Trích ly tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp trích ly co2 siêu tới hạn và xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu

TÊN ĐỀ TÀI: Trích ly tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp trích ly CO2 siêu tới hạn và xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu.. Các phương pháp trích ly tinh dầu hiện nay gồm có phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN THỊ MAI ĐÀO

TRÍCH LY TINH DẦU VỎ TẮC SỬ DỤNG

VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Võ Đình Lệ Tâm

4 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

5 TS Nguyễn Hoài Hương

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc -NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Nguyễn Thị Mai Đào MSHV: 13111010

I TÊN ĐỀ TÀI: Trích ly tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp trích ly CO2 siêu tới hạn và xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

Khảo sát ảnh hưởng độ tuổi của quả tắc đến hiệu suất trích ly tinh dầu

Khảo sát điều kiện trích ly tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp CO2 siêu tới hạn

Xác định thành phần hóa học tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp sắc khí kết nối khối phổ GC/MS

Xác định hoạt tính kháng oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ tắc thu nhận

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/07/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 04/12/2015

Em cũng xin trân trọng cảm ơn tập thể quý thầy, quý cô thuộc bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, những người đã nhiệt tình hỗ trợ cho em các hóa chất và thiết bị cần thiết, nhờ vậy em mới có thể tiến hành tốt các thí nghiệm trong luận văn

Em cũng xin trân trọng cảm ơn thầy Mai Thành Trí – giám đốc trung tâm chuyển giao khoa học công nghệ - Viện hóa học và chị Vy, anh Nguyễn Quốc Duy – phòng vi sinh, khu xét nghiệm, bệnh viện đa khoa khu vực Củ Chi đã tận tình giúp đỡ một số hóa chất, thiết bị cần thiết và trao đổi vấn đề kỹ thuật thao tác để em tiến hành tốt các thí nghiệm trong luận văn

Sau cùng, tôi xin cám ơn các anh, chị, các bạn học và các bạn sinh viên, những người bạn đồng hành cùng tôi trong thời gian thực hiện nhiệm vụ luận văn

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 201

Nguyễn Thị Mai Đào

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong nghiên cứu này, tinh dầu vỏ tắc được trích ly sử dụng phương pháp

CO2 siêu tới hạn Trước tiên, ảnh hưởng của độ tuổi của quả tắc đến hiệu suất thu hồi tinh dầu được khảo sát Kết quả khảo sát cho thấy độ chín quả tắc 4 – 5 tháng tuổi cho hiệu suất trích cao nhất Tiếp theo, ảnh hưởng các yếu tố như áp suất, nhiệt

độ, lưu lượng dòng, thời gian đến hiệu suất trích ly cũng được khảo sát Kết quả cho thấy hiệu suất trích đạt được là 3,89 ± 0,03% khi điều kiện trích ở áp suất 250 bar, nhiệt độ 500C, lưu lượng dòng 20 g/phút, thời gian 120 phút Sau đó, thành phần hóa học tinh dầu vỏ tắc được xác định bằng phương pháp sắc ký kết nối khối phổ (GC/MS) Kết quả cho thấy tinh dầu vỏ tắc chứa các thành phần terpen (trong đó limonene chiếm 47,39%), phytol (1,8773%) và hợp chất bicyclo [2.2.1] heptan (1,77%) (một dạng hợp chất caryophyllene) và 1,2,3,4,4a,5,6,8a – octahydro – 7 – metylen -1-(1-metyletyl)naphthalene (13,05%) Hàm lượng phenolic tổng trong tinh dầu là 924,879 ± 133,6 mg GAE/g chất khô, thấp hơn 4694,23 lần so với vitamin C Hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp nhốt gốc tự do ABTS đạt 25289,9 ± 168,4 µmol trolox/ g chất khô, thấp hơn 4508,2 lần so với vitamin C và theo phương pháp khử sắt (FRAP) của tinh dầu vỏ tắc đạt 6252,19 ± 551 µmol trolox/g chất khô, thấp hơn 4623,5 lần so với vitamin C Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

tinh dầu vỏ tắc đối với giống Bacilus subtilis là 5 mg/ml; đối với Staphylococus

aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa và Proteus mirabilis là 10 mg/ml Ở cùng đường kính vùng ức chế (IZD) là 25,33mm, hoạt tính

kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất đối với giống Bacillus subtilis tương đương

hoạt tính kháng khuẩn của Ampicilin ở nồng độ 9,181 µg/ml Ở cùng đường kính vùng ức chế (IZD) là 15,67 mm, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất

đối với giống Staphylococus aureus ATCC 25923 tương đương hoạt tính kháng

khuẩn của Ampicilin ở nồng độ 23,35 µg/ml Ở cùng đường kính vùng ức chế (IZD)

là 16,67 mm, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu nguyên chất đối với giống

Klebsiella pneumonia tương đương hoạt tính kháng khuẩn của Streptomycin ở nồng

độ 7,17 µg/ml Ở cùng đường kính vùng ức chế (IZD) là 13,67 mm, hoạt tính kháng

khuẩn của tinh dầu nguyên chất đối với giống Pseudomonas aeruginosa tương đương hoạt tính kháng khuẩn của Amikacin nồng độ là 35,14 µg/ml Ở cùng đường

kính vùng ức chế (IZD) là 16,33 mm, hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu nguyên

chất đối với giống Proteus mirabilis tương đương hoạt tính kháng khuẩn của

Amikacin ở nồng độ 37,68 µg/ml

ABSTRACT

First, the effect of calamondin ripeness to the essential oil yield was studied The result showed that the highest yield reached when the kumquat was about 4-5 months-old Next, the effects of pressure, temperature, flow rate and extraction time to extraction yield were studied The result showed that the yield was 3.89 ± 0.03% when the

20 g/min and the extraction time was 120 min Then, the chemical compositions of calamondin peel essential oil were determined using Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS) The result showed that calamondin peel essential oil included terpenoid (47.39% of limonene), phytol (1.8773%) and bicyclo [2.2.1], heptane (1.77%) (caryophyllene) compounds and 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-7-methylene-1-(1-methylethyl) naphthalene (13.05%) After that, total phenolic content in the essential oil was 924.879 ± 133.6 mg GAE/g dry weight, lower than 4694.23 fold vitamin C content The antioxidant activity of the essential oil was evaluated using Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) Assay (ABTS) radical scavenging assay was 25289.9 ± 168.4 μmol trolox/g dry weight, lower than 4508.2 fold vitamin C content and Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay was 6252.19 ± 551 μmol trolox/g dry weight, lower than 4623.5 fold vitamin C content The minimum inhibitory

concentration (MIC) of the essential oil was 5 mg/ml against Bacilus subtilis; against

Staphylococus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Proteus mirabilis were 10 mg/ml At the same inhibition zone diameter (IZD) of

25.33 mm, then antimicrobial activity of the pure essential oil not diluted against

Bacillus subtilis was equivalent to that of Ampicillin at the concentration of 9.181

µg/ml At the same inhibition zone diameter (IZD) of 15.67 mm, then antimicrobial

activity of the pure essential oil not diluted against Staphylococus aureus ATCC 25923

was equivalent to that of Ampicillin at the concentration of 23.35 µg/ml At the same inhibition zone diameter (IZD) of 16.67 mm, then antimicrobial activity of the pure

essential oil not diluted against Klebsiella pneumonia was equivalent to that of

Streptomycin at the concentration of 7.17 µg/ml At the same inhibition zone diameter (IZD) of 13.67 mm, then antimicrobial activity of the pure essential oil not diluted

against Pseudomonas aeruginosa was equivalent to that of Amikacin at the

concentration of 35.14 µg/ml At the same inhibition zone diameter (IZD) of 16.33

mm, then antimicrobial activity of the pure essential oil not diluted against Proteus

mirabilis was equivalent to that of Amikacin at the concentration of 37.68 µg/ml

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép

từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Mai Đào

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN v

ABSTRACT vi

LỜI CAM ĐOAN vii

MỤC LỤC viii

DANH MỤC BẢNG xii

DANH MỤC HÌNH xiii

TỪ VIẾT TẮT xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ xv

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về cây tắc (quất) 1

1.1.1 Đặc điểm hình thái 1

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Ứng dụng trong đời sống 2

1.2 Tổng quan về tinh dầu 3

1.2.1 Khái quát về tinh dầu 3

1.2.2 Tính chất vật lý 4

1.2.3 Tính chất hóa học 5

1.2.4 Thành phần và tính chất hóa lý của tinh dầu vỏ quả tắc 6

1.3 Một số phương pháp trích ly tinh dầu tắc 7

1.3.1 Phương pháp cơ học 7

1.3.2 Phương pháp tẩm trích 7

1.3.3 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 7

1.3.4 Phương pháp sử dụng sóng siêu âm 8

1.3.5 Phương pháp trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng 8

1.3.6 Phương pháp trích ly CO2 siêu tới hạn 9

1.4 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa 11

1.4.1 Gốc tự do 11

1.4.2 Các chất kháng oxy hóa 13

1.5 Tổng quan hoạt tính kháng khuấn 15

1.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn 15

1.5.2 Các vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm 15

1.5.2.1 Vi khuẩn Staphyloccus aureus 15

1.5.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 16

1.5.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 17

1.5.2.4 Vi khuẩn Klebsiella pneumonia 18

1.5.2.5 Vi khuẩn Proteus mirabilis 19

1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 19

1.6.1 Phương pháp sử dụng khoanh giấy trên môi trường đặc 19

1.6.2 Phương pháp sử dụng ống trụ trên môi trường đặc 20

1.6.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng 20

1.6.4 Phương pháp sử dụng kỹ thuật vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtitre technique) 20

1.6.5 Phương pháp sinh tự ký (Bioautography) 20

1.7 Tình hình nghiên cứu về tinh dầu họ citrus trong và ngoài nước 21

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 23

2CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 28

2.2.2 Thuyết minh sơ đồ thí nghiệm 29

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.3.1 Trích ly tinh dầu sử dụng phương pháp hỗ trợ vi sóng 32

2.2.3.2 Trích ly tinh dầu sử dụng phương pháp SC – CO2 32

2.2.3.3 Xác định chỉ số hóa lý của tinh dầu 32

2.2.3.4 Xác định thành phần hóa học – Phương pháp sắc ký kết nối khối phổ (Gas Chromatography/Mass Spectrometry, GC-MS) 33

2.2.3.5 Xác định hàm lượng polyphenol (phenolic tổng) – Phương pháp Folin –

Ciocalteu .34

2.2.3.6 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa thông qua bắt gốc tự do ABTS (TEAC) 34 2.2.3.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa bằng quá trình khử sắt (FRAP) 34

2.2.3.8 Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật khoanh giấy trên đĩa thạch của Kriby Bauer 35

2.2.3.9 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu sử dụng kỹ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng .35

2.2.3.10 Phân tích độ ẩm bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi 35

2.2.3.11 Hiệu suất của quá trình trích ly tinh dầu tắc được tính bằng công thức 35

2.2.3.12 Phương pháp xử lý thông tin 35

3CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng độ tuổi của vỏ tắc đến hiệu suất trích ly tinh dầu 36

3.2 Kết quả khảo sát hiệu suất trích ly tinh dầu sử dụng phương pháp CO2 siêu tới hạn 37

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của cặp thông số áp suất và nhiệt độ đến hiệu suất trích ly 37

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất trích ly tinh dầu 40 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly tinh dầu 42

3.3 Xác định chỉ số hóa lý của tinh dầu vỏ tắc 45

3.4 Xác định thành phần hóa học tinh dầu bằng GC-MS .46

3.5 Xác định hàm lượng phenolic tổng và hoạt tính kháng oxy hóa 51

3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu vỏ tắc 53

3.6.1 Kết quả kháng khuẩn mẫu tinh dầu tắc sử dụng phương pháp khoanh giấy trên đĩa thạch của Kirby – Bauer 53

3.6.2 Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu vỏ tắc theo kỹ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng .60

4CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

4.1 Kết luận 62

4.2 Kiến nghị 63

5TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

6PHỤ LỤC 79

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của quả tắc (tính trên 100g) [11] 2

Bảng 1.2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ tắc [16] 6

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quả tắc sử dụng phương pháp lôi cuốn hơi nước .7

Bảng 1.4 Các gốc tự do trong cơ thể sinh học 12

Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa 13

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng áp suất và nhiệt độ đến hiệu suất trích ly 30

Bảng 3.1 Kết quả hiệu suất trích ly vỏ tắc sử dụng SC – CO2 39

Bảng 3.2 Kết quả hiệu suất trích ly tinh dầu theo lưu lượng dòng 41

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phương sai một chiều của hiệu suất thu nhận mẫu dầu theo thời gian 42

Bảng 3.4 Kết quả chỉ số hóa lý của tinh dầu vỏ tắc 45

Bảng 3.5 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ tắc sử dụng phương pháp trích ly SC - CO2 được xác định bằng sắc ký kết nối khối phổ GCMS 46

Bảng 3.6 Kết quả trung bình hoạt tính kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu 51

Bảng 3.7 Kết quả đường kính vòng vô khuẩn trên vi khuẩn thử nghiệm 54

Bảng 3.8 Đường kính trung bình vòng kháng khuẩn trên các giống vi khuẩn khi sử dụng kháng sinh tham chiếu 56

Bảng 3.9 Bảng so sánh hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tương đương hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh tham chiếu khi xét cùng đường kính vòng vô khuẩn 60 Bảng 3.10 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên các giống vi khuẩn 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây và quả tắc 1

Hình 1.2 Giản đồ pha trạng thái siêu tới hạn của một chất 10

Hình 1.3 Tụ cầu khuẩn Staphylococus aureus 16

Hình 1.4 Trực khuẩn Baciluss subtilis 16

Hình 1.5 Trực khuẩn Pseudomonas aeruginosa 17

Hình 1.6 Vi khuẩn Klebsiella pneumonia 18

Hình 1.7 Vi khuẩn Proteus mirabilis 19

Hình 2.1 Mẫu tắc được sử dụng cho khảo sát 29

Hình 3.1 Đồ thị hiệu suất trích ly tinh dầu theo độ chín 36

Hình 3.2 Đồ thị hiệu suất trích ly tinh dầu theo điều kiện áp suất và nhiệt độ khảo sát 37

Hình 3.3 Đồ thị hiệu suất trích ly tinh dầu theo lưu lượng dòng 41

Hình 3.4 Đồ thị hiệu suất trích ly tinh dầu theo thời gian 42

Hình 3.5 Đồ thị hiệu suất trích ly tinh dầu theo thời gian đến khi trích kiệt 44

TỪ VIẾT TẮT

SC – CO2: Supercritical carbon dioxide – CO2 siêu tới hạn

MIC: Minimal inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

IZD (d): Diameter of inhibition zone - Đường kính vòng kháng khuẩn

Trolox: 6-hydroxy – 2,5,7,8-tetramethylchroman – 2-carboxylic acid

GAE: Gallic acid equivalent

ABTS: 2,2` - azino – bis(3 ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)

FRAP: The Ferric Reducing Ability of Plasma hoặc Ferric ion Reducing Antioxidant Power hoặc Ferric Reducing Power – Khả năng khử sắt của huyết tương hoặc khả năng chống oxy hóa được thể hiện qua sự khử ion FeIII

TPTZ: 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine

IC50: Half maximal inhibitory concentration

TE hay TEAC: trolox Equivalent Antioxidant Capacity – Khả năng kháng oxy hóa tương đương trolox

ANOVA: Analysis of variance – phân tích phương sai

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

CFU: colony Forming Unit – Đơn vị khuẩn lạc

w/v: weight/volume - khối lượng/ thể tích

v/v: volume/volume: thể tích/ thể tích

w/w: weight/weight - khối lượng/ khối lượng

µM hay µmol: micro mol

DMSO: Dimethyl sulfoxide

µg: microgram

TN: Thí nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vỏ tắc là nguồn phụ phẩm trong công nghệ chế biến nước ép tắc Nguồn phụ phẩm này rất dồi dào ở các nhà máy chế biến nước tắc và được thải trực tiếp ra môi trường Vỏ tắc là nguồn phụ phẩm chứa tinh dầu [1] Các phương pháp trích ly tinh dầu hiện nay gồm có phương pháp cơ học, phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp tẩm trích, trích ly hỗ trợ vi sóng, trích ly sử dụng lưu chất siêu tới hạn….Phương pháp sử dụng lưu chất siêu tới hạn với dung môi CO2 - một dung môi thân thiện môi trường, nhiệt độ tới hạn thấp, không độc hại… cho chất lượng tinh dầu cao hơn các phương pháp khác nhưng phương pháp này chưa được nghiên cứu nhiều trên đối tượng vỏ tắc Đặc biệt đối với vỏ tắc các công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và ở Việt Nam thấy rằng tinh dầu trích ly từ vỏ quả của

các loài thuộc chi Citrus có nhiều tác dụng sinh học (hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt

tính kháng khuẩn) [2]–[5],[6], [7] Vì những lý do trên đề tài ―Trích ly tinh dầu vỏ tắc (quất) sử dụng phương pháp trích ly CO 2 siêu tới hạn và xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu” nhằm tận dụng nguồn phụ phẩm tạo sản phẩm có giá trị gia

tăng, giảm chi phí xử lý rác thải cho các nhà máy đồng thời giảm ô nhiễm môi trường

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây tắc (quất)

Tên khoa học: Citrofortunella microcarpa (Bunge) Wijnands

Loài: Citrus japonica

Cây tắc còn gọi là cây tắc, hạnh Tiếng Anh, Pháp gọi là Kumquat, Clementine Có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, Trung Quốc, Nhật Bản; ở Việt Nam được trồng từ Bắc đến Nam, được trồng để làm cảnh, trang trí dịp tết Nguyên Đán, làm mứt, nước giải khát,….Ở miền Nam Việt Nam đặc biệt là Tây Nam Bộ như Bến Tre, Cái Mơn, Đồng Tháp…nghề trồng tắc phát triển hơn và sản lượng cao hơn [1],[2],[8]

Hình 1.1 Cây và quả tắc

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây tắc là cây nhỏ phân nhiều cành, cao 1m - 1,5m, thân dẻo màu xanh xám,

lá đơn hình bầu dục, màu xanh thẫm Hoa đơn, nở xòe 5 cánh màu trắng, rất thơm, chùm nhụy rất ngắn Quả tắc có hình cầu, lúc còn non màu xanh bóng, khi già chín đổi thành màu vàng cam [9]

Cấu tạo quả: lớp vỏ ngoài cùng chứa tinh dầu ở dạng tự do trong các túi tế bào, kế tiếp là lớp vỏ trắng có chứa nhiều pectin, trong cùng là ruột quả Trên lớp vỏ ngoài cùng thường có một lớp sáp mỏng giúp cho quả không bị quá khô hoặc quá

ẩm do tác động của không khí bên ngoài và tránh sự xâm nhập của vi sinh vật vào bên trong quả [10]

Quả tắc tròn, đường kính từ 25-35mm, khi chín có màu vàng Bên trong ruột

có nhiều múi màu vàng nhạt, chứa nhiều nước chua, phần vỏ khá mỏng, có mùi thơm dễ chịu Quả tắc có thể được thu hái quanh năm [9]

Cây tắc là cây trồng nhiệt đới, cây tắc thích hợp với điều kiện nhiệt độ từ

13-39 0C, tối thích từ 23-29 0C; độ ẩm không khí 80-85%; độ ẩm đất 60-70%; lượng mưa trung bình 1500mm/năm và phân bố đều trong năm; tầng đất canh tác dày, thoát nước tốt [2]

Trong vỏ tắc có một số hoạt chất sinh học như tinh dầu, hợp chất phenolic,

flavanoid, glycosid và alkaloid [12]

mùi, trị đầy hơi, hạ đường huyết… , và còn làm hương liệu phụ gia ngành thực phẩm, mỹ phẩm [2],[13] Quả tắc với hàm lượng vitamin C đáng kể, có thể ăn quả tươi hoặc dùng để làm nước uống hoặc chế biến thành các món ăn như bánh mứt, trà, marmalade, siro, tắc muối, món tráng miệng Quả tắc cũng được cắt nhỏ và đem lạnh đông với nước (ice cube) rồi cho vào các loại trà, cocktail và nước giải khát [9]

Trong công nghiệp, nước quả tắc được kết hợp với vodka và đường để sản xuất rượu mùi Vỏ tắc được sử dụng để khai thác tinh dầu rồi pha chế vào mứt quả,

và thu hồi pectin [14],[9]

Theo Đông y, quả tắc vị ngọt chua, tính ấm, có khả năng trị ho, giải uất, giúp thư giãn, giải rượu Vỏ có tác dụng mạnh hơn Nước tắc có thể pha với trà và nó có khả năng chống viêm và trị mụn tự nhiên Hạt tắc có tác dụng giảm ho, cầm máu, chống nôn Lá tắc có tinh dầu, có tác dụng chữa cảm mạo phong hàn rất tốt[2],[14],[1] Vỏ cam, quýt, bưởi, tắc phơi khô đốt lên giúp xua muỗi, khử mùi Tinh dầu từ vỏ tắc có một số thành phần hóa học đặc biệt, có công dụng an thần kinh, giải lo âu mà các loại tinh dầu khác không có được [12],[6]

1.2 Tổng quan về tinh dầu

1.2.1 Khái quát về tinh dầu

Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau và dễ bay hơi, có mùi đặc trưng Ở nhiệt độ thường hầu hết tinh dầu ở thể lỏng, có khối lượng riêng nhỏ hơn 1 (trừ một vài tinh dầu như quế, đinh hương…), không tan trong nước hoặc tan rất ít, nhưng lại hòa tan tốt trong dung môi hữu cơ như alcohol, ether, chất béo [1],[13]

Thành phần hóa học của tinh dầu gồm terpene và những dẫn xuất chứa oxy của terpene (như alcohol, aldehyde, ketone, ether…) Mặc dù có nhiều cấu tử như vậy nhưng thường một vài cấu tử chính có giá trị và có mùi đặc trưng cho tinh dầu đó[1],[13] Terpene là một loại hydrocarbon không no có công thức (C5H8)n, có thể xem terpene là sản phẩm polymer hóa của isoprene.Người ta còn phân biệt terpene thành monoterpene (C10H16) có chứa hai đơn vị isoprene hay sesquiterpene (C15H24)

Các cấu tử chủ yếu trong tinh dầu vỏ quả của hầu hết các loài thuộc họ cam quýt là các hợp chất thuộc nhóm terpene thường chiếm 80- 85%, tiếp đến là các dẫn xuất chứa oxy của terpene như alcohol, aldehyde, ketone, ester và acid như geranial, decanal, octanol, linalool và citronellol [15]

Limonene (C10H16) là cấu phần chính trong các tinh dầu họ cam quýt Limonene là một chất tự nhiên từ nhóm của terpene monocyclic monoterpene có thể

tồn tại dưới dạng d-limonene, l-limonene hay hỗn hợp d,l-limonene (dipentene) Là

chất lỏng hơi tan trong nước

Tinh dầu được chiết từ mọi bộ phận của cây như cánh hoa, lá, cành, rễ, vỏ trái, hạt, vỏ cây… Tinh dầu chứa trong thực vật có thành phần không ổn định Hàm lượng tinh dầu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, di truyền, đất trồng, phân bón, thời tiết, ánh sáng, thời điểm thu hoạch Trong các bộ phận của cây hàm lượng tinh dầu cũng khác nhau Dựa vào những đặc tính trên thời gian thu hái được xác định để cho hàm lượng tinh dầu nhiều nhất và chất lượng tốt nhất Tinh dầu là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất và không được sử dụng trở lại cho hoạt động sống của cây[1],[13] Phương pháp phổ biến để tách tinh dầu từ cây cỏ là chưng cất bằng lôi cuốn hơi nước Nếu các chất trong tinh dầu bị phân hủy bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước thì người ta sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ (ví dụ như ete dầu hỏa, benzen…) Tinh dầu cũng có thể được khai thác bằng phương pháp cơ học, trích ly siêu tới hạn, trích ly có hỗ trợ vi sóng, sóng siêu âm[1], [13]

1.2.2 Tính chất vật lý

Tinh dầu ở thể lỏng tại nhiệt độ thường, một số trường hợp đặc biệt như menthol, camphor là ở thể rắn Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, tan tốt trong cồn và các loại dung môi hữu cơ, dầu mỡ Tinh dầu không màu hoặc vàng nhạt, một số có màu đặc trưng riêng theo nguyên liệu Tinh dầu có vị cay

và hắc[1],[13]

Tỉ trọng của tinh dầu thường khoảng 0,7-1,2 Tỉ trọng phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hydrocarbon

thường có tỉ trọng nhỏ hơn 0,9 Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất oxygen, hợp chất có nhân thơm thường có tỉ trọng lớn hơn 1 [1],[13]

Tinh dầu thường có chỉ số khúc xạ vào khoảng 1,45 - 1,56 Chỉ số khúc xạ (nD) còn gọi là chiết suất, là tỉ số giữa sin góc tới và sin góc khúc xạ của một tia sáng có độ dài sóng xác định đi từ không khí qua tinh dầu ở nhiệt độ xác định Chỉ

số khúc xạ cao hay thấp tùy theo thành phần các chất chứa trong tinh dầu là no, không no hoặc nhân thơm Nếu trong tinh dầu có nhiều thành phần có nhiều nối đôi thì có chỉ số khúc xạ cao Chỉ số khúc xạ bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ, nhiệt độ càng lớn thì chỉ số khúc xạ biến thiên theo hướng giảm và ngược lại [1],[13]

Hầu hết các tinh dầu đều có tính quang hoạt, nghĩa là có khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực khi ánh sáng này đi xuyên qua Khả năng làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực của mỗi tinh dầu đều khác nhau và biểu thị bằng góc quay cực (αD) Ngoài ra, góc quay cực của tinh dầu thể hiện khả năng hòa tan của tinh dầu trong các loại dung môi, nếu αD càng lớn thì có thể hòa tan tốt trong dung môi phân cực, ngược lại αD càng bé thì có thể hòa tan tốt trong dung môi không phân cực[1],[13]

Vì tinh dầu là hỗn hợp nên không có nhiệt độ sôi nhất định Điểm sôi của tinh dầu thay đổi tùy theo thành phần hợp chất Ví dụ, hợp chất terpene có điểm sôi

là 150-160 0C, hợp chất sesquiterpene có điểm sôi cao hơn khoảng 250-2800C, còn các hợp chất polyterpene có điểm sôi trên 3000C Từ đó, ta có thể tách riêng các thành phần khác nhau trong tinh dầu bằng phương pháp chưng cất phân đoạn Khi

hạ nhiệt độ một số tinh dầu có thể kết tinh như tinh dầu hồi, tinh dầu bạc hà, tinh dầu xá xị[1],[13]

1.2.3 Tính chất hóa học

Tinh dầu dễ bị oxy hóa và có thể bị nhựa hóa một phần dưới tác động của ánh sáng, nhiệt độ, không khí… Alcohol trong tinh dầu bị oxy hóa biến thành aldehyde, aldehyde biến thành acid Các hợp chất có nối đôi dễ bị oxy hóa hoặc tham gia vào phản ứng cộng hợp Các hợp chất ketone và aldehyde dễ bị alcohol hóa tạo nhựa khi

có mặt của kiềm [1]

1.2.4 Thành phần và tính chất hóa lý của tinh dầu vỏ quả tắc

Dưới đây là một số công trình nghiên cứu về thành phần tinh dầu tắc trong những năm gần đây

Từ công trình nghiên cứu Tách tinh dầu và alkaloid từ quả tắc trong Hội nghị Khoa học và Công nghệ lần 9 đã tìm ra thành phần hóa học của tinh dầu

Ghi chú: a (%): hàm lượng thành phần theo phương pháp chưng cất hơi nước

b (%): hàm lượng thành phần theo phương pháp chiếu xạ vi sóng

Từ việc khảo sát hoạt tính giải lo âu của một số tinh dầu từ vỏ quả cây chi Citrus họ Rutacece của Dương Phước An, Huỳnh Thị Bích Tuyền, Nguyễn Ngọc Khôi cũng đã tìm ra được các thành phần trong tinh dầu vỏ quả tắc

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của tinh dầu vỏ quả tắc sử dụng phương pháp

lôi cuốn hơi nước [6]

Phương pháp này cho chất lượng tinh dầu cao Có mùi thơm tự nhiên của

nguyên liệu Quy trình đơn giản nhưng hiệu suất thấp [1], [10], [13]

1.3.2 Phương pháp tẩm trích

Nguyên tắc

Dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu có trong các

mô cây đối với các dung môi hữu cơ [1], [10], [13]

Tinh dầu trích ly có mùi thơm tự nhiên Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn phương pháp cơ học nhưng yêu cầu cao về thiết bị; thất thoát dung môi và quy trình tương đối phức tạp [1], [10], [13]

1.3.3 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Nguyên tắc

Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng Phương pháp lôi cuốn tinh dầu bằng hơi nước dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp không tan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu Khi hỗn hợp này được gia nhiệt, hai chất này dều bay hơi Nếu

áp suất của nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng với áp suất của môi trường, thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước [1], [10], [13]

Quy trình thực hiện cho phương pháp này đơn giản Thiết bị gọn, dễ chế tạo Không cần dung môi Tuy nhiên, không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị) Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn Những tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém [1], [10], [13]

1.3.4 Phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Nguyên tắc: Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16 Hz – 18 kHz) Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và

vỡ ―bọt‖ (khoảng cách liên phân tử) Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu và vỡ trong nửa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn [17]–[20]

Ưu – nhược điểm: Thời gian trích ly nhanh Hiệu suất và chất lượng trích ly cao hơn Thiết bị dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ môi trường Tăng tốc độ hòa tan và tốc độ phản ứng → rút ngắn thời gian phản ứng Giảm tiêu hao năng lượng Nhưng chỉ áp dụng quy mô nhỏ và dễ gây cháy nổ [17]–[20]

1.3.5 Phương pháp trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Nguyên lý: Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích) [1],[10],[21],[22],[23]

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất

có chứa oxygen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém) nên sự trích ly chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi

vi sóng[1],[10],[21],[22],[23]

Ưu điểm: Không có quán tính nhiệt Hiệu suất trích ly cao hơn Thời gian trích

ly nhanh Dung môi sử dụng ít Thiết bị dễ sử dụng và bảo vệ môi trường (năng lượng sạch, dễ chế tạo và dễ kiểm soát) Khả năng tự động hóa và độ chính xác cao hơn Có tác dụng đặc biệt với các phân tử phân cực [1],[10],[21],[22],[23]

Nhược điểm: Không áp dụng cho các phân tử không phân cực Khó áp dụng cho quy mô công nghiệp và có thể gây nổ [1],[10],[21],[22],[23]

1.3.6 Phương pháp trích ly CO 2 siêu tới hạn

Được biết đến cách đây rất lâu từ năm 1879, nhưng đến những năm 1980, phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ nghệ để chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia

vị và nhất là hoa bia Tùy theo thành phần muốn trích sẽ có áp suất, nhiệt độ và điều kiện trích khác nhau [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Định nghĩa: Một hợp chất ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ

và áp suất cao hơn giá trị tới hạn Ở trạng thái siêu tới hạn, hợp chất này không còn

ở thể lỏng nhưng vẫn chưa thành thể khí [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn là phương pháp chiết sử dụng dạng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Điểm ba là nơi mà ba trạng thái rắn, lỏng và khí giao nhau Các đường cong là nơi hai trạng thái cùng hiện diện và hai pha lỏng, khí cân bằng nhau Quan sát dọc theo đường cong khí - lỏng hướng lên cao gặp 1 điểm, nơi đó nồng độ của khí và lỏng bằng nhau Điểm này được gọi là điểm siêu tới hạn và hợp chất lúc đó gọi là chất lỏng siêu tới hạn Tại điểm tới hạn, áp suất và nhiệt độ có các giá trị được gọi lần lượt là áp suất tới hạn (Pc) và nhiệt độ tới hạn (Tc) Hai giá trị này là đặc trưng cho từng chất Lưu chất siêu tới hạn có độ dẫn nhiệt tương đối cao, sức căng bề mặt gần bằng không Ngoài ra, lưu chất siêu tới hạn có khối lượng riêng và độ nhớt thấp hơn nhưng độ khuếch tán lớn hơn chất lỏng Chính tính chất vật lý này làm tăng khả năng truyền nhiệt và truyền khối của lưu chất siêu tới hạn, giúp lưu chất này mang đặc điểm của cả chất lỏng và chất khí [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Các lưu chất được nghiên cứu cho thấy CO2 được ứng dụng rộng rãi nhất trong trích ly siêu tới hạn Vì khí CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31oC), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn.Ở trạng thái này CO2 mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng đồng thời CO2không độc hại, không bắt lửa, dễ tìm và giá thành thấp Với moment lưỡng cực có thể hòa tan một số thành phần phân cực trung bình như ester, andehyde, ketone và

Trạng thái rắn

Trạng thái lỏng

Điểm ba Điểm ba

Điểm tới hạn

Chất lỏng siêu tới hạn

một số thành phần không phân cực như hydrocarbon [24],[25],[26],[27],[28],[29], [30]

Nguyên tắc: Quá trình được chia làm hai giai đoạn chính: chiết tách hòa tan cấu

tử trong dung môi siêu tới hạn, sau đó tách chất trích ra khỏi dung môi Để tách cấu

tử hòa tan ra khỏi dung môi siêu tới hạn bằng cách thay đổi tính chất nhiệt động của dung môi siêu tới hạn bằng việc thay đổi áp suất và nhiệt độ Ngoài ra có thể hấp thụ hoặc hấp phụ các cấu tử bằng các tác nhân khác [24], [25], [26], [27], [28], [29], [30]

Nguyên lý quá trình: Nạp nguyên liệu vào bình chiết, khóa nắp lại Mở dòng

CO2 lỏng đi qua bộ phận làm lạnh rồi qua bơm nén Sau đó qua bộ tăng nhiệt Khi đạt nhiệt độ và áp suất, CO2 trở thành dòng siêu tới hạn, dòng này vào bình chiết Hoạt chất theo dòng CO2 qua bộ phận làm lạnh Tại đây CO2 hóa lỏng và được đưa vào bình tách Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành dạng khí, sản phẩm sẽ lắng xuống, được thu riêng CO2 dạng khí được đưa qua bộp phận nén lạnh, hóa lỏng và đưa trở lại bình chứa Quá trình chiết lại tiếp tục [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Ưu điểm: Khả năng khuếch tán tốt Độ nhớt thấp, áp suất hơi cao, điểm siêu tới hạn của CO2 dễ đạt Độ chọn lọc cao với loại hợp chất cần chiết Vì thế chất chiết tương đối sạch Dễ áp dụng ở qui mô công nghiệp Thân thiện với môi trường Tốc độ phản ứng lớn Tc = 31,1o C nên hòa tan chất dễ phân hủy ở nhiệt độ cao Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

Nhược điểm: Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền Không thích hợp với mẫu chiết dạng lỏng Khó lường được khi chiết trên một mẫu mới Cần có nhiều nghiên cứu tìm các thông số tối ưu để chiết thành công [24],[25],[26],[27],[28],[29],[30]

1.4 Tổng quan hoạt tính kháng oxy hóa

1.4.1 Gốc tự do

Các gốc tự do là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn,

hydroperoxyde, nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do Các gốc tự do phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh nó do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như DNA, protein, lipid [31]

Bảng 1.4 Các gốc tự do trong cơ thể sinh học

Các gốc tự do được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể, ở nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu điều hòa phân ly tế bào; kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm; điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzyme kháng oxy hóa ở nồng độ cao, các gốc tự do oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: đột biến DNA; biến tính protein; oxy hóa lipid [31]

Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi các gốc tự do là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm Sự oxy hóa các Low Density Lipoprotein (LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh huyết

áp cao và nhiều bệnh tim mạch Các gốc tự do tấn công phospholipide màng tế bào làm thay đổi tính mềm dẻo, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên màng do đó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng cũng như việc trao đổi thông tin giữa tế bào và môi trường Sự oxy hóa các DNA bởi các gốc tự do gây nên sự biến dị di truyền là một trong những nguy cơ phát triển ung thư Nhiều enzyme và protein vận chuyển cũng bị oxy hóa và vô hoạt bởi các gốc tự do Sự tích lũy các sản phẩm của

sự oxy hóa các cấu tử tế bào gây nên hiện tƣợng lão hóa sớm Để bảo vệ cơ thể khỏi các tác động của các gốc tự do, tế bào đƣợc trang bị một hệ thống bảo vệ bao gồm các chất kháng oxy hóa [31]

1.4.2 Các chất kháng oxy hóa

Các chất kháng oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngƣợc quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào cơ thể Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất kháng oxy hóa đƣợc phân thành hai loại: các chất kháng oxy hóa bậc một và các chất kháng oxy hóa bậc hai Các chất kháng oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kiềm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất kháng oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do nhƣ Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn) [31]

Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa

1 Các chất kháng oxy hóa bậc 1: vô hoạt các gốc tự do

2 Các chất kháng oxy hóa bậc hai: ngăn chặn sự tạo các gốc tự do

2.1 Phân giải hydroperoxyde và hydrogen peroxyde

2 H2O2 → 2 H2O + O2 Glutathion peroxydase (tế bào) Phân giải hydrogen peroxyde và hydroperoxyde

của acid béo tự do

2 H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG

của chất béo LOOH + AH2 → LOH + 2 H2O + A

H2O2 + AH2 → 2 H2O + A aber-Weiss

2.2 Tạo phức với kim loại gây phản ứng Fenton và H

Transferrin, lactoferrin Tạo phức với Fe

Ceruloplassmin, albumin Tạo phức với Cu

2.3 Vô hoạt oxy đơn và ion superoxyd

Superoxyde dimutase Biến đổi ion superoxyde

2 O●-2 + 2 H+ → 2 H2O + O2

Hệ thống các chất kháng oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn: bên trong và bên ngoài Các chất kháng oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt) và các enzyme kháng oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase) Các chất kháng oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamine E, vitamine C, các carotenoid và các hợp chất phenolic Các chất này có nhiều trong rau và quả Chúng được coi là các chất kháng oxy hóa tự nhiên Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống kháng oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa [31]

1.5 Tổng quan hoạt tính kháng khuấn

1.5.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Phần lớn các hợp chất có khả năng kháng vi sinh vật được tìm thấy trong tinh dầu là terpene, terpenoid, phenylpropene, aldehyde và một số hợp chất khác Tinh dầu có các hợp chất với cấu hình cis hoặc cấu tạo mạch thẳng có hoạt tính mạnh hơn cấu hình trans hoặc cấu tạo mạch nhánh Nhóm định chức hydroxy trong alcohol và phenol là những nhóm có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính kháng vi sinh vật [32]

Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm

được hiểu như là khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện in

vitro thông qua việc xác định đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô

khuẩn càng lớn thì khả năng ức chế vi sinh vật tương ứng của tinh dầu càng cao [1],[33]

Có nhiều phương pháp được dùng để xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu, trong đó, thông dụng nhất là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch[1],[33]

Cách tác dụng lên vi sinh vật của các tinh dầu thường giống nhau, đó là tác dụng vào tế bào chất hơn là lên vách tế bào Cơ chế kháng vi sinh vật của tinh dầu nhìn chung rất phức tạp và vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu

Theo Knobloch và các cộng sự, đặc tính quan trọng nhất của tinh dầu là có chứa các thành phần có tính kị nước, nên có khả năng liên kết với lipid ở ti thể, thành tế bào của vi khuẩn, làm thay đổi cấu trúc và khiến thành tế bào dễ thấm thấu hơn Từ đó, các ion và chất chuyển hóa ở tế bào chất sẽ thoát ra ngoài, ảnh hưởng đến khả năng trao đổi chất và ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Đây là một trong rất nhiều cơ chế tác động của tinh dầu lên vi sinh vật [34]

Bên cạnh đó, tinh dầu có chứa các hợp chất phenolic như carvacrol, eugenol, thymol cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự sinh trưởng của vi sinh vật [34]

1.5.2 Các vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm

1.5.2.1 Vi khuẩn Staphyloccus aureus

Giới: Eubacteria

(2005) nhiệt độ sinh trưởng tối ưu

của S.aureus là 18 – 400C Nhiệt độ

thích hợp để tiết sắc tố là 20 – 250C Ngoài ra chủng này còn có thể sinh trưởng trong môi trường có hoạt độ nước thấp (aw min = 0,85) hay môi trường có nồng độ muối cao [35]

Staphylococcus aureus (S aureus) là tụ cầu khuẩn xếp thành đám giống hình

chùm nho, gram dương, kỵ khí tùy tiện Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên

tính chất màu vàng của S aureus và đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính

chất chống ôxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết bởi các phản ứng oxy của hệ miễn dịch vật chủ [36], [37] Chủng này thường được tìm thấy trong đường hô hấp và trên da, niêm mạc người Nó dương tính với catalase và giảm nitrate Mặc

dù S aureus không phải lúc nào cũng gây bệnh, nó là một nguyên nhân phổ biến

của nhiễm trùng da như áp xe, nhiễm trùng đường hô hấp như viêm xoang, ngộ độc thực phẩm Chủng gây bệnh thường thúc đẩy nhiễm trùng bằng cách sản xuất

mạnh protein độc tố và bất hoạt kháng thể S aureus là loài phổ biến nhất của Staphylococcus gây nhiễm trùng tụ cầu khuẩn [38]; có thể tồn tại từ vài giờ đến

vài tuần, thậm chí hàng tháng, trên bề mặt môi trường khô [39] và có khả năng gây

ra ngoại độc tố gây bệnh khi nhiễm vào thực phẩm [35] [40]

1.5.2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

 Bộ: Bacillales

 Họ: Bacillaceae

 Giống: Bacillus

 Loài: Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+), hình que, hiếu khí, có khả năng sinh bào

tử nhỏ, không có khả năng di động Bacillus subtilis nói riêng và giống Bacillus nói

chung sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 5 - 50 0

C, tối ưu ở 35 – 400C, pH dao

động từ 4,5 – 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng [41] Bacillus

subtilis là một probiotic trên người khỏe nhưng đối với người suy giảm miễn dịch

nặng có thể gây ngộ độc dạ dày ruột [42] và gây hư hỏng bột bánh mì [43]

1.5.2.3 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi

khuẩn hình gậy gram âm, có khả năng di động bởi một tiêm mao đơn cực[45],[46],

là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nhưng có thể phát triển trong môi trường kỵ khí khi có

NO3- làm chất nhận điện tử; nhiệt độ phát triển tối ưu 370C nhưng có thể phát triển

ở 5-420C Đặc điểm sinh hóa: không lên men glucose, có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrat (+), oxydase (+), sử dụng citrate (+) Là chủng phổ biến gây bệnh ở động vật và con người [42],[44],[35] Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới, thường gặp trong các loại thực phẩm đặc biệt rau quả, thịt gia súc, gia cầm và hải sản Sinh sắc tố bao gồm pyocyanin (lam-lục), fluorescein (vàng-lục và fluorescent, hiện tại được gọi là pyoverdin), và pyorubin (đỏ-nâu) [47] và chất thơm Kymetylamin

Hình 1.5 Trực khuẩn Pseudomonas

aeruginosa

Thực vật và y học (gây bệnh): viêm đường ruột, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng trong tim, viêm màng não mủ,viêm tủy xương, hóa sừng ở mắt, nhiễm trùng da, mô mềm, viêm tai mủ [45] Hay nhiễm trong nước đóng chai [48],[49]

1.5.2.4 Vi khuẩn Klebsiella pneumonia

Loài: Klebsiella pneumonia

Là vi khuẩn hình que, gram âm, kỵ khí tùy ý Mặc dù được tìm thấy trong các thực vật bình thường trong miệng, da và ruột, [50] nó có thể gây ra những thay đổi phá hoại phổi của con người và động vật nếu hút (hít vào), cụ thể để các phế nang (trong phổi) kết quả trong đờm có máu Trong bối cảnh lâm sàng, nó là thành

viên quan trọng nhất của Klebsiella chi của Enterobacteriaceae Trong những năm

gần đây, đã trở thành tác nhân gây bệnh klebsiellae quan trọng trong bệnh viện nhiễm trùng Nó tự nhiên xảy ra trong đất, và khoảng 30% các chủng có thể sửa chữa nitơ trong điều kiện yếm khí [51].Sống tự do trong hệ thống cố định đạm của nó đã được nhiều nghiên cứu nhiều, và là mối quan tâm nông nghiệp,

như K pneumoniae đã được chứng minh để tăng năng suất cây trồng trong điều

kiện nông nghiệp [52] Gây bệnh viêm phổi, viêm phế quản, viêm mủ màng phổi,

dính màng phổi Ngoài viêm phổi, Klebsiella cũng có thể gây nhiễm trùng

trong nước, người bị bệnh tiểu đường, thấp hơn mật đường, và các vết thương phẫu thuật Phạm vi của các bệnh lâm sàng bao gồm viêm phổi, viêm tắc tĩnh mạch, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm túi mật, tiêu chảy, trên đường hô hấp nhiễm trùng đường, nhiễm trùng vết mổ, viêm tủy xương, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết và và nhiễm trùng huyết Nghiên cứu tiến hành tại trường

Hình 1.6 Vi khuẩn Klebsiella pneumonia

Cao đẳng King, London đã khảo sát phân tử HLA-B27 và hai phân tử bề

mặt Klebsiella như nguyên nhân của viêm cột sống dính khớp [53]

Klebsiella đứng thứ hai với E coli nhiễm trùng đường tiết niệu ở người

già Nó cũng là một tác nhân gây bệnh cơ hội cho những bệnh nhân có bệnh mãn tính ở phổi, gây bệnh đường ruột, niêm mạc mũi teo, và rhinoscleroma

Chủng K pneumoniae kháng thuốc đang xuất hiện [54] Khi chủng này tồn tại trong

thịt gia cầm gây bệnh cho người (bội nhiễm đường hô hấp, nhiễm trùng máu…) [55][56]

1.5.2.5 Vi khuẩn Proteus mirabilis

Loài: Proteus mirabilis [42],[57]

Là vi khuẩn hình que, gram âm, kỵ khí; phát triển ở 370C có khả năng thủy phân ure tạo ammoniac làm nước tiểu tăng tính kiềm, để lâu dẫn đến suy thận, sỏi

thận Proteus cũng có thể gây ra nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng huyết, viêm

phổi, chủ yếu là ở những bệnh nhân nhập viện Gây viêm dạ dày ruột trẻ em Proteus kháng nhiều loại kháng sinh do vậy khi sử dụng kháng sinh nhiều loại vi khuẩn bị diệt nhưng proteus ít bị ảnh hưởng Proteus còn là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, có trong thịt cá hôi thối [42],[57]

1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

1.6.1 Phương pháp sử dụng khoanh giấy trên môi trường đặc

Nguyên tắc: Mẫu chứa các hoạt tính kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với mẫu chứa hoạt tính kháng sinh được biểu thị bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của chất thử càng mạnh [58],[59]–[71],[33], [72], [73],[74],[75]

Hình 1.7 Vi khuẩn Proteus mirabilis

1.6.2 Phương pháp sử dụng ống trụ trên môi trường đặc

Nguyên tắc: xác định khả năng kháng khuẩn của chất thử nghiệm cho vào ống trụ, khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh ống trụ đựng chất thử Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng chất thử nghiệm càng mạnh [33]

1.6.3 Phương pháp sử dụng kỹ thuật hệ nồng độ trong môi trường lỏng

Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng

độ khác nhau của chất cần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống Xác định nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm ức chế được sự phát triển của vi khuẩn Nồng độ này được gọi là nồng độ tối thiểu ức chế (MIC: Minimal inhibitory concentration) Phương pháp này còn được gọi là phương pháp hệ nồng độ [33], [66]–[71], [76]

1.6.4 Phương pháp sử dụng kỹ thuật vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtitre technique)

Nguyên tắc: dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trường lỏng, có chất dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn định nghiên cứu Thêm những nồng

độ khác nhau của chất cần nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống Xác định nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm ức chế được sự phát triển của vi khuẩn sử dụng dàn máy ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: thử nghiệm miễn dịch enzyme) để đo Do đó phương pháp này hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với kỹ thuật hệ nồng độ thông thường ở các điểm sau [33]:

 Phương pháp này sử dụng 8 dãy thí nghiệm

 Phương pháp này sử dụng 11 độ pha loãng

 Kỹ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường, phương pháp này được xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA

1.6.5 Phương pháp sinh tự ký (Bioautography)

Phương pháp này tiến hành khi đã xác định mẫu chiết toàn phần có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn Để xác định thành phần trong mẫu có tác dụng,

thì có thể phân lập ra một số dạng chiết phân đoạn rồi thử nghiệm với vi khuẩn bằng các phương pháp khác nhưng để phát hiện nhanh hơn dùng phương pháp sinh

tự ký sử dụng tấm kính có lớp mỏng silicagel và hệ dung môi để sắc ký, sau đó soi bản mỏng chứa mẫu ở dạng vết dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm hoặc 366 nm, đánh dấu các vết và láng vi khuẩn đều, ủ 18 – 24 giờ Xem kết quả vùng vết nào đã đánh dấu trên tấm kính mà không bắt màu thì chất đó có tác dụng kháng khuẩn [33]

1.7 Tình hình nghiên cứu về tinh dầu họ citrus trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Dưới đây là một vài công trình nghiên cứu trên thế giới về trích ly tinh dầu bằng SC - CO2 và hoạt tính sinh học của chúng

G.A Castillo – Herrera và cộng sự (2015) đã trích ly limonoid trên hạt chanh ta

(citrus aurantifolia swingle seed) sử dụng phương pháp SC - CO2 và phương pháp trích ly bằng dung môi hexan (tỷ lệ 1:10); kết quả cho thấy IC50 tác động lên tế bào lympho bởi limonoid là 8,5 µg/ml (SC - CO2) và 9 µg/ml (dung môi), hiệu suất trích

ly limonoid chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và đạt cao nhất 0,388 mg/g hạt khô (48,5 bar, 3330K [77]

B Uysal và cộng sự (2011) so sánh hiệu suất, thành phần tinh dầu, khả năng

kháng khuẩn của vỏ bưởi (grapefruit – Citrus paradise Mac.f peel) sử dụng phương

pháp siêu tới hạn và lôi cuốn hơi nước cho thấy khi sử dụng SC - CO2 cho hiệu suất 0,44%, thành phần 91,5% limonene và 4,7% các hợp chất chứa oxygen, thời gian trích ly 20 phút Đối với phương pháp lôi cuốn hơi nước thu hiệu suất 0,42% chứa 88,6% limonene và 2,8 % các hợp chất oxygene trong 180 phút Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu thu nhận bằng SC - CO2 cao hơn trích bằng lôi cuốn hơi nước [78]

N.H.M Al-saadi và cộng sự (2009) xác định hoạt tính tinh dầu vỏ cam Irag trên

các chủng vi sinh Aeromonas hydrophila, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescenes, Proteus spp Enterococcus feacalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Listeria spp

Kết quả thu được với nồng độ tinh dầu 12,5 mg/ ml, IZD = 12 mm đối với

Klebsiella pneumonia, IZD = 14 mm đối với Aeromonas hydrophila [79]

Y W Wang và cộng sự (2012) thu tinh dầu trên tắc Trung Quốc (Fortunella

crassifolia Swingle) bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước và xác định hoạt tính trên

các chủng vi sinh Escherichia coli, Samonella typhimurium, Staphylococus aureus,

Bacilus cereus, Baclilus subtilis, Lactobacillus bulgaricus, Bacilus laterosporus, Candida albicans ; kết quả IZD = 13,7–20,8 mm đối với tất cả chủng vi sinh khảo

sát, IZD = 13,7 ± 0,75 mm đối với Candida albicans, MIC = 70,0 μg/mL đối với

P Tongnuanchan và cộng sự (2013) đã xác định hoạt tính trên tinh dầu chanh bằng phương pháp DPPH và ABTS, FRAP cho kết quả kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH (µmol trolox/g) là 0,15 ± 0,01; ABTS (µmol trolox/g) là 28,01±2,07 ; FRAP (µmol trolox/g) là 2,76 ± 0,08 [82]

D Barreca và cộng sự (2011) đã khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa nước quả kumquat theo phương pháp ABTS và DPPH cho kết quả tắc chín cho hoạt tính oxy hóa thấp hơn tắc xanh trưởng thành, Khả năng bắt gốc tự do của ABTS (93%) cao hơn so với DPPH (79%) [83]

Z Wu và cộng sự (2013) đã khảo sát trên tinh dầu chanh cho thấy giai đoạn trưởng thành các hàm lượng gia tăng đáng kể, tồn tại sự tích tụ hydrocacbon, keton trong suốt quá trình trưởng thành và limonene dao động từ 32,07% đến 36,27% Hoạt tính kháng oxy hóa của chúng theo DPPH ở giai đoạn chưa trưởng thành là cao nhất (78,4 ± 2,6%), tiếp theo là trung gian (64,7 ± 3,6%) và trưởng thành (63,8

± 2.1%) Theo phương pháp bắt gốc oxy hóa (H2O2) hoạt tính tăng dần từ 2,5 đến

15 µl/ml và nguyên liệu chưa trưởng thành cho hoạt tính cao hơn [84]

D Roberto và cộng sự (2010) đã khảo sát trên dịch chiết nóng tắc (citrus mitis blanco) cho thấy Monoterpene có hoạt tính kháng oxy hóa Trước đó, đã được chứng minh rằng limonene có khả năng chống tăng sinh trên lymphoma dòng tế bào

mà không sửa đổi khả năng tồn tại các tế bào lympho bình thường H2O2 có một vai trò trong điều chế tăng sinh tế bào Trong nghiên cứu này, các tác động của sự tăng sinh tế bào lympho limonene về bình thường và quan hệ của nó với điều chế mức

độ H2O2 được phân tích, đánh giá tác động của nó đối với hoạt động của các enzym kháng oxy hóa tế bào, chẳng hạn như catalase, peroxydase và superoxyde dismutase Limonene gây ra ảnh hưởng qua hai giai đoạn trên tăng sinh tế bào; sự gia tăng phát triển tế bào có liên quan đến việc giảm mức độ H2O2 bởi sự gia tăng trong hoạt động catalase và peroxydase Hơn nữa, limonene bảo vệ các tế bào để oxy hóa gây

ra bằng cách bổ sung ngoại sinh của H2O2 Theo quan điểm của các kết quả này, có thể là limonene có thể bảo vệ các tế bào lympho bình thường, các bệnh liên quan đến stress oxy hóa, bao gồm cả ung thư, nhưng nghiên cứu thêm là cần thiết để thiết lập vai trò của limonene như là một chất kháng oxy hóa tiềm năng mà hiệu quả có thể bảo vệ các tế bào lympho từ sự căng thẳng oxy hóa và rối loạn chức năng của ty lạp thể [85]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Các nghiên cứu về tinh dầu h ọ c i t r u s ( c a m , c h a n h , b ư ở i , tắc) được thực hiện khá nhiều trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Thái Lan… nhưng tại Việt Nam còn rất hạn chế, gần đây mới có một số ít công trình nghiên cứu về tinh dầu họ citrus và tinh dầu tắc

Lê Phạm Tấn Quốc và cộng sự (2013) tối ưu hóa quá trình trích ly tinh dầu tắc bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước; kết quả cho thấy với số lượng vỏ tắc/ lần =

50 g, xay thời gian (118 giây), tỷ lệ nước / vỏ (6/1) và thời gian chưng cất (32 phút), hàm lượng tối ưu của tinh dầu là 1,8 ml / 50 g mẫu (tương đương 3,6%, v / w) Thành phần của tinh dầu gồm limonene (90,87%), β-myrcene (4,41%) và α-pinen, β-pinen, Sabinene [86]

Nguyễn Minh Hoàng (2006) khảo sát tinh dầu vỏ trái giống citrus (cam sành, bưởi da xanh, chanh giấy) bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước cổ điển và hỗ trợ vi sóng Kết quả cho thấy thành phần hóa học của tinh dầu bưởi da xanh, cam sành, chanh giấy và thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu này Nguyên liệu xay

sẽ cho hàm lượng tinh dầu cao hơn, thời gian trích ly ngắn hơn so với nguyên liệu không xay Hiệu suất theo phương pháp cổ điển không xay nguyên liệu (bưởi: 0,59%; cam: 1,34%; chanh: 0,83%); với Phương pháp cổ điển có xay (bưởi: 1,58%; cam: 3,79%; chanh: 1,78%); phương pháp chưng cất vi sóng (bưởi: 0,51%; cam: 0,48%; chanh: 0,40%) Kháng khuẩn tốt trên một số chủng thử nghiệm

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (d = 7-13mm), Shigella (d = 7 -16mm), Salmonella paratyphi A (d = 8- 16 mm) [87]

Nguyễn Thị Lý và cộng sự (2009) tách chiết tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước cổ điển và lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng cho thấy các thông số tối ưu theo phương pháp đun nóng cổ điển là tỷ lệ vỏ tươi: nước = 1:2,5; thời gian chưng 90 phút; đối với phương pháp chiếu xạ vi sóng tỷ lệ vỏ tươi:nước=1:3,5; vỏ trữ đông=1:3,5; vỏ khô=1:5,5, thời gian chưng cất 35 phút Kết quả cho thấy thành phần hóa học và chỉ số hóa lý của tinh dầu tắc Thành phần cao tắc: flavonoid, alkcaloid, phytosterol, steroid, acid hữu cơ, đường khử, carotenoid, saponin Hiệu suất tinh dầu khá cao (2,61% từ phương pháp đun nóng cổ điển; 3,54% từ phương pháp chiếu xạ vi sóng) Thành phần chính trong tinh dầu là limonene Nước tắc gồm: Alkcaloid A (codein) và alkcaloid B với hiệu suất 6,68% (so với lượng cao khô) [16]

Trịnh Hoàng Hiếu và cộng sự (2009) khảo sát tinh dầu từ vỏ và lá tắc thu hái tại Châu Thành – Tiền Giang sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chưng cất lôi cuốn hơi nước có sự kết hợp của chiếu xạ vi sóng, kết quả cho thấy

hoạt tính kháng vi sinh vật trên tinh dầu vỏ tắc đối với chủng Bacilus subtilis (d =

6-18,5 mm), Ecsherichia Coli ATCC 25922 (d = 6 - 9 mm), Staphylococcus aureus

ATCC 25923 (d = 6 - 12mm), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (d = 6mm),

Candida albicans (d = 6 - 12mm), khả năng kháng vi sinh vật trên tinh dầu lá tắc

cao hơn so với tinh dầu vỏ tắc [88]

Dương Phước An và cộng sự (2010) trích ly tinh dầu vỏ tắc bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sau đó được làm khan bằng NaSO3 kết quả thành phần tinh dầu thu nhận có sự hiện diện của 7,7-dimethyl-2-methylen bicyclo[2.2.1]heptan (0,21%) và 1,2,3,4a,5,6,8a-octahydro-7-methyl-4-methylen-1-(methylethyl) naphthalen (1,32%) có tác dụng giải lo âu mà không phát hiện ở 4 loại tinh dầu còn lại [6]

Ths Nguyễn Ngọc Thanh (2010) đã nghiên cứu chiết tách limonene trên cam, chanh, bưởi và nghiên cứu chính trên đối tượng vỏ cam ngọt bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước và SC - CO2 thu nhận kết quả tối ưu đối với phương pháp cất lôi cuốn hơi nước kết hợp với chưng cất phân đoạn ở áp suất giảm thì thời gian chưng là 150 phút, tỷ lệ nguyên liệu/ nước =1:2.5, hiệu suất tách limonene 56,1%; đối với phương pháp chiết bằng CO2 siêu tới hạn chiết tinh dầu tối ưu ở nhiệt độ 500C, áp suất 260 bar, thời gian 285 phút, hiệu suất 4,02%, chiết limonene tối ưu tại nhiệt độ

500C, áp suất 110 bar, thời gian chiết 3 giờ và thu được hàm lượng D-limonene: 95,58% (phương pháp lôi cuốn kết hợp cất phân đoạn); 80,78% (phương pháp SC -

CO2) [7]

Lê Phạm Tấn Quốc và cộng sự đã trích ly tinh dầu vỏ chanh không hạt (Citrus

latifolia) sử dụng phương pháp lôi cuốn hơi nước kết quả cho thấy thành phần hóa

học với limonene là chủ yếu, chỉ số hóa lý của tinh dầu nhẹ hơn nước [89]