Tạo dòng và tối ưu hóa biểu hiện gen mã hóa enzyme lignin peroxidase trên hệ thống biểu hiện pichia pastoris

Phạm Nguyễn ức Hoàng đã tận tình hướng dẫn tôi về kiến th c chuyên môn, luôn hỗ trợ về mặt thời gian và tạ điều kiện thuận lợi cho tôi sử dụng phòng thí nghiệm trong quá trình nghiên c

NGÔ THÙY TRÂM

C VIÊN: 13310318

ENZYME LIGNIN BI U

QU C BÌNH

– tháng 01 năm 16

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quốc Bình

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Hoàng Quốc Khánh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại rường đại học Bách Khoa, HQG Tp HCM

ngày 08 tháng 01 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch: PGS TS Lê Phi Nga

2 Thư ký: TS Hoàng Mỹ Dung

3 Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

4 Phản biện 2: TS Hoàng Quốc Khánh

5 Ủy viên: TS Nguyễn Tú Anh

Xác nhận của Chủ tịch hội đồng đánh giá LV và rưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

I H C BÁCH KHOA

ộc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHI M VỤ LU

Họ tên học viên: NGÔ THÙY TRÂM MSHV: 13310318

gày, tháng, năm sinh 14/04/1987 ơi sinh à Nẵng

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280

Ề TÀI: Ư

R R BI U HI N PICHIA PASTORIS

NHI M VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Thu nhận, tạ ng à i hiện thành ng g n mã h n ym ignin

L I CẢ Ơ

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâ sắc tới TS Nguyễn Quốc Bình,

người đã hướng dẫn tận tình, đ ng góp những ý kiến quý báu, giúp tôi có th hoàn thành đề tài tốt nghiệp thạc sỹ này

i ũng in gửi lời cảm ơn hân thành đến ThS Nguyễn uân ồng, TS

Phạm Nguyễn ức Hoàng đã tận tình hướng dẫn tôi về kiến th c chuyên môn,

luôn hỗ trợ về mặt thời gian và tạ điều kiện thuận lợi cho tôi sử dụng phòng thí

nghiệm trong quá trình nghiên c u , cùng toàn th quý thầy cô bộ môn Công nghệ

Sinh học trường ại Học Bách Khoa Tp.HCM, đã tr yền đạt kiến th c chuyên

môn, tạ điều kiện cho tôi trong quá trình học tập ũng như ú thực hiện luận ăn

Tôi cảm ơn n ãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí

Minh và các anh chị em phòng Công nghệ Vi Sinh đã đã n động i n, giú đỡ

và tạ điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian làm luận ăn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gi đình, ạn bè, những người đã n n cạnh, giú đỡ t i ượt kh khăn tr ng s ốt quá trình học tập

Tuy có nhiều nỗ lực và cố gắng nhưng thời gian và kiến th c có hạn nên không

th tránh khỏi những thiếu sót, khiếm khuyết Rất mong nhận được sự góp ý, chỉnh sửa của quý thầy cô

Trân trọng!

Ngô Thùy Trâm

Trong xu thế phát tri n hiện n y, i th n đ ng à ng ồn năng ượng thay thế đầy tri n vọng do các lợi ích từ nó như có nguồn gốc từ thiên nhiên, không gây ô nhiễm

m i trường và có th sản xuất từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có Tuy nhiên quá trình sản xuất bioethanol từ nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp còn nhiều khó khăn

và tốn kém hi h , đặc biệt là ở gi i đ ạn tiền xử ý đ loại bỏ thành phần lignin Việc sử dụng á hương há h ý t y đ m ại hiệu quả cao, song lại gây tiêu tốn năng ượng ũng như tạo ra các chất độc hại ảnh hưởng đến m i trường và s c khỏe củ n người Nhằm hướng đến mục tiêu nâng cao hiệu quả loại bỏ lignin,

tạ điều kiện thuận lợi cho quy trình sản xuất ethanol sinh học, hương há tiền xử

lý sinh học sử dụng enzyme lignin peroxidase là một cải tiến quan trọng

r ng nghi n này, húng t i đã tiến hành tổng hợ nhân tạ một g n mã hóa cho enzyme lignin peroxidase H8 ( ) đồng thời th nhận mã h h

LiPH8 từ nấm mụ trắng P chrysosporium ATCC 24725 Hai gene này đã đượ iến nạ thành ng à hệ thống i hiện Pichia pastoris ạt t nh n ym ignin r i s ủ ng nấm men P pastoria mang gen lipH8 và TH đạt ần ượt

9, / à 1 , / s 9 giờ n i ấy tr n m i trường Kết ả khả sát

nồng độ methanol cảm ng cho thấy dòng L4 (tuy n chọn từ P pastoris mang gene lipH8 ) và TH1 (tuy n chọn từ P pastoris mang gene TH) có hoạt tính enzyme cao

nhất là 19,9U/l và 11,2U/l khi sử dụng nồng độ m th n ,5% à 1%, thời gi n

tương ng à s 7 h à 9 h

Nowadays, bioethanol is prospect energy source because of its advantages such as: natural original, no – ti n n h m t ri w r, it’s sti iffi t n expensive for bioethanol manufacturing process from agricultural waste, especially pretreatment removes lignin Although physical – chemical method has high efficiency, it consumes more energy and generate toxic affected on health and environment To improve efficiency in lignin removal in bioethanol manufacturing process, biological pre–treatment using lignin peroxidase is important improvement

In this research, we made artificial synthesic gene encoding enzyme lignin

peroxidase H8 (TH) and isolating LiPH8 cDNA from P chrysosporium ATCC

24725 These genes were transformed into Pichia pastoris expression system successfully Lignin peroxidase activity of P pastoris which lipH8 and TH genes

were 9,4 U/l and 12,4U/l respectively after culturing 96 hours in BMMY medium

Survey result of methanol concentration shows that L4 (from P pastoris with lipH8 gene) and TH1 (from P pastoris with TH gene) have the highest enzyme

activity 19,9 U/I and 11,2 U/I when used methanol concentration are 0,5% and 1% after 72hrs and 96hrs respectively

i in m đ n đây à ng trình nghi n u của riêng tôi Các số liệu, kết quả

nêu trong luận ăn à tr ng thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên c u của mình

LỜI CẢ Ơ i

TÓM TẮT LUẬ Ă ii

ABSTRACT iii

LỜ iv

MỤC LỤC v

Ụ Ắ viii

Ụ ix

Ụ BẢNG xi

Ụ BI xi

Ở 1

1 nh ấ thiết ủ đề tài 1

2 Mụ ti đề tài 3

3 Phạm vi nghiên c u 3

4 Nội dung nghiên c u 3

5 hương há nghi n u 3

6 Ý nghĩ kh họ à ý nghĩ thực tiễn 4

ƯƠ 1 ỔNG QUAN 5

1.1 Bioethanol 5

1.2 ổng n ề ng y n iệ ign s à ignin 6

1.2.1 Nguồn nguyên liệu lignocellulose 6

1.2.2 ử ý ignin tr ng sản ất ồn sinh họ 9

1.3 ệ n ym hân giải ignin 10

1.4 Nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium 11

1.5 ệ thống i hiện Pichia pastoris 13

peroxidase thu nhận từ P chrysosporium 14

1.6.1 ghi n ng ài nướ 14

1.6.2 ghi n tr ng nướ 15

ƯƠ ẬT LI ƯƠ ỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 ối tượng nghiên c u 16

2.1.2 Thiết bị dụng cụ 16

2.1.3 i trường và hóa chất 17

2.2 hương há nghi n u 18

2.2.1 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 từ dòng P chrysosporium ATCC 24275 19

2.2.2 Nhân dòng gen mã hóa cho LiPH8 trên E.coli 5α 21

2.2.3 Tạo dòng gen mã hóa cho LiPH8 trên Pichia pastoris 26

2.2.4 Khả sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ng lên sự bi u hiện của enzyme lignin peroxidase 30

ƯƠ 3 K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 từ dòng P.chrysosporium ATCC 24275 31

3.2 Nhân dòng gene mã hóa cho LiPH8 trên E.coli 5α 33

3.3 Tạo dòng gen mã hóa cho LiPH8 trên Pichia pastoris 37

3.4 Bi u hiện enzyme lignin peroxidase tái tổ hợp 38

3 5 Khả sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ng lên sự bi u hiện của enzyme lignin peroxidase 40

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 44

Kết luận 44

K Ả 45 PHỤ LỤC 49 TÓM TẮT LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 57

bp Base pair

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

DNA Deoxyribonucleic acid

LB Luria-Bertani

LiP Lignin peroxidase

MnP Manganese peroxidase

mRNA messenger ribonucleic acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomeribonucleic acid

tRNA Transfer ribonucleic acid

BMMY Buffer glycerol complex medium

BMGY Buffer methanol complex medium

Hình 1.1 Cấu tạo ủ hệ lignocellulose 8

Hình 1.2 ấ trú ủ ignin à 3 ti u đơn ị ủ n 8

Hình 1.3 Nấm mục trắng P Chrysosporium 13

Hình 2.1 Bản đồ gen plasmid pPIC9K 16

Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ng RT- R ước 2 với cặp mồi LiPH8F-LiPH8R 21

Hình 2.3 Chu trình nhiệt phản ng RT- R ước 2 với cặp mồi AOX1F/AOX1R và RiH8F/RiH8R 24

Hình 2.4 Mô hình plasmid pPIC9K mang gen mục tiêu chèn vào genome của Pichia pastoris 27

Hình 3.1 Kết ả điện i tá h hiết R tổng số 31

Hình 3.2 Kết ả điện i sản hẩm R ới ặ mồi i F-LiPH8R 32

Hình 3.3 ấ tạ ủ t r i hiện 9K-lipH8 33

Hình 3.4 ẫ E coli 5α đã iến nạ smi 34

Hình 3.5 Cấu tạo của vector bi u hiện pPIC9K-TH 34

Hình 3.6 Kết ả R kh ẩn ạ ới mồi 1F/R 35

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pPIC9K-lipH8 mang gen lipH8 của dòng EL8.3 với hai enzyme cắt NotI và SnaBI 36

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pPIC9K-TH của dòng ETH1 với hai enzyme cắt NotI và SnaBI 37

Hình 3.9 Kết ả sàn ọ tr n m i trường h 1 mg/m 37

ình 3 1 Kết quả điện di sản phẩm PCR ki m tra sự sát nhập của các plasmid pPIC9K-TH và pPIC9K-lipH8 vào bộ gen P pastoris GS115 38

Hình 3.11 iện di SDS-PAGE sản phẩm dịch lên men sau 96 giờ của các chủng nấm men tái tổ hợp 40

1% methanol 43 Hình 3.13 iện di SDS-PAGE sản phẩm dịch lên men của dòng H4, bổ sung 0,5% methanol 43

Bảng 1.1 Thành phần cellulose, hemicellulose và lignin trong một số loại vật liệu

lignocellulose 7

Bảng 2.1 Các cặp mồi dung trong phản ng PCR 17

Bảng 2.2 Thành phần phản ng tạo cDNA 20

Bảng 2.3 Thành phần phản ng PCR khuế h đại gen LIPH8 với cặp mồi LipH8F/LipH8R 21

Bảng 2.4 Thành phần phản ng cắt với NotI và SnaBI 21

Bảng 2.5 Thành phần phản ng nối 23

Bảng 2.6 Thành phần gel chạy SDS-PAGE 29

Ụ BI U Ồ Bi đồ 3.1 Hoạt tính lignin peroxidase của một số dòng P pastoris tái tổ hợp 39

i đồ 3 ạt t nh ignin r i s ủ dòng P pastoris L4 41

i đồ 3 3 ạt t nh ignin r i s ủ dòng P pastoris TH1 42

Ở

1 n t t t

gày n y, n người đ ng hải đối mặt với hai vấn đề khủng hoảng lớn: năng ượng, và sự biến đổi khí hậu mang tính toàn cầu Các vấn đề này liên quan trực tiếp với nh à tương tá ại lẫn nhau

Cùng với sự phát tri n của xã hội, nhu cầu sản xuất ngày càng nhiều các sản phẩm phục vụ đời sống và việc sử dụng năng ượng củ n người ngày càng tăng cao Tuy nhiên việc khai thác và sử dụng các nguồn tài ng y n năng ượng không

hợ ý đã gây r nhiều hậu quả nghiêm trọng Theo dự báo của các nhà khoa học thế giới, nguồn năng ượng từ các sản phẩm hóa thạch dầu mỏ sẽ ng y ơ ạn kiệt trong vòng 40-5 năm nữa Nhiệt độ trung bình củ trái đất ũng được dự đ án sẽ tăng từ 1,4 – 5,80 đến năm 2100 và vì vậy sẽ kéo theo những ng y ơ ảnh hưởng đến chất ượng cuộc sống củ n người [1] Các nghiên c u của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã hỉ ra rằng sự ấm lên toàn cầu là kết quả của quá trình biến đổi khí hậu, mà nguyên nhân chủ yếu là do sự gi tăng nh nh h ng á kh gây hiệu

ng nhà kính trong khí quy n Các khí này chủ yế được tạ r á trình đốt cháy các nguồn nhiên liệu hóa thạch ch như th n đá, ầu mỏ, kh đốt [2] Vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu mới phù hợ đ giảm dần sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch và dần thay thế chúng trở thành một mụ ti đượ ư ti n hàng đầu hiện nay

Trong số các nguồn năng ượng thay thế đ ng sử dụng hiện n y, năng ượng sinh họ đ ng à thế phát tri n tất yếu, nhờ à á ư đi m ượt trội củ n như quá trình sản xuất n t àn à đơn giản, nguồn nguyên liệ ùng đ sản xuất phong phú, có th tái tạ được, á trình đốt cháy triệt đ giúp giảm ti h năng ượng, giảm phát thải các khí gây ô nhiễm…

Nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên sử dụng các loại cây trồng hàm ượng đường hoặc tinh bột đ sản suất bioethanol, dầu thực vật hoặc mỡ động vật đ

sản xuất biodiesel y nhi n điều này dẫn đến gi tăng giá ả các loại cây trồng nông nghiệp và bất ổn ương thực

hạn chế á nhượ đi m của nhiên liệu sinh học thế hệ th nhất, nhiên liệu sinh học thế hệ th hai sử dụng nguồn sinh khối cellulose từ phế thải nông nghiệp hay một số loại cây thân cỏ dại ây à ng ồn nguyên liệu rẻ tiền dồi dào sẵn có, phù hợp với từng đị hương ồng thời, các loại cây cỏ sử dụng đ sản xuất có th trồng tốt trên những khu vự đất trồng không phù hợp cho sản xuất nông nghiệp [3]

Mặc dù không gây ảnh hưởng đến vấn đề sản xuất ương thực, việc sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ th hai vẫn hư thực sự mang lại hiệu quả kinh tế Thành tế bào thực vật với ph c hợp lignocellulose rất kh đ chuy n hóa so với việc sử dụng đường hay tinh bột Lignin là một polymer có cấu trúc hóa học ph c tạp, có tính bền vững , đ ng i tr tr ng iệc ổn định cấu trúc cây, vì vậy sự tồn tại của lignin trong thành tế bào làm cản trở quá trình chuy n h đ tạo thành nhiên liệu sinh học [4] ước tiền xử lý lignin trở thành một trong những gi i đ ạn quan trọng của quá trình sản xuất, quyết định đến giá thành của sản phẩm sau này

Nhóm enzyme phân hủy ignin gồm n ym h nh, tr ng đ ignin peroxidase là enzyme quan trọng đối ới sự hân hủy lignin y nhi n, ượng lignin peroxidase (LIP) do á ại nấm tự nhi n tiết r rất t à hi h sản ất i

ở y m ng nghiệ n , hư đạt hiệ ả ề kinh tế ng nghệ g n sử ụng đ ải thiện khả năng sinh tổng hợ á n ym hân hủy ignin ủ i sinh

ật à hướng nghiên c đ ng đượ n tâm rộng rãi hiện n y, đ nâng hiệ

s ất ủ á trình sản s ất bioethanol à hạ giá thành sản hẩm

ậy, đượ sự giú đỡ ủ r ng tâm ng nghệ inh họ ồ h

inh húng t i đã tiến hành thự hiện đề tài “ ạ ng tố ưu u ện

gen mã hóa enzyme lignin peroxidase tr n ệ t ống u ện Pichia pastoris”

nhằm mụ đ h nghi n nâng hiệ ả sản ất n ym i đ ng ụng

à gi i đ ạn tiền ử ý ng y n iệ tr ng y trình sản ất th n sinh họ

Trong luận ăn này, húng t i hỉ giới hạn từ quá trình thu nhận, tạ ng à

i hiện g ne mã hóa cho enzyme lignin peroxidase, thu được từ chủng

P.chrysosporium ATCC 24725 và từ gene tổng hợp TH tr n hệ thống bi u hiện Pichia pastoris GS115 và lên men khảo sát hoạt t nh n ym ướ đầu ở quy mô phòng thí nghiệm

4 ộ ung ng n ứu

- Thu nhận cDNA mã hóa cho LiPH8 của P chrysosporium

- Nhân dòng gene mã hóa cho LiPH8 trên E.coli

- Tạo dòng gene mã hóa cho LiPH8 trên Pichia pastoris

- Khả sát ảnh hưởng nồng độ hất ảm ng methanol đến sự i hiện LIPH8

5 ương á ng n ứu

- Nghiên c u lý thuyết: tiến hành thu thập tài liệu tham khả đáng tin ậy về tổng quan các vấn đề i n n đến i th n à hương há tiền xử lý sinh học sinh khối ign s đ sản xuất bioethanol, quy trình nuôi cấy

vi khuẩn, các quy trình, thao tác trong kỹ thuật sinh học phân tử … phục vụ cho quá trình thí nghiệm

- Nghiên c u thực nghiệm: Xây dựng quy trình thí nghiệm, tiến hành thực hiện các nội dung nghiên c th á hương há đã iết, thu nhận các kết quả bằng số liệu, hình ảnh và xử lý bằng các phần mềm hỗ trợ

- Phân tích, so sánh kết quả th được với các kết quả đã ủa các tác giả khác về hiệu quả của quá trình thực hiện thí nghiệm

6 Ý ng ĩ k ọ ý ng ĩ t ự t ễn

- nghĩ kh họ

Kết quả nghiên c u của đề tài th được chủng nấm men P pastoris mang

gene tái tổ hợp mã hóa cho enzyme lignin peroxidase, có th ng dụng vào sản xuất cồn sinh học Ngoài ra, nghiên c n đ ng góp một số kết quả

ướ đầu về bi u hiện thành công gene mã hóa cho enzyme này tại Việt Nam

- nghĩ thự tiễn

iệ i hiện thành ng n ym ignin r i s tr n P pastoris th

giúp nâng hiệ ả sản ất n ym này tr n y m ng nghiệ Kết

hợ ới iệ sử ụng hệ n ym thủy hân s , ng ụng à gi i đ ạn tiền ử ý ng y n iệ tr ng á trình sản ất i th n giú g hần rút ngắn thời gi n, tiết kiệm h h à giảm thi nhiễm m i trường

Ơ 1: ỔNG QUAN 1.1 Bioethanol

Ethanol là dạng nhiên liệu lỏng có th được tổng hợp từ dầu mỏ hoặc chuy n hóa từ biomass nhờ vi sinh vật thông qua quá trình lên men (bioethanol) Có khoảng

90 – 93% ethanol trên thế giới được sản xuất bằng hương há n m n à 7% à nhờ á hương há tổng hợp hóa học Quá trình lên men tạo ethanol thông thường trải 3 ướ ơ ản: (1) tiền xử lý tạo dung dị h đường có th lên men đượ ; ( ) n m n đường thành ethanol; (3) tinh sạ h th n , th ng thường sử dụng hương há hưng ất [5]

Ngày nay bioethanol được hướng đến nghiên c u sản xuất và sử dụng trên toàn thế giới Về mặt kỹ thuật, bioethanol có chỉ số octane cao, tố độ bốc cháy nhanh và nhiệt ượng tỏ r hơn s ới ăng ầu Nhờ đ , đối với động ơ đốt trong thì sử dụng ethanol mang lại hiệu quả cao hơn khi sử dụng ăng ầu Ngoài

ra, oxy chiếm 35% trong bioethanol nên việc sử dụng bioethanol sẽ làm giảm đáng

k á kh hát r tr ng á trình đốt cháy, đặt biệt là các khí gây hiệu ng nhà kính Bioethanol rất thích hợ đ tạ ăng hỗn hợ , tr ng đ phổ biến nhất à ăng E85, với 5% th n à 15% ăng, có th sử dụng ở nhiều loại hương tiện giao thông Bên cạnh đ , iệc sản xuất bioethanol từ quá trình lên men có th sử dụng đ dạng các nguồn nguyên liệ ũng như đ i hỏi quy trình và trang thiết bị sản xuất đơn giản, n t àn hơn s ới tổng hợp từ dầu mỏ [6]

Những nguyên liệ đ sản xuất i th n được chia làm ba dạng: (1) nguyên liệu ch đường; (2) tinh bột; (3) sinh khối lignocellulose Khoảng 60% ượng bioethanol sản xuất trên toàn cầu là từ m đường và 40% còn lại là từ các sản phẩm nông nghiệp khác Brazil sử dụng m đường đ sản xuất ethanol trong khi Mỹ sản xuất từ ngô, còn tại á nước Châu Âu chủ yếu dùng nguồn tinh bột từ lúa mì và lúa mạch [7], [8] Việc sử dụng các sản phẩm nông nghiệ đ sản xuất

i th n gây r á tá động tiêu cự như ạnh tr nh đất trồng, nguồn nước, làm lệch sự ổn định đ ạng sinh thái, thiếu hụt ương thự … á tá động đ ẫn đến

những tranh cãi về việc sản xuất và sử dụng bioethanol Ngày nay, có rất nhiều các nghiên c u về việc sử dụng sinh khối lignocellulose làm nguồn nguyên liệ đ sản xuất bioethanol Sản xuất bioethanol từ lignocellulose có th giảm bớt các vấn đề về

m i trường ũng như n ninh ương thự ây còn là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và

h ng hú, đặt biệt à ư ti n hàng đầ đối với những nước gặ kh khăn tr ng iệc trồng các loại cây nông nghiệp phục vụ cho sản xuất nhiên liệu sinh học

1.2 ng u n ngu n ệu gn u gn n

1.2.1 Nguồn nguyên liệu lignocellulose

á hất iệ ấ trú ủ thự ật đ hình thành tế à , á, thân à á hân

tử h họ , thường đượ hân thành 3 nh m h nh s , h mi s à lignin – gọi h ng à ign s h ng thường khối ượng kh ủ thành tế à

kh ảng 35 – 5 % s , – 35% h mi s à 1 – 25% lignin

- Cellulose là một polymer cao phân tử với khoảng 1 đơn ị monomer là các phân tử D-glucose Các phân tử g s tr ng s được liên kết với nhau bằng các liên kết 1,4- β glucoside Các liên kết này thẳng hàng không phân nhánh Cellulose có cấu trúc bền chặt và không tan trong hầu hết các dung môi [9]

- Hemicellulose là biopolymer phổ biến th h i tr n trái đất, có số đơn ị monomer khoảng 7 - , à hỗn hợp bao gồm đường 6C (glucose, galactose,

m nn s ), đường 5C (xylose, arabinose, mannose) và các acid hữ ơ như mannoroic, glucoronoic, galactoronic, Thành phần của hemicellulose phụ thuộc vào từng loại cây, loại tế à , điều kiện phát tri n… Xylose chiếm hàm ượng cao nhất trên tổng các loại đường 5C của hemicellulose trong cây

gỗ c ng, trong khi arabinose có mặt chủ yếu trong nhiều loại phế phụ phẩm nông nghiệp hay các loại cây thân cỏ khác [10] Kh ng như s , hemicellulose có cấu trúc phân nhánh và liên kết không theo trật tự nhất định, rất dễ bị thủy hân thành á đường đơn ởi acid loãng [11]

- Lignin là 1 polyme sinh học dạng vòng và có cấu trúc ph c tạp Thành phần

củ ignin gồm 9 % thành hần non-phenolic và 10% thành phần phenolic Nó có 3 monome khá nh à nif ry h (quaiacyl propanol), simapyl alcohol (syringyl propanol) và p-coumaryl alcohol (p-hydroxyl phenylpropanol) [12] ignin kh ng t n tr ng nước và hầu hết bền

tr ng điều kiện i , nhưng húng ị biến đổi ưới tác dụng của kiềm Lignin không phải à r hy r t nhưng n có liên kết chặt chẽ với nhóm này đ tạo nên thành tế bào giúp thực vật c ng chắc và giòn, giữ cho cây không bị gãy đổ, giúp cây phát tri n và chống lại sự tấn công của côn trùng

và mầm bệnh [13] Tỷ lệ của lignin trong thành phần lignocellulose quyết định đến khả năng hống chịu với á tá động của hóa học và các enzyme phân hủy Thực vật àng già, ượng lignin tích tụ càng lớn [6]

Bảng 1.1 Thành phần cellulose, hemicellulose và lignin trong một số loại vật liệu lignocellulose [10]

Cellulose Hemicellulose Lignin

Rơm từ cây lúa 29,2 – 34,7 23 – 25,9 17 – 19

Hình 1.1 Cấu tạo ủ hệ lignocellulose [14] (http://www.hoahocngaynay.com)

Hình 1.2 ấ trú ủ ignin à 3 ti u đơn ị ủ n [15] ( https://wikimedia.org )

àng năm một ượng lớn ign s được thải ra từ các hoạt động lâm nghiệp, nông nghiệp và công nghiệp giấy gây ra ô nhiễm m i trường à thường được xử lý bằng á h đốt bỏ iệ tận ụng ng ồn ng y n iệ này th tạ r á sản phẩm có giá trị khá nh như nhi n iệu sinh học, hóa chất, nguồn năng ượng

rẻ h á trình n m n… g hần giải yết á ấn đề ề năng ượng, m i trường à nâng tri n ọng kinh tế

1.2.2 ý gn n tr ng n u t ồn n ọ

Lignin là thành phần quan trọng đối với thực vật và có nhiều hữ h đối với

n người Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất bioethanol thì lignin tạo thành rào cản vật lý bảo vệ cấu trúc tinh th củ s à h mi s , ngăn ản hoạt động của hệ enzyme (hemi)cellulase iều này làm giảm hiệu xuất thực hiện các ước tiếp theo trong quá trình lên men

sản ất bio th n từ ng ồn hế iệ ign s , quy trình thực hiện tổng quát gồm ướ h nh như sơ đồ ưới đây:

Việc lựa chọn hương há tiền xử lý thích hợp có vai trò quyết định đến hiệu quả chuy n hóa sau này Vì vậy, một quy trình tiền xử lý có hiệu quả thường kèm th á điều kiện: (1) khả năng h y n hóa của enzyme cao nhất; (2) tránh các yếu tố làm giảm ượng sinh khối; (3) hạn chế các chất c chế quá trình lên men; (4) yêu cầu về năng ượng sử dụng và giá thành thấp nhất; (5) phát sinh ít chất thải nhất; (6) không dùng hóa chất hoặc sử dụng một phần nhỏ các hóa chất rẻ tiền [16], [17]

Các hương há tiền xử lý phổ biến trướ đây có th k đến bao gồm hương há ơ họ như nghiền, y, à … đ àm giảm k h thướ ng y n iệ , hương há sử lý bằng acid sulfuric loãng (0,5% – 2%)/ kiềm ở nhiệt độ cao (1400C – 1800C), sử dụng hơi nước ở nhiệt độ và áp suất cao ( 2000C),…đ h ng

th h thành hần s từ ấ trú hặt hẽ ủ ign s [5] Ư đi m

Tiền xử lý nguyên liệu

Cơ học Hóa học Sinh học

Tổ hợp enzyme thủy phân

Chủng nấm men lên men

dị h đường hiệu quả

Thủy phân nguyên liệu

Lên men dị h đường

Thu nhận – tinh sạch cồn

chung củ á hương há này à đề đ m ại hiệu quả xử lý cao Tuy nhiên điều kiện thực hiện khắ nghiệt, yêu cầu cao về mặt thiết bị máy móc Thêm vào đ , bất

c hương há tiền xử ý nà ũng đều tiêu tốn năng ượng lớn, vì vậy có th làm tăng giá thành thực hiện, hiệu quả kinh tế thấp Ngoài ra, khi tiến hành á hương

há ơ h ý n tạ r á hất độ ảnh hưởng ấ đến n người và m i trường [8]

gày n y, á hương há sinh họ đ ng đượ ư ti n hàng đầu ì y trình ử ý đơn giản à thân thiện ới m i trường Có rất nhiều các nghiên c u về vi sinh vật chuy n hóa, phân hủy ign s ũng như hệ enzyme phân hủy lignin

và tiềm năng ng dụng của chúng trong công nghệ sản xuất bioethanol

- Lignin peroxidase (LiP, EC1.11.1.14)

Enzyme này lần đầ ti n được phát hiện khi nuôi cấy nấm mụ trắng

Phanerochaete chrysosporium Enzyme này có trọng ượng phân tử 38- 46 kD, pH

tối thích khoảng từ 2 – 4 Lignin p r i s được mô tả là 1 glycoprotein ch a khoảng 15% carbonhydrate và 1 nhóm phụ protoporphyrin sắt IX Lignin peroxidase là cấu tử chủ yếu của hệ enzyme phân hủy lignin, enzyme này xúc tác cho hàng loạt phản ng, tr ng đ hản ng phân hủy các liên kết ete - aryl và liên kết C-C trong mẫu dime của lignin Lignin peroxidase xúc tác cho quá trình

hy r y h á nh m n y i m thy n , y h á rượ thơm, tạo thành nhóm aldehyl hay xeton và oxy hóa phenol LiP còn xúc tác cho phản ng cắt mở vòng của thành phần non-phenolic [19], [20] Một số vi sinh vật tổng hợp lignin

peroxidase bao gồm: Phanerochaete chrysosporium, Trametes cervina, Phlebia radiata…[21]

- Manganese peroxidase (MnP, EC1.11.1.13)

ược Kuwahara và cộng sự phát hiện khi nuôi cấy P chrysosporium vào

năm 19 , trọng ượng phân tử 46kD Enzyme này hoạt động như 1 h n

i s tr n ơ hất phenolic với thế khử thấp bằng cách sử dụng Mn3+

/Mn2+ làm cặp oxy hóa khử trung gian Chúng tham gia phản ng oxy hóa phenol và các hợp chất ẫn ất phenol của lignin bằng cách tấn công trực tiếp vào cấ trú ng thơm chuy n hóa chúng thành mảnh có trọng ượng phân tử thấ th n đường oxy hóa khử mangan gián tiếp Một số vi sinh vật sản sinh được manganese peroxidase bao

gồm: Lentinus sp., Phlebia sp., Phanerochaete chrysosporium, Stropharia coronilla, Irpex lactues [8]

- Laccase (EC1.10.3.2)

Enzyme này thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ th là polyphenol oxidase Phân tử s thường là monomeric protein, chỉ 1 số là ologomeric protein, có khối ượng phân tử động vào khoảng 50-70 kDa Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm ượng carbonhydrate chiếm khoảng 10- 25% Enzyme này oxy hóa hợp chất ki h n ũng như ấu trúc phenolic của lignin bằng á h tá h 1 điện tử, tạo thành gốc tự do, các gốc tự này s đ th tái trùng hợp hay tiếp tục depolyme hoá Một số vi sinh vật tiết ra laccase bao gồm:

Polyporus versicolor, Pleurotus sp., Pholiata sp., Podospora anserina, Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Pyricularia oryzae [5], [8]

- Versatile peroxidase (VP, EC1.11.1.16)

ây à nh m á n ym hoạt động dựa trên sự kết hợp các hoạt tính xúc tác của MnP và LiP Hệ enzyme VP có ái lực cao với n( ), á hy r in n s ũng như khả năng i h r try h , im th y n n à á im ignin

Versatile peroxidase được tiết ra khi tiến hành lên men nhóm Pleurotus sp [22]

1.4 N m mục trắng Phanerochaete chrysosporium

hân hủy ignin à th ộ t nh ơ ản tr ng á trình tr đổi hất ủ nhóm

nấm mụ trắng tr ng tự nhi n r ng số á hủng nấm mụ , P chrysosporium

đượ xem là mô hình mẫ h những nghi n ề hệ thống á n ym

lignolytic P chrysosporium là ài đầu tiên trong nhóm nấm đảm có bộ gene được

á định hoàn chỉnh [23] Những phân tích gene cho thấy P chrysosporium có hệ

enzyme phân hủy lignin hoàn thiện với số ượng lớn các gene mã hóa cho các enzyme lignin peroxidase và manganese peroxidase (có đến 10 LiP gene và 5 MnP gene), ũng như rất nhiều glyoxal oxidase hoạt động phụ trợ với LiP và MnP trong

quá trình oxi hóa Với hệ n ym đ ạng, P chrysosporium có khả năng hân hủy

ignin một á h nh nh h ng ới h ạt t nh tr n nhiề ại ật iệ hơn s ới

á ại i sinh ật khá , đồng thời ảnh hưởng rất thấ đến á thành hần s

Hình 1.3 ấm mụ trắng P chrysosporium [26] ( http://www.mycobank.org)

1.5 ệ t ống u ện Pichia pastoris

ự r đời à hát tri n ủ ng nghệ g n h hé sản ất nhiề ại

r t in kh ng những ới số ượng ớn mà hất ượng à giá thành tốt hơn Trong số

á hệ thống i hiện, P pastoris từ â đã đượ sử dụng rộng rãi à thành ng

tr ng iệ i hiện nhiề r t in tái tổ hợ khác nhau sánh ới á hệ thống

i hiện eukaryote khác, P pastoris nhiề th ận ợi h iệ n i ấy à i

hiện r t in ng ại i

Là một k ry t đơn à , P pastoris rất dễ nuôi cấy và thực hiện các thao

tác gene Ngoài ra, chúng có khả năng i u hiện đượ r t in đặc chủng, thực hiện nhiều cải biến sau dị h mã như cắt bỏ các trình tự tín hiệu, gấp cuộn, tạo liên kết disulfide, glycosyl hóa khiến protein ngoại lai có tính tan tốt, giữ được trạng thái

tự nhi n à đảm bảo hoạt tính sinh học [27], [28]

P pastoris có tố độ phát tri n nhanh, có th phát tri n với mật độ hơn nhiều so với nấm men S cerevisiae trong quá trình lên men [29] Khả năng sản xuất protein ngoại lai của P pastoris cao, có th bi u hiện protein với hàm ượng từ

miligram/L tới gram/L cả trong nghiên c u phòng thí nghiệm lẫn trong quy mô công nghiệp, thêm vào đ hệ thống này có th bi u hiện được các protein gây độc

cho tế bào gược lại, P pastoris chỉ tiết ra với hàm ượng rất thấp các protein của

chính nó nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu rất dễ dàng

Với khả năng sử dụng m th n như ng ồn r n h nh n n m i trường

nuôi cấy P pastoris ch a nhiều methanol, có th hạn chế được sự tạp nhiễm của các

loài sinh vật khác, đồng thời không gây bệnh h n người Ngoài ra, methanol là chất cảm ng rẻ tiền hơn nhiều so với IPTG, chất cảm ng của hệ thống bi u hiện

E.coli

Hầu hết các hệ thống bi u hiện P pastoris sử dụng promoter AOX1

(methanol-in h i s ) ây à một promoter mạnh, sử dụng methanol

là chất cảm ng, có khả năng tạ ượng protein ngoại lai chiếm hơn 3 % tổng

protein trong tế bào P pastoris có khả năng hát tri n ở dải pH rộng từ 3 đến 7, do

đ th điề hỉnh đượ đ giảm thi u tối đ h ạt động củ r t s đối với

r t in được tiết ra [27], [28], [30]

Một ư đi m quan trọng nữa của P pastoris đ à thành phần m i trường

nuôi cấy đơn giản, giá thành lên men thấ , á hương há sử dụng đượ thương mại hóa, chủng và các vector bi u hiện có sẵn trên thị trường Quá trình lên men có

th thực hiện nhanh chóng, mỗi mẻ từ 5- ngày, đá ng được nhu cầu sản xuất protein số ượng lớn, các thông số , độ th ng kh , ượng CO2 có th được ki m soát chặt chẽ

Với các thuận lợi trên, P pastoris th hút được nhiều sự n tâm à à đối

tượng được lựa chọn đ bi u hiện nhiều loại r t in, nâng được hiệu quả và tiết kiệm được chi phí sản xuất so với các hệ thống bi u hiện khác

1.6 á ng n ứu tr ng ng nư v tạo dòng và bi u hiện lignin

peroxidase thu nhận từ P chrysosporium

1.6.1 g n ứu ng nư

Do tầm quan trọng của lignin peroxidase nên nhiều nghiên c đã được thực hiện nhằm bi u hiện ượt m á đồng phân enzyme này trên các hệ thống bi u hiện khác nhau, nổi bật là LiPH8 và LiPH2

- Hệ thống bi u hiện của LiPH8 [31] và LiPH2 [32] đầu tiên trên Baculovirus

Tuy nhiên mặt hạn chế của hệ thống bi u hiện n y à ượng enzyme sản xuất thấ , giá thành đ kh ng hù hợp cho việc sản xuất enzyme ở quy mô

lớn M độ bi u hi n của LiPH8 chỉ đạt 20µmol oxi hóa VA/phút/mg Hoạt

tính riêng của enzyme tái tổ hợ i đạt 57U/mg protein

- Trên hệ thống bi u hiện E coli, i à i được tìm thấy ở th vùi

[33], [34] LiPH8 tái tổ hợp có th tái gấp cuộn ở m c thấp (1%) trong tổng

số protein tự nhiên 0,2mg/ 500 ml, hoạt t nh ri ng đạt 39 µmol oxihóa

VA/phút/mg tại 230C

- ăm 1999, Aifa và cộng sự sử dụng A niger F38 cho việc bi u hiện LiPH8,

tuy nhiên hoạt tính của LiP chỉ đạt ở m c thấp 1,125 nkat/mg [35]

- ăm , Conesa và cộng sự sử dụng chủng A niger MGG029 cho việc

bi u hiện MnP1 và lipA (LipH8) Hoạt tính của MnP tái tổ hợ đạt được

tương tự so với protein tự nhi n à khi th m 5g/ h m g in à m i trường

thì hoạt t nh tăng n đáng k sau 36h nuôi cấy [36]

- ăm 2004, Wang và cộng sự đã tiến hành bi u hiện LiHP8 trên Pichia

methanolica pMAD16 Tại 240C, hoạt tính củ i đạt 4018U/L với tổng

i đạt 100mg/L [37]

- ăm ,Wang Wei và cộng sự tiến hành tạo dòng bi u hiện lignin

peroxidase H2 từ P chrysosporium BKMF 1767 trên Pichia pastoris X-33

với trình tự tiết α từ S cerevisieae, kết quả cho thấy bi u hiện thành công

LiPH2, tuy nhiên hoạt tính lignin peroxidase chỉ đạt 15U/l sau 12h cảm ng

[38]

1.6.2 g n ứu tr ng nư

Ở Việt Nam, các nghiên c u về lignin peroxidase chủ yếu giới hạn ở phân

lập và tuy n chọn các chủng vi sinh vật có khả năng hân hủy lignin là chính Các

nghiên c u nhằm tạo dòng và bi u hiện gene này còn khá ít Tiêu bi u có nghiên

c u của tác giả Phạm Thị Bích Hợp và các cộng sự tại Viện Công nghệ Sinh học –

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam năm 1 ề bi u hiện gen lignin

peroxidase H8 từ Phanerochaete chrysosporium 36210 vào Pichia pastoris, kết quả

th được enzyme tái tổ hợp có hoạt tính n đến 9239 nkat/l sau 72h lên men [39]

Ơ 2: T LI Ơ ỨU

2.1 ật ệu

2.1.1 ố tượng ng n ứu

- D ng P chrysosporium ATCC 24725 từ ngân hàng vi sinh vật DSMZ –

c đ thu nhận cDNA mã hóa gen LIPH8

- Gene TH-LIPH8 (TH) mã hóa enzyme lignin peroxidase H8 tổng hợp nhân

tạo tại công ty Integrated DNA Technologies (Hoa Kỳ), không ch a các

đ ạn intron, đồng thời có thêm trình tự của hai enzyme cắt NotI và SnaBI ở

h i đầu Gene này đã được tối ưu hóa trình tự đ bi u hiện tốt trong P pastoris và chèn vào plasmid pUCIDT-AMP, plasmid này ch a gene kháng

kháng sinh ampicillin

- Chủng i kh ẩn E coli 5α sử ụng tr ng th nghiệm họn ng

- hủng nấm m n P pastoris GS115 khuyết ưỡng histidin ùng đ i hiện

enzyme tái tổ hợp LiPH8

- smi 9K ùng h th nghiệm nhân ng à i hiện

Hình 2.1 Bản đồ gen plasmid pPIC9K (Invitrogen)

2.1.2 t ị ụng ụ

- á thiết ị ùng tr ng th nghiệm th ộ h ng th nghiệm sinh họ hân tử,

r ng tâm ng nghệ inh họ ồ h inh như lò vi sóng, b ổn nhiệt, ân hân t h, máy đ , tủ ấy,máy ắ n i ấy, hệ thống chụp hình gel-doc, hệ thống điện di ngang, máy y tâm ạnh, máy R, nồi hấ khử trùng, tủ ạnh ° , -20°C, -80°C

- ụng ụ đĩ tri, ống nghiệm, mi r i tt , r n 5 m

2.1.3 ô trường t

2.1.3.1 Môi trường

- i trường LB (Luria- rt ni) ùng tăng sinh E coli

- i trường hạn chế nitrogen, tạ điều kiện bi u hiện enzyme LiPH8, nhằm thu nhận gene mã hóa enzyme phân hủy lignin (Tien và Kirk, 1988)

- i trường sàn ọ (Minimal Dextrose), YBD (Yeast Extract Peptone Dextrose)

- i trường tăng sinh P pastoris BMGY (Buffered Glycerol-complex)

- i trường ảm ng tạo enzyme LiP BMMY (Buffered Methanol-complex)

2.1.3.2 Hóa chất

- n ym ắt giới hạn SnaBI, NotI, BspEI

- n ym nối T4 ligase

- ồi ùng tr ng hản ng R

Bảng 2.1 Các cặp mồi dung trong phản ng PCR

Extraction System (Intron); kit tách chiết plasmid – DNA-spin Plasmid DNA

Purification Kit (Intron)

- Các loại dung dị h à đệm ần thiết đượ h th hướng dẫn

- á h hất ần thiết đ h á ại m i trường

Thử hoạt tính enzyme iện di SDS-PAGE ki m tra protein

2.2.1 u n ận cDNA mã 8 từ ng P chrysosporium ATCC

24725

Dòng P chrysosporium ATCC 24725 được n i ấy tr n m i trường i n à

Kirk, s -5 ngày thì tiến hành thu nhận sinh khối và tách chiết RNA theo quy trình tách chiết bằng kit RNeasy plant mini (Qiagen)

 Quy trình tách RNA t ng số từ sinh khối n m:

+ Nghiền mịn sinh khối nấm bằng nitơ ỏng h m 5 μ ff r R h ặc Buffer RLC, vortex mạnh đ hòa tan toàn bộ sinh khối

+ Lọc dung dịch qua màng lọ sh r r đượ đặt trong eppendorf, ly tâm

14000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ phần trên màng, thu phần dịch ly giải bên ưới

+ Rửa dịch ly giải bằng ethanol (96 – 100%) theo tỉ lệ ethanol : dịch là 1 : 2, trộn đều bằng pipet Chuy n s ng ước tiếp theo ngay lập t c

+ Lọc toàn bộ dung dịch qua màng lọ R sy đượ đặt trong eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 giây, loại bỏ phần dị h n ưới, thu phần trên màng

+ Rửa màng lọc bằng 7 μ ff r RW1, y tâm 13 ng/ hút tr ng 15 giây, loại bỏ dị h n ưới, thu phần trên màng

+ Tiếp tục rửa màng lọc bằng 5 μ ff r R , y tâm 13 ng/ hút tr ng

15 giây, loại bỏ dị h n ưới, thu phần trên màng

+ Tiếp tục rửa màng lọc bằng 5 μ ff r R , y tâm 13 ng/ hút tr ng

2 phút, loại bỏ dị h n ưới, thu phần trên màng

+ Làm khô màng bằng cách ly tâm 14000 vòng/phút trong 1 phút

+ Chuy n màng lọc vào eppendorf mới, hòa tan RNA bằng cách thêm 30 – 50

μ nước RNase-free vào giữa màng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Thực hiện hai lần đ thu RNA RNA tổng được sử dụng làm mạch khuôn tạo cDNA

 T ng hợp cDNA từ RNA

Quá trình tổng hợ được thực hiện nhờ n ym hi n mã ngược reverse transcriptase với mồi thích hợp Tất cả các dụng cụ, hóa chất trước khi sử dụng đề được xử ý đ loại bỏ enzyme phân hủy RNA là Rnase (RNase-free) bằng

á h ngâm đ m tr ng Cặp mồi thu nhận gene LiPH8: LIPH8F -

LIPH8R được thiết kế với enzyme cắt giới hạn ở đầu là SnaBI và NotI phù hợp

với vị trí cắt ở plasmid ồng thời trong thiết kế đã loại bỏ đ ạn pre và propeptide

Thực hiện phản ng RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) đ tạo cDNA từ RNA theo QIAGEN LongRange 2Step RT-PCR Mẫu

R trước đ đã được tiến hành biến tính bằng cách ủ ở 65o tr ng 5 hút, s đ chuy n ng y R à đá ạnh

LongRange RNase inhibitor ( 4U/ µl) 0,2 µl 0,04 U/ µl

rộn đề hỗn hợ hản ng à ủ ở o

C trong 90 phút, s đ ất h ạt

n ym ằng á h giữ 5oC trong 5 phút Sản phẩm hi n mã ngượ được bảo quản

ở -80oC và sử dụng làm mạch khuôn cho phản ng R đ khuế h đại số ượng cDNA

Bảng 2.3 Thành phần phản ng PCR khuế h đại gen LIPH8 với cặp mồi

Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ng RT- R ước 2 với cặp mồi LiPH8F-LiPH8R

2.2.2 Nhân dòng gen mã hóa cho LiPH8 trên E.coli 5α

Sau khi thu nhận được cDNA mã hóa cho LiP H8, tiến hành biến nạp cDNA và

gene TH vào E.coli 5α th á ước:

 Cắt sản phẩm PCR LiPH8 và plasmid pPIC9K, ằng n ym SnaBI à

NotI, thành phần của phản ng cắt được mô tả ở bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần phản ng cắt với NotI và SnaBI

Thành phần (50µl/reaction) lipH8 pPIC9K

94oC 5’

94oC 1’

59oC 45’’

72oC 2’

72oC 10’

4oC

∞

35 chu kỳ

Hỗn hợp phản ng được trộn đều và ủ ở 37oC trong 3 giờ Sản phẩm cắt sau

đ được ki m tra lại bằng điện di trên gel agarose và tinh sạch qua cột spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction System (Intron) gồm á ước:

MEGAquick Cho mẫu vào eppendorf 1,5 ml Thêm BNL Buffer (5 Buffer : 1 mẫu), vortex

đ hòa tan toàn bộ mẫu, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

- Chuy n mẫu vào màng lọ đượ đặt trong eppendorf mới, ly tâm 13000 ng/ hút tr ng 1 hút, đổ bỏ phần dị h n ưới, giữ lại phần trên màng

 Thực hiện phản ng nối giữa gen lipH8 và plasmid 9K đã ắt bằng hai

enzyme cắt hạn chế NotI và SnaBI ằng T4 ligase tạ smi tái tổ hợ lipH8 Mẫu ch ng âm là vector pPIC9K kh ng đ ạn chèn lipH8 Phản ng nối

9K-được tiến hành ở 220C trong 2 giờ