplicon length polymorphism

CTAB: Cetyl trimethylammonium bromide

DAF: DNA amplification fingerprinting

ĐBSCL: Đồng bằng Sông Cửu Long

DH: Double Haploid

EB: Ethidium bromide

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

HSP: Heat shock protein

ISA: Inter – simple sequence repeat amplication

MAS: Marker – assisted selection

MeJA: Methyl jasmonate

NIL: Near isogenic lines

PCR: Polymerase chain reaction

QTL: Quantitive trait loci

RAPD: Random amplified polymorphic DNA

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

RIL: Recombinant inbred line

SSCP: Single strand conformation polymorphism STS: Sequence – tagged sites

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Sự biến đổi khí hậu toàn cầu đang diễn ra ngày càng nghiêm trọng Biểu hiện

rõ nhất là sự nóng lên của trái đất Đến cuối thế kỷ 21, khí hậu trái đất được dự đoán

sẽ trở nên nóng hơn từ 1,8-4oC (IPCC, 2007), do cả những yếu tố từ con người và tự nhiên (Eitzinger và ctv, 2010) Sự phát thải khí nhà kính như carbon dioxide, methane và N2O từ các hệ thống nông nghiệp là một trong những nguồn góp phần vào sự gia tăng nhiệt độ toàn cầu Kết quả nghiên cứu của Viện Lúa quốc tế về sự biến thiên của nhiệt độ ghi nhận từ 1979 đến năm 2003 nhiệt độ cao nhất đã tăng thêm 0,35oC và nhiệt độ thấp nhất tăng thêm 1,13oC

Cây lúa (Oryza Sativa) là một trong những cây lương thực quan trọng cho

khoảng 1/2 dân số thế giới Theo thống kê của bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ, năm 2011 trên thế giới có khoảng 158,5 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng là 697,8 triệu tấn thóc, khoảng 90% diện tích này thuộc các nước châu Á (145,3 triệu ha) với 653,2 triệu tấn thóc chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo thế giới Hiện nay,

sự thay đổi khí hậu đang diễn biến vô cùng phức tạp làm ảnh hưởng đến sản xuất lúa gạo trong tương lai gần Khô hạn, xâm nhập mặn, ngập úng và nhiệt độ cao hơn, đặc biệt trong giai đoạn lúa làm đòng và trổ bông là những hiện tượng ngày càng rõ nét, có ảnh hưởng nhất định với cây lúa Sự gia tăng nền nhiệt độ trong tương lai hay nhiệt độ tăng cao ở vài giai đoạn quan trọng trong chu trình phát triển sẽ làm giảm sản lượng hạt Với tình hình diễn biến xấu của khí hậu, sản lượng lúa ước tính

sẽ giảm bớt đến 41% cho đến cuối thế kỷ 21 (Ceccarelli và ctv, 2010)

Ở Việt Nam, lúa gạo được xem là loại cây trồng quan trọng nhất, và Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ 2 thế giới sau Thái Lan Tuy nhiên, ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, đặc biệt là nhiệt độ tăng đã và đang có ảnh hưởng lớn đến tình hình an ninh lương thực ở nước ta Theo ghi nhận của Trung tâm dự báo khí tượng Thủy văn, nhiệt độ tại miền Nam Việt Nam có ngày đã lên đến 37-

40oC trong mùa hè, đây là ngưỡng gây hại cho cây lúa ở giai đoạn sinh sản Do đó, nhằm đảm bảo sản lượng lúa sản xuất ra trong tương lai, việc nghiên cứu và phát

triển những giống lúa cho năng suất cao và có khả năng chống, chịu stress do nhiệt

độ cao trở nên rất cần thiết

Đề tài “Xác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen chịu nóng và ứng dụng trong chọn tạo giống lúa chịu nóng” được thực hiện làm cơ sở cho việc chọn tạo, phát triển giống lúa chịu nóng đáp ứng với sự thay đổi của khí hậu, phục vụ cho nhu cầu sản xuất hiện nay

Mục tiêu của đề tài:

- Đánh giá kiểu hình chống, chịu nóng của các cá thể trong quần thể lúa lai tạo

- Xác định chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen chịu nóng ở cây lúa

- Ứng dụng chọn giống lúa chịu nóng

Trong giới hạn về thời gian và các điều kiện khác cho phép, đề tài được giới hạn trong các nội dung nghiên cứu như sau:

- Xây dựng quần thể lai tạo giữa dòng cho gen và dòng tái tục

- Lựa chọn phương pháp đánh giá kiểu hình chịu nóng

- Lựa chọn và ứng dụng marker cho PCR để xác định con lai chứa gen của quần thể lai tạo

- Ứng dụng chọn dòng bằng marker liên kết trên quần thể con lai So sánh kết quả chọn lọc bằng chỉ thị phân tử với kết quả đánh giá chọn lọc dựa trên kiểu hình để khẳng định tính chính xác của chọn giống bằng chỉ thị phân tử

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây lúa

2.1.1 Phân loại thực vật cây lúa

Theo phân loại thực vật, cây lúa thuộc

2.1.2 Tìm hiểu về genome cây lúa

Lúa là một trong những cây lương thực quan trọng nhất trên thế giới, có một mối quan hệ liên kết gen quan trọng với các loài ngũ cốc khác và là cây điển hình cho các cây thân cỏ Như là bước đầu tiên trong mô tả đặc điểm chức năng của bộ gen lúa, dự án giải trình tự bộ gen lúa (International Rice Genome Sequencing Project - IRGSP) đã hoàn thành việc phân tích các trình tự của bộ gen cây lúa với

Hình 2.1 Cây lúa

độ chính xác cao trên bản đồ di truyền Các phân tích đã cho thấy một vài đặc trưng nổi bật của bộ gen lúa:

- Kích thước bộ gen là 389 Mb, lớn hơn khoảng 260 Mb so với trình tự đầy đủ của

cây mô hình Arabidopsis thaliana Các tác giả thu thập 370 Mb được giải trình tự

hoàn chỉnh, đại diện cho 95% bao phủ toàn bộ gen và gần như tất cả các vùng điển hình

- Tổng số 37.544 trình tự mã hóa protein liên quan đến yếu tố không chuyển vị được phát hiện, so sánh với khoảng 28.000-29.000 ở Arabidopsis, với một mật độ gen thấp hơn khoảng 1 gen trên 9,9 kb ở lúa Tổng số 2.859 gen có lẽ chỉ có ở lúa

và một vài loài ngũ cốc khác, một vài gen trong số đó có thể phân biệt được cây một

lá mầm và hai lá mầm

- Gene knockout là những công cụ hữu ích để xác định chức năng gen và các gen liên quan đến kiểu hình Các tác giả nhận diện được 11.487 vị trí chèn retrotransposon Tos17, 3.243 trong số đó ở trong các gen

- Khoảng từ 0,38 đến 0,43% của bộ gen nhân chứa các đoạn DNA cơ quan, đại diện

sự chuyển đổi lặp lại và tiếp diễn của DNA cơ quan đến bộ gen nhân

- Phần chuyển vị của lúa chiếm ít nhất 35% và được phổ biến bởi các đại diện từ các liên họ chuyển vị đã biết

- 80.127 điểm đa hình phân biệt giữa 2 phân loài lúa được trồng là japonica và indica, tạo nên một bản đồ di truyền độ phân giải cao cho lúa Tần số đa hình nucleotide đơn (SNP) biến động từ 0,53 đến 0,78% (International Rice Genome Sequencing Project, 2005)

2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam

Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), sản lượng lúa gạo toàn cầu niên vụ 2011/12 đạt 465,4 triệu tấn gạo, tăng 2,65 triệu tấn so với dự báo đưa ra trước đó và tăng 3% so với sản lượng niên vụ 2010/11 do diện tích thu hoạch toàn cầu tăng Sản

lượng tăng tại các nước như: Myanmar, Ấn Độ, Malaysia, Ai Cập, Trung Quốc, Pakistan, EU, Colombia, Nigeria, Australia, Indonesia và Sri Lanka

Trong khi đó, một số nước của khu vực Nam Mỹ sản lượng lúa gạo lại giảm Sản lượng lúa gạo niên vụ 2011/12 của Brazil giảm 136 nghìn tấn, đạt 7,7 triệu tấn gạo do diện tích và năng suất giảm Tại Ecuador giảm 82 nghìn tấn, đạt 624 nghìn tấn gạo do thời tiết mưa quá nhiều vào giai đoạn gieo trồng Sản xuất lúa gạo niên

vụ 2011/12 của Philippines cũng giảm 84 nghìn tấn, đạt 10,6 triệu tấn gạo

Sự hình thành và phát triển sản xuất lúa gạo ở nước ta có lịch sử truyền thống lâu đời và có ảnh hưởng lớn đến đời sống của người dân Việt Nam có khoảng 9,3 triệu ha đất nông nghiệp, phần lớn diện tích đất dành cho trồng lúa là chính khoảng 4,3 triệu ha (chiếm khoảng 46% diện tích đất nông nghiệp)

Năm 2009 diện tích canh tác lúa có khoảng 7,44 triệu ha, năm 2011 tăng thêm 0,21 triệu ha lên 7,65 triệu ha Theo số liệu tạm tính đến tháng 11/2012 cả nước đã gieo trồng được 7 triệu ha lúa Năng suất lúa bình quân 4,2 tấn/ha vào năm

2000 đã tăng lên 5,3 tấn/ha vào năm 2010 Năm 2012 theo số liệu ước tính năng suất có thể đạt mức cao nhất từ trước đến năm 2012 là 5,6 tấn/ha

Từ năm 1990 đến nay, sản lượng lúa gạo Việt Nam liên tục tăng trưởng nhờ biện pháp kỹ thuật canh tác tốt, tăng năng suất và một phần nhờ mở rộng diện tích canh tác hàng năm Sản lượng lúa ở nước ta năm 1990 chỉ dừng lại ở 19,23 triệu tấn nhưng đến năm 2000 đã đạt được 32,51 triệu tấn Năng suất và diện tích canh tác tăng không ngừng đã giúp Việt Nam lần đầu tiên đạt sản lượng ở mức cao nhất từ trước tới nay là 42,31 triệu tấn vào năm 2011 Theo tính toán tạm thời đến tháng 11 năm 2012 nước ta đã thu hoạch được 39,2 triệu tấn

Từ năm 1989, Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ hai trên thế giới Sản lượng lúa gạo Việt Nam đã đạt tới 32,9 triệu tấn suốt từ năm 2000 đến 2002 và lượng gạo xuất khẩu hàng năm khoảng 3,5 triệu tấn Năm 2009 lần đầu tiên Việt Nam đạt 6,05 triệu tấn gạo xuất khẩu Sản lượng xuất khẩu đó không những được duy trì mà còn tăng liên tiếp trong năm 2010 (6,75 triệu tấn) và năm

2011 (7,1 triệu tấn) Tính đến thời điểm tháng 11/2012 nước ta đã xuất được 7,26 triệu tấn Sản lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam đã cung cấp lương thực cho 120 nước trên toàn thế giới (Đoàn Mạnh Tường, 2012)

Khác với các nước khác trong khu vực, sản xuất nông nghiệp nói chung và sản xuất lúa gạo của Việt Nam nói riêng đã phát triển một cách vượt bậc, ổn định và nhanh chóng Sản xuất và xuất khẩu lúa gạo đã giúp cải thiện thu nhập và nâng cao đời sống của nông dân, bên cạnh đó đã nâng cao giá trị hạt gạo của Việt Nam và thúc đẩy ngành nông nghiệp của nước nhà ngày càng phát triển Với kết quả trên, Việt Nam đã nhận được sự đánh giá rất cao của các tổ chức quốc tế và khách hàng nhập khẩu gạo của chúng ta (Bộ NN và PTNT, 2012)

2.3 Tình hình diễn biến khí hậu thế giới và Việt Nam

Trong thế kỷ XX, trên khắp các châu lục và đại dương, nhiệt độ có xu thế tăng rõ rệt Độ lệch tiêu chuẩn của nhiệt độ trung bình toàn cầu là 0,24o

C, sai khác lớn nhất giữa hai năm liên tiếp là 0,29oC (giữa năm 1976 và 1977), tốc độ của xu thế biến đổi nhiệt độ cả thế kỷ là 0,75oC, nhanh hơn bất kỳ thế kỷ nào trong lịch sử,

kỳ 1961-1990

Nhiệt độ cực trị cũng có xu thế phù hợp với nhiệt độ trung bình, kết quả là giảm số đêm lạnh và tăng số ngày nóng và biên độ nhiệt giảm đi chừng 0,07oC mỗi thập kỷ (Nguyễn Văn Thắng và ctv, 2010)

Trong 50 năm (1958 - 2007), nhiệt độ trung bình năm ở Việt Nam đã tăng khoảng 0,1oC qua mỗi thập kỷ Nhiệt độ trung bình một số tháng mùa hè tăng

khoảng 0,1 - 0,3oC/thập kỷ Về mùa đông, nhiệt độ giảm đi trong các tháng đầu mùa

và tăng lên trong các tháng cuối mùa

Có thể nhận thấy nhiệt độ tháng 1 (tháng đặc trưng cho mùa đông), nhiệt độ tháng 7 (tháng đặc trưng cho mùa hè) và nhiệt độ trung bình năm tăng trên phạm vi

cả nước trong 50 năm qua Nhiệt độ vào mùa đông tăng nhanh hơn so với mùa hè

và các vùng có nhiệt độ tăng nhanh hơn là Tây Bắc, Đông Bắc Bộ, Đồng bằng Bắc

Bộ, Bắc Trung Bộ (khoảng 1,3-1,5oC/50 năm) Tính trung bình cho cả nước, nhiệt

độ mùa đông ở nước ta tăng thêm 1,2oC trong 50 năm qua Nhiệt độ tháng 7 tăng khoảng 0,3-0,5oC/50 năm trên tất cả các vùng khí hậu của nước ta Tính trung bình cho cả nước, nhiệt độ trung bình năm đã tăng lên khoảng 0,56oC trong 50 năm qua (Trần Thục và ctv, 2009)

2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của cây lúa

Nhiệt độ có tác dụng quyết định đến tốc độ sinh trưởng của cây lúa nhanh hay chậm, tốt hay xấu Trong phạm vi giới hạn (20-30oC), nhiệt độ càng tăng cây lúa phát triển càng mạnh Nhiệt độ trên 40oC hoặc dưới 17oC, cây lúa tăng trưởng chậm lại Dưới 13oC cây lúa ngừng sinh trưởng, nếu kéo dài 1 tuần cây lúa sẽ chết Phạm vi nhiệt độ mà cây lúa có thể chịu đựng được và nhiệt độ tối hảo thay đổi tùy theo giống lúa, giai đoạn sinh trưởng, thời gian bị ảnh hưởng và tình trạng sinh lý của cây lúa Nói chung, các giống lúa ôn đới chịu đựng nhiệt độ thấp tốt hơn các giống lúa nhiệt đới và ngược lại Cây lúa già chịu đựng tốt hơn cây lúa non; thời gian bị ảnh hưởng càng dài, cây lúa càng suy yếu thì khả năng chịu đựng càng kém

Đối với lúa nước, cả nhiệt độ không khí lẫn nhiệt độ nước đều có ảnh hưởng trên sinh trưởng và phát triển của cây lúa Suốt từ đầu đến khi tượng khối sơ khởi, đỉnh sinh trưởng của lá, chồi và bông nằm trong nước nên ảnh hưởng của nhiệt độ nước rất quan trọng Tuy nhiên, sự vươn dài của lá và sự phát triển chiều cao chịu ảnh hưởng cả nhiệt độ nước và không khí Đến khi đòng lúa vươn ra khỏi nước, vào khoảng giai đoạn phân bào giảm nhiễm, thì ảnh hưởng của nhiệt độ không khí trở nên quan trọng hơn Do đó, có thể nói rằng, nhiệt độ nước và không khí ảnh hưởng trên năng suất và các thành phần năng suất lúa thay đổi tùy giai đoạn sinh trưởng

của cây Trong giai đoạn sinh trưởng ban đầu, nhiệt độ nước ảnh hưởng đến năng suất thông qua việc ảnh hưởng lên số bông trên bụi Giai đoạn giữa nhiệt độ nước ảnh hưởng lên số hạt trên bông và phần trăm hạt chắc Đến giai đoạn sau, nhiệt độ không khí sẽ ảnh hưởng lên năng suất thông qua ảnh hưởng trên phần trăm hạt chắc

và trọng lượng hạt Trong phạm vi nhiệt độ từ 22-31oC tốc độ tăng trưởng của cây lúa hầu như gia tăng theo đường thẳng cùng với sự gia tăng nhiệt độ Hệ số nhiệt Q10 được định nghĩa là mức gia tăng sinh khối của cây lúa khi nhiệt độ tăng lên

10oC Đối với sinh trưởng của cây lúa sau khi nảy mầm Q10 thường bằng 2 và giảm dần khi nhiệt độ tăng lên quá 32oC (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

Ảnh hưởng của nhiệt độ cao

Thiệt hại do nhiệt độ cao thường xảy ra ở vùng nhiệt đới trong mùa nắng vào giữa trưa khi nhiệt độ vượt quá 35oC và kéo dài hơn 1 giờ đồng hồ Ở nhiệt độ cao, chót lá bị khô trắng, trên lá có những dãy và đốm bị mất màu, nở bụi kém, chiều cao giảm, số hạt trên bông giảm, bông lúa bị trắng, hạt thoái hóa nhiều, hạt bất thụ cao, hạt chắc giảm Nói chung, nhiệt độ thích hợp nhất cho cây lúa là 26-28oC, nhiệt độ thay đổi tùy theo cao độ, vĩ độ và mùa trong năm Càng lên phía Bắc nhiệt độ càng trở nên khắt khe, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất quan trọng đến việc trồng lúa Riêng

ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), nhiệt độ trung bình trong năm thay đổi rất

ít, trung bình từ 26-27oC Ở hầu khắp các nơi trong vùng, tổng nhiệt độ năm lên tới 9500-1000oC, trong khi tổng tích ôn cần thiết của cây lúa trung bình là 3500-

4500oC đối với các giống lúa trung mùa và khoảng 2500-3000oC đối với các giống lúa ngắn ngày Do đó, ở ĐBSCL, người ta có thể trồng lúa quanh năm và trồng được nhiều vụ 1 năm vẫn có khả năng cho năng suất cao miễn bảo đảm có đủ nước tưới Yếu tố quyết định mùa vụ ở đây là đất đai và chế độ nước Tuy nhiên, ở ĐBSCL, biến động nhiệt độ giữa ngày và đêm (biên độ nhiệt) khá mạnh, nhất là vào những tháng mùa khô, biên độ nhiệt ngày và đêm có thể đạt tới 8-10oC tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tích lũy chất khô trong cây, giúp cây lúa phát triển tốt và cho năng suất cao Năng suất lúa vụ Đông Xuân thường cao hơn các vụ khác trong năm, ngoài các yếu tố độ phì của đất cao hơn (do được bổ sung trong mùa lũ), bức xạ mặt

trời dồi dào hơn, thì biên độ nhiệt ngày và đêm cao cũng là yếu tố quan trọng lý giải cho hiện tượng này (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008)

2.5 Tính chịu nóng ở cây lúa

Tính chịu nóng được xác định là khả năng của thực vật có thể sống và tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế dưới điều kiện nhiệt độ cao (Wahid và ctv, 2007)

Thực vật không di chuyển được, do đó chúng chỉ có thể chống lại các điều kiện bất lợi bằng cách biến dưỡng và thay đổi cấu trúc Khả năng làm giảm nhiệt độ của bông lúa (spikelet temperature) cùng với giảm độ ẩm tương đối (RH-relative humidity) được coi là một cơ chế phòng tránh

Tính chịu nóng thật sự ở những giai đoạn nhạy cảm có thể được thực hiện bởi việc bảo vệ các protein, enzyme và màng tế bào tránh khỏi tác hại của nhiệt độ cao Vai trò của các protein sốc nhiệt (heat shock proteins- HSPs) rất quan trọng trong các quá trình này

Tính chịu nhiệt vốn có là thước đo khả năng sẵn có của thực vật chịu được nhiệt độ cao Nghiên cứu QTL (quantitive trait loci) cho thấy tính chịu nóng ở lúa trong thời kỳ trổ bông được điều khiển bởi nhiều gen (Shah và ctv, 2011)

2.5.1 Đặc điểm thích nghi chịu nóng ở cây lúa

Cấu trúc thực vật

Cấu trúc thực vật đóng vai trò quan trọng trong chống stress nhiệt độ cao, do

đó cần phát triển các giống có cấu trúc thích hợp giúp đối phó được sự gia tăng của nhiệt độ Ví dụ, nếu kiểu hình cây giống như một chùm hoa hình chùy được bao bởi nhiều lá, cây sẽ chịu nóng tốt hơn nhờ tăng khả năng truyền nhiệt và ngăn bay phấn hoa nhờ chúng được che bởi lá Sự giảm thoát hơi nước của hạt phấn hoa sẽ giúp đảm bảo sự trương lên của hạt phấn, một đặc tính quan trọng cho sự mở ra của bao phấn

Thời gian ra hoa và nở hoa

Nở hoa xảy ra vào sáng sớm được thảo luận từ lâu như một hiện tượng có ích

để chịu nhiệt độ cao cho kiểu gen cây lúa (IRRI, 1997)

Ra hoa và nở hoa ở hầu hết kiểu gen O.sativa của lúa xảy ra trong thời gian 5

ngày, với hầu hết hoa lúa nở vào thời điểm 10 giờ-12 giờ Hoa lúa nhô ra từ lớp phủ của lá lúa ngay trước lúc nở hoa và nở hoa trong khoảng 1 giờ trong buổi sáng

Cơ chế phòng tránh nhiệt độ cao bao gồm:

- Làm mát hoa lúa ở thời kỳ nở hoa

- Không đồng bộ sự phát triển chồi và chùm hoa

- Không đồng bộ thời gian ra hoa của các hoa lúa trong bông

- Nở hoa và thụ phấn xảy ra trong cùng một hoa lúa (tự thụ phấn)

Đặc điểm thứ hai được xem là một trong những điểm khác nhau chính của giống chịu nhiệt (N22) và giống nhạy nhiệt độ cao khác (Yoshida, 1981)

Phát triển những kỹ thuật để chắc chắn quá trình nở hoa xảy ra hoàn toàn trong cùng một bông lúa (spikelet) sẽ giúp cây tránh stress nhiệt một cách thành công Ứng dụng của methyl jasmonate (MeJA) đã được chứng minh là cảm ứng đáng kể sự nở hoa trong khoảng 30 phút, với cảm ứng nhanh nhất xảy ra chỉ 6 phút sau khi xử lý (Zeng và ctv, 1999) Kết quả cho thấy MeJA cảm ứng sự mở của hoa

lúa một cách đáng kể Thêm vào đó, ứng dụng MeJA ngoại sinh ở A.thaliana được

báo cáo liên quan đến khả năng chịu nóng và bảo vệ chống lại sốc nhiệt (Clarke và ctv, 2009)

Chiều dài của bao phấn

Nghiên cứu cho kết quả là các giống với bao phấn lớn thì chịu được nhiệt độ cao ở giai đoạn ra hoa (Matsui và Omasa, 2002) Nguyên nhân trực tiếp của stress nhiệt là sự giảm bớt số lượng hạt phấn sinh ra từ đầu nhụy (stigma) nên có thể cho rằng những giống có bao phấn to hơn chịu được stress nhiệt vì chúng có một số

lượng lớn hạt phấn trên mỗi bao phấn, bù lại cho sự giảm số lượng hạt phấn sinh ra

do tác động của nhiệt độ cao

Chiều dài chỗ mở ra của vỏ bao phấn

Sự mở ra của bao phấn là bước cuối cùng của sự phát triển bao phấn và kết

quả là phóng thích các hạt phấn để có thể thụ phấn, thụ tinh và tạo hạt Ở O.sativa,

chỉ nhị bắt đầu kéo dài ra ở đầu sự nở hoa và hạt phấn trương phồng lên nhanh chóng Áp lực tăng lên do hạt phấn ở chỗ phồng, gây nứt vách ngăn, đã được làm yếu đi do tác động của enzyme thủy phân Bao phấn mở ra thành công và thụ phấn, chuỗi sự kiện tiếp theo dẫn tới vỡ tại vùng bao phấn mở (stomium) và phóng thích hạt phấn được đồng bộ hóa với những quá trình tiếp theo xảy ra trong bao phấn và hoa đơn (Zhu và ctv, 2004)

Matsui và Omasa (2002) chỉ ra rằng vài cây trồng chịu nhiệt với độ hữu thụ bông con lớn hơn 80% dưới nhiệt độ 37,5oC thì có lỗ khuyết phát triển tốt cho sự

mở ra của bao phấn giữa phần vách ngăn và vùng bao phấn mở của vỏ bao phấn

Lỗ khuyết phát triển tốt lại không phải một dấu hiệu thích hợp để khám phá nguồn di truyền và gây giống của các giống cây trồng chịu nhiệt bởi vì lỗ khuyết không nhìn thấy được từ bên ngoài của bao phấn và tốn thời gian để khảo sát chúng

Để chọn giống có hiệu quả, xác định được các marker hình thái của tính chịu được nhiệt độ cao là điều cần thiết Matsui và Kagata (2003) sử dụng lúa japonica ở Nhật, báo cáo rằng vỏ bao phấn có chỗ mở ra dài (long basal dehiscence of theca) sẽ giúp cho sự phân tán hạt phấn tăng đều đặn và hạt phấn được đưa đến núm nhụy trong điều kiện bình thường Sự cải thiện di truyền để tạo ra chỗ mở ra của vỏ bao phấn dài sẽ làm tăng khả năng hạt phấn được tung ra bằng cách bù trừ cho sự giảm của sự

mở ra của vỏ bao phấn và sự trì trệ của sự phóng thích hạt phấn, vì thế tăng sức chống, chịu với nhiệt độ cao Người ta có thể dễ dàng để đo kích thước lỗ nứt ra Dưới nhiệt độ cao, sự trồi lên của hạt phấn bị ức chế, dẫn đến vỏ bao phấn không

mở ra được Trong khi đó nhiệt độ cao làm cho quá trình phóng thích hạt phấn bị thất bại Trong thí nghiệm khác, Matsui (2005) tìm ra rằng vỏ bao phấn có chỗ mở

ra dài sẽ giúp hạt phấn rơi từ vỏ bao phấn xuống núm nhụy và tăng tính bền của sự

thụ phấn dưới điều kiện nóng và ẩm như trong điều kiện bình thường Matsui kết luận rằng dưới những điều kiện thông thường, tính chịu nhiệt độ cao của giống có thể được ước tính bằng cách đo chiều dài của chỗ mở vỏ bao phấn Các kiểu gen có chỗ mở bao phấn lớn dưới nhiệt độ bình thường cũng có chỗ mở bao phấn lớn dưới nhiệt độ cao Vì vậy có thể dễ dàng ước đoán nhiệt độ cao dưới những điều kiện bình thường Điều đó thể hiện là đặc tính này biểu hiện ổn định cả ở điều kiện nhiệt

độ cao và bình thường Chiều dài của chỗ mở vỏ bao phấn chịu sự điều khiển di truyền mạnh Các thí nghiệm sau đó cũng cho rằng điều kiện môi trường ảnh hưởng lên chỗ mở vỏ bao phấn như rìa của vỏ ngoài bông lúa dài hơn và ngày thứ hai lớn hơn ngày thứ nhất Có sự đa dạng kích thước chỗ mở vỏ bao phấn giữa các cây trồng từ các nguồn khác nhau liên quan đến khả năng thụ phấn trong phạm vi rộng các kiểu gen, kích thước của chỗ mở vỏ bao phấn là dấu hiệu hình thái hữu ích của khả năng tồn tại của hạt phấn

2.5.2 Cơ chế của tính chịu nóng

Thực vật thể hiện các cơ chế khác nhau để tồn tại dưới nhiệt độ cao, bao gồm các thích nghi hình thái và giải phẫu mang tính dài hạn hay cơ chế thích nghi khí hậu như là thay đổi hướng lá, làm mát bằng thoát hơi nước, hay thay đổi kết cấu của lipid màng Ở nhiều loại cây trồng, sự trưởng thành sớm thì liên quan gần với sự giảm thất thoát sản lượng dưới tác động của nhiệt độ cao, hứa hẹn góp phần vào cơ chế tránh nhiệt (Adams và ctv, 2001) Tính bất động giới hạn các đáp ứng thuộc về hành vi của thực vật đến tín hiệu của môi trường, do đó cơ chế đáp ứng và bảo vệ thuộc về tế bào và kiểu hình chiếm vị trí quan trọng Thực vật cũng trải qua nhiều kiểu stress tại các giai đoạn phát triển và cơ chế đáp ứng có thể đa dạng ở các mô khác nhau (Queitsch và ctv, 2000) Tín hiệu stress ban đầu (ví dụ áp suất thẩm thấu, hay thay đổi ở nhiệt độ hay tính lỏng của màng) sẽ kích hoạt tính xử lý tín hiệu xuôi chiều và điều khiển dịch mã, kích hoạt cơ chế đáp ứng stress để tái thành lập cân bằng nội môi (homeostasis), bảo vệ và sửa chữa các protein và màng tế bào bị hư hỏng Đáp ứng không đầy đủ ở một hay nhiều bước trong quá trình hoạt hóa gen và tín hiệu gây ra hư hỏng không thuận nghịch ở cân bằng nội môi tế bào và sự phá

hủy các protein cấu trúc và chức năng và các màng, dẫn đến sự chết tế bào Thực vật phát triển trong các khu vực phân bố tự nhiên khác nhau tiếp xúc với nhiệt độ cao có thể chết do không có sự đáp ứng thích nghi nhanh chóng Hơn nữa, do thực vật có thể trải qua những dao động bất thường của nhiệt độ ban ngày, có được tính chịu nhiệt sẽ góp phần vào hình thành cân bằng nội môi của biến dưỡng (Hong và ctv, 2003)

Làm sáng tỏ các cơ chế khác nhau của đáp ứng thực vật với stress và vai trò của chúng trong tính chịu nhiệt là rất thiết thực và quan trọng Vài cơ chế chịu nhiệt chính, bao gồm vận chuyển ion, bảo vệ áp suất thẩm thấu, các protein phát sinh phôi muộn và các yếu tố liên quan đến các đợt tín hiệu và điều khiển dịch mã là cần thiết đáng kể để chống lại tác động của stress Chuỗi các biến đổi và cơ chế, bắt đầu với sự nhận thức nhiệt và truyền tín hiệu, sản xuất các chất biến dưỡng làm cho thực vật có khả năng chống lại stress nhiệt, đã được công bố Tác động của stress do nhiệt độ cao là đáng kể ở nhiều mức độ khác nhau, bao gồm màng bào tương và con đường sinh hóa đa dạng trong tế bào chất hay các cơ quan thuộc tế bào chất (Sung

và ctv, 2003) Tuy nhiên, tác động ban đầu của stress nhiệt lại ở màng bào tương, thể hiện ở tính lỏng hơn của lớp đôi lipid dưới tác động stress Điều này dẫn tới cảm ứng Ca2+

đi vào và tái tổ chức lại bộ xương tế bào, kết quả là điều hòa dương MAPK (mitogen activated protein kinase) và protein kinase phụ thuộc calcium (calcium dependent protein kinase - CDPK) Sự truyền tín hiệu của các đợt này ở mức độ nhân dẫn đến sản xuất chất kháng oxi hóa và điều hòa áp lực thẩm thấu tương hợp cho cân bằng nước của tế bào Sự sản xuất các gốc oxy hóa tự do (reactive oxygen species - ROS) trong các bào quan (ví dụ như lục lạp và ti thể) là dấu hiệu đáng kể của sự truyền tín hiệu cũng như là sản xuất các chất chống oxi hóa Cơ chế phòng thủ kháng oxi hóa là một phần của đáp ứng stress nhiệt, sức mạnh của nó liên quan đến khả năng chịu nhiệt (Maestri và ctv, 2002)

Một trong những cơ chế chịu nhiệt được nghiên cứu gần đây nhất là sự cảm ứng của các protein sốc nhiệt (HSP), bao gồm những họ protein bảo tồn Tuy nhiên, mỗi họ HSP chính có một cơ chế hoạt động duy nhất với hoạt động chaperon Tác

động bảo vệ của HSP có thể góp phần vào mạng lưới hệ thống chaperon, trong đó nhiều loại chaperon liên quan Ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy tương tác HSP và chaperon với các cơ chế đáp ứng stress khác (Wang và ctv, 2004) HSP/chaperon có thể đóng một vai trò trong con đường truyền tín hiệu và hoạt hóa gen cũng như là điều hòa quá trình oxi hóa khử của tế bào và các chất kháng oxi hóa

Sự bão hòa lipid màng được xem như là một yếu tố quan trọng trong chịu nhiệt độ cao Hiện tại, người ta vẫn chưa xác định được độ bão hòa cao hay thấp là

có ích cho tính chịu nhiệt Sự đóng góp của các thành phần protein và lipid vào chức năng của màng dưới stress nhiệt cần được nghiên cứu kĩ hơn Sự định vị protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử thấp (LMW-HSP) với màng chloroplastic dưới stress nhiệt cho thấy chúng đóng một vai trò trong bảo vệ vận chuyển electron quang hợp

Một thành phần quan trọng của tính chịu nhiệt là sự thay đổi trong biểu hiện gen Stress nhiệt được biết là nhanh chóng làm thay đổi mô hình biểu hiện gen, bao gồm biểu hiện của các thành phần HSP và ức chế biểu hiện của nhiều gen khác mRNA mã hóa các protein không cảm ứng bởi stress nhiệt bị làm mất ổn định suốt quá trình stress nhiệt Stress nhiệt có thể cũng ức chế sự ghép nối của vài mRNA Các giả thuyết sớm cho rằng các mRNA mã hóa HSP không thể được xử lý một cách chính xác do sự vắng mặt của các intron trong các gen tương ứng.Vì vậy, chỉ vài gen mã hóa HSP có các đoạn intron và dưới điều kiện stress nhiệt, các mRNA của chúng được ghép nối một cách chính xác Tuy nhiên, cơ chế của biến đổi sau phiên mã và dịch mã mRNA mã hóa HSP dưới stress nhiệt vẫn chưa được sáng tỏ (Wahid và ctv, 2007)

2.6 Phương pháp PCR

2.6.1 Giới thiệu

Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) được viết tắt là PCR Nó là một công cụ trong sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kỳ

quan trọng giống như các khám phá trước đây về enzyme cắt giới hạn và phương pháp Southern blot Việc phát minh ra máy “thermalcycler” (chu kỳ nhiệt độ được điều chỉnh một cách tự động) và sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu đựng một phổ khá rộng về nhiệt độ như “Taq polymerase” đã giúp cho Kary Mullis đạt giải thưởng Nobel năm 1993

2.6.2 Nguyên tắc chung

PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 trình tự như sau:

a Biến thành dây đơn (denature)

b Phản ứng của primer gắn vào đầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây nền (template), được gọi là tiến trình “annealing” để có phân tử DNA mới

c Kéo dài dây mới nhờ Taq polymerase (extension)

Những phản ứng này được thực hiện nhờ polymerase như Taq polymerase, và sự thay đổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ

để tách dây đôi thành dây đơn và nhiệt độ cho đoạn mồi gắn vào vùng mục tiêu trên dây nền (annealing)

Ba trình tự này xảy ra theo chu kỳ rất nhanh để khuếch đại DNA

Sự phát hiện và phân lập một DNA có tính ổn định rất cao đối với

nhiệt độ, từ một vi khuẩn có tính chất chịu nhiệt là Thermus aquaticus (Taq)

cho phép chúng có thể tổng hợp dây mới có tính lập đi, lập lại nhiều lần, số lượng khuếch đại tăng theo hàm số mũ, làm cho công nghệ sinh học có thêm một phương tiện rất có giá trị ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau

Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng để khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA Thể tăng hoạt có tính chọn lọc này được hoàn thiện thông qua sự hợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản ứng Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác động làm cho DNA bị biến chất (mở dây đôi thành dây đơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và cho nó hoạt

động như những primer (mồi) trong sinh tổng hợp DNA Để có tác động một cách đặc biệt tại vị trí mình mong muốn, những primer này phải được tổng hợp để cung cấp khoảng 20-24 bp chuỗi xoắn (duplex) tại đoạn cuối của phân đoạn

Primer ở bên trái tác động lên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kí hiệu là F Primer bên phải tác động lên dây 5’-3’ còn gọi là reverse primer, kí hiệu là R Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng bị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự đã nói ở trên

Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo mức độ cao trong sự khuếch đại Ba giai đoạn xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau nên máy luân nhiệt (thermocycler) phải có tính chất tự động hóa một cách chính xác, với

sự trợ giúp của Taq Đó là nguyên tắc cơ bản quyết định sự thành công của PCR Sự lập lại theo chu kì thường xảy ra khoảng 30 lần, để làm tăng hoạt các DNA muốn có tại vùng mục tiêu vào khoảng 100 triệu folds, đủ để tăng hoạt một gen thành khối lớn hơn rất nhiều lần so với DNA tổng số ban đầu Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA 200-2000

bp về chiều dài Tóm lại, khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng dây chuyền với polymerase Độ dài của DNA được tăng hoạt tùy thuộc vào số đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất đệm, nhiệt độ bắt cặp… (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2002)

2.7 Chỉ thị di truyền

2.7.1 Khái niệm

Chỉ thị di truyền là những chỉ thị có thể phân biệt được sự khác biệt về mặt

di truyền giữa các cá thể trong một quần thể hay ở các loài riêng lẻ Chỉ thị di truyền không đại diện cho gen mục tiêu nhưng hoạt động như một dấu hiệu được định vị gần với các gen mục tiêu Chỉ thị di truyền chỉ định vị gần hoặc liên kết với gen kiểm soát tính trạng nên không ảnh hưởng đến kiểu hình của tính trạng Tất cả các

chỉ thị di truyền chiếm một vị trí chuyên biệt trong bộ gen trên nhiễm sắc thể gọi là

“locus” (Collard và ctv, 2005)

2.7.2 Phân loại

Chỉ thị di truyền được chia thành 3 loại chính:

- Chỉ thị hình thái: chỉ thị hình thái là những tính trạng hay đặc tính về kiểu hình, có thể nhìn thấy được bằng mắt thường như màu sắc hoa, kích thước hạt, màu da Chỉ thị hình thái có những bất lợi như bị giới hạn về số lượng, phụ thuộc cao vào môi trường và các giai đoạn phát triển của thực vật Thông thường, những điều kiện để thực vật phát triển có thể ảnh hưởng tới sự biểu hiện của chỉ thị hình thái và dẫn tới sai sót trong quá trình chọn lọc Bên cạnh đó, khi tiến hành thí nghiệm với những chỉ thị này thì tốn thời gian, nhân công và yêu cầu phải có quần thể lớn (Akhtar và ctv, 2010)

- Chỉ thị hóa sinh: chỉ thị hóa sinh hay còn gọi là chỉ thị isozyme Chỉ thị hóa sinh bao gồm sự khác nhau về alen của các enzyme Trong tế bào, hệ thống enzyme đều có hệ gen tương ứng và được sắp xếp một cách hợp lý Cấu trúc phân

tử của enzyme là do cấu trúc đặc biệt của DNA trong một đoạn tương ứng của nhiễm sắc thể Phân tử enzyme có thể tồn tại ở dạng anion, cation, hoặc trung tính tùy thuộc vào pH của môi trường Vì chỉ thị isozyme là sự khác biệt trong enzyme nên có thể được phát hiện nhờ điện di và nhuộm màu chuyên biệt (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1995; Collard và ctv, 2005)

- Chỉ thị phân tử: hay còn được gọi chỉ thị DNA Đó là những trình tự DNA được tìm thấy tại những vị trí đặc biệt trong bộ gen và được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo quy luật cơ bản và được nhận diện bằng phân tích DNA

2.7.3 Chỉ thị phân tử

Trong một loài, các giống khác nhau thường có trình tự bộ gen khác nhau Trình tự bộ gen của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau Sự khác nhau này bắt nguồn từ các loại đột biến khác nhau như đột biến điểm, đột biến chèn đoạn, đột biến mất đoạn, hoặc có sai sót xảy ra trong quá trình sao chép của DNA

được lặp lại một cách có thứ tự (Paterson, 1996) Đây chính là cơ sở để ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân tích di truyền và chọn giống Không giống với chỉ thị hình thái và hóa sinh, chỉ thị DNA không bị giới hạn về số lượng và không chịu tác động bởi các yếu tố môi trường hoặc các giai đoạn phát triển của thực vật

Dựa vào phương pháp phát hiện, chỉ thị DNA được chia thành ba nhóm:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR

- Chỉ thị dựa trên cơ sở đánh dấu thăm dò, lai DNA

- Chỉ thị dựa trên giải trình tự DNA

Bảng 2.1: Các loại chỉ thị DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2008)

Chỉ thị Tên đầy đủ

Theo Akhtar và ctv (2010), chỉ thị phân tử là một công cụ quan trọng hỗ trợ cho quá trình phân tích di truyền như xây dựng bản đồ liên kết gen Chỉ thị phân tử giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong ngân hàng gen để xác định các giống cây trồng có những tính trạng ưu việt nhằm ứng dụng trong chọn giống thực vật Về

bản chất, chỉ thị DNA thể hiện sự khác nhau về mặt di truyền nên có thể xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật điện di và nhuộm màu với các chất hóa học như ethidium bromide (EB) hay bạc, hoặc phát hiện với các chất phóng xạ hay các mẫu

dò nhuộm màu

Dựa vào kiểu hình chỉ thị DNA được chia thành hai loại là đồng trội và trội hoàn toàn Chỉ thị DNA đồng trội cho các băng chỉ ra sự khác biệt về kích thước cả hai alen trội và lặn, ngược lại chỉ thị DNA trội hoàn toàn chỉ sự có mặt hay không

có mặt và chỉ cho băng mang alen trội không cho băng mang alen lặn (hình 2.2) Tóm lại, các dạng khác nhau của các chỉ thị phân tử (thể hiện các băng kích thước khác nhau trên gel khi điện di) được gọi là chỉ thị phân tử “alen” Chỉ thị phân tử đồng trội có thể có nhiều alen khác nhau Ngược lại, chỉ thị trội hoàn toàn chỉ thể hiện băng mang alen trội khi điện di trên gel Chỉ thị đồng trội thể hiện kiểu gen đầy

đủ của thực vật, chỉ thị trội hoàn toàn không thể phân biệt được giữa các kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử ở quần thể F2 Tỷ lệ phân ly của các chỉ thị có thể được hiểu một cách dễ dàng bằng sử dụng trắc nghiệm Punnet để xác định nguồn gốc các kiểu gen của quần thể

Hình 2.2 Chỉ thị đồng hợp trội (a) và chỉ thị trội hoàn toàn (b) (Collard và ctv,

2005)

Những chỉ thị DNA thể hiện sự khác nhau giữa bố mẹ (chỉ thị đa hình) là yếu tố quyết định trong việc xây dựng một bản đồ liên kết gen (Young, 1994) Nhìn chung, các loài thụ phấn chéo có mức độ đa hình DNA cao hơn so với các loài cận giao Việc lập bản đồ trong các loài cận giao yêu cầu chọn lựa bố mẹ có

quan hệ xa Trong nhiều trường hợp, nếu bố mẹ cung cấp đủ đa hình thì việc lựa chọn dựa trên mức độ đa dạng di truyền giữa bố mẹ (Anderson, 1993) Khả năng chỉ thị DNA được sử dụng cho lập bản đồ có thể phụ thuộc vào từng loại chỉ thị hay phụ thuộc vào sự thích hợp của các chỉ thị đặc biệt cho các loài đặc biệt

2.8 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học đã tạo ra một tiềm năng to lớn cho công tác chọn tạo giống cây trồng Việc áp dụng những kỹ thuật ở mức độ phân tử cho phép chúng ta chuyển những gen mong muốn vào trong các giống cây của cùng một loài, và chúng ta có thể du nhập những gen mới từ loài hoang dại gần gũi với loài cây trồng Đối với những tính trạng đa gen, người ta đã gặp nhiều khó khăn trong phân tích, khi sử dụng phương pháp chọn giống cổ truyền Những điều này trở nên dễ dàng hơn, vì người ta có thể sử dụng các marker phân tử, công cụ đánh dấu rất hiệu quả Người ta có thể hình thành nên mối quan hệ di truyền giữa những cây trồng mà trước đó nó không thể nào tương hợp nhau về giới tính Kỹ thuật hỗ trợ cho việc chọn lọc giống thường được sử dụng là RAPD, RFLP, microsatellite, STS, AFLP hoặc ISA (inter-simple sequence repeat amplification) và ALP (amplicon length polymorphism) trên quần thể F2 hoặc quần thể hồi giao, quần thể các dòng đẳng gen (near isogenic lines-NIL), quần thể đơn bội kép (double haploid- DH) và quần thể các dòng cận giao tái tổ hợp (recombinant inbred line-RIL)

Vấn đề có tính chiến lược trong ứng dụng di truyền phân tử vào lĩnh vực chọn giống chính là chọn giống nhờ marker phân tử, với thuật ngữ thông dụng MAS, viết tắt từ chữ “marker-assited selection” Những thể đánh dấu phân tử (molecular tags) là điều kiện đầu tiên trong chiến lược MAS, đã được phát triển trong nhiều loài cây trồng, với nhiều loại hình khác nhau của marker phân tử Những marker phân tử có nhiều ưu điểm hơn các marker hình thái cổ điển Do đó

nó rất có ích cho các nhà chọn tạo giống Hiệu quả cải tiến giống cây trồng sẽ tăng rất nhiều lần so với chọn giống cổ điển, nhờ việc thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà thông qua marker phân tử liên kết với tính trạng

đó Điều này đòi hỏi marker phải liên kết rất chặt với tính trạng mong muốn Hơn

nữa marker này không bị điều tiết bởi môi trường, không bị ảnh hưởng bởi điều kiện trong đó cây trồng đang sinh trưởng và phát triển (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.9 Giới thiệu về microsatellite

2.9.1 Khái niệm

SSR hay còn gọi là microsatellite ngày nay đã trở thành thuật ngữ chung nhất

để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR hay VNTR Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 – 100 bp Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những alen đồng trội (bao gồm 2 loại: alen đồng hợp và alen dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker Tần số đột biến từ 5.10-6 - 10-4, nó tuân theo định luật Mendel Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Lagercrantz, 1993)

2.9.2 Các loại microsatellite

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) chúng ta có:

Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4

ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa

Những đoạn lặp lại của poly A/poly T là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các

bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau Tuy nhiên, nó không phù hợp để sử dụng trong lập bản đồ, phân tích quần thể vì nó không ổn định và bền vững trong quá trình phân tích bằng PCR Trong quá trình này, dưới tác động của

enzyme Taq polymerase nó có thể làm cho kích thước alen bị thay đổi bằng cách

thêm một nucleotide A vào cuối đoạn hoặc chèn vào vùng lặp lại của alen

Những phân tích gần đây trong số liệu của những đoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT là loại thường gặp hơn cả ở động vật có vú, gấp đôi so với AT và gấp 3 so với AG/TC Loại dinucleotide thường gặp ở thực vật là AA/TT và AT/TA Chúng

có thể phân ra ba loại sau:

- Hoàn hảo: không có sự ngắt quãng

Loại có tính đa hình cao nhất là loại không bị ngắt quãng, nhưng trong thực

tế các microsatellite thường bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các trình tự lặp lại

Trong số 3 nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất hiện các kiểu này tùy thuộc vào chủng loại genome (Ma và ctv, 1996)

2.9.3 Vai trò của microsatellite

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã Chức năng cụ thể của những vùng như vậy vẫn còn

chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền

Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen Tuy nhiên, có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen (Beckmann và Weber, 1992)

Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promoter Vị trí của microsatellite gần hay xa promoter cũng làm hoạt động của promoter thay đổi Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen (Morgante và Olivieri, 1993)

Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động và sao mã Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hướng đến protein bám Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó Như một trình tự mang

mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về

số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen Những tính chất đặc biệt của

microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite

có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng

di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa Do vậy, microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho

sự thay đổi của tiến hóa (Rossetto, 2001)

2.9.4 Ưu khuyết điểm của phương pháp SSR

Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó là khả năng phân tích tự động bằng máy giải trình tự

Primer microsatellite có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nhà nghiên cứu

vì mỗi locus có mang trình tự microsatellite đều được phát hiện bởi những cặp primer thích hợp Primer microsatellite cũng dễ áp dụng từ loài này sang loài khác hơn phương pháp AFLP

Phương pháp microsatellite cho kết quả phân tích tính đa hình chính xác hơn, với mức độ đa hình cao gấp 7 lần so với phương pháp RAPD

Hiện nay, microsatellite là công cụ chủ yếu và đang thay thế phương pháp RFLP trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền ở thực vật Ngoài ra, sự kết hợp giữa phương pháp microsatellite và phương pháp AFLP sẽ giúp cho việc xây dựng bản

đồ di truyền một cách chi tiết

Đặc tính đồng trội (co – dominant), đồng phân ly của microsatellite là một

ưu điểm trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền, trong khi RAPD và AFLP không có đặc tính này

Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại Thứ nhất, trình tự vùng

flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellite của loài này cho loài khác Thứ hai, do

tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19 (Powell và ctv, 1996)

2.9.5 Ứng dụng của microsatellite

Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao hơn bất kỳ marker phân tử nào khác Do đó, microsatellite là một công cụ rất đắc lực trong nghiên cứu đa dạng

di truyền của cây trồng (Powell và ctv, 1996)

Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như: Lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm ra bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt là áp dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các

cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL) Các thông tin về microsatellite đa alen của một locus cũng như trên nhiều locus có thể được phân tích bằng các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, phả hệ, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.10 Tình hình nghiên cứu tính chịu nóng ở cây lúa

Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của stress do nhiệt độ cao trên cây lúa được thực hiện Ảnh hưởng của stress do nhiệt độ cao được thấy rõ nhất ở giai đoạn lúa ra hoa khi nhiệt độ môi trường trên 35oC.Tỉ lệ thụ tinh của hoa lúa giảm theo sự gia tăng nhiệt độ Sự ra hoa, thụ phấn, và sự phát triển ống phấn sẽ bị kìm hãm dẫn

đến việc gây ảnh hưởng đến khả năng phát triển của hạt (Morita và ctv, 2005; Peng

và ctv, 2004; Zhu và ctv, 2005) Nếu nhiệt độ môi trường liên tục cao hơn 35oC trong 5 ngày sẽ dẫn đến bất thụ ở hoa và không có hạt Ngược lại, stress do nhiệt độ cao xảy ra ở giai đoạn vào chắc (grain filling period) sẽ dẫn đến thiệt hại về mặt kinh tế qua giảm sản sản lượng và chất lượng hạt (Zhu và ctv, 2005)

Maestri và ctv (2002) cho rằng phải kết hợp tuyển chọn các giống lúa có mức độ chịu nóng khác nhau, phân tích vùng giả định nhằm xác định các QTL (quantitative trait loci) chịu stress do nhiệt độ cao, tiến tới xác định gen ứng cử viên

và chỉ thị liên kết với các gen như vậy, nhằm mục đích giúp cho nhà chọn giống chọn, tạo ra giống mới bằng chỉ thị phân tử

Theo nghiên cứu của Foolad (2005), việc kiểm soát stress do nhiệt độ cao được điều khiển bởi nhiều gen Các gen này thể hiện rất chuyên biệt ở từng giai đoạn sinh truởng và phát triển, trong từng cơ quan của cây lúa, tại những thời điểm nhiệt độ tăng cao Tác giả cho rằng việc sử dụng MAS (marker-assissted selection)

sẽ hỗ trợ việc chọn giống để tìm ra giống lúa có khả năng chịu nhiệt cao một cách hiệu quả, khắc phục được những khó khăn mà chọn giống truyền thống đang gặp phải

Zhu và ctv (2005) đã tiến hành nghiên cứu ở giai đoạn vào chắc trên cây lúa với quần thể BIL (backcross inbred lines) từ tổ hợp lai Nipponbare / Kasalth Chỉ số nhạy nhiệt trọng lượng hạt (the grain weight heat susceptibility index) được dùng để đánh giá tính chịu nhiệt của lúa Kết quả cho thấy có 3 QTL nằm trên nhiễm sắc thể

số 1, 4, 7 kiểm soát tính trạng chống, chịu stress do nhiệt độ cao Chuyên biệt hơn, QTL định vị tại quãng giữa hai marker C1100-R1783 trên nhiễm sắc thể số 4 cho thấy: không bị sự tác động của môi truờng (QTL x enviroment interaction) và không có tương tác không alen (epistatic effect) Điều đó chứng tỏ QTL này biểu hiện được tính ổn định trong các môi truờng khác nhau và nền tảng di truyền khác nhau (genetic background) Thực hiện fine mapping trong quãng giữa hai marker này để xác định những chỉ thị phân tử mới giúp chọn giống lúa chống, chịu stress

do nhiệt độ cao, ở giai đoạn vào chắc