Khảo sát hệ vi sinh vật trong bánh men rượu bàu đá

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG - Phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Bàu Đá - Nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập được, tiến hành định danh cấp độ giống.. TÓM TẮT LU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC K 2013



LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT HỆ VI SINH VẬT TRONG BÁNH MEN RƯỢU BÀU ĐÁ

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TS Nguyễn Thị Bích Hồng

Học viên thực hiện: Nguyễn Minh Trí

Mã học viên: 13310810

TP, Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2015

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – Đại Học Quốc Gia

TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ nhận xét 1:………

Cán bộ nhận xét 2: ………

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại Học Bách Khoa – Đại Học Quốc Gia TP.HCM Thời gian bảo vệ: Ngày … Tháng ……Năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn Thạc sĩ bao gồm: ( Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của hội đồng chấm bảo vệ luận văn Thạc sĩ) 1 ………

2 ………

3 ………

4 ………

5 ………

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sữa chữa (nếu có)

0

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN MINH TRÍ MSHV: 13310810

Ngày, tháng, năm, sinh: 23/04/1990 Nơi sinh: Bình Định

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh Học

I TÊN ĐỀ TÀI: “Khảo sát hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Bàu Đá”

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

- Phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Bàu Đá

- Nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập được, tiến hành định danh cấp độ giống

- Tuyển chọn những chủng nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có hoạt tính cao trong lên men rượu

- Định danh cấp độ loài các chủng tuyển chọn

- Bảo quản bộ sưu tập giống vi sinh vật tuyển chọn

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 19/01/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/12/2015

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, cho con xin cảm ơn Ba, Mẹ đã nuôi nấng dạy dỗ con nên người Cảm ơn Ba, Mẹ và những người thân yêu luôn bên cạnh động viên, tạo điều kiện cho con học tập, luôn bên cạnh con những lúc khó khăn

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý giá, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận và chương trình học này

Xin cảm ơn các Anh, Chị, các bạn đang làm đề tài tại bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách Khoa luôn luôn động viên giúp đỡ tôi những lúc khó khăn

Lời cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn đến các bạn CNSH khóa 2013 trường Đại Học Bách Khoa TP HCM đã động viên, khích lệ giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

và thực hiện luận văn tốt nghiệp này

TP Hồ Chí Minh, Ngày Tháng Năm 2015

Nguyễn Minh Trí

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Rượu Bàu Đá là sản phẩm truyền thống của người Bình Định, bên cạnh nguồn nước thì hệ vi sinh vật trong lên men rượu đóng vai trò quan trọng quyết định chất lượng, tạo nét đặc trưng cho sản phẩm rượu Bàu Đá Trong nghiên cứu này, với đề tài:

“Khảo sát hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Bàu Đá”, được thực hiện nhằm mục đích làm sáng tỏ hệ vi sinh vật tham gia lên men rượu tạo nét đặc trưng cho rượu Bàu

Đá Bên cạnh đó, làm tiền đề cho khâu tuyển chọn, bảo tồn những giống có hoạt tính cao trong lên men rượu Kết quả nghiên cứu cho thấy bánh men rượu Bàu Đá gồm đầy

đủ ba nhóm nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Với mật độ nấm mốc, nấm men, vi khuẩn trong bánh men rượu Bàu Đá lần lượt là 3,7 x106 CFU/gam, 1,1 x107 CFU/gam, 1,8 x105 CFU/gam Chúng tôi tiến hành phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu bao gồm 4 dòng nấm mốc, 6 dòng nấm men, 4 dòng vi khuẩn Tiến hành định danh sơ bộ theo hình thái và sinh hóa các dòng nấm mốc phân lập có sự tương đồng với các giống

Mucor, Aspergillus, Rhizopus Nấm men chủ yếu sự xuất hiện phổ biến của dòng nấm

men rượu Saccharomyces Vi khuẩn có sự xuất hiện của nhóm vi khuẩn lactic và

acetic Từ các dòng phân lập được chúng tôi tiến hành tuyển chọn những dòng có hoạt tính, vai trò quan trọng trong lên men rượu Qua quá trình thực nghiệm, đã tuyển chọn được 3 dòng nấm mốc có khả năng tạo vòng phân giải tinh bột 2,4 - 5,2 cm trên môi trường tinh bột 1%, tuyển chọn được 1 dòng nấm men có khả năng lên men rượu nhanh, nồng độ ethanol thu được cao nhất 10,7mg/100ml và tuyển chọn 2 dòng vi khuẩn mang những đặc trưng vi khuẩn lactic Chúng tôi tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và 16S rRNA để định danh cấp độ loài các dòng tuyển chọn được Chúng tôi đã

xác định được các loài Rhizopus microsporus, Aspergillus oryzae, Saccharomyces

cerevisiae, Pediococcus lolii, Lactobacillus plantarum Tiến hành xây dựng bộ sưu tập

giống vi sinh vật bánh men rượu Bàu Đá bằng phương pháp bảo quản thạch nghiêng

và đông sâu -700C các dòng tuyển chọn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN……… i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 RƯỢU TRUYỀN THỐNG 3

1.1.1 Ý nghĩa của lên men rượu truyền thống 3

1.1.2 Bánh men trong sản xuất rượu truyền thống 3

1.1.3 Tương tác hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu 8

1.1.4 Giới thiệu rượu Bàu Đá 9

1.2 HỆ VI SINH VẬT BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG 10

1.3.1 Nấm mốc trong bánh men rượu 10

1.3.2 Nấm men trong bánh men rượu 13

1.3.3 Vi khuẩn trong bánh men rượu 15

1.3 TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 18

1.3.1 Phương pháp truyền thống 18

1.3.2 Phương pháp hiện đại 19

1.4 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 23

1.4.1 Những nghiên cứu ngoài nước liên quan đề tài 23

1.4.2 Những nghiên cứu trong nước liên quan đề tài 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 27

2.2 VẬT LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ - MÔI TRƯỜNG 27

2.2.1.Vật liệu 27

2.2.2 Hóa chất 27

2.2.3 Thiết bị 27

2.2.4 Môi trường nuôi cấy 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 29

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 30

2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG HỆ VI SINH VẬT BÁNH MEN RƯỢU BÀU ĐÁ 39

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP HỆ VI SINH VẬT BÁNH MEN RƯỢU BÀU ĐÁ 39

3.2.1 Nấm mốc 39

3.2.2 Nấm men 42

3.2.3 Vi khuẩn 45

3.3 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN DÒNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG LÊN MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG 47

3.3.1 Tuyển chọn những dòng nấm mốc có hoạt tính phân giải tinh bột cao 47

3.3.2 Tuyển chọn những dòng nấm men có khả năng lên men rượu nhanh, nồng độ rượu cao 49

3.3.3 Tuyển chọn những dòng vi khuẩn lactic trong bánh men 51

3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH DÒNG VI SINH VẬT TUYỂN CHỌN 53

3.4.1 Kết quả định danh các dòng nấm mốc tuyển chọn 53

3.4.2 Kết quả định danh dòng nấm men tuyển chọn 57

3.4.3 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn tuyển chọn 58

4.5 BẢO QUẢN CÁC DÒNG VI SINH VẬT PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH 60

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1 KẾT LUẬN 61

4.2 KIẾN NGHỊ 61

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc điểm phân loại Saccharomyces và Endomycopsis 15

Bảng 1.2: Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic 17

Bảng 3.1 Mật số nấm men, nấm mốc, vi khuẩn trong bánh men rượu Bàu Đá 39

Bảng 3.2: Đặc điểm đại thể, vi thể các dòng nấm mốc phân lập 40

Bảng 3.3: Đặc điểm đại thể, vi thể các dòng nấm men phân lập 42

Bảng 3.4: Đặc điểm đại thể, vi thể các dòng vi khuẩn phân lập 45

Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải tinh bột các chủng nấm mốc 48

Bảng 3.6 Hàm lượng cồn sau 36 giờ nuôi cấy của các dòng nấm men 51

Bảng 3.7 Đặc điểm phân loại các dòng vi khuẩn phân lập 52

Bảng 3.8 Bộ sưu tập hệ vi sinh vật bánh men rượu Bàu Đá 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bánh men rượu truyền thống 6

Hình 1.2 Quy trình sản xuất bánh men rượu truyền thống 7

Hình 1.3 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Aspergillus oryzae 11

Hình 1.4 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Aspergillus niger 11

Hình 1.5 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Mucor 12

Hình 1.6 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Rhizopus 12

Hình 1.7 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử của Penicillium 13

Hình 1.8 Hình thái tế bào nấm men 14

Hình 1.9 Hình thái đại thể, vi thể của giống Saccharomyces 15

Hình 1.10 Hình thái đại thể, vi thể nhóm Bacillus 16

Hình 1.11 Hình thái vi thể nhóm vi khuẩn Acetobacter 16

Hình 1.12 Hình thái vi thể của nhóm vi khuẩn lactic 17

Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải tinh bột các dòng nấm mốc phân lập 49

Hình 3.2 Khảo sát khả năng lên men rượu 6 dòng nấm men 50

Hình 3.3 Kết quả so sánh trình tự gen 28S rRNA của NM01 và chủng Rhizopus microsporus với số đăng ký CQ328854.1 54

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự gen 28S rRNA của NM03 và chủng Aspergillus oryzae với số đăng ký AP007173.1 55

Hình 3.5 Kết quả so sánh trình tự gen 28S rRNA của NM04 và chủng Rhizopus microsporus với số đăng ký GQ328854.1 56

Hình 3.6 Kết quả sắp gióng cột vùng thay đổi trình tự gen 28S rRNA của dòng nấm mốc NM01 và NM04 56

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự gen 28S rRNA của NMe01 và chủng Saccharomyces cerevisiae với số đăng ký CP006446.1 57

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự gen 16S rRNA của VK01 và chủng Pediococcus lolii với số đăng ký KJ580428.1 58

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự gen 16S rRNA của VK03 và chủng Lactobacillus plantarum với số đăng ký CP005942.2 59

MỞ ĐẦU

Rượu cổ truyền từ lâu là niềm tự hào dân tộc, là đặc sản quý của nhiều quốc gia trên thế giới Người ta không chỉ biết đến hương vị độc đáo đặc trưng của nó, mà thông qua cách thưởng thức rượu cổ truyền dân tộc, người thưởng thức có thể tìm về cội nguồn văn hóa của dân tộc ấy Trải dài trên đất nước Việt Nam mỗi mảnh đất, mỗi vùng miền là một hương vị riêng của rượu hòa quyện trong nét văn hóa bản địa như rượu Làng Vân-Bắc Ninh, rượu Gò Đen-Long An, rượu cần Tây Bắc, Tây Nguyên và rượu Bàu Đá-Bình Định Rượu Bàu Đá là sản phẩm rượu cổ truyền có từ lâu đời, có nét văn hóa đặc trưng của người Bình Định Tuy nhiên, giá trị này ngày càng bị mai một, năng suất và chất lượng rượu còn ở mức thấp, không giữ được bản sắc riêng, nét đặc trưng vốn có của rượu Bàu đá, không đáp ứng được nhu cầu người sử dụng

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng rượu như nguồn nước, nguyên liệu, nhiệt độ, pH, hệ vi sinh vật sử dụng trong lên men, quá trình chưng cất…Trong các yếu tố trên, hệ vi sinh vật lên men rượu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và năng suất rượu tạo thành Việc sử dụng nguồn vi sinh vật thuần chủng và có hoạt tính cao trong quá trình lên men là rất cần thiết [3]

Hệ vi sinh vật bánh men rượu chủ yếu là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Hệ vi sinh vật có vai trò nhất định ở từng giống và tương tác lẫn nhau trong quá trình lên men rượu Nấm mốc sản sinh hệ enzyme phân giải tinh bột, nấm men chuyển hóa đường thành rượu, vi khuẩn ổn định môi trường và tham gia vào giai đoạn tạo hương Bên cạnh đó, một số loại bánh men chứa giống nấm mốc có thể chuyển hóa đường thành rượu hoặc một số giống nấm men có thể thực hiện cả đường hóa và rượu hóa [26, 34] Hệ vi sinh vật bánh men rất đa dạng, phong phú có sự khác nhau lớn về thành phần và số lượng trong mỗi loại men Sự khác nhau này góp phần tạo nét đặc trưng riêng cho từng sản phẩm rượu truyền thống

Rượu Bàu Đá là một trong những đặc sản của người Bình Định, rượu Bàu Đá

có độ rượu cao trên 50% (v/v), mùi thơm, cay nồng đậm nét truyền thống Rượu Bàu

Đá được sản xuất bằng phương pháp lên men truyền thống sử dụng bánh men ủ với

cơm, sau đó tiến hành chưng cất Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nên nét đặc trưng của rượu Bàu Đá

Vì vậy, khảo sát hệ vi sinh vật bánh men rượu Bàu Đá góp phần làm sáng tỏ hệ

vi sinh vật tham gia lên men rượu, tạo nét đặc trưng cho rượu Bàu Đá Bên cạnh đó, làm tiền đề cho khâu tuyển chọn, bảo tồn những chủng có hoạt tính cao trong lên men rượu Với mục đích này, chúng tôi đề xuất nghiên cứu đề tài “ Khảo sát hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Bàu Đá”

Mục tiêu đề tài là xác định hệ vi sinh vật lên men rượu trong bánh men rượu Bàu Đá, lưu trữ các giống có hoạt tính cao tạo nét đặc trưng rượu Bàu Đá

Với mục tiêu trên, đề tài được thực hiện quy mô phòng thí nghiệm với các nội dung sau:

- Phân lập hệ vi sinh vật trong bánh men rượu

- Nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa các chủng phân lập được, tiến hành định danh sơ bộ theo hình thái

- Tuyển chọn những giống nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có hoạt tính cao trong lên men rượu

- Định danh cấp độ loài các giống tuyển chọn

- Bảo quản, xây dựng bộ sưu tập giống vi sinh vật bánh men rượu Bàu Đá

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RƯỢU TRUYỀN THỐNG

1.1.1 Ý nghĩa của lên men rượu truyền thống

Lên men truyền thống là một dạng lên men bởi hỗn hợp vi sinh vật để tạo nhiều loại thực phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng Lên men rượu là hình thức lên men truyền thống điển hình đã có từ lâu đời và được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm Nguyên liệu chính của lên men rượu là các sản phẩm nông nghiệp do vậy

nó phát sinh và phát triển cùng với sự phát triển của nông nghiệp [18]

Ở các nước phương đông từ thời thượng cổ, người dân đã biết làm rượu từ nguyên liệu tinh bột Cách đây 4000 năm Trung Quốc đã biết làm rượu từ ngũ cốc, người Nhật làm rượu shake cách đây 1700 năm Ở Việt Nam, nghề nấu rượu cũng có

từ thời xa xưa Đến năm 1989, Calmette đã phân lập giống nấm mốc Amylomyces

rouxi trong bánh men thuốc bắc, giống nấm mốc này vừa có khả năng đường hóa vừa

có khả năng rượu hóa nên được ứng dụng thuận lợi để nấu rượu từ những nguồn nguyên liệu tinh bột Từ đó, nghề nấu rượu thủ công của chúng ta nhanh chóng phát triển [18]

Lên men rượu truyền thống đặc biệt có ý nghĩa đối với các nước có nền kinh tế chủ yếu nông nghiệp như nước ta, do đó việc sản xuất các thực phẩm và đồ uống lên men có nguồn gốc từ tinh bột lại phải càng coi trọng, góp phần đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm, tận dụng hiệu quả nguồn nông sản giàu tinh bột, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ cao Lên men truyền thống còn góp phần giữ gìn bản sắc, giá trị văn hóa mà các sản phẩm truyền thống tạo ra từ lâu đời Tuy nhiên, các sản phẩm rượu truyền thống cho đến nay chủ yếu sản xuất quy mô hộ gia đình, quá trình sản xuất thủ công, thiết bị đơn giản, chất lượng sản phẩm không ổn định [18]

1.1.2 Bánh men trong sản xuất rượu truyền thống

1.1.2.1 Giới thiệu bánh men rượu truyền thống

Công nghệ sản xuất bánh men có từ lâu đời, mỗi vùng miền có một công thức làm bánh men riêng Ở Việt Nam có hai loại bánh men chính là bánh men thuốc bắc và bánh men lá Bánh men thuốc bắc được sản xuất một số vị thuốc bắc và bột gạo cùng men giống, bánh men lá được sản xuất từ bột gạo và các loại lá, củ quả rừng được thu hái theo kinh nghiệm cổ truyền Số lượng và chủng loại cây thuốc hay cây rừng bổ

sung vào bánh men luôn là bí quyết của từng hộ, từng vùng tạo nét đặc trưng riêng Ngoài ra, trên thị trường còn có bánh men thuốc tây, đây là loại bánh men bổ sung một

số chất kháng sinh để hạn chế tạp nhiễm [19]

 Men thuốc bắc

Nguyên liệu sản xuất men thuốc bắc bao gồm các vị thuốc bắc hoặc thuốc nam trộn với bột gạo Bột gạo, thuốc bắc được nghiền nhỏ, cùng với bột bánh men cái trộn đều Tỷ lệ thuốc bắc với bột gạo là 1:10 Bổ sung nước đến độ ẩm 50-55% [16] Vai trò của các vị thuốc bắc trong bánh men có thể chia làm 4 nhóm sau [17]:

- Nhóm chất có tác dụng dược lý sát trùng

- Nhóm tăng cường sức đề kháng cho nấm mốc, nấm men

- Nhóm đóng vai trò thúc đẩy sự trao đổi chất của nấm mốc, nấm men

- Nhóm cung cấp hương thuốc bắc cho sản phẩm rượu

Trong bánh men thuốc bắc nhờ có các vị thuốc với thành phần hợp lý mà hạn chế được sự lây nhiễm các tạp khuẩn từ không khí vào bánh men Mặt khác một số vị thuốc còn có tác dụng kích thích sự phát triển của nấm men và nấm mốc, nhờ vậy mà quá trình đường hoá và rượu hoá diễn ra tốt hơn [17]

 Men lá

Men lá thường được sử dụng ở các vùng núi cao Người dân dùng các lá cây có

ở miền núi thay cho các vị thuốc bắc Lá sử dụng thường là các loại có nhiều tinh dầu,

có mùi thơm Tùy thuộc vào từng địa phương, vùng miền mà có các công thức sản xuất bánh men lá khác nhau Mùi vị của rượu thành phẩm phụ thuộc rất nhiều vào các loại lá, vào tỷ lệ sử dụng chúng trong bánh men Để làm men lá, người K’Ho Tây Nguyên sử dụng bột thân cây “đòng” và nước chiết cây “me-kà-zut” trộn với bột gạo [16]

1.1.2.2 Vai trò bánh men trong lên men rượu

Trong sản xuất rượu truyền thống bánh men là một trong những nguyên liệu không thể thiếu, có vai trò quan trọng, quyết định đến năng suất và chất lượng, tạo thương hiệu nét đặt trưng cho từng sản phẩm [6]

Bánh men là một hỗn hợp các vi sinh vật, ở đó có sự tác động tương hỗ trong quá trình lên men Quá trình lên men rượu cổ truyền là một quá trình gần giống với phương pháp sản xuất cồn công nghiệp theo phương pháp amylo Ở đó xảy ra đồng thời hàng loạt các quá trình sinh hóa khác nhau khi lên men như: tăng sinh khối, quá

trình thủy phân tinh bột, quá trình chuyển hóa đường thành rượu, quá trình tạo hương

Vì thế, thành phần và số lượng của hệ vi sinh vật trong bánh men rất quan trọng quyết định tính đặc trưng, thành công của sản phẩm rượu sau lên men [10]

Quá trình lên men rượu trải qua hai giai đoạn chính là đường hóa và rượu hóa Giai đoạn đường hóa được thực hiện bởi nấm mốc, rượu hóa được thực hiện bởi nấm men, vi khuẩn trong bánh men giúp ổn định pH dịch lên men tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, nấm men hoạt động tốt

Giai đoạn đầu của quá trình lên men: thường môi trường lên men có pH cao không thích hợp cho nấm mốc và nấm men phát triển Giai đoạn này vi khuẩn có trong bánh men hoạt động mạnh góp phần acid hóa nguyên liệu đồng thời giảm pH môi trường lên men tạo điều kiện thích hợp cho nấm mốc, nấm men hoạt động Ngoài ra, vi khuẩn trong bánh men sản sinh acid hữu cơ, tham gia tạo hương cho sản phẩm ở giai đoạn sau lên men [34]

Giai đoạn đường hóa: người ta thường sử dụng nấm mốc là tác nhân chính Một

số dòng nấm mốc phổ biến trong bánh men rượu như Amylomyces rouxii, Rhizopus spp., Mucor spp., Aspergillus spp Để hiệu suất quá trình thủy phân tinh bột đạt hiệu

quả cao, thì hệ vi sinh vật bánh men phải có khả năng tạo ra nguồn enzyme phân giải tinh bột có hoạt lực cao, để có được điều này chúng ta cần chú ý khâu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt, có khả năng tích tụ nhiều enzyme amylase có hoạt độ cao Bên cạnh đó chúng ta cần tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy cho chủng vi sinh vật sử dụng [21]

Giai đoạn rượu hóa: được thực hiện bởi nấm men Có rất nhiều dòng nấm men

có thể chuyển hóa đường thành rượu, tuy nhiên những dòng nấm men quan trọng và

chiếm ưu thế trong quá trình lên men rượu thuộc giống Saccharomyces đặc biệt là

Saccharomyces cerevisiae xuất hiện phần lớn trong bánh men rượu truyền thống [8]

Để thu được hiệu suất lên men cao, người ta thường tuyển chọn những dòng nấm men tốt có khả năng lên men tốc độ mạnh và chịu được nồng độ cồn cao Bên cạnh rượu là sản phẩm chính của quá trình lên men, nấm men còn sản sinh những hợp chất khác như ester, acid hữu cơ, diacetyl Sự hiện diện của các hợp chất này tùy thuộc vào từng dòng nấm men và điều kiện lên men, chúng góp phần quan trọng tạo nên hương đặc trưng cho sản phẩm [10]

1.1.2.3 Cách làm bánh men rượu truyền thống

Nguyên liệu để sản xuất bánh men rượu chủ yếu bột gạo, thuốc bắc, men giống,

nước, trấu Gạo tẻ tiến hành ngâm nước 1-2 giờ, để ráo, nghiền mịn Thuốc bắc, bánh

men giống tiến hành nghiền mịn Sau đó, phối trộn các nguyên liệu theo tỷ lệ 2-5 bánh men giống trộn với 1kg bột gạo ẩm Sau đó tiến hành tạo hình, đường kính 3-5 cm Độ

ẩm bánh men 50-55 % sao cho khi định hình bánh men không bị chảy nước hoặc không bị tơi bột Nếu độ ẩm cao sự thoáng khí kém, nấm mốc, nấm men phát triển kém, vi khuẩn kỵ khí phát triển mạnh, độ ẩm thấp tạo hình rất khó Khi làm bánh men chú ý chọn gạo xay có nhiều cám, trong đó chứa nhiều vitamin, khoáng chất Những

chất này cần cho sự sinh trưởng, phát triển nấm mốc, nấm men giai đoạn ủ [16]

Bánh men được đặt lên một lớp trấu đã được rửa sạch, phơi khô Sau đó, tiến hành ủ 2-3 ngày khi thấy bánh men phồng nở đều và xung quanh thấy các bào tử nấm mốc có chấm đen, vàng nhạt thì đem bánh men phơi khô chỗ thoáng, nhiệt độ 30-

350C Bánh men sau khi phơi khô tiến hành đóng gói bảo quản [16]

Hình 1.1 Bánh men rượu truyền thống [42]

Mỗi vùng miền có một công nghệ sản xuất bánh men riêng mang đậm nét đặc trưng vùng miền Tuy nhiên bánh men rượu truyền thống được sản xuất cơ bản theo quy trình mô tả ở hình 1.2

Hình 1.2 Quy trình sản xuất bánh men rƣợu truyền thống [19, 20]

1.1.3 Tương tác hệ vi sinh vật trong quá trình lên men rượu

Hệ vi sinh vật trong bánh men chủ yếu gồm ba nhóm nấm mốc, nấm men, vi khuẩn (chủ yếu vi khuẩn lactic) [7] Do đó sự tương tác giữa các nhóm vi sinh vật trong lên men rượu chủ yếu là mối tương tác giữa nấm men - nấm mốc, nấm men - nấm men và nấm men - vi khuẩn lactic [33]

1.1.3.1 Tương tác nấm men và nấm mốc

Sự tương tác nấm men và nấm mốc chủ yếu hỗ sinh trong lên men thực phẩm Mối quan hệ hỗ sinh thường xuất hiện khi ta tiến hành đồng nuôi cấy nấm mốc với nấm men trong điều kiện cơ chất phức tạp, khi đó cần có hệ enzyme của nấm mốc phân hủy các cơ chất phức tạp thành sản phẩm đơn giản hơn khi đó nấm men có thể sử dụng Bên cạnh đó, sản phẩm trao đổi chất của nấm men cũng có thể thúc đẩy sinh

trưởng phát triển của nấm sợi như Rhodotorula mucilaginosa nâng cao sự phát triển của Glomus mossese và Gigaspora rosea [33]

1.1.3.2 Tương tác nấm men và nấm men

Mối tương tác nấm men và nấm men trong lên men rượu chủ yếu sự tương tác

giữa những loài Saccharomyces và những loài nấm men khác thông qua cạnh tranh

nguồn carbonhydrate, nitơ và các hợp chất khác Ngoài ra các sản phẩm của nấm men như ethanol, acid hữu cơ, các hợp chất sulphur, các acid béo, decanoic và octanoic acid cũng liên quan đến việc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của những loài nấm men dại, tạp nhiễm [33]

Mối tương tác nấm men – nấm men cũng được nghiên cứu Khi tiến hành nuôi cấy đồng thời trong môi trường glucose - xylose sau khi thủy phân từ rác thải nông

nghiệp, với việc cố định Pichia stipitis và Saccharomyces cerevisiae kết quả thu được nồng độ ethanol cao hơn Một số loài Candida novellus, Candida tropicalis hoặc

Pichia sake cần có mặt biotin hoặc một số loài khác cần B1 cho sự sinh trưởng và phát triển, tuy nhiên khi đồng nuôi cấy một số loài vẫn phát triển tốt trong điều kiện không

bổ sung vitamin, điều này có thể giải thích do một số loài nấm men khác sinh tổng hợp

và cung cấp các amino acid, vitamin [33]

1.1.3.3 Tương tác nấm men và vi khuẩn

Sự tương tác của nấm men rượu với các loài vi khuẩn lactic có thể ức chế hoặc thúc đẩy sự phát triển Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic thường xuất hiện với số lượng ít và chết trong suốt quá trình lên men và ảnh hưởng ít hoặc thậm chí không ảnh

hưởng đến sự phát triển của nấm men Nếu quá trình lên men rượu hạn chế hoặc chậm thì mối quan hệ nấm men và vi khuẩn chủ yếu có vai trò trong suốt quá trình lên men malolactic, quá trình này xảy ra khi giai đoạn kết thúc lên men rượu Sự tương tác nấm men thông qua khả năng sản xuất rượu, protein, acid béo, các chất kháng khuẩn và tiêu thụ hoặc loại bỏ các cơ chất quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn [33]

Megee (1972), đã mô tả sự tương tác giữa Saccharomyces cerevisiae và

Lactobacillus casein Tác giả đã chỉ ra rằng với thành phần cơ chất khác nhau thì mối

quan hệ giữa hai nhóm này khác nhau có thể hỗ sinh hoặc cạnh tranh Khi đồng nuôi cấy hai nhóm này trong điều kiện thiếu riboflavin sự phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào nấm men, nấm men phát triển chuyển hóa dinh dưỡng tổng hợp riboflavin cho vi khuẩn sinh trưởng Khi môi trường có mặt riboflavin, thì mối quan hệ giữa nấm men

và vi khuẩn không còn là hỗ sinh mà chuyển sang cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sống [33]

1.1.4 Giới thiệu rượu Bàu Đá

Rượu Bàu Đá là sản phẩm truyền thống của người Bình Định, thành tựu nổi bật của công nghệ lên men truyền thống Rượu Bàu Đá xuất hiện sớm từ những năm 1945, được lưu truyền và phát triển cho đến ngày nay

Nguyên liệu sản xuất rượu Bàu Đá là gạo tẻ, bánh men và nước Gạo thường được dùng là loại gạo nở, mỗi nồi nấu khoảng 6 kg gạo, sử dụng 12 viên men, lên men

ẩm 3 ngày sau đó bổ sung nước lên men lỏng sau 5 ngày tiến hành chưng cất Nước dùng để nấu rượu Bàu Đá được lấy từ bàu nước do sông Kôn đổ về, tuy nhiên ngày nay bàu nước này bị phù sa lấp dần và mất hẳn, vì vậy các hộ nấu rượu chủ yếu sử dụng nước giếng ngầm sâu 20-25 m Bánh men dùng để sản xuất rượu Bàu Đá sử dụng chủ yếu bánh men dạng viên Trước đây, địa phương chủ yếu dùng men ông Mậu được làm từ các loại củ như củ riềng, củ mình tinh, củ sắn tuy nhiên men này bị thất truyền ngày nay chủ yếu sử dụng men Hồng và nay đổi tên là men Hòa Tuấn

Quá trình chưng cất rượu Bàu Đá sử dụng bằng những nồi đồng, nhôm Người

ta tiến hành đun nhỏ lửa liên tục cho nồi hèm sôi nhẹ làm cho hơi rượu bốc hơi đều mà không bị cháy hèm, hơi rượu được dẫn qua hệ thống làm lạnh bằng ống tre hoặc nhôm

để dẫn hơi rượu đến hệ thống làm mát ngưng tụ Đó là một chu trình hoàn toàn khép kín không có hơi rượu thoát ra ngoài

Sản phẩm rượu Bàu Đá có độ rượu cao, rất trong, rượu thơm và có hậu vị ngọt

ở cổ Rượu Bàu Đá có 4 dòng sản phẩm chính:

 Rượu gạo Bàu Đá: màu trắng trong được chưng cất từ cơm gạo

 Rượu nếp Bàu Đá: màu trắng trong được chưng cất từ cơm nếp

 Rượu đậu xanh Bàu Đá: màu trắng trong được chưng cất từ hỗn hợp xôi đậu xanh (70% đậu xanh + 30% nếp)

 Rượu nếp ngọt Bàu Đá: màu hơi vàng đục được lấy từ hỗn hợp xôi nếp + men rượu ủ, tự phân hủy nhỏ giọt

1.2 HỆ VI SINH VẬT BÁNH MEN RƯỢU TRUYỀN THỐNG

Hệ vi sinh vật trong bánh men đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất rượu, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng của sản phẩm Trong quá trình sản xuất bánh men, men giống của mẻ trước được truyền cho mẻ sau cứ như vậy từ thế

hệ này sang thế hệ khác Ở mỗi địa phương khác nhau người ta chuẩn bị bánh men theo những công thức khác nhau, men giống được gia truyền nhiều thế hệ tạo nét đặc trưng cho từng hộ, từng vùng miền Với truyền thống văn hóa lâu đời và đa sắc tộc, sự

đa dạng trong các loại bánh men rượu của Việt Nam cũng như sự đa dạng nguồn gen của hệ vi sinh vật bánh men rượu là rất lớn Tuy nhiên, hệ vi sinh vật bánh men rượu truyền thống chủ yếu gồm ba nhóm là nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Theo Anthony C Lee và Yusaku Fujio (1999) hệ vi sinh vật trong bánh men rượu Việt Nam chủ yếu

thuộc các chi: Rhizopus, Mucor, Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomycopsis và vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic [3, 37]

1.3.1 Nấm mốc trong bánh men rượu

Vai trò của nhóm nấm mốc trong lên men rượu chủ yếu tham gia giai đoạn đường hóa Nhờ khả năng sinh hệ enzyme phân giải tinh bột, các nhóm nấm mốc có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường là nguồn cơ chất cho nấm men thực hiện giai đoạn rượu hóa Nấm mốc trong bánh men rượu rất phong phú đa dạng Tuy nhiên, bánh men rượu truyền thống Việt Nam chủ yếu các nhóm sau:

Aspergillus oryzae: thuộc nhóm đa bào, thường có màu vàng khi già nên còn

được gọi là mốc vàng hoa cau Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển dần sang màu lục và khi già chuyển hẳn sang màu vàng Phát triển trong khoảng nhiệt

độ rất rộng 15-400

C, nhiệt độ tối ưu là 30-320C Aspergillus oryzae có khả năng sinh

nhiều enzyme amylase [3]

Hình 1.3 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Aspergillus oryzae [1, 40]

Aspergillus niger: khi mới phát triển sợi nấm có màu trắng, sau đó sẫm lại

nhưng không hoàn toàn đen.Từ một sợi nấm đầu tiên, chúng phân nhánh tạo thành 2-4 nhánh sợi nhỏ Từ các nhánh này sẽ phát triển thành những đính bào tử và từ đó phát

triển thành những bào tử màu đen Aspergillus niger có khả năng sinh nhiều enzyme

amylase [3]

Hình 1.4 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Aspergillus niger [15, 40]

Mucor: là chi tiêu biểu họ Mucoraceae, đặc trưng bởi sợi nấm không có các

đoạn sợi nấm bò và rễ giả, các nang bào tử kín với các cuống nang phân nhánh hoặc

không phân nhánh, đơn độc hay thành cụm, mọc từ các sợi nấm Một số giống Mucor

có khả năng đồng thời đường hóa và rượu hóa trong quá trình lên men Vì vậy chúng

có thể lên men trực tiếp tinh bột thành rượu [3, 15]

Hình 1.5 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Mucor [15, 40]

Rhizopus: Chi Rhizopus có khoảng 10 loài phân bổ rộng rãi, đặc trưng bởi hệ

sợi nấm có các đoạn sợi nấm bò và rễ giả, bào tử nang Tuy nhiên, nang bào tử kín,

mọc đầu mút các đoạn sợi nấm bò đối diện rễ giả Dòng nấm mốc Rhizopus cũng đồng

thời có hai hệ enzyme vừa thực hiện đường hóa và rượu hóa, ngoài ra còn có nhiều đặc tính quý khác như khả năng chịu nhiệt độ cao, lên men có mùi thơm [15]

Hình 1.6 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử Rhizopus [15, 40]

Penicillium: là mốc sinh bào tử xanh hay còn gọi là mốc xanh Sợi nấm phân

nhánh, có vách ngăn, bộ phận mang bào tử có dạng phân nhánh hình chổi Cuống có thể phân nhánh 1,2,3 tầng, trên đó là các thể bình rồi đến bào tử đính Khuẩn lạc có hoặc không có vết khía xuyên tâm hoặc đồng tâm, có hoặc không có giọt tiết Dòng

nấm mốc Penicillium tuy có khả năng sinh ra hệ enzyme đường hóa mạnh nhưng một

số loài tạo mùi mốc trong sản phẩm [15]

Hình 1.7 Hình dạng khuẩn lạc và bào tử của Penicillium [15, 40]

1.3.2 Nấm men trong bánh men rượu

Hình thái khuẩn lạc của nấm men trên môi trường đặc có kích thước lớn, bóng, tròn đều, trắng sữa, trắng đục

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật, có cơ thể đơn bào hay tập hợp đơn bào Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau phụ thuộc vào giống, loài có thể hình cầu, hình trứng, hình ovan, bầu dục, hình trụ…Một số giống nấm men

tế bào kéo dài, nối tiếp nhau tạo thành dạng sợi gọi là khuẩn ty giả như Endomycopsis

Kích thước tế bào nấm men: chiều dài từ 6 -10 µm, chiều ngang 4 – 8 µm, kích thước tế bào nấm men thay đổi tùy vào loài và điều kiện nuôi cấy

Nấm men sinh sản theo hình thức nảy chồi phổ biến Khi nấm men trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ, chồi sẽ lớn dần lên, một phần nhân của tế bào mẹ được chuyển sang chồi sau đó tách ra một nhân mới rồi hình thành vách ngăn để ngăn cách với tế bào mẹ hoặc dính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới Ngoài ra, nấm men còn sinh sản bằng cách phân đôi, tế bào kéo dài rồi hình thành vách ngăn phân đôi thành nhiều tế bào mới, hoặc sinh sản bằng bào tử đốt, bào tử bắn, bào tử áo

Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện, do đó chúng có khả năng sống điều kiện hiếu khí và kỵ khí Ở điều kiện môi trường dinh dưỡng có oxy nấm men thực hiện quá trình sinh trưởng, tăng sinh khối và sống ở trạng thái hô hấp hiếu khí, khi môi trường không có oxy, nấm men chuyển sang trạng thái hô hấp kỵ khí hay lên men

Hình 1.8 Hình thái tế bào nấm men [16]

Trong bánh men rượu truyền thống chủ yếu xuất hiện hai chi:

Endomycopsis: là loài giả nấm men rất giàu amylase, glucoamylase, do đó vừa

có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa Khi trưởng thành có hệ sợi giả cùng với bào tử đính nhiều chồi, bào tử phân đôi bằng vách ngăn hoặc nảy chồi nhiều phía

Saccharomyces: chủ yếu là giống Saccharomyces cerevisiae chúng có khả năng

lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose Chúng có khả năng lên men ở nhiệt độ cao, chịu được nồng độ cồn cao, môi trường acid Đặc biệt khả năng chịu được chất sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0.02-0.025% đặc điểm này thuận lợi cho lên men khi cần sử dụng thuốc sát trùng đặc biệt có ý nghĩa khi lên men quy mô công nghiệp

Vai trò nấm men trong lên men rượu: nấm men thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc, chúng vừa có khả năng hô hấp và lên men, khả năng lên men của các giống rất khác nhau Nhờ khả năng lên men của các dòng nấm men trong điều kiện thiếu oxy, nấm men chuyển hướng trao đổi chất, chuyển hóa nguồn cơ chất trong môi trường tạo sản phẩm ethanol chủ yếu Sự hình tạo thành ethanol, có thể xem là hình thức giải tỏa sự nhiễm độc cho nấm men khỏi acid pyruvic, đồng thời tái sinh NAD+một coenzyme sử dụng trong quá trình đường phân [16]

Hình 1.9 Hình thái đại thể, vi thể của giống Saccharomyces [20, 43]

Bảng 1.1: Đặc điểm phân loại Saccharomyces và Endomycopsis

Đặc điểm đại thể Kích thước khuẩn lạc lớn,

bóng, viền đều

Khuẩn lạc xù xì, có khuẩn ty,

viền không đều

Đặc điểm sinh

dưỡng

Tế bào nảy chồi đơn, đa cực,

có bào tử đốt, thường sinh bào

tử trần dạng chồi

Tế bào nảy chồi đa cực, đôi khi

có khuẩn ty giả

Sinh sản hữu tính Mỗi túi bào tử có (2 - 4), hiếm

khi là 8 bào tử túi, dạng mũ, ovan hay dạng hình cầu và có thể có một hay nhiều rãnh Bề mặt có thể nhẵn hoặc xù xì

Túi bào tử khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội Mỗi túi có chứa 1- 4 bào tử túi, hình ô van, tròn nhẵn

[1]

1.3.3 Vi khuẩn trong bánh men rượu

Sự đa dạng sinh học nhóm vi khuẩn trong bánh men rượu truyền thống rất phức

tạp, tuy nhiên bánh men rượu truyền thống Việt Nam chủ yếu gồm nhóm vi khuẩn sau:

Giống Bacillus: xuất hiện rất phổ biến, sinh trưởng phát triển rất nhanh trong

điều kiện hiếu khí, có hệ enzyme phân giải tinh bột mạnh Một số loài phổ biến như

Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus amylolique-faciens, Bacillus

sporothermodurans Sự hiện diện nhóm Bacillus trong bánh men có ý nghĩa trong vai

trò thủy phân tinh bột, tuy nhiên với tốc độ sinh trưởng phát triển mạnh, nhóm này có

thể nguồn cạnh tranh dinh dưỡng với nấm mốc, nấm men trong quá trình lên men rượu

[12]

Nhóm vi khuẩn acetic: xuất hiện không phổ biến trong bánh men rượu, nhóm vi

khuẩn acetic chủ yếu hai loài Acetobacter orientalisand và Acetobacter pasteurianus,

trong lên men rượu nhóm vi khuẩn acetic hầu như không mong muốn có mặt do khả năng oxy hóa rượu thành acid acetic, gây thất thoát ethanol và tạo mùi khó chịu cho sản phẩm cuối cùng [12]

Hình 1.11 Hình thái vi thể nhóm vi khuẩn Acetobacter [1, 43]

Nhóm vi khuẩn lactic: rất phổ biến trong bánh men rượu truyền thống Vai trò của nhóm vi khuẩn lactic trong lên men rượu tham gia vào quá trình acid hóa môi trường lên men tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, nấm men sinh trưởng phát triển tốt, ức chế vi sinh vật tạp nhiễm gây hại cho quá trình lên men rượu Tuy nhiên sự phát triển mạnh mẽ của nhóm vi khuẩn lactic cũng gây cạnh tranh, tổn thất nguồn đường

cho quá trình lên men Nhóm vi khuẩn latic thường xuất hiện những loài: Pediococcus

pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella confusa, Weissella paramesenteroides [12]

Hình 1.10 Hình thái đại thể, vi thể nhóm Bacillus [43]

Hình 1.12 Hình thái vi thể của nhóm vi khuẩn lactic [1, 43]

Bảng 1.2: Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic

Khuẩn lạc

Khuẩn lạc tròn đều, nhỏ li ti, trắng đục, bề láng, bề mặt khuẩn lạc trơn hơi lồi, già hơi nhăn nheo, bìa nguyên hoặc chia thùy, ở giữa dày hơn và đục hơn mép ngoài

Khuẩn lạc tròn đều nhỏ li ti, màu trắng đục, trắng trong, đường kính trung bình 1-3 mm, bề mặt trơn bóng, tâm hơi lồi hoặc lõm xuống, bìa nguyên

vi sinh vật thực hiện quá trình thủy phân tinh bột, nhóm nấm men thực hiện quá trình lên men rượu, sự hiện diện của vi khuẩn tham gia quá trình acid hóa nguyên liệu, tạo môi trường thuận lợi cho nấm men, nấm mốc sinh trưởng, phát triển tốt hơn

Để cải thiện hiệu quả lên men rượu, chúng ta có thể tuyển chọn những dòng nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có hoạt tính cao tham gia vào quá trình lên men rượu,

bổ sung trực tiếp vào quá trình sản xuất bánh men rượu

Pediococcus Lactobacillus

1.3 TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI SINH VẬT

1.3.1 Phương pháp truyền thống

Định danh vi khuẩn được thực hiện đầu tiên năm 1987, Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình thái tế bào Mặc dù phương pháp định danh theo hình thái cho kết quả có độ tin cậy không cao, tuy nhiên hình thái và cấu trúc hiển vi có vai trò rất quan trọng trong phân lập, định danh giống mới Nếu thực hiện đúng phương pháp chúng ta có thể định danh cấp độ giống các dòng vi sinh vật phân lập

Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các tiêu chí phân loại chính: đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, đặc điểm biến dưỡng

và đặc điểm sinh thái của vi sinh vật

Đặc điểm hình thái của loài vi sinh vật bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, hình dạng bào tử, hình thức sinh sản, khả năng di động,

sự hiện diện một số cơ quan đặc trưng như: bào tử, tiên mao, thể nhầy…

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: khả năng sử dụng nguồn carbon, nitrogen, các sản phẩm tạo ra trong quá trình trao đổi chất, mối quan hệ với oxy, khả năng chịu áp suất thẩm thấu, nhiệt độ, pH thích hợp [24, 25]

1.3.1.1 Định danh theo hình thái

- Sử dụng khóa phân loại

Thông thường để định danh vi sinh vật theo hình thái ta phải dựa vào các khóa phân loại Khóa phân loại Prokaryotes đầy đủ nhất, sử sụng phổ biến nhất là khóa phân loại Bergey’s

Đối với nấm men việc định danh theo phương pháp hình thái rất phức tạp, có rất nhiều khóa phân loại nấm men Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên Đến năm 1952, J Lodder và Kreger-van rij đã tổng hợp hoàn thiện khóa phân loại nấm men Đây là tài liệu phân loại nấm men có giá trị và thông dụng nhất hiện nay trên thế giới Việt Nam có khóa phân loại nấm men của Lương Đức Phẩm (2008) cũng được sử dụng phổ biến

Đối với nấm mốc định danh theo phương pháp truyền thống thường sử dụng khóa phân loại Robert A Samson (1984), Việt Nam có nhiều khóa phân loại nấm mốc như khóa phân loại nấm mốc của Bùi Xuân Đồng (2004) hay Nguyễn Đức Lượng (2006)

- Sử dụng phương pháp số học

Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta còn có thể tính hệ số tương đồng để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi sinh vật Trong đó hệ số Jaccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà hai chủng đều thiếu [25]

1.3.1.2 Định danh theo phản ứng sinh hóa

- API20E KIT

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào 20 phản ứng sinh hóa khác nhau để định danh vi sinh vật Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều sai số do có thể gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau tuổi tế bào, quá trình nuôi cấy [24]

- Thực khuẩn thể

Thường sử dụng định danh vi khuẩn, mỗi loại vi khuẩn có độ mẫn cảm với một thực khuẩn thể nhất định Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào, trong khi đó một số loài vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm mà không làm tan tế bào, chúng tồn tại cùng tế bào chủ Dựa vào sự khác biệt này người ta dùng thực khuẩn thể để phân biệt các đối tượng nghiên cứu [24]

- Phân biệt theo typ huyết thanh

Nguyên tắc dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài [24]

- Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn

Bacteriocin bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại

vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin [24]

1.3.2 Phương pháp hiện đại

Với sự phát triển của sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật học Nếu như các phương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thì phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật, cho kết quả chính xác cao trong thời gian ngắn [24]

Ứng dụng thành tựu sinh học phân tử trong định danh vi sinh vật chủ yếu tập trung vào các kỹ thuật: Phân tích acid nucleic, phân tích protein, phân tích lipopolysaccharid

Một số phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào vật liệu di truyền được sử dụng hiện nay:

1.3.2.1 Phương pháp lai DNA

Nguyên tắc: DNA tổng số được tách ra và xử lý với enzyme cắt hạn chế, sau đó điện di trên gel agarose và chuyển lên màng lai Mẫu dò được chuẩn bị và lai với màng DNA ở trên Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu DNA khác nhau Phép lai được dựa vào cấu trúc sợi đôi DNA từ hai sợi đơn với các cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung Bắt đầu là đứt gãy các liên kết hydrogene do hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc này hai sợi đơn DNA tách nhau ra Nếu tại thời điểm này người ta cho vào một DNA đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau đó tạo điều kiện hồi biến xuất hiện, lúc đó sẽ cho phép các sợi đơn của mẫu dò bắt cặp với các sợi đơn của mẫu DNA ban đầu Mức độ lai sẽ phụ thuộc vào tính đặc hiệu giữa mẫu dò và mẫu gốc cũng như điều kiện cho phép lai thực hiện (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lệ mẫu

dò, kích thước mẫu dò) Như vậy, việc chọn điều kiện chính xác cho phép lai có ý nghĩa rất quan trọng cho tính đặc hiệu của kết quả phép lai Sau khi lai, tiếp theo là rửa bằng đệm thích hợp để loại mẫu dò dư và cuối cùng là phép đo bức xạ đánh dấu (tùy theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng của phép lai

Mẫu dò: Mẫu dò sẽ lai với DNA đích và không lai với các nguồn DNA khác có mặt trong mẫu lai Mẫu dò nên là đoạn nucleotid đặc trưng cho các mẫu phân tích để phân biệt với các sinh vật khác Mẫu dò đôi khi không cần phải là toàn bộ gene mà chỉ

là một đoạn gene mã hoá cho một đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu, có thể

là yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay một gene chức năng nào đó trên plasmid Với cách chọn mẫu dò có kích thước nhỏ 14 - 40 bp, có thuận lợi là các mẫu dò được tổng hợp nhân tạo và phép lai thực hiện nhanh dưới 30 phút, trong khi đó với các mẫu

dò lớn thời gian kéo dài hơn

Quá trình lai được tiến hành theo một trong 3 cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai trong dịch thể và lai với chất mang

Yếu tố nhận biết kết quả phép lai là chất phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, hay liên kết đặc hiệu với cơ chất [24]

1.3.2.2 Phương pháp phân tích DNA plasmid

Phương pháp phân tích plasmid là phương pháp được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật Plasmid là nhân tố di truyền ngoài nhân và sao chép độc lập với nhiễm sắc thể Cấu trúc plasmid là sợi đôi DNA khép kín theo vòng Tuy nhiên, có nhiều trường hợp là sợi kép DNA mạch thẳng

(Borrelia và Streptomyces) Plasmid được tìm thấy hầu hết ở các vi khuẩn và một số ít

các vi sinh vật nhân thực bậc thấp như nấm men Tuy nhiên, chúng ta cần lưu ý là các plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch các kết quả nghiên cứu

Phương pháp phân tích plasmid ở đây bao gồm tách plasmid, so sánh các loại plasmid về kích thước sau đó tinh sạch plasmid và xử lý bằng enzyme cắt hạn chế, sau

đó điện di trên gel agarose và so sánh sự đa hình của các mảnh cắt để phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau [24]

1.3.2.3 Phương pháp khuyếch đại DNA và kỹ thuật giải trình tự DNA

- Khuyếch đại DNA

Khuyếch đại DNA cho phép làm tăng số lượng DNA hay RNA từ vài chục đến hàng triệu lần Có rất nhiều phương pháp khác nhau để phân tích nguồn DNA khuyếch đại Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng điện di để xác định kích thước sản phẩm của phản ứng PCR Có thể xác định độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu đã được đánh dấu Phương pháp đưa lại thông tin nhiều nhất là xác định được trình tự DNA và RNA của sản phẩm PCR

Khuyếch đại DNA bằng phương pháp PCR PCR là phương pháp dùng enzyme khuyếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP) Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước:

- Bước 1 là biến tính DNA, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép

- Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn

- Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung

Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan trọng cho định danh vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), revert transtriptase PCR (sao chép ngược) và asymmetric PCR (PCR một chiều) [24]

- Kỹ thuật giải trình tự DNA

Phương pháp này cho kết quả chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh vi sinh vật Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng, kết quả

so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu

Một số phương pháp giải trình tự thường dùng hiện nay:

- Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở đầu 5’, được xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẽ gãy các đoạn DNA tại vị trí các base khác nhau

- Phương pháp dideoxy (Phương pháp Sanger, 1977): dựa trên hoạt động các enzyme DNA polymerase xúc tác cho phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide và dừng lại khi gặp các dideoxynucleotide

- Phương pháp giải trình tự DNA tự động: dựa vào sự phát tín hiệu huỳnh quang

từ những dNTP được đánh dấu Hiện nay máy giải trình tự DNA đang được dùng phổ biến nhất là: Beckman Coulter và ABI 3100-Avant [24]

1.3.2.4 Phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA và 28S rDNA

- Gen16S rDNA

Phương pháp này sử dụng cặp mồi NK

16s-F và NK16s-R được phát phát triển bởi công ty Nam Khoa Biotek để khuếch đại đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và loài vi khuẩn [11]

Quy trình thực hiện:

- Khuẩn lạc vi khuẩn được đồng nhất vào nước muối sinh lý vô khuẩn để đạt

độ đục 0.5-1 McF Sau đó đun sôi cách thủy trong 10 phút Để nguội rồi ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút Lấy 5µl dịch nổi cho vào PCR mix 45µl chứa sẵn các thành phần kể

cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R để khuếch đại đoạn DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gen 16S của vi khuẩn

- Chạy chương trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95°C/5 phút để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase, rồi 40 chu kỳ 94°C/15 giây - 60°C/30 giây- 72°C/1 phút Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng bộ kit “Wizard SV Gel and PCR clen -up System” của Promega

- Sản phẩm tinh sạch được điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip của Agilent, sau đó được đưa vào phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi và mồi ngược của PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “BigDye Terminator V.3.1 Cycle sequencing kit” của ABI Chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 1 chu kỳ 96°C/1 phút, theo sau 25 chu kỳ 96°C/10 giây - 50°C/5 giây

- 60°C/4 phút Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được tủa bằng ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL với gel POP 7 và mao quản 50cm

- Kết quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình Blast Search trên ngân hàng gene NCBI Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có kết quả định danh vi khuẩn [11]

1.4 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Những nghiên cứu ngoài nước liên quan đề tài

A.C Lee và Y Fujio (1993) tiến hành nghiên cứu một số mẫu bánh men thu thập tại Việt Nam Kết quả thu nhận được tác giả đã kết luận bánh men phân tích có giá trị pH: 5.76, độ ẩm đạt 13.6%, tổng số nấm mốc 1.3 x 106 CFU/gam, mật số nấm men 4.3 x 106 CFU/gam Hệ vi sinh vật bánh men Việt Nam chủ yếu Rhizopus oryzae,

Mucor indicus, Mucor circinilloides và Amylomyces rouxii Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae, Hyphopichia burtonii, Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomala và Candida sp [37]

Bánh men rượu của các nước khu vực Châu Á hầu hết có nguồn gốc từ Trung Quốc sau đó được truyền sang các nước trong khu vực với những tên gọi khác nhau

như Chu ( Trung Quốc), Koji (Nhật Bản), Nuruk ( Hàn Quốc), Murcha ( Ấn Độ), Ragi

(Indonesia), Ragi tapai (Malaysia), Bubod (Philippines), Loog-pang (Thái Lan) Bánh

men là hỗn hợp gồm nấm mốc, nấm men và vi khuẩn phát triển trên bột gạo hay những loại ngũ cốc khác (Limtong và cộng sự, 2002) Nấm men trong bánh men rượu truyền

thống Thái Lan bao gồm chủ yếu Saccharomycopsis fibuligera, Pichia anomal,

Issatchenkia orientalis, Pichia burtonii, Pichia fabianii, Candida rhagii, Candida glabrata, Torulaspora globosa, Rhodotorula philyla, Saccharomyces cerevisiae

Trong đó phổ biến nhất là Saccharomycopsis fibuligera [38]

Xu-Cong LV và cộng sự (2011) đã phân tích đa dạng sinh học bánh men rượu truyền thống Hong Qu bằng phương pháp PCR kết hợp DGGE (Denaturing gradient

gel electrophoresis) Hệ vi sinh vật bánh men rượu truyền thống Trung Quốc Hong

Qu có hiện diện, chi phối của rất nhiều loài Bacillus như Bacillus ginsengihumi, Bacillus megaterium, Bacillus aryabhattai, Bacillus subtilis, Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens Vi khuẩn lactic bao gồm Weissella paramesenteroides, Pediococcus pentosaceusand, Pediococcus acidilactici Nấm

mốc có sự xuất hiện Rhizopus oryzae, Rhizopus microsporus, Aspergillus Ba giống nấm men Saccharomycopsis fibuligera, Pichia guilliermondii, Pichia

farinose [35]

Bên cạnh nấm mốc và nấm men, hai tác nhân chính quá trình lên men rượu, thì

vi khuẩn cũng được quan tâm và ảnh hưởng đến sản phẩm lên men Ardana và Fleet

(1989) cho rằng trong lên men tape ketan hai nhóm vi khuẩn là Bacillus sp và

Acetobacter sp đóng vai trò quan trọng quyết định chất lượng sản phẩm cuối cùng

I.N Sujaya và cộng sự (2001) xác định đặc tính của vi khuẩn lactic trong ragi tape Kết

quả trong bánh men Ragi tape có sự hiện diện của các dòng Pediococcus pentosaceus,

Enterococcus faecium, Lactobacillus curvatus, Weissella confusa, W paramesenteroide Quá trình lên men rượu các nhóm vi khuẩn phát triển giai đoạn đầu

của quá trình lên men, nhờ môi trường cơm gạo có lượng đường do giai đoạn nấu nguyên liệu tạo thành và pH cao phù hợp cho các dòng vi khuẩn này phát triển Tuy nhiên giai đoạn sau thì các dòng vi khuẩn bị ức chế bởi nồng độ cao của đường và acid lactic trong môi trường (Kodama, 1970) Vai trò của các dòng vi khuẩn acid lactic trong lên men rượu truyền thống thực hiện quá trình acid hóa nguyên liệu tạo môi trường acid phù hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển, vì nấm men là các vi sinh vật ưa acid (Neelakantam, 2005), đồng thời ức chế vi sinh vật tạp nhiễm gây hại quá

trình lên men Vi khuẩn lactic góp phần tạo hương vị cho sản phẩm tạo nét đặc trưng

cho từng vùng miền [34]

Mối quan hệ giữa pH và nồng độ chất tan trong môi trường ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng và phát triển của Lactobacilli và Saccharomyces trong suốt quá trình lên

men rượu được Neelakantam và cộng sự nghiên cứu (2005) Trong quá trình lên men rượu nhóm vi khuẩn lactic có vai trò nhất định, tham gia giảm pH ban đầu cho nấm mốc và nấm men, đồng thời sinh acid lactic có vai trò trong việc tạo hương và ức chế các nhóm tạp nhiễm khác (Shuji Kodama, 2002), tuy nhiên sự phát triển mạnh mẽ của

vi khuẩn lactic lại ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu, làm hao hụt lượng đường của môi trường lên men, tạo môi trường pH quá thấp ức chế nấm men, do đó trong lên men rượu cũng cần kiểm soát sinh trưởng và phát triển của nhóm vi khuẩn Theo Neelakantam (2005), môi trường lên men nồng độ đường trên 30% và pH từ 5.0-5.5 thì giảm tối thiểu ảnh hưởng nhóm vi khuẩn lactic và vi khuẩn tạp nhiễm đồng thời hiệu suất thu hồi rượu từ nấm men cao nhất

1.4.2 Những nghiên cứu trong nước liên quan đề tài

Huỳnh Ngọc Thanh Tâm (2006) với đề tài: “Tuyển chọn nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao từ bánh men Xuân Thạnh” Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng bánh men Xuân Thạnh chứa mật độ nấm mốc 6.3-8.5 CFU/g, nấm men: 5.8-8.3 CFU/g, vi khuẩn 3.6-6.4 CFU/g Tác giả tuyển chọn 3 dòng nấm mốc có khả năng đường hóa với nồng

độ glucose đạt 36-37% (w/v) Các dòng nấm mốc có hoạt tính đường hóa cao được

định danh sơ bộ thuộc giống Rhizopus, Zygomycetes và Mucorales [5]

Vũ Nguyên Thành và cộng sự (2008) tiến hành xác định đa dạng sinh học bánh men rượu truyền thống bằng phương pháp PCR kết hợp DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) Tác giả phân lập được 13 loài nấm mốc nấm men và 23 loài

vi khuẩn Trong đó nhóm vi sinh vật thực hiện đường hóa chủ yếu Rhizopus

oryzae, Rhizopus microsporus, Absidia corymbifera, Amylomyces sp.,

Saccharomycopsis fibuligera, nhóm thực hiện rượu hóa chủ yếu Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia sp., Pichia anomala, Candida tropicalis, Pichia ranongensis, Clavispora lusitaniae Bên cạnh nấm mốc, nấm men, bánh men rượu

truyền thống nhóm nghiên cứu còn phát hiện một mật độ vi khuẩn trong bánh men khá lớn và thay đổi tùy từng loại bánh men, chiếm ưu thế bởi vi khuẩn lactic như

Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Weissella

confusa, Weissella paramesenteroides Tuy nhiên, trong các mẫu bánh men nghiên

cứu, tác giả chưa khảo sát vùng men Bình Định và bánh men sản xuất rượu Bàu Đá [29]

Ngô Thị Phương Dung (2012) với đề tài: “Sản xuất men rượu từ

Saccharomyces cerevisiae và enzyme amylase trong mầm lúa” Trong nghiên cứu này

tác giả xác định mật số nấm mốc nấm men của các loai bánh men thị trường với mật

độ nấm men 7.49-10.23 log CFU/g và nấm mốc 5.93 – 7.61 log CFU/g Phân lập được

26 dòng nấm men thuần, có 5 dòng có khả năng lên men mạnh Đề tài bước đầu thử

nghiệm kết hợp khả năng lên men rượu của amylase trong mầm lúa và Saccharomyces

cerevisiae Mặc dù hiệu suất lên men rượu chưa cao, nhưng đây là một hướng mới

trong công nghệ lên men ethanol [6]

Nguyễn Hữu Thanh và cộng sự (2012) tiến hành khảo sát một số đặc tính sinh học và định danh nấm men phân lập từ bánh men rượu ở đồng bằng sông Cửu long

Theo tác giả, nấm men Saccharomyces cerevisiae có vai trò chính trong lên men rượu

Phân lập tuyển chọn những chủng nấm men trong bánh men tại địa phương rất quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả lên men rượu bởi vì những chủng nấm men này phù hợp và thích nghi với điều kiện khí hậu, tự nhiên của vùng miền đó Từ bánh men rượu ở đồng bằng sông Cửu long nhóm nghiên cứu đã phân lập 128 chủng, trong đó

30 chủng chịu nhiệt độ 500C, đồng thời chịu cồn 17ml/l, sinh bào tử lắng tốt, trong đó

có 10 chủng không sinh H2S, tiến hành giải trình tự định danh chủ yếu thuộc loài

Saccharomyces cerevisiae và Clavispora lusitaniae [9]

Nguyễn Hữu Tường (2013) với đề tài: “Thử nghiệm lên men ethanol ở nhiệt độ cao bằng nấm men chịu nhiệt” Kết quả nghiên cứu tác giả tuyển chọn được 18 dòng nấm men có khả năng chịu nhiệt độ tương đối cao 430C, trong đó có 4 dòng phát triển được 450C Trong đó có dòng nấm men HX1 có khả năng chịu được ethanol nồng độ

9%.Tiến hành định danh xác định thuộc loài Candida tropicalis [14]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 12/ 2014 đến tháng 8/2015

2.2 VẬT LIỆU – HÓA CHẤT – THIẾT BỊ - MÔI TRƯỜNG

2.2.1.Vật liệu

Mẫu bánh men sản xuất rượu Bàu Đá

Hệ vi sinh vật phân lập từ bánh men rượu Bàu Đá

2.2.3 Thiết bị

Tủ ấm nuôi cấy vi sinh vật

Tủ cấy vô khuẩn

Tủ lạnh trữ mẫu Máy quang phổ UV vis Đĩa Petri, ống nghiệm, Erlen Pipetman, lò vi sóng

2.2.4 Môi trường nuôi cấy

Bổ sung chloramphenicol 0.1g/l

Phân lập, nuôi cấy nấm

Saccharose: 30g FeSO4: 1g NaNO3: 2g

K2PO4: 1g MgSO4: 0.5g KCl: 0.5g Agar: 20g

K2PO4: 2g CaCO3: 0.5%

MgSO4.7H2O: 0.5g MnSO4.4H2O: 0.05g Sodium acetate: 5g Triamonium citrate: 2g

Tinh bột tan: 10g

Yeast extract: 2g Agar: 20g

Dung dịch pha loãng Nước muối

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Bánh men rượu

Phân lập hệ vi sinh vật trong

Định danh sơ bộ các dòng phân

lập được theo đặc điểm hình thái

và sinh hóa

Tuyển chọn những dòng có hoạt

tính cao trong lên men rượu

Bảo quản giống

2.3.2 Bố trí thí nghiệm

2.3.2.1 Giải thích quy trình

Với mục đích xác định hệ vi sinh vật có trong bánh men rượu Bàu Đá nhằm tuyển chọn những chủng có hoạt tính cao, tạo nét đặc trưng sản phẩm trong quá lên men rượu Bàu Đá Từ lý do trên đề tài được thực hiện với các bước sau:

Bước 1: Thu thập và bảo quản mẫu bánh men sản xuất rượu Bàu Đá

Mẫu bánh men được thu thập tại các hộ sản xuất rượu Bàu Đá, được bảo quản lạnh 40C

Bước 2: Phân lập hệ vi sinh vật có trong bánh men sản xuất rượu Bàu Đá

Mẫu bánh men rượu Bàu Đá tiến hành xử lý, phân lập trên các môi trường chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật

Xác định mật độ vi sinh vật trong bánh men theo từng nhóm nấm men, nấm mốc, vi khuẩn

Các dòng vi sinh vật phân lập được tiến hành kiểm tra đại thể, vi thể, nhuộm Gram, các đặc tính sinh hóa

Định danh sơ bộ các dòng phân lập được theo hình thái và sinh hóa

Bước 3: Tuyển chọn các dòng có hoạt tính cao trong lên men rượu

Nấm mốc: tiến hành khảo sát khả năng sinh hệ enzyme phân giải tinh bột trên môi trường tinh bột 1%, tuyển chọn những dòng tạo vòng phân giải tinh bột lớn khi thử dung dịch iot

Nấm men: tiến hành khảo sát khả năng lên men rượu của các dòng nấm men phân lập được trên môi trường PDA lỏng, dựa vào khả năng sinh khí CO2 và lượng rượu tạo thành trong quá trình lên men Ta chọn những dòng có tốc độ lên men nhanh, nồng độ rượu cao

Vi khuẩn: tiến hành tuyển chọn những dòng vi khuẩn mang những đặc trưng của dòng vi khuẩn lactic: tạo vòng phân giải CaCO3, catalase âm tính, gram dương

Bước 4: Định danh cấp độ loài các dòng tuyển chọn được

Các dòng vi sinh vật tuyển chọn được, tiến hành gởi mẫu phân tích trình tự 28S rRNA và 16S rRNA tại công ty Nam Khoa Bioteck, sử dụng công cụ Blast search để xác định tên loài các dòng tuyển chọn

Bước 5: Bảo quản các dòng phân lập, tuyển chọn, định danh

Các dòng sau khi tuyển chọn và định danh cấp độ loài tiến hành bảo quản trong điều kiện đông sâu -700

Cách tiến hành:

Mẫu bánh men tiến hành nghiền mịn, cân 1 gam bánh men pha loãng trong 9 ml nước muối sinh lý vô trùng lắc đều, ta được huyền phù có độ pha loãng 10-1

Hút 1ml mẫu có độ pha loãng 10-1, cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, vortex đều ta thu được dịch có độ pha loãng 10-2, tiếp tục pha loãng mẫu bậc 10 để thu được các mẫu có độ pha loãng là 10-3,10-4, 10-5,

Trải và ủ: tiến hành hút 0.1ml dung dịch có độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa petri chứa môi trường chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật muốn phân lập Dùng que cấy trang đã khử trùng để nguội, trải đều dung dịch mẫu lên trên mặt thạch đến khi mặt thạch khô, lật ngược đĩa Petri và ủ nhiệt độ thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật

Cấy chuyền: Sau 24-48 giờ ủ, xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng riêng lẻ, dùng que cấy mốc hoặc que cấy điểm tách khuẩn lạc qua đĩa môi trường mới, ủ nhiệt độ thích hợp Ta tiến hành cấy chuyền nhiều lần đến khi đạt được giống thuần, tiến hành bảo quản trong điều kiện thạch nghiêng, đông sâu

2.4.1.2 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật trong bánh men rượu