Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp gamma aminobutyric aicd (gaba) từ môi trường cám gạo sử dụng chủng lactobacillus brevis

- Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men sản xuất GABA - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ pepton bổ sung đến khả năng lên men sinh tổng hợp G

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Lại Quốc Đạt

TS Trần Thị Ngọc Yên

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 04 tháng 01 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1.PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu

2 PGS.TS Ngô Đại Nghiệp

3 TS Tôn Nữ Minh Nguyệt

4 TS Huỳnh Tiến Phong

5 TS Võ Đình Lệ Tâm

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Xuân Nữ MSHV: 13111021

Ngày, tháng, năm sinh: 25/02/1989 Nơi sinh: Phú Yên

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số : 60540101

I TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP GAMMA AMINOBUTYRIC

AICD (GABA) TỪ MÔI TRƯỜNG CÁM GẠO SỬ DỤNG CHỦNG

LACTOBACILLUS BREVIS

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Xác định thành phần cơ bản của cám gạo ở 2 giai đoạn chính trong quy trình sản

xuất gạo (giai đoạn xát và giai đoạn xoa) Từ đó, chọn được nguyên liệu phù hợp

cho quá trình sinh tổng hợp GABA

- Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men

sản xuất GABA

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ (pepton) bổ sung đến khả năng lên men sinh

tổng hợp GABA

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 17/08/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2015

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Lại Quốc Đạt

TS Trần Thị Ngọc Yên

Tp HCM, ngày 04 tháng 01 năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy/cô hướng dẫn khoa học là: TS Lại Quốc Đạt và TS Trần Thị Ngọc Yên Hai thầy/cô đã tận tình hướng dẫn, truyền dạy và động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài tại trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM Sự chỉ dẫn của các thầy/cô không chỉ là nguồn kiến thức khoa học quý báu mà còn là những kinh nghiệm về tư duy, lý luận khoa học quan trọng để xây dựng nền tảng vững chắc cho sự nghiệp chuyên môn của em trong tương lai Những phương pháp giải quyết các vấn đề khoa học của hai thầy/cô cũng ươm mầm cho em những vốn tư liệu sống quý giá trước khi bước chân rời khỏi ghế nhà trường Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn hai thầy/cô hướng dẫn kính mến

Ngoài ra, em cũng xin cảm ơn đến quý thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm

bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hòan thành luận văn

Cuối cùng, em xin cảm ơn các bạn đồng học đã hỗ trợ, giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu tại trường

TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 12 năm 2015

Học viên thực hiện

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Cám gạo tại Việt Nam là nguyên liệu rất dồi dào, giá thành rẻ và gần như chỉ

sử dụng để làm thức ăn gia súc, một lượng nhỏ cám gạo được ứng dụng trong thực phẩm như: sản xuất dầu cám, protein, GABA,… Nghiên cứu tận dùng nguồn cám

gạo tại Việt Nam để sinh tổng hợp GABA sử dụng Lactobacillus brevis với sự hỗ

trợ của enzyme

Kết quả cho thấy cám xát (độ nghiền 6-7%) có đặc tính phù hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp GABA hơn so với cám xoa (độ nghiền 3%) Với tác động của α-amylase, hàm lượng GABA tạo thành (6,41mg/ml) cao gấp 2,38 lần so với mẫu đối chứng (2,69 mg/ml) ở điều kiện thủy phân pH 6,5, nhiệt độ 950C, nồng độ α-amylase 0,15 %(v/w), thời gian 45 phút Việc thủy phân bằng α-amylase làm tiền

đề cho quá trình thủy phân protein sử dụng Alcalase:Flavourzyme (tỷ lệ Alcalase:Flavourzyme 3:7, nồng độ 2% (w/w), pH =8, nhiệt độ 500C) đạt hiệu quả sinh tổng hợp GABA cao hơn (8,43 mg/ml sau 48 giờ lên men) so với các môi trường xử lý bằng enzyme khác Dịch lên men bổ sung peptone đạt hàm lượng GABA cao nhất (12,15 mg/ml) sau 40 giờ lên men tại nồng độ peptone 1,5% (w/v)

Quá trình lên men sử dụng Lb brevis để sinh tổng hợp GABA từ môi trường

cám gạo tách béo với sự hỗ trợ của enzyme cho kết quả khả quan

ABSTRACT

Rice Bran in Vietnam is very abundant raw materials, low price and almost used for animal feed, a small amount of rice bran is used in foods such as bran oil production, protein, GABA, Study takes advantages of rice bran in Vietnam to

create GABA biosynthesis using Lb brevis with the support of the enzyme

Results showed that milled bran (degree of milling of 6-7%) have characteristics suitable for fermentation GABA biosynthesis than rubbed bran (degree of milling of 3%) With α-amylase impacts, concentrations of GABA (6,41mg/ml) was almost 2.38 times higher than the control sample (2.69 mg / ml) at

pH 6.5 hydrolysis conditions, heat 950C degrees, α-amylase concentration of 0.15% (v/w), for 45 min The α-amylase hydrolysis by as prerequisite for protein hydrolysis using Alcalase: Flavourzyme (ratio Alcalase: Flavourzyme 3: 7, the concentration of 2% (w/w), pH = 8, the temperature 500C) reached GABA synthesis efficiency higher (8.43 mg / ml after 48 hours of fermentation) than the processing medium by other enzymes Medium fermentation was added peptone reached the highest concentrations of GABA (12.15 mg / ml) after 40 hours of fermentation at concentrations of 1.5% peptone (w / v)

Fermentation using Lb brevis for GABA biosynthesis from defatted rice bran medium with the help of enzymes for positive results

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công việc do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy Lại Quốc Đạt và cô Trần Thị Ngọc Yên Các kết quả trong luận văn là đúng sự thật và chưa được công bố ở các nghiên cứu khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về công việc đã thực hiện của mình

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT LUẬN VĂN

ABSTRACT

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về GABA 3

2.1.1 Giới thiệu về GABA 3

2.1.2 Chức năng sinh lý của GABA 3

2.1.3 Cơ chế sinh tổng hợp GABA 4

2.1.4 Tình hình nghiên cứu – sản xuất GABA hiện nay 5

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tổng hợp GABA từ vi sinh vật 6 2.1.5.1 Chủng vi sinh vật 6

2.1.5.2 Thông số công nghệ 8

2.1.5.3 Nguồn dinh dưỡng 9

2.2 Tổng quan về cám gạo 11

2.2.1 Thành phần hóa học của cám gạo 11

2.2.2.1 Protein và thành phần nitrogen 11

2.2.2.2 Carbohydrate 13

2.2.2.3 Lipit cám gạo 14

2.2.2.4 Một số thành phần khác trong cám gạo 14

2.2.2 Tình hình nghiên cứu cám gạo hiện nay trên Thế giới và Việt Nam 16

2.3 Tổng quan về enzyme thủy phân 17

2.3.1 Giới thiệu về enzyme thủy phân  - amylase 17

2.3.2 Giới thiệu về enzyme thủy phân protease 18

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Mục tiêu đề tài 21

3.2 Nguyên liệu 21

3.2.1 Cám gạo 21

3.2.2 Vi khuẩn Lb brevis 23

3.2.3 Enzyme thủy phân 23

3.3 Nội dung nghiên cứu 25

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu – quy trình thí nghiệm 25

3.3.1.1 Quy trình thí nghiệm 25

3.3.1.2 Sơ đồ nghiên cứu 27

3.3.2 Nội dung 1: Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu 29

3.3.3 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men sản xuất GABA 29

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo 29

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng quá trình xử lý bằng α- amylase đến khả năng sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn Lb brevis 30

3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase : Flavourzyme đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo 31

3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme protease đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo 32

3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý nguyên liệu đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA 33

3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung đối với quá trình lên men sản xuất Gaba từ dịch thủy phân cám gạo tách béo sử dụng chủng Lb brevis 35

3.4 Phương pháp phân tích 35

3.4.1 Định lượng nitơ tổng 35

3.4.1.1 Nguyên tắc 35

3.4.1.2 Cách tiến hành 36

3.4.2 Xác định độ ẩm 36

3.4.2.1 Nguyên tắc 36

3.4.2.2 Cách tiến hành 36

3.4.3 Định lượng hàm lượng tro tổng 36

3.4.3.1 Nguyên tắc 36

3.4.3.2 Cách tiến hành 37

3.4.4 Định hàm lượng tinh bột 37

3.4.4.1 Nguyên tắc 37

3.4.4.2 Cách tiến hành 37

3.4.5 Phương pháp xác định đường tổng và khử 37

3.4.5.1 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp axit sulfuric-phenol 37

3.4.5.2 Xác định hàm lượng khử bằng phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS) 37

3.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin 38

3.4.6.1 Nguyên tắc 38

3.4.6.2 Cách tiến hành 38

3.4.7 Định lượng lipit tổng 38

3.4.7.1 Nguyên tắc 38

3.4.7.2 Cách tiến hành 38

3.4.8 Định lượng hàm lượng chất khô 38

3.4.8.1 Nguyên tắc 38

3.4.4.2 Cách tiến hành 38

3.4.9 Đánh giá về sự tăng trưởng của tế bào vi sinh vật – phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp 38

3.4.9.1 Nguyên tắc 38

3.4.9.2 Cách tiến hành 39

3.4.10 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang 39

3.4.10.1 Nguyên tắc 39

3.4.10.2 Cách tiến hành 39

3.4.11 Định lượng hàm lượng GABA 39

3.4.11.1 Nguyên tắc 39

3.4.11.2 Cách tiến hành 39

3.5 Tính toán - Xử lý thống kê 39

3.5.1 Tính toán 39

3.5.2 Xử lý thống kê 40

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

4.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu cám gạo 41

4.2 Ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA 43

4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme α- amylase đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo 43

4.2.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ α - amylase đến hàm lượng chất khô hòa tan 43

4.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ α- amylase đến hàm lượng đường khử 44

4.2.2 Ảnh hưởng quá trình xử lý bằng α- amylase đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA từ vi khuẩn Lb brevis 47

4.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase : Flavourzyme đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo 51

4.2.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ Alcalase:Flavourzyme đến mức độ thủy phân axit amin 51

4.2.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Alcalase:Flavourzyme đến hàm lượng đường khử 52

4.2.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ Alcalase:Flavourzyme đến hàm lượng chất khô hòa tan 54

4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ enzyme protease đến quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo 55

4.2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến mức độ thủy phân axit amin của dịch cám gạo 55

4.2.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hàm lượng đường khử 56 4.2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hàm lượng chất khô hòa

tan 57

4.2.5 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám tạo tách béo đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA 59

4.2.5.1 Sự biến thiên hàm lượng đường khử theo thời gian 59

4.2.5.2 Sự biến thiên hàm lượng chất khô hòa tan theo thời gian 61

4.2.5.3 Sự biến thiên độ pH theo thời gian 62

4.2.5.4 Sự biến thiên mật độ tế bào theo thời gian 63

4.2.5.5 Sự biến thiên hàm lượng GABA theo thời gian 65

4.3 Ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung đối với quá trình lên men sản xuất Gaba từ dịch thủy phân cám gạo tách béo sử dụng chủng Lb brevis 67

4.3.1 Sự biến thiên độ pH theo thời gian 67

4.3.2 Sự biến thiên hàm lượng chất khô hòa tan 68

4.3.3 Sự biến thiên của hàm lượng đường khử theo thời gian 70

4.3.4 Sự biến thiên mật độ tế bào của vi khuẩn theo thời gian 71

4.3.5 Sự biến thiên hàm lượng GABA theo thời gian 73

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

5.1 KẾT LUẬN 75

5.2 Kiến nghị 76

PHỤ LỤC 83

1 Quy trình thực hiện các phương pháp phân tích 83

2 Số liệu thô 93

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tính chất của GAD từ Lb Lb paracasei, Lb brevis, L lactis 4

Bảng 2.2 Khả năng tổng hợp GABA từ vi khuẩn Lb brevis trong điều kiện tối ưu của quá trình lên men đậu tương 8

Bảng 2.3 Thành phần hóa học của cám gạo (theo chất khô) 11

Bảng 2.4 So sánh thành phần các hợp chất (%, khối lượng) có trong cám gạo với các loại cám ngũ cốc khác ở độ ẩm 14% 12

Bảng 2.5 Thành phần Amino Axit của cám gạo, gạo đánh bóng, một số cám ngũ cốc khác 12

Bảng 2.6 Thành phần axit béo trong cám gạo 14

Bảng 2.7 Thành phần khoáng vô cơ trong cám gạo 15

Bảng 2.8 Hàm lượng vitamin trong cám gạo 15

Bảng 3.1 Thông số của cám nguyên liệu trong nghiên cứu 21

Bảng 3.2 Thông tin về enzyme sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 4.1 Thành phần hóa học cơ bản của cám gạo (theo khối lượng ướt) 41

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của quá trình xử lý bằng α-amylase đến khả năng sinh tổng hợp GABA từ môi trường cám gạo tách béo 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của Gamma Aminobutyric Acid 3

Hình 2.2 Các thành phần cấu tạo chính của hạt lúa gạo 11

Hình 3.1 Nguyên liệu cám gạo 21

Hình 3.2 Quy trình xử lý cám gạo 22

Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ α - amylase đến hàm lượng chất khô hòa tan của dịch cám gạo khử béo 44

Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ α- amylase đến hàm lượng đường khử của dịch cám gạo khử béo 46

Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase: Flavourzyme đến mức độ thủy phân axit amin của dịch cám gạo tách béo 51

Hình 4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase: Flavourzyme đến hàm lượng đường khử của dịch cám gạo tách béo 53

Hình 4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase: Flavourzyme đến hàm lượng chất khô hòa tan của dịch cám gạo 54

Hình 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến mức độ thủy phân axit amin của dịch cám gạo tách béo 56

Hình 4.7 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hàm lượng đường khử của dịch cám gạo tách béo 57

Hình 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme protease đến hàm lượng chất khô hòa tan của dịch cám gạo tách béo 58

Hình 4.9 Ảnh hưởng của loại quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo tách béo đến sự biến thiên hàm lượng đường khử theo thời gian 60

Hình 4.10 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý cám gạo tách béo đến sự biến thiên hàm lượng chất khô hòa tan theo thời gian 61

Hình 4.11 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý cám gạo tách béo đến sự biến thiên độ pH theo thời gian 63

Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý cám gạo tách béo đến sự biến thiên mật độ tế bào theo thời gian 64

Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý cám gạo tách béo đến sự biến

thiên hàm lượng GABA theo thời gian 65Hình 4.14 Ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung đến sự biến thiên độ pH của dịch

cám gạo lên men 68Hình 4.15 Ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung đến sự biến thiên hàm lượng chất

khô hòa tan của dịch cám gạo lên men 69Hình 4.16 Ảnh hưởng nồng độ peptone đến sự biến thiên hàm lượng đường khử

của dịch cám gạo lên men 71Hình 4.17 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ peptone đến sự biến thiên mật độ tế bào của

vi khuẩn trong dịch cám gạo 72Hình 4.18 Ảnh hưởng nồng độ peptone bổ sung đến sự biến thiên hàm lượng

GABA trong dịch cám gạo 73

GAD Glutamic axit decarboxylase Axit glutamic decarboxylase

Lb brevis Lactobacillus brevis Lactobacillus brevis

MRS Man, Rogosa and Sharpes Man, Rogosa and Sharpes MSG Mono sodium glutamate Bột ngọt

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Lý do hình thành đề tài

Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một axit amin, chất dẫn truyền có chức năng quan trọng trong hệ thống thần kinh GABA như là thuốc an thần tự nhiên của cơ thể Thông thường, não bộ sẽ tiết ra lượng GABA chúng ta cần Nhưng đối với chế độ ăn uống kém, tiếp xúc với các chất độc môi trường, nồng độ GABA có thể trở nên cạn kiện Quá ít hợp chất quan trọng này trong cơ thể có thể dẫn đến sự lo lắng, khó chịu, mất ngủ,… Vì vậy, GABA được xem như là thành phần quan trọng cần bổ sung cho cơ thể Đây chính là lý do nhiều hướng tập trung nghiên cứu để tìm ra được giải pháp, các nguồn nguyên liệu khác nhau có thể tổng hợp GABA đạt hiệu quả cao

Gạo là nguồn lượng thực quan trọng, chiếm số lượng lớn ở nước ta Trong đó, lúa sau quá trình xay xát cho ra cám gạo là nguồn phụ phẩm chiếm 10% tổng khối lượng lúa Cám gạo tại Việt Nam hiện nay là nguồn nguyên liệu rất dồi dào, giá thành rẻ nhưng gần như chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc Việc ứng dụng cám gạo làm nguyên liệu trong quá trình sinh tổng hợp GABA sẽ làm gia tăng giá trị của cám

Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp GABA từ cám lúa mạch và cám lúa mì qua quá trình ủ cho năng suất chuyển đổi từ glutamate sang GABA khá cao tương ứng 92%, 60% tỷ lệ chuyển đổi [1] Từ đây cho thấy, cám gạo với thành phần hoá học tương tự cũng có thể thực hiện quá trình sinh tổng hợp tạo GABA

Mặt khác, nguyên liệu cám gạo sử dụng enzyme Alcalase, Flavourzyme đạt hiệu quả thủy phân protein, đồng thời tăng hàm lượng axit glutamic đã được nghiên cứu bởi Hamada (2000)[2] Villanueva và cộng sự (1999) cũng chứng minh hàm lượng axit glutamic tăng lên khi thủy phân hạt dướng dương bằng Alcalase, Flavourzyme, kết hợp 2 protease tương ứng là: 21,4, 13,3, 21,8 (g/100g protein) [3] Kết quả cũng được báo cáo bởi Čková và cộng sự (2002) [4] Điều này cho thấy việc ứng dụng enzyme để thủy phân protein để làm tăng hàm lượng axit glutamic cho quá trình sinh tổng hợp GABA là khả thi

Bên cạnh đó, các nghiên cứu về sinh tổng hợp GABA hiện nay chủ yếu sử

dụng vi khuẩn LAB, đặc biệt là Lb brevis do khả năng sản sinh enzyme GAD cao hơn so với các phương pháp ủ, nẩy mầm Lb brevis đã được ứng dụng để sinh tổng

hợp GABA từ nguyên liệu nước ép quả mâm xôi đen, bã rượu shochu, môi trường MRS [5] Việc ứng dụng vi khuẩn này trong sinh tổng hợp GABA từ cám gạo chưa được nghiên cứu nhiều

Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu được triển khai thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp Gamma Aminobutyric Acid (GABA) từ môi trường

cám gạo sử dụng chủng Lactobacillus brevis”

Lên men sản xuất GABA đạt hiệu suất cao từ nguyên liệu cám gạo sử dụng

các vi sinh vật có lợi (Lactobacillus brevis) với sự hỗ trợ của enzyme

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần cơ bản của cám gạo ở 2 giai đoạn chính trong quy trình sản xuất gạo (giai đoạn xát và giai đoạn đánh bóng) Từ đó, chọn được nguyên liệu phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp GABA

- Khảo sát ảnh hưởng quá trình tiền xử lý nguyên liệu cám gạo đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ (peptone) bổ sung đến khả năng lên men sinh tổng hợp GABA

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về GABA

2.1.1 Giới thiệu về GABA

Gamma Aminobutyric Acid (GABA) là một axit amin phi protein có 4 carbon (hình 2.1), một thành phần quan trọng trong nhóm các axit amin tự do

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của Gamma Aminobutyric Acid[6]

GABA có khả năng hòa tan tốt trong nước, là ion lưỡng tính tại giá trị pK là 4,03 và 10,56

Thông thường, nồng độ GABA trong mô thực vật thấp (dao động 2,00mol/g)[7], nhưng tăng lên nhiều lần khi bị tác động bởi các tác nhân: sốc nhiệt, kích thích cơ học, tình trạng thiếu oxy,…

0,03-2.1.2 Chức năng sinh lý của GABA

GABA là một chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học GABA có nhiều chức năng sinh lý và nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe con người

GABA có chức năng sinh lý khác nhau ở động vật và con người Một số chức năng sinh lý của GABA đã được nghiên cứu:

 GABA góp phần vào việc hạ huyết áp: uống GABA hoặc sữa lên men GABA (0,5 mg GABA/kg) giúp giảm huyết áp trên đối tượng thí nghiệm là chuột bị cao huyết áp nhưng lại không làm tăng huyết áp đối với chuột bình thường, sau 4-8 giờ sử dụng [8, 9]

 Lợi tiểu, ngăn ngừa bệnh tiểu đường thông qua tác dụng của GABA dựa trên sự tiết insulin [10] [11]

 Điều trị các triệu ứng an thần, mất ngủ, trầm cảm và các rối loạn tự phát trong suốt thời kỳ mãn kinh với tổng hàm lượng GABA sử dụng là 26,4 mg/ngày[12]

 GABA cũng có thể giúp điều trị các triệu chứng rối loạn thần kinh khác nhau như động kinh, bệnh Parkinson, và tâm thần phân liệt [13]

 Các triệu chứng liên quan đến rượu mãn tính, rối loạn giấc ngủ, nghiện ma túy và rượu [13]

 Axit amin này góp phần làm tăng nồng độ của hormone tăng trưởng trong huyết tương và tỷ lệ tổng hợp protein trong não[14]

 Có khả năng ức chế tế bào ung thư khi sử dụng dịch chiết xuất từ nguyên liệu gạo nâu chứa GABA [15]

Vì thế, GABA có tiềm năng là một thành phần hoạt tính sinh học trong thực phẩm và dược phẩm

2.1.3 Cơ chế sinh tổng hợp GABA

Trong cả thực vật và động vật, GABA được hình thành qua 3 enzyme: enzyme glutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA-T) và enzyme succinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH) Trong đó, phản ứng chủ

yếu để tổng hợp GABA được thực hiện bởi glutamate decarboxylase (GAD, EC

4.1.1.15) Đây là phản ứng khử carboxyl trực tiếp và không thể đảo ngược của glutamate bởi glutamate decarboxylase[16]:

Bảng 2.1 Tính chất của GAD từ Lb Lb paracasei, Lb brevis, L lactis[17]

Lb paracasei Lb brevis[18] L lactis

Khối lượng phân tử (kDa)

SDS-PAGE: Tinh sạch GAD bằng phương pháp Laemmli sử dụng sắc ký cột

2.1.4 Tình hình nghiên cứu – sản xuất GABA hiện nay

Hiện nay, các sản phẩm thực phẩm chứa GABA trên thị trường Việt Nam chưa được phổ biến, chủ yếu được sử dụng dưới dạng tá dược

Trong khi đó, một số sản phẩm thực phẩm chứa GABA đã được sản xuất với quy mô công nghiệp ở Nhật như:

- Trà Oolong GABA chứa 150mg GABA/100ml trà Trà GABA qua quá trình xử lý yếm khí bằng nitơ thu được 100g lá trà GABA có chứa khoảng 240 mg GABA [19]

- Một dòng nước uống trái cây không gas đóng lon chứa GABA của Jones như: GABA chanh mật ong Jones, GABA bưởi Jones,…[20]

Bên cạnh đó, một số sản phẩm thực phẩm chứa GABA cũng đã xuất hiện trong nước như:

- Gạo mầm GABAnature- HGH là sản phẩm có thành phần hoàn toàn tự nhiên, chế biến từ những hạt gạo lứt qua quá trình nẩy mầm trong điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt nhằm tạo ra dưỡng chất GABA

- Sản phẩm cốm gạo mầm rong biển từ gạo mầm GABA và rong biển

Đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm thương mại chứa GABA bằng phương thức sản xuất sinh học và hóa học đã được nghiên cứu:

- Tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm:

o Trà xanh giàu GABA được sản xuất bằng cách xử lý yếm khí chồi trà[21]

o Sản xuất GABA từ cám lúa mạch và cám lúa mì: cám lúa mạch qua xử lý

ủ thu được 9,2 mM GABA từ 10 mM glutamate, năng suất chuyển đổi thành GABA

là 92%, trong khi cám lúa mì thu được sử dụng 6.0 mM GABA từ 10 mM glutamate, năng suất GABA 60% tỷ lệ chuyển đổi [1] Từ đây một hướng nghiên cứu khả thi có thể phát triển khi sử dụng một nguồn nguyên liệu khá dồi dào, giá thành rẻ là cám gạo

o Gạo lúa mạch, gạo lức được ngâm và xử lý nảy mầm yếm khí để thu GABA [22, 23]

- Lên men bằng vi sinh vật: quá trình sinh tổng hợp GABA bằng cách lên men sử dụng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trên thế giới

o Đậu tương lên men sử dụng nấm Rhizopus microsporus var oligosporus IFO 8631 lên men thu 1,740 mg /100g GABA[24]

o Đặc biệt nhóm LAB đã được ứng dụng để lên men và thu hàm lượng lớn GABA từ thực phẩm truyền thống, hơn nữa LAB được xem là an toàn cho người sử dụng

Như vậy, các loại vi khuẩn LAB cho sản xuất GABA là mục tiêu lớn cho

ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là các giống: Lb brevis phân lập từ nhà máy chưng cất rượu[25], Lactobacillus paracasei từ cá lên men[26], Lactobacillus paracasei NFRI 7415 sản xuất ở mức cao GABA khi sử dụng môi trường MRS

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tổng hợp GABA từ vi sinh vật

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp GABA từ vi sinh vật Trong đó, các yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất:

quả về chất lượng và số lượng Gần đây, một số chủng LAB đã được nghiên cứu khả năng tổng hợp GABA cao thông qua sự hiện diện của enzyme GAD, đây là yếu

tố quan trọng quyết định trong quá trình sinh tổng hợp GABA.[18, 27, 28]

LAB cũng có thể sinh tổng hợp các chất hữu cơ tạo hương thơm và các thuộc tính cảm quan đặc biệt cho sản phẩm các sản phẩm thực phẩm Bên cạnh đó, sự hiện diện của vi khuẩn có lợi này trong thực phẩm góp phần ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh, duy trì chất lượng dinh dưỡng và nâng cao tuổi thọ của các loại thực phẩm Đồng thời, quá trình tổng hợp GABA có thể từ nguồn nguyên liệu

rẻ tiền, phế phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm

Khả năng của LAB để sản xuất GABA là khác nhau giữa các loài và chủng Điều này được báo cáo khi so sánh khả năng sinh tổng hợp GABA trên môi trường lên men đậu tương bởi các chủng vi khuẩn LAB khác nhau[29] (Bảng 2.1)

Dựa vào bảng 2.1, ta thấy được Lb brevis có khả năng lên men tổng hợp GABA cho hiệu quả cao Lb brevis, trực khuẩn Gram ( ), không có khả năng di

động, là một trong những vi khuẩn phổ biến nhất liên quan đến quá trình lên men tổng hợp GABA của các loại rau, sữa, các phế phẩm trong công nghiệp thực phẩm (

bã rượu shochu,… )

Mặt khác, Lb brevis trong nhiều nghiên cứu cũng được báo cáo về khả năng

sinh tổng hợp GABA từ các nguyên liệu khác nhau:

- Lb brevis GABA 100 lên men nước ép quả mâm xôi đen với việc bổ sung

MSG (2%, w/v), ở 300C trong 12 ngày cho hàm lượng GABA 26,9mg/ml [5]

- Trong rượu shochu Nhật, hầu hết các axit glutamic tự do (10,50 mM) đã

được chuyển đổi sang GABA (10,18 mM) bởi Lb brevis IFO-12005[25]

- Môi trường MRS: đây là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng của Lb brevis Khả năng tổng hợp GABA từ Lb brevis NCL912 được phân lập từ loại rau

lên men truyền thống của Trung Quốc từ môi trường MRS [30] Tối ưu quá trình

tổng hợp GABA từ môi trường MRS sử dụng Lb brevis[31].[32]

Bảng 2.2 Khả năng tổng hợp GABA từ vi khuẩn Lb brevis trong điều kiện tối ưu

của quá trình lên men đậu tương[29]

NR Cheese

NR Kim chi Cheese

35,62 g/L 0,82 g/L 31,10 g/L 1,04 g/L

15 mg/kg 23,38 g/L 26,9 g/L 99,9 mg/kg

2.1.5.2 Thông số công nghệ

i Nhiệt độ

Quá trình lên men phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ

Yếu tố này có thể thay đổi sự phát triển cũng như các hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn, ảnh hưởng năng suất quá trình lên men và tiết kiệm năng lượng sử dụng

Lb brevis GABA 100 lên men nước ép quả mâm xôi đen sản xuất hàm lượng

GABA ở các nhiệt độ 250C, 300C, 370C Trong đó, GABA đạt tối đa (26,9 mg/mL)

ở nhiệt độ 300

C [5] Nhiệt độ lên men tổng hợp GABA đạt hiệu quả cao khi sử dụng môi trường MRS đã được báo cáo ở các nhiệt độ: 300C [25], 320C[32], 340C [30], 37[31]

Nói chung, nhiệt độ lên men đối với chủng Lb brevis trong khoảng 30 0C -

370C thì quá trình tổng hợp GABA đạt năng suất cao

ii Giá trị pH

Trong quá trình lên men, độ pH thay đổi do sự di chuyển của các chất qua màng tế bào và các axit hữu cơ được tổng hợp bởi một số vi sinh vật, qua đó làm biến đổi nồng độ H+ Các enzyme sẽ bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH do thay đổi

trạng thái ion hóa của axit hoặc axit amin cơ bản trong cấu trúc enzyme, từ đó ức chế hoạt động của enzyme

Vì vậy, duy trì độ pH thích hợp cho sự tăng trưởng của vi khuẩn cũng là duy trì tốt hoạt động của các enzyme, từ đó tạo môi trường tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp GABA

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, khoảng pH để Lb.brevis hoạt động khoảng

5-5,25 đã được nghiên cứu trong môi trường rượu shochu : 5,2[25], môi trường MRS: 5[30, 32], 5,25[31]

iii Lượng vi sinh vật

Tỷ lệ giống ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp GABA

Nếu tỷ lệ giống thấp, lượng enzyme được sinh ra từ vi khuẩn là thấp kết quả hàm lượng GABA tổng hợp được thấp Bên cạnh đó, nếu lượng giống cấy không đủ lớn trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, vi sinh vật tạp nhiễm sẽ dễ dàng phát triển trong môi trường lên men, ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp GABA Ngược lại, nếu lượng giống cấy vào môi trường lên men quá nhiều, thời gian lên men rút lại nhưng chi phí về giống sẽ tăng lên Hơn nữa, các chất chuyển hóa được sản xuất nhiều hơn, có thể gây ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn

Giống vi khuẩn thường được bổ sung vào từ 107

– 109cfu/ml

iv Thời gian lên men

Sau khi tạo thành, GABA sẽ tiếp tục bị thuỷ phân thành succinate, tham gia vào chu trình Krebs Do đó, GABA chỉ là một sản phẩm trung gian nên nồng độ GABA sẽ đạt cực đại tại một điểm nào đó Việc giảm GABA này là do sự chuyển đổi GABA thành semialdehyde succinic xúc tác bởi  - amino butyrate transaminase, đó là một quá trình cần thiết chuẩn bị cho chu trình axit citric trong tất cả các sinh hoạt của sinh vật.[16]

Một số nghiên cứu về thời gian trong khoảng 48 giờ [25, 32] cho hiệu quả GABA cao

2.1.5.3 Nguồn dinh dưỡng

Nhu cầu dinh dưỡng của Lb brevis không chỉ bao gồm các yếu tố cơ bản như

cacbon, nitơ, phosphor, lưu huỳnh… mà còn vitamin và muối vô cơ

- Nguồn Carbon: có thể sử dụng nhiều nguồn khác nhau từ monosaccharide (glucose, fructose, và mannose) đến disaccharide (saccharose, maltose, lactose) và

polysaccharide (dextrin, tinh bột) Lb brevis sử dụng các nguồn carbon để cung cấp

năng lượng và xây dựng cấu trúc tế bào Li và cộng sự (2010), nghiên cứu 2 nguồn

carbon: glucose và maltose cho quá trình lên men Lb brevis NLC 912 trong môi

trường MRS cho thấy đây là nguồn carbon tốt hơn cho sự sinh trưởng của vi khuẩn này Đặc biệt, glucose là nguồn carbon cho hiệu quả sinh trưởng tốt hơn so với maltose trong quá trình lên men sinh tổng hợp GABA Khi nồng độ glucose trên 5%, nồng độ GABA gần như ổn định, chỉ tăng nhẹ [30]

- Nguồn Nitơ: vi sinh vật không thể tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật, nguồn nitơ phải được cung cấp cho môi trường lên men Nguồn nitơ có thể ở dạng hỗn hợp của các axit amin hoặc dịch thuỷ phân các sản phẩm từ thịt, protein, casein và peptone Báo cáo của

Li và cộng sự (2010), cho thấy nguồn nitơ từ peptone, dịch chiết nấm men, cao thịt

là những nguồn dinh dưỡng tốt cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn khi lên men sinh tổng hợp GABA Hàm lượng GABA tăng đáng kể khi nồng độ peptone thấp hơn 2,5% [30] Đặc biệt là nguồn peptone với hiệu quả lên men sinh tổng hợp GABA cao, giá thành rẻ hơn so với các nguồn nitơ khác

- Vitamin: là coenzyme trong chuyển hóa của các tế bào Rất ít LAB có khả

năng tổng hợp vitamin Lactobacillus cần vitamin cho sự phát triển bình thường, do

đó các vitamin phải được thêm vào môi trường như dịch chiết khoai tây, ngô, dịch chiết cà rốt, dịch chiết nấm men Đặc biệt là Vitamin B6, là cofactor trong chu trình chuyển hóa GABA

- Muối vô cơ: các hợp chất vô cơ có chứa đồng, sắt, natri, mangan, magiê cần

thiết cho sự phát triển của Lactobacillus Mangan, magie có vai trò quan trọng trong

việc ngăn ngừa sự phân giải tự động tế bào và ổn định cấu trúc tế bào vi khuẩn

2.2 Tổng quan về cám gạo

2.2.1 Thành phần hóa học của cám gạo

Hình 2.2 Các thành phần cấu tạo chính của hạt lúa gạo

Cám gạo đƣợc hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, cũng nhƣ một phần từ tấm Lúa sau quá trình xay xát cho gạo trắng (nội nhũ) chiếm số lƣợng lớn 65%, 25% vỏ cứng (trấu), 10% cám Hình 2.2 [33]

Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc trƣng, đặc biết rất giàu thành phần dinh dƣỡng Các thành phần hóa học cơ bản của cám gạo đƣợc thể hiện qua Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần hóa học của cám gạo (theo chất khô)[34]

Khoảng dao động Protein

(%)

Lipit (%)

Chất xơ (%)

Khóang (%)

NFE a (%)

dồi dào protein, có thể thủy phân để tạo cơ chất axit glutamic cần thiết cho quá trình chuyển hóa thành GABA

Bảng 2.4 So sánh thành phần các hợp chất (%, khối lƣợng) có trong cám gạo với

22 [34] Hàm lƣợng protein phụ thuộc vào loại, điều kiện thổ nhƣỡng, hàm lƣợng phân bón nitơ

Hàm lƣợng nitơ của cám thay đổi trong khoảng 1-3%, dựa vào chất khô Các thành phần axit amin của cám gạo thay đổi trong giới hạn rộng (Bảng 2.5)[34]

Bảng 2.5 Thành phần Amino Axit của cám gạo, gạo đánh bóng, một số cám ngũ

cốc khác

mì

Cám lúa mạch

Cám yến mạch

Cám Nội nhũ

Alanine 6,5 - 7,0 6,5; 6,6 5,7; 3,8 5,4 5,1 Arginine 8,6 - 9,1 8,9; 9,0 8,1; 5,9 6,3 6,8 Axit Aspartic 10,0 - 11,0 9,7; 10,7 8,5; 6,1 7,5 8,6 Cystine 2,5 - 2,8 2,7; 2,8 2,8; 1,9 1,9 2,4

Axit Glutamic 14,6 - 15,0 16,1; 17,6 21,2; 16,8 27,9 21,1

Gycine 5,8 - 6,2 5,6; 5,7 6,7; 4,6 5,4 5,4 Histidine 2,9 - 3,7 2,8; 2,9 3,2; 2,5 2,2 2,2 Isoleucine 2,9 - 4,5 2,9; 4,2 3,4; 2,7 3,7 3,8 Leucine 7,6 - 8,4 7,2; 8,4 6,8; 5,1 6,8 7,4 Lysine 5,3 - 6,0 4,6; 5,1 4,5; 3,4 4,1 4,1 Methionine 1,9 - 2,5 2,4; 3,0 1,7; 1,0 0,4 2,1

Phenylalanine 4,9 - 5,3 4,6; 5,0 4,3; 3,1 4,6 5,1 Proline 4,6 - 6,1 4,2, 5,7 6,5; 5,7 4,9 6,2 Serine 5,1 - 6,0 4,9; 5,9 5,0; 4,3 4,5 4,8 Threonine 4,2 - 4,6 3,9; 4,4 3,7; 2,9 3,3 3,4

Tryosine 3,5 - 3,8 3,8; 4,3 3,3; 2,4 2,7 3,5 Valine 5,4 - 6,6 4,8; 6,2 3,2; 3,7 5,3 5,5

α

Expressaed in g/16 of N,

U,S, Dept, of Health, Education, and Welfare/FAO (1968, 1972),

Trong thành phần axit amin của bảng 2.5, hàm lượng axit glutamic chiếm hàm lượng đáng kể (14,6 – 15,0%), đây là cơ chất quan trọng chuyển hóa thành GABA Điều này chứng tỏ, cám gạo làm một nguồn nguyên liệu có thể sử dụng cho mục đích lên men tạo sản phẩm Gaba

Đường tự do dường như rất ít trong lớp vỏ lụa, vỏ bao, và Aleurone Tuy nhiên, nhiều báo cáo hàm lượng đường trong cám gạo chiếm 3-5% (dựa vào hàm ẩm) [34]; có lẽ do có sự hiện diện đáng kể của mầm và nội nhũ trong cám gạo Đường không khử cao hơn so với đường khử với tỷ lệ là 3:1 đến 4:1 Glucose, fructose, sucrose và đã được báo cáo là có trong cám gạo

Cám rất giàu cellulose và hemicelluloses Nghiên cứu với 10 mẫu cám tại nhà máy xay xát của nước Ý với hàm lượng cellulose thô dao động trong khoảng 9,64-12,80%.[34]

Tóm lại, một lượng đường tự do trong cám và hàm lượng tinh bột phong phú hiện diện trong cám sẽ là nguồn C cho vi sinh vật phát triển

2.2.2.3 Lipit cám gạo

Cám gạo thường chứa 10-23% lipit Ba axit béo chính là: palmitic, oleic, linoleic, chiếm khoảng 90% của các axit béo tổng (Bảng 2.6)[34] Thành phần dầu cám gạo tương tự thành phần dầu trong vừng, ngô, hạt bông, dầu đậu phộng

Bảng 2.6 Thành phần axit béo trong cám gạo Axit béo Thành phần Dầu cám gạo, % Myristic (C14 : 0) 0,1 - 1,0

2.2.2.4 Một số thành phần khác trong cám gạo

i Enzyme

Cám gạo chứa hệ thống các enzyme khác nhau Các enzyme sau đây đã được báo cáo xuất hiện trong cám gạo: α-amylase, β-amylase, catalase, dehydrogenase, axit glutamic decarboxylase, glutamine synthetase, β-glycerophosphatase, invertase, lipase,… lipoxygenase, pectinase, peroxidase, protease, và succinate dehydrogenase Các enzyme quan trọng liên quan đến sự ổn định gạo cám là lipase,

lipoxygenase, và peroxidase Trong số các enzyme, lipase được chú ý nhiều nhất bởi vì nó ảnh hưởng đến chất lượng của cám gạo

ii Khoáng

Khoáng tập trung chủ yếu ở các lớp cám[34] Photpho chiếm hàm lượng chủ yếu, khoảng 90%, trong số đó là phytate phosphorus Hàm lượng khoáng khác nhau tuỳ vào mức độ xay xát Một số yếu tố (P, K, Mg) tăng ban đầu, sau đó giảm dần với sự gia tăng mức độ xay xát Thành phần khoáng cũng thay đổi theo môi trường đất Một số thành phần khoáng chứa hàm lượng cao trong cám gạo sẽ cần thiết cho

sự sinh trưởng của vi sinh vật

Bảng 2.7 Thành phần khoáng vô cơ trong cám gạo Thành phần Hàm lượng, ppm (khối lượng khô)

Bảng 2.8 Hàm lượng vitamin trong cám gạo

2.2.2 Tình hình nghiên cứu cám gạo hiện nay trên Thế giới và Việt Nam

Tăng sản xuất lương thực là trọng tâm của chương trình phát triển ở hầu hết các nước Nhiều giải pháp được đề cập trong chương trình này như tăng sản lượng cây trồng, tái sử dụng phụ phẩm để có thể góp phần đáng kể vào việc tăng nguồn thực phẩm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ

Sản lượng lúa trên toàn thế giới đạt trên 700 triệu tấn vào năm 2011 [3] Cám gạo chiếm khoảng 10% trọng lượng hạt lúa nên bình quân trong một năm trên thế giới có khoảng hơn 70 triệu tấn cám gạo thu được trong quá trình xay xát lúa gạo Trong khi đó, sản lượng lúa thống kê sơ bộ năm 2014 trong cả nước Việt Nam đạt gần 44, 975 triệu tấn [Tổng cục thống kê], ước tính lượng cám gạo thải ra hàng năm trong các cơ sở chế biến khoảng 4.4 triệu tấn [3]

Mặt khác, cám gạo rất giàu protein, lipit, vitamin và các chất khoáng Vì vậy, hiện nay trên thế giới đã có không ít quốc gia tập trung khai thác nguồn phụ phẩm cám gạo này thành nhiều sản phẩm có giá trị cao hơn

Mặc dù nhiều quốc gia trên thế giới đã ứng dụng sản xuất cám gạo trong lĩnh vực thực phẩm nhưng hiện nay lượng cám gạo ở nước ta chủ yếu sử dụng vào mục đích chế biến thức ăn chăn nuôi, ít được sử dụng trong thực phẩm, chỉ một lượng nhỏ cám gạo được dùng cho các ứng dụng trong thực phẩm như: sản xuất dầu cám gạo, protein từ cám,…

Do đó, cám gạo tại Việt Nam chính là một trong nguồn nguyên liệu có thể sản xuất GABA mang lại hiệu quả cao, giá thành rẻ

Tại Việt Nam, Trịnh Tất Cường và cộng sự thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ enzyme và protein, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã bước đầu nghiên cứu thành công quy trình sản xuất GABA từ lên men từ

dịch cám gạo bằng Lactobacillus đạt hiệu quả cao Kết quả này có ý nghĩa cao về

mặt khoa học – công nghệ cũng như kinh tế - xã hội Đây có thể xem là tiền đề cho các công trình nghiên cứu ứng dụng sản xuất nâng cao hàm lượng Gaba từ các nguồn nguyên liệu sẵn có, giá thành rẻ, chất lượng đảm bảo, đáp ứng các đối tượng

có nhu cầu sử dụng như thực phẩm hàng ngày, sản xuất đơn giản

2.3 Tổng quan về enzyme thủy ph n

2.3.1 Giới thiệu về enzyme thủy phân  - amylase

-amylase có khả phân cắt các liên kết  -1,4-glucoside nằm phía trong phân

tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, sản phẩm tạo thành là glucose và dextrose Trung tâm hoạt động của -amylase có chứa nhóm [-COOH] và [NH2], -amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối và rượu loãng

Termamyl 120L (Novozymes) là chế phẩm enzyme dạng nước chứa 

-amylase, có khả năng thủy phân ở nhiệt độ cao, được sản xuất bởi chủng Bacillus subtilis Enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis hoạt động mạnh ở

900C, có khả năng dịch hóa tinh bột và làm giảm độ nhớt của dịch hồ hóa [36] Điều kiện hoạt động của -amylase từ nguồn khác nhau thì khác nhau -amylase chịu nhiệt có thể hoạt động tốt trong vùng pH 6,0 -8,0, nhiệt độ mức 90-

1000C, nồng độ enzyme từ 0,03-1%[37, 38] Ở pH ≤ 4,0, -amylase của vi khuẩn bị

vô hoạt hoàn toàn.[38]

Hạnh và cộng sự (2014) đã nghiên cứu các điều kiện tối ưu hóa của quá trình thủy phân tinh bột từ nguyên liệu gạo huyết rồng được xác định: nồng độ enzyme α -amylase 0,18% với nhiệt độ và thời gian thủy phân tương ứng là 90oC và 41,44 phút Báo cáo cho thấy dịch tinh bột với hàm lượng chất khô hòa tan và đường khử

cao cùng với độ nhớt tương đối thấp, tạo điều kiện tốt cho quá trình chế biến gạo huyết rồng ở các giai đoạn tiếp theo.[39]

Mặt khác, phần lớn các protein trong cám hòa tan hạn chế trong nước, vì nó kết hợp với các thành phần khác bao gồm tinh bột và chất xơ -Amylase có thể thủy phân liên kết α -1,4 Glucoside của tinh bột với các protein, từ đó tăng khả năng khai thác protein Tang và cộng cự (2003) đã tiến hành nghiên cứu: cám gạo được pha trộn với nước khử ion theo một tỷ lệ 1:10 (w / v) (tỷ lệ 01:10 cho là chiết xuất tối đa hàm lượng protein[40, 41]) với điều kiện xử lý: pH 6,5, nhiệt độ 450C, thời gian 3,5 giờ, bổ sung 22000U amylase Sau đó tiến hành bổ sung 12000U protease thuộc nhóm endoprotease và ủ ở 50°C trong 2 giờ, ở tốc độ lắc 200vòng/ phút Báo cáo cho thấy cám gạo khi sử dụng amylase để xử lý thì hàm lượng protein chiết xuất được 37,3%, trong khi đó cám không qua xử lý thì % protein thu được chỉ khoảng 11,7% [41]

Shih và cộng sự (1999) cũng đã tiến hành nghiên cứu việc sử dụng các enzyme carbohydrate trong đó có  - amylase (Termamy 120L từ Novo Nordisk) để thủy phân liên kết giữa carbohydrate và protein Nghiên cứu tiến hành ở điều kiện thủy phân cám bằng  - amylase tỷ lệ cám: nước là 1:5, pH 6,5 điều chỉnh bằng HCl 1N, nồng độ enzyme là 0,15% enzymme/cơ chất, nhiệt độ 950C, thời gian là 45 phút Sau đó, dịch thủy phân được đưa về pH 4, trong 5 phút để vô hoạt enzyme Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tăng 24.8% so với ban đầu là 12,6% Bên cạnh đó, protein không bị phân hủy đáng kể bởi nhiệt độ khi xử lý bằng  - amylase, có khả năng thủy phân và hòa tan các thành phần tinh bột.[38]

Tóm lại, việc sử dụng enzyme thủy phân tinh bột vừa đạt mục đích tăng hàm lượng đường khử, cơ chất cho vi sinh vật phát triển tổng hợp GABA, vừa tạo điều kiện hỗ trợ tăng hiệu quả cho quá trình thủy phân protein

2.3.2 Giới thiệu về enzyme thủy phân protease

So với việc thủy phân protein bằng axit hoặc kiềm, việc sử dụng protease có chọn lọc với điều kiện thủy phân ôn hòa hơn, ít hoặc không tạo các phản ứng, sản phẩm phụ không mong muốn

Mặt khác, phần lớn protein cám không thể được hòa tan bằng dung môi nước bình thường Protease đã được sử dụng để tăng cường thu hồi protein cám gạo và có được các thành phần, tính chất chức năng đáp ứng nhu cầu sử dụng cho sản phẩm thực phẩm công nghiệp

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid, sản phẩm tạo thành là các aicd amin tự do, một ít peptid ngắn

Có 2 loại protease là exoprotease và endoprotease

Hỗn hợp exoprotease và endprotease được sử dụng phổ biến hơn so với khi chỉ sử dụng endopeptidase vì nó cho phép thủy phân protein với tính chất chức năng của sản phẩm được nâng cao hơn

Hamada (2000) báo cáo kết quả cám gạo được xử lý với 2 protease thương mại là Alcalase và Flavourzyme với điều kiện thủy phân là: 5g protein cám pha với 250ml nước, pH =8,0, nhiệt độ thủy phân 500C, 0,025g Alcalase hoặc Flavourzyme được thêm vào Phân tích các nhóm amin tự do trong quá trình thủy phân protein sử dụng Alcalase và Flavourzyme thu được giá trị mức độ thủy phân (DH) của cám gạo tương ứng là 7,5% và 8,8%.[2]

Čková và cộng sự (2002) đã tiến hành thủy phân protein đậu nành sử dụng 3 enzyme Flavourzyme, Alcalase, Novourzyme tại điều kiện pH 7, nhiệt độ 40°C trong 8 giờ cho thấy : độ thủy phân đậu nành tách béo của Flavourzyme cao hơn (39,5%) so với thủy phân bằng Alcalase (35,1%) và Novourzyme (33,3%) Mặt khác, hàm lượng axit glutamic ban đầu là 21 (g/100g protein), sau thủy phân bằng Flavourzyme và Alcalase thì hàm lượng axit glutamic tăng lên tương ứng là 45 và

54 (g/100g protein).[4]

Bên cạnh đó, việc sử dụng kết hợp 2 loại enzyme để tiến hành thủy phân protein đậu nành, cám gạo đã được nghiên cứu và cho hiệu quả cao Hàm lượng axit amin tăng đáng kể so với sử dụng một enzyme Đặc biệt là thủy phân tạo sản phẩm

là axit glutamic, cơ chất cần thiết để enzyme GAD sinh tổng hợp thành GABA Yeom và cộng sự (2010) cũng cho thấy việc thủy phân protein cám gạo bằng enzyme được tiến hành bằng cách sử dụng một hỗn hợp của Alcalase 2.4L và

Flavourzyme (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Đan Mạch) cho kết quả cao Bột protein

từ cám gạo phối trộn với cất theo tỷ lệ cám:nước =1:7, nhiệt độ tối ưu: 500C, pH tối

ưu của 8.0 Hỗn hợp protease (tỷ lệ 1%, w / w) được thêm vào để và ủ trong 2 giờ Sau thủy phân 2 giờ, dịch thủy phân được làm nóng đến 850C trong 10 phút để vô hoạt enzyme Mức độ thủy phân protein tăng sau 15 phút đạt 21,9%, và tăng đến 27,7% sau 2 giờ.[42]

Villanueva và cộng sự (1999) tiến hành thủy phân protein chiết xuất từ hạt hướng dương sử dụng Alcalase, Flavourzyme, hoặc cả hai enzym theo tuần tự tại điều kiện thủy phân: 50g bột protein hướng dương trong 1000ml nước, tỷ lệ enzyme/cơ chất: 5% (0,3AU/g cho Alcalase, 50LAPU/g cho Flavourzyme), pH 8 cho Alcalase và 7 cho Flavourzyme, nhiệt độ: 500C, thời gian là 3 giờ (khi kết hợp 2 protease: đầu tiên Alcalase được thêm vào trước, thủy phân trong 1giờ Sau đó Flavourzyme được thêm vào, thủy phân trong 2 giờ) Đánh giá độ thủy phân của Alcalase, Flavourzyme, và kết hợp 2 protease khi thủy phân bột protein hạt hướng dương tương ứng là 34,7%, 42,2%, 54,2% Mặt khác, khi phân tích hàm lượng axit amin, mà đặc biệt là axit glutamic thủy phân bằng Alcalase, Flavourzye, kết hợp 2 protease tương ứng là: 21,4, 13,3, 21,8 (g/100g protein) Điều này cho thấy việc thủy phân protein sử dụng kết hợp 2 enzyme cho hiệu quả thủy phân cao [3]

Cám gạo, một phụ phẩm của ngành lúa gạo, sử dụng enzyme để tiến hành thủy phân có thể được ứng dụng trong nghiên cứu sinh tổng hợp GABA

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu tổng quát của đề tài là tận dụng nguồn phụ phẩm cám gạo từ quá trình sản xuất công nghiệp để làm môi trường sinh tổng hợp sản phẩm GABA có giá trị gia tăng cao, đáp ứng như cầu tiêu thụ của thị trường

Mục tiêu cụ thể của đề tài là nghiên cứu quá trình lên men sinh tổng hợp

GABA đạt hiệu suất cao từ nguyên liệu cám gạo sử dụng các vi sinh vật có lợi (Lb brevis) dưới sự hỗ trợ của enzyme

• Nguồn gốc: Nhà máy xay xát lúa gạo TƯ RÔ

• Địa chỉ: 126/1a đường Phan Văn Hớn, ấp 1, xã Xuân Thới Thượng, huyện Hóc Môn, TP.HCM

• Sản lượng: 30 tấn/ngày

• Thông số kĩ thuật của nguyên liệu cám thể hiện qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số của cám nguyên liệu trong nghiên cứu

(Degree of milling)

Cám gạo ngay sau khi lấy trực tiếp từ nhà máy sẽ đƣợc đƣa vào quy trình xử

lý cám, phục vụ cho nghiên cứu

Cám gạo đƣợc xử lý theo quy trình trong hình 3.2.[43]

Hình 3.2 Quy trình xử lý cám gạo

 Hấp

Cám gạo sau khi thu nhận từ các nhà máy xay xát sẽ đƣợc hấp ở nhiệt độ 950C

±50C, thời gian 10 phút để vô hoạt các enzyme gây hƣ hỏng dầu nhƣ lipase, lipoxygenase và peroxidase có trong cám, ngăn cản sự oxy hóa và làm ổn định nguyên liệu cám sau này

 Sấy

Sau khi hấp vô hoạt enzyme, cám chuyển qua sấy ở nhiệt độ là 600C đến khi

độ ẩm đạt 5 – 6%, thời gian sấy 30 phút/mẻ/500g, nhằm thuận lợi cho quá trình tách béo tiếp theo

Cám gạo tách béo

Dung môi

 Tách béo

Tiến hành tách béo bằng phương pháp trích ly trong dung môi hexane, trong thiết bị trích ly có vỏ áo điều nhiệt Tỉ lệ dung môi : cám là 3:1 (w/w), trích ly ở nhiệt độ thường, thời gian trích ly là 48 giờ

Sau quá trình trích ly, pha rắn được tách riêng Pha lỏng được đưa qua thiết bị chưng cất để tách dung môi và thu hồi béo của cám gạo

Thí nghiệm này sử dụng vi khuẩn Lactobacillus brevis VTCC – B – 397 được

phân lập từ cải chua của Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Giống được giữ trong môi trường thạch nghiêng MRS bảo quản ở 4 – 100C Mỗi tháng tiến hành cấy chuyền định kỳ để giữ giống

3.2.3 Enzyme thủy phân

Enzyme được bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 5-100

C

Thông tin về enzyme được trình bày tại bảng 3.2

Bảng 3.2 Thông tin về enzyme sử dụng trong nghiên cứu

Tên enzyme Nhóm enzyme Xuất xứ Nguồn gốc sản

Baccillus Licheniformis

Chất lỏng màu nâu

và exopeptidases

Aspergillus oryzae

Dạng rắn, màu nâu

500 LAPU/g, 50-550C 5,0-7,0