Đánh giá hiệu quả kỹ thuật xét nghiệm nucleic acid (nat) đối với hbv, hcv và hiv ở người hiến máu tình nguyện

Khảo sát tỷ lệ dương tính của HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử kỹ thuật xét nghiệm NAT ở các mẫu thử có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học.. So

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM LÊ NHẬT MINH

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NUCLEIC ACID (NAT) ĐỐI VỚI HBV, HCV VÀ HIV Ở NGƯỜI HIẾN MÁU TÌNH NGUYỆN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số ngành: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NUCLEIC ACID (NAT) ĐỐI VỚI HBV, HCV VÀ HIV Ở NGƯỜI HIẾN MÁU TÌNH NGUYỆN

GVHD: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

HVTH: PHẠM LÊ NHẬT MINH MSHV: 7140288

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 01/2016

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

1 TS Phan Ngọc Hòa - Chủ tịch hội đồng

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh- Thư ký hội đồng

3 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng- Phản biện 1

4 TS Nguyễn Hữu Phúc- Phản biện 2

5 TS Võ Đình Lệ Tâm- Ủy viên

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn được sửa chữa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập-Tự do-Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Phạm Lê Nhật Minh MSHV: 7140288

Ngày, tháng, năm sinh: 17/12/1979 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80

I Tên đề tài

“Đánh giá hiệu quả kỹ thuật xét nghiệm Nucleic Acid (NAT) đối với HBV, HCV

và HIV ở người hiến máu tình nguyện”

II Nhiệm vụ và nội dung

1 Khảo sát tỷ lệ dương tính của HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học

2 Khảo sát tỷ lệ dương tính của HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xét nghiệm NAT) ở các mẫu thử âm tính với phương pháp huyết thanh học

3 So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm phát hiện HBV, HCV và HIV bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xét nghiệm NAT) với phương pháp huyết thanh học

III Ngày giao nhiệm vụ: 07/2015

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ:12/2015

V Cán bộ hướng dẫn: 1 PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TP HCM, ngày 15 tháng 01 năm 2016

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

TRƯỞNG KHOA

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa TP.HCM; Khoa Kỹ thuật Hóa học; Bộ môn Công nghệ sinh học và Phòng đào tạo sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập tại trường và hoàn thành luận văn

Cô PGS.TS Nguyễn Thúy Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và hoàn thành luận văn này Tôi được học cô không chỉ kiến thức, sự tâm huyết đóng góp cho sự phát triển của chuyên ngành mà còn lĩnh hội nơi cô tình yêu thương con người và lòng nhân ái cao cả

TS.DS Trần Văn Bảo, một người lãnh đạo, cũng là một người thầy đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt những năm tháng làm việc tại Bệnh viện Chợ Rẫy và luôn tận tâm hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn

Ban giám đốc Bệnh viện Chợ Rẫy, Ban giám đốc Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy, đơn vị xét nghiệm và sàng lọc máu, bộ phận tiếp nhận máu cùng tất cả các anh chị đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn đến ba mẹ, anh chị và những người thân luôn ở bên cạnh tôi, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này Xin trân trọng và biết ơn tất cả

PHẠM LÊ NHẬT MINH

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài luận văn: “Đánh giá hiệu quả kỹ thuật xét nghiệm Nucleic Acid (NAT) đối với HBV, HCV và HIV ở người hiến máu tình nguyện”

Học viên thực hiện: Phạm Lê Nhật Minh

Cán bộ hướng dẫn: 1.PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

2 TS.DS Trần Văn Bảo Thời gian thực hiện: 08/07/2015 đến 04/12/2015

Nội dung đề tài

1 Khảo sát tỷ lệ dương tính của HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học

2 Khảo sát tỷ lệ dương tính của HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xét nghiệm NAT) ở các mẫu thử có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học

3 So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm phát hiện HBV, HCV và HIV bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xét nghiệm NAT) với phương pháp huyết thanh học

Kết quả đề tài

1 Tỷ lệ dương tính của HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học

− Phát hiện 430 mẫu máu dương tính với HBV, chiếm tỷ lệ 1,58%

− Phát hiện 136 mẫu máu dương tính với HCV, chiếm tỷ lệ 0,50%

− Phát hiện 84 mẫu máu dương tính với HIV, chiếm tỷ lệ 0,31%

2 Tỷ lệ dương tính của HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử ở các mẫu âm tính với phương pháp huyết thanh học

− Phát hiện 34 mẫu máu dương tính với HBV-DNA, chiếm tỷ lệ 0,13%

− Phát hiện 1 mẫu máu dương tính với HIV-RNA, chiếm tỷ lệ 0,004%

− Chưa phát hiện mẫu máu dương tính với HCV-RNA

3 So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm HBV, HCV và HIV bằng phương pháp sinh học phân tử (xét nghiệm NAT) với phương pháp huyết thanh học

Trong 26.620 mẫu máu đã có kết quả xét nghiệm âm tính với HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học, chúng tôi phát hiện: 34 trường hợp dương tính HBV-DNA; 01 trường hợp dương tính HIV-RNA ở giai đoạn cửa sổ mà phương pháp huyết thanh học không phát hiện được Chưa phát hiện trường hợp nào dương tính với HCV-RNA

Vì vậy, triển khai kỹ thuật xét nghiệm NAT mang lại ý nghĩa to lớn trong việc rút ngắn giai đoạn cửa sổ, giúp phát hiện sớm sự hiện diện của vi rút trong máu với tải lượng rất thấp mà phương pháp huyết thanh học đang được sử dụng hiện tại không phát hiện được

SUMMARY EVALUATION ON EFFECTIVE OF NUCLEIC ACID TESTING ON SCREENING HBV,HCV, HIV FOR VOLUNTARY BLOOD DONORS

I OBJECTIVES

1 To study the positive rate of HBV, HCV and HIV tested by serology method

2 To study the positive rate of HBV-DNA, HCV-RNA and HIV-RNA tested by

nucleic acid testing with negative samples tested by serology method

3 Comparison and evaluation the results between serology method and nucleic

acid testing

II RESULTS

1 The positive rate of HBV, HCV and HIV tested by serology method

− There are 430 postive samples detected with HBV, take 1.58%

− There are 136 postive samples detected with HCV, take 0.50%

− There are 84 postive samples detected with HIV, take 0.31%

2 The positive rate of HBV-DNA, HCV-RNA and HIV-RNA tested by nucleic acid testing with negative samples by serology method

− There are 34 postive samples detected with HBV-DNA, take 0.13%

− There is 1 postive sample detected with HIV-RNA, takes 0.004%

− There is no case detected with HCV-RNA

3 Comparison and evaluation the results between serology method and nucleic acid testing

In 26,620 samples tested negative results by serology method, we detected 34 positive cases with HBV-DNA and 1 positive case with HIV-RNA in window period which serology method may be lost By shorten window period, NAT is a really effective to screening blood donor to ensure the safety on blood transfusion

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi Tất cả kết quả của nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác

Người cam đoan

PHẠM LÊ NHẬT MINH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TP.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

ALT: Alanin amino Tranferase

CMIA: Chemiluminescent microparticle immunoassay: Miễn dịch vi hạt hóa phát quang

DNA: Deoxyribonucleic acid

EDTA: Etylen Diamin Tetra Acetate

ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay: Miễn dịch gắn men

HBV: Hepatitis B Virus: Vi rút gây viêm gan siêu vi B

HCV: Hepatitis C virus: Vi rút gây viêm gan siêu vi C

HIV: Human Immunodeficiency Virus: Vi rút gây suy giảm miễn dịch mắc phải ởngười

NAT: Nucleic Acid Testing

RNA: Ribonucleic acid

US FDA: United State of Food and Drug Administration: Cơ quan quản lý thực phẩm

và dược phẩm Hoa Kỳ

WHO: World Health Organization: Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1 Cấu trúc của HIV 4

Hình 2 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HIV 5

Hình 3 Cấu trúc HBV 7

Hình 4 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HBV cấp 8

Hình 5 Cấu trúc HCV 10

Hình 6 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HCV 11

Hình 7 Xét nghiệm nhanh HBV 13

Hình 8 Kỹ thuật ngưng kết hạt trong xét nghiệm HIV 14

Hình 9 Kỹ thuật ELISA 15

Hình 10 Trình tự xét nghiệm NAT 24

Hình 11 Giá để mẫu thử 25

Hình 12 Tube S, tube K và SPU 26

Hình 13 Giá và hộp chứa sinh phẩm xét nghiệm 27

Hình 14 Máy phối trộn mẫu Hamilton STAR 27

Hình 15 Máy tách chiết và tinh sạch nucleic acid 28

Hình 16 Quy trình tách chiết nucleic acid bằng hạt từ 28

Hình 17 Máy khuếch đại và phát hiện nucleic acid 29

Hình 20 Diễn biến huyết thanh và các yếu tố có thể phát hiện được ở bệnh nhân sau nhiễm HIV 45

DANH MỤC SƠ ĐỒ -BIỂU ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 23

Biểu đồ 4-1: Phân loại người hiến máu theo giới tính 34

Biểu đồ 4-2: Phân loại người hiến máu theo độ tuổi 34

Biểu đồ 4-3: Phân loại người hiến máu theo nghề nghiệp 35

Biểu đồ 4-4: Phân loại người hiến máu theo địa phương 36

Biểu đồ 4-5 Kết quả đo của kỹ thuật xét nghiệm HIV-RNA trên mẫu lấy lần 1 45

Biểu đồ 4-6 Kết quả đo của kỹ thuật xét nghiệm HIV-RNA trên mẫu lấy lần 2 46

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3-1: Kết quả của mẫu thử hiển thị ở hệ thống quản lý dữ liệu 31

Bảng 3-2: Giới hạn phát hiện các vi rút của hệ thống xét nghiệm Cobas® TaqScreen MPX, phiên bản 2.0 của Roche 32

Bảng 4-1: Một số đặc điểm của đối tượng hiến máu 33

Bảng 4-2: Kết quả xét nghiệm HBV, HCV và HIV bằng PP Huyết thanh học 36

Bảng 4-3: Kết quả xét nghiệm dương tính HBV, HCV và HIV theo địa phương 37

Bảng 4-4: Kết quả xét nghiệm HBV-DNA 40

Bảng 4-5: Kết quả xét nghiệm các dấu ấn chẩn đoán nhiễm HBV 41

Bảng 4-6: Kết quả xét nghiệm theo dõi người cho máu để chẩn đoán nhiễm HBV 42

Bảng 4-7: Kết quả xét nghiệm HCV-RNA 43

Bảng 4-8: Kết quả xét nghiệm HIV-RNA 43

Bảng 4-9: Kết quả xét nghiệm HIV trên mẫu lấy lần 1 44

Bảng 4-10: Kết quả xét nghiệm HIV trên mẫu lấy lần 2 46

Bảng 4-11: Kết quả xét nghiệm HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA 47

Bảng 4-12: Kết quả xét nghiệm của hai phương pháp 48

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN (TIẾNG VIỆT) v

TÓM TẮT LUẬN VĂN (TIẾNG ANH) vii

LỜI CAM ĐOAN viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ xi

DANH MỤC BẢNG xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Mục tiêu cụ thể 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự cần thiết của máu và đảm bảo an toàn trong truyền máu 3

2.2 Đặc điểm sinh học của HIV, HBV và HCV 4

2.2.1 Đặc điểm sinh học của HIV 4

2.2.2 Đặc điểm sinh học của HBV 7

2.2.3 Đặc điểm sinh học của HCV 10

2.3 Các kỹ thuật xét nghiệm được áp dụng trong sàng lọc máu 12

2.3.1 Phương pháp huyết thanh học 12

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 16

2.4 Tình hình xét nghiệm NAT trên thế giới và tại Việt Nam 18

Chương 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.2 Mẫu thử, thuốc thử và trang thiết bị 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

3.3.2 Kỹ thuật xét nghiệm NAT 24

3.3.3 Xử lý kết quả nghiên cứu 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Một số đặc điểm của đối tượng hiến máu 33

4.2 Kết quả xét nghiệm HBV, HCV, HIV bằng phương pháp huyết thanh học 36

4.3 Kết quả xét nghiệm HBV-DNA, HCV-RNA, HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử (kỹ thuật xét nghiệm NAT) ở các mẫu máu âm tính với phương pháp huyết thanh học 40

4.3.1 Kết quả xét nghiệm HBV-DNA 40

4.3.2 Kết quả xét nghiệm HCV-RNA 43

4.3.3 Kết quả xét nghiệm HIV-RNA 43

4.3.4 Kết quả xét nghiệm HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA theo địa phương 47 4.4 So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm HBV, HCV và HIV bằng phương pháp sinh học phân tử (xét nghiệm NAT) với phương pháp huyết thanh học 48

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 51

5.1.1 Tỷ lệ dương tính của HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học51 5.1.2 Tỷ lệ dương tính của HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA bằng phương pháp sinh học phân tử ở các mẫu âm tính với phương pháp huyết thanh học 51

5.1.3 So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm HBV, HCV và HIV bằng phương pháp sinh học phân tử (xét nghiệm NAT) với phương pháp huyết thanh học 51

5.2 KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CỦA NGHIÊN CỨU CÁC BIỆN PHÁP NGĂN CHẶN NGOẠI NHIỄM

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Máu là một dược phẩm rất quý mà hiện nay khoa học vẫn chưa có chất nào thay thế được [4] Máu cần thiết như vậy nhưng chỉ có thể đến được từ những người hiến tặng máu Theo số liệu của Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, năm 2014 cả nước đã vận động và tiếp nhận 1.054.387 đơn vị máu, trong đó có 963.293 đơn vị máu được tiếp nhận từ người hiến máu tình nguyện, tương đương 1,17% dân số, vẫn chưa đạt được yêu cầu tối thiểu 2% [10] dân số hiến máu theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) Vì vậy, số lượng máu hiến hiện nay chưa đủ số lượng cung cấp theo nhu cầu điều trị và dự phòng thảm họa Bên cạnh đó, chất lượng của máu cũng là điều đáng quan tâm [3][10]

Tại nước ta tình hình nhiễm HIV, HCV và HBV thứ tự là 0,25%, 6,5% và 10-15% dân số [7][12][17] Như vậy, tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan tại Việt Nam khá cao, đặc biệt là viêm gan siêu vi B “Giai đoạn cửa sổ” để phát hiện nhiễm HBV khá dài, khoảng 56 ngày [25] Giai đoạn cửa sổ là thời gian từ khi vi rút xâm nhập vào cơ thể vật chủ, các dấu ấn có tác dụng chỉ điểm cho việc chẩn đoán chưa xuất hiện hoặc xuất hiện ở một tỷ lệ rất thấp mà phương pháp xét nghiệm đang được áp dụng hiện nay là phương pháp huyết thanh học không phát hiện được [6] và đây cũng là một trong những nguyên nhân làm tăng tỷ lệ lây truyền HBV trong dân số

Nhằm đảm bảo chất lượng cho các đơn vị máu, việc áp dụng các xét nghiệm sàng lọc máu được thực hiện khá sớm tại nước ta Vào năm 1973, các xét nghiệm sàng lọc máu đã bắt đầu thực hiện tại nước ta để phát hiện kháng nguyên Australia bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Xét nghiệm HBsAg và anti-HIV được thực hiện

từ năm 1987 bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) và năm 1990 bắt đầu thực hiện xét nghiệm sàng lọc viêm gan siêu vi C [12][17] Khoa học ngày càng phát triển, các kỹ thuật xét nghiệm ứng dụng trong sàng lọc máu ngày càng được cải thiện về độ nhạy và độ đặc hiệu để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gây bệnh trong mẫu thử Hiện nay, đa số các cơ sở truyền máu sử dụng các phương pháp huyết thanh học để sàng lọc máu, bao gồm xét nghiệm nhanh, kỹ thuật ngưng kết, kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), hoặc miễn dịch vi hạt hóa phát quang (CMIA) [1] Bên cạnh một số ưu điểm như dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, chí phí xét nghiệm thấp thì vẫn còn hạn chế

là chưa phát hiện được sự hiện diện của vi rút ở “giai đoạn cửa sổ” Với phương pháp huyết thanh học, giai đoạn cửa sổ của HIV là 22 ngày, HBV 56 ngày và HCV 66 ngày

[25] Trong giai đoạn cửa sổ này, có thể sẽ không phát hiện được sự hiện diện của vi rút bằng các phương pháp huyết thanh học, nhưng nếu lấy máu này truyền cho ngưởi bệnh thì họ có khả năng sẽ bị lây nhiễm các vi rút trên

Như vậy, việc triển khai một kỹ thuật xét nghiệm để có thể phát hiện sớm sự hiện diện của vi rút, rút ngắn hơn nữa giai đoạn cửa sổ là một nhu cầu bức thiết vì sự an toàn của bệnh nhân khi truyền máu

Kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid (NAT) là kỹ thuật phát hiện chất liệu di truyền của các vi rút nên sẽ giúp phát hiện sớm sự hiện diện của các vi rút trên ở giai đoạn cửa sổ [29], như phát hiện HIV chỉ còn 11 ngày, HBV còn 25 ngày và HCV là 59 ngày [25] Từ đó, sẽ mang lại sự an toàn cho bệnh nhân khi truyền máu

Hiện nay tại Việt Nam, việc áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT trong xét nghiệm các bệnh lây truyền qua đường truyền máu như HBV, HCV, HIV mới được thực hiện tại một số trung tâm truyền máu lớn trên toàn quốc từ tháng 01/2015 [2] Do vậy, vẫn còn rất ít đề tài nghiên cứu về việc áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT trong sàng lọc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu cũng như đánh giá về tính hiệu quả của kỹ thuật này đối với An toàn trong truyền máu Vì vậy, tôi đã chọn thực hiện đề tài

“Đánh giá hiệu quả kỹ thuật xét nghiệm Nucleic Acid (NAT) đối với HBV, HCV

và HIV ở người hiến máu tình nguyện”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá hiệu quả kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid đối với HBV, HCV và HIV trong việc phát hiện sớm sự hiện diện của vi rút ở ngưởi hiến máu tình nguyện để đem lại an toàn cho bệnh nhân khi truyền máu tại Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy- Bệnh viện Chợ Rẫy

có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học

− So sánh và đánh giá kết quả xét nghiệm phát hiện HBV, HCV và HIV bằng

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sự cần thiết của máu và đảm bảo an toàn trong truyền máu

Máu là một dược phẩm quý hiếm cần thiết trong công tác điều trị bệnh Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị ngày càng gia tăng cùng với việc áp dụng những

kỹ thuật cao trong điều trị như ghép các cơ quan nội tạng, bao gồm ghép thận, gan, tim, phổi , bên cạnh đó máu còn được sử dụng để điều trị trong các bệnh lý về máu [7] Trên thế giới, mỗi năm có hơn một trăm triệu đơn vị máu được tiếp nhận để truyền cho bệnh nhân, tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng so với nhu cầu điều trị Theo thống kê có khoảng năm trăm nghìn phụ nữ ở các nước đang phát triển bị tử vong trong quá trình sinh nở, trong đó một trong những nguyên nhân gây tử vong chính là không được cung cấp máu kịp thời khi bị mất máu cấp [3] Máu rất cần thiết cho điều trị như vậy nhưng chất lượng của máu vẫn chưa được đảm bảo, vì vậy đe dọa đến công tác An toàn truyền máu

Số liệu thống kê cho thấy có khoảng mười ba triệu đơn vị máu tiếp nhận mỗi năm được truyền cho bệnh nhân mà không được thực hiện các xét nghiệm sàng lọc máu [3] Truyền máu được xem là con dao hai lưỡi Một mặt nếu cung cấp đủ máu cho bệnh nhân trong nhu cầu cấp cứu và điều trị thì bệnh nhân sẽ được cứu sống, mặt khác nếu như đơn vị máu được truyền cho bệnh nhân không được xét nghiệm sàng lọc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu thì sẽ đem các tác nhân lây bệnh có sẵn trong đơn vị máu truyền sang cho bệnh nhân Vào năm 1981, sự việc một em bé mắc bệnh Hemophilia A bị lây nhiễm HIV do truyền máu đã được Trung tâm kiểm soát bệnh tật của Mỹ ghi nhận đã gióng lên hồi chuông cảnh báo là chúng ta đều có thể bị lây nhiễm bệnh nếu truyền máu không an toàn [9]

Một số người tham gia hiến máu vẫn còn tâm lý là đi hiến máu để được kiểm tra sức khỏe hay là được xét nghiệm miễn phí [9], những người này đa phần là những người có nguy cơ cao và máu của họ có thể không an toàn cho bệnh nhân Nếu tiếp nhận máu, một mặt có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của chính người hiến máu, mặt khác gây sự lãng phí khi phải hủy bỏ máu do phát hiện bệnh khi thực hiện các xét nghiệm sàng lọc Tuy nhiên, điều lo ngại nhất là với kỹ thuật xét nghiệm hiện tại thì có thể bỏ sót sự hiện diện của vi rút trong giai đoạn cửa sổ Trong giai đoạn này, nếu lấy máu của người hiến máu truyền cho bệnh nhân thì bệnh nhân có khả năng bị lây nhiễm bệnh mặc dù kết quả xét nghiệm sàng lọc máu là âm tính

Tùy vào điều kiện địa lý, vùng dịch tễ mà mỗi quốc gia đề ra các chiến lược cũng như các chính sách quy định bắt buộc thực hiện xét nghiệm sàng lọc các tác nhân lây truyền qua đường máu cụ thể Tuy nhiên có ba loại vi rút lây truyền qua đường truyền máu mà hầu hết các quốc gia đều đưa vào trong chiến lược bắt buộc thực hiện khi sàng lọc máu, đó chính là HIV, HBV và HCV

2.2 Đặc điểm sinh học của HIV, HBV và HCV

2.2.1 Đặc điểm sinh học của HIV

2.2.1.1 Cấu trúc của HIV

Hình 1 Cấu trúc của HIV [27]

HIV được nhà bác học người Pháp tên là Luc Montagnier và cộng sự của mình phát hiện vào năm 1983 Ông và cộng sự đã chứng minh rằng HIV là tác nhân gốc gây

ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải cho người

HIV thuộc nhóm Retroviridae, họ Lentivirus, có kích thước khoảng từ 100 đến 120nm Cấu trúc của HIV gồm có 2 phần chính là phần vỏ và phần nhân Phần vỏ được cấu tạo bởi lipoprotein và các glycoprotein màng như gp41, gp120, gp160 Phần nhân bao gồm các protein có các kháng nguyên quan trọng là p18, p24 Bên cạnh đó còn có các enzyme sau:

− Reverse transcriptase: tham gia vào quá trình xúc tác cho giai đoạn sao chép ngược từ RNA của vi rút thành sợi đơn DNA, từ đó nó có thể gắn vào DNA của tế bào

Cấu trúc HIV

chủ và sau đó được chuyển vào trong nhân của tế bào chủ để thực hiện quá trình sao chép

− Protease: thực hiện việc xúc tác trong việc chọn lựa nucleotid, giúp vi rút hoàn thiện và thoát ra khỏi tế bào

− Intergrase: thực hiện việc gắn DNA của vi rút vào DNA của tế bào chủ

Chất liệu di truyền của HIV bao gồm sợi đơn RNA có khoảng mười nghìn nucleotid, có chín gen, trong đó có ba gen quan trọng là gen gap, env và pol

Hiện nay trên thế giới, người ta đã phát hiện được HIV-1 và HIV-2 HIV-1 được phát hiện vào năm 1983, được xem là phổ biến do có mặt ở khắp nơi trên thế giới và tốc độ lan truyền cũng như thời gian phát bệnh sớm hơn HIV-2 HIV-2 được phát hiện vào năm 1986, chủ yếu ở Tây Phi và Đông Phi [3][5][11]

2.2.1.2 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HIV

\

Hình 2.Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HIV [7]

Khi một người bắt đầu nhiễm HIV thì ngay lúc này sẽ bước vào thời kỳ cửa sổ kéo dài khoảng từ hai đến sáu tuần, trong thời kỳ này kháng nguyên và kháng thể của vi rút

sẽ không phát hiện được Các triệu chứng lâm sàng thường không rõ ràng, một số triệu

NAT để phát hiện trực tiếp chất liệu di truyền của vi rút vì phương pháp huyết thanh học sẽ không phát hiện được

Tiếp theo đó là kháng nguyên của vi rút (p24) sẽ bắt đầu xuất hiện trong huyết thanh Tuy nhiên, kháng nguyên của vi rút xuất hiện trong thời gian rất ngắn chỉ khoảng một đến hai tuần Giai đoạn này có thể phát hiện được bằng phương pháp huyết thanh học

Sau khi kháng nguyên xuất hiện khoảng một tuần thì bằng phương pháp huyết thanh học có thể phát hiện kháng thể HIV-IgM Kháng thể HIV-IgM sẽ giảm dần và tiếp theo đó sẽ bắt đầu xuất hiện kháng thể HIV-IgG Nồng độ kháng thể này sẽ tăng dần trong máu và tồn tại trong máu với thời gian khá dài trong nhiều năm

Khi người bệnh bước vào giai đoạn cuối và chuyển sang AIDS với các biểu hiện của hội chứng suy giảm miễn dịch thì có thể phát hiện kháng nguyên gp41 và kháng thể kháng p24 trong huyết thanh của người nhiễm bệnh [3][5][11]

2.2.1.3 Nguyên nhân và khả năng gây bệnh khi nhiễm HIV

HIV khi xâm nhập vào cơ thể sẽ tấn công vào hệ miễn dịch của cơ thể, từ đó làm giảm và rối loạn chức năng miễn dịch, tạo điều kiện cho các bệnh nhiễm trùng cơ hội tấn công cơ thể Người bệnh thường tử vong do bị nhiễm trùng cơ hội Một số con đường được xem là nguyên nhân chính lây truyền HIV như:

 Truyền qua đường tình dục

 Truyền qua đường truyền máu, chế phẩm máu khi điều trị bệnh

 Mẹ truyền cho con trong thời kỳ mang thai hoặc cho con bú [3]

Như vậy, phương pháp huyết thanh học có thể bỏ sót sự hiện diện của vi rút ở giai đoạn cửa sổ, trong giai đoạn này chỉ có thể dùng kỹ thuật xét nghiệm NAT để phát hiện chất liệu di truyền của vi rút khi vừa xâm nhập vào cơ thể

2.2.2 Đặc điểm sinh học của HBV

2.2.2.1 Cấu trúc của HBV

Hình 3 Cấu trúc HBV [44]

HBV được nhà bác học Dane và cộng sự của mình phân lập vào năm 1970 HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có kích thước khoảng từ 40 đến 42nm Khi phân tích cấu trúc của vi rút, ta thấy có các thành phần như sau:

Phần vỏ của vi rút bao gồm lớp đôi lipoprotein chứa ba loại protein quan trọng, được xem là thành phần cơ bản của kháng nguyên bề mặt HBV:

− Protein nhỏ: có 226 acid amin Đây là Protein có tỷ lệ cao nhất và tham gia vào việc quyết định kháng nguyên bề mặt HBV

− Protein trung bình: có 281 acid amin, có tính miễn dịch cao và được xem là có khả năng là thụ thể để vi rút tiếp cận và tấn công vào tế bào gan

− Protein lớn: có từ 389 đến 400 acid amin, đây là protein có tính trọng yếu trong việc quyết định kháng nguyên bề mặt HBV và được xem là có vai trò trong việc phối

Lõi

Phần nhân: có 183 acid amin, được phân tích là mang đặc trưng của kháng nguyên lõi (HBcAg), đây là kháng nguyên được xem là có liên quan đến việc nhân lên của vi rút

Lớp trong cùng bao gồm: Genome của vi rút là sợi đôi HBV-DNA và các enzyme DNA polymerase và protein kinase [3][5][11]

2.2.2.2 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HBV

Hình 4 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HBV cấp [6]

Tùy theo từng bệnh nhân và cách lây truyền vi rút cũng như số lượng vi rút xâm nhập vào cơ thể vật chủ mà thời kỳ ủ bệnh diễn ra dài ngắn khác nhau, thông thường khoảng từ 45-180 ngày Người ta có thể dựa vào các dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp huyết thanh học để phát hiện nhiễm HBV trong máu người nhưng cũng phải khoảng 56 ngày sau khi bị nhiễm Tuy nhiên, bằng cách sử dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT thì có thể giúp phát hiện sớm nhiễm HBV ở giai đoạn cửa sổ ở ngày thứ 25 sau khi nhiễm [25]

Một số dấu ấn miễn dịch của nhiễm HBV là:

− HBsAg: Là kháng nguyên bề mặt HBV, xuất hiện rất sớm trong máu người và có thể tồn tại vĩnh viễn hoặc mất đi sau từ hai đến ba tháng

− Anti HBs: Kháng thể chống kháng nguyên HBs, thường xuất hiện sau khi HBsAg có mặt trong khoảng thời gian từ một đến ba tháng Sự xuất hiện của kháng thể này có ý nghĩa là ngưởi nhiễm bệnh đã hồi phục hoặc kháng thể được tạo ra do tiêm ngừa bằng vắc-xin

− HBeAg: đây là một kháng nguyên chỉ xuất hiện sau HBsAg vài ngày Việc phát hiện có sự hiện diện của HBeAg chứng tỏ bệnh nhân đang trong giai đoạn viêm gan cấp, các vi rút đang tăng lên với tần suất cao hoặc trong các trường hợp viêm gan mãn tính

− Anti-HBe: Kháng thể chống kháng nguyên HBe Sự xuất hiện của kháng thể này trong máu là dấu hiệu cho thấy vi rút đang ở giai đoạn ngơi nghỉ, khả năng lây truyền bệnh thấp

− Anti-HBc: Kháng thể chống kháng nguyên HBc, gồm hai loại là Anti-HBc IgM

và Anti-HBc IgG Anti-HBc IgM là dấu hiệu cho biết tình trạng viêm gan cấp và có thể phát hiện trong thời gian từ bốn đến sáu tuần sau khi nhiễm Anti-HBc IgG tồn tại trong nhiều năm trong máu của ngưởi nhiễm HBV [3][5][11]

2.2.2.3 Nguyên nhân và khả năng gây bệnh khi nhiễm HBV

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, mỗi năm có khoảng 2 triệu người chết có liên quan đến HBV Châu Á là khu vực có tỷ lệ nhiễm HBV khoảng 78%, chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới Số người nhiễm HBV cấp rồi chuyển thành viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan ngày một gia tăng vì khoảng 80% các trường hợp bị ung thư gan được thống kế là có liên quan đến nhiễm HBV [6]

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao của thế giới, với tỷ lệ nhiễm HBV trong dân số khoảng 10-15% [6]

Con đường lây nhiễm HBV tương tự như HIV

2.2.3 Đặc điểm sinh học của HCV

2.2.3.1 Cấu trúc HCV

Hình 5 Cấu trúc HCV [42]

HCV được nhà khoa học Houghton phân lập và xác định vào năm 1988 HCV có đường kính khoảng từ 55 đến 60nm, thuộc họ Flaviridae Cấu trúc của HCV bao gồm các phần sau:

− Lớp vỏ: bao gồm lớp lipid và protein xuyên màng

− Lớp nhân: bao gồm các protein được phosphoryl hóa, đảm nhận vai trò là điều hòa và sao chép Có hai enzyme là polymerase và replicase được xem là cần thiết cho quá trình sao chép

− Lớp trong cùng là genome của vi rút là sợi đơn RNA có khoảng 9400 acid amin

và các enzyme đóng vai trò giúp mã hóa gen để tổng hợp protein cho vi rút [3][11]

2.2.3.2 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HCV

Hình 6 Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HCV [43]

Giai đoạn chuyển đổi huyết thanh của HCV khá phức tạp, khoảng 95% người nhiễm HCV không có các biểu hiện lâm sàng rõ ràng vì vậy rất khó để xác định nhiễm HCV trong thời kỳ cửa sổ Có một yếu tố giúp bác sĩ điều trị nghĩ đến nhiễm HCV là chỉ số enzyme Alanine Amino Transferase (ALT) tăng cao do có sự phá hủy tế bào gan và làm chức năng gan bị ảnh hưởng Bằng phương pháp huyết thanh học có thể phát hiện kháng thể kháng HCV trong huyết thanh sau từ 7 đến 10 tuần nhiễm HCV Hiện nay, với kỹ thuật xét nghiệm NAT thì có thể phát hiện RNA của vi rút ở ngày thứ 59 sau khi nhiễm HCV [11][22][25]

2.2.3.3 Nguyên nhân và khả năng gây bệnh khi nhiễm HCV

Tương tự như HBV, HCV khi tấn công vào tế bào gan sẽ gây viêm gan cấp, viêm gan mạn, từ đó có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan Các triệu chứng thường xảy ra rất âm thầm và người bệnh có thể không để ý đến như chán ăn, mệt mỏi, sụt cân Khi xét nghiệm chức năng gan thì thấy men gan (ALT) tăng cao HCV được xem là tác nhân chính gây viêm gan và hiện nay vẫn chưa có thuốc chủng ngừa [22]

Con đường lây nhiễm của HCV cũng tương tự như HBV, bên cạnh đó người ta còn thống kê tỷ lệ nhiễm HCV sau khi chạy thận nhân tạo cũng ở mức khá cao (khoảng 50%) [6]

Theo tác giả Miriam J Alter tỷ lệ nhiễm HCV trung bình trên toàn thế giới là 2,2%, riêng khu vực Châu Á khoảng từ 2,0-2,9% [27]

2.3 Các kỹ thuật xét nghiệm được áp dụng trong sàng lọc máu

Tùy thuộc vào nhiều yếu tố, điều kiện đặc thù, vùng dịch tễ ví dụ như tỷ lệ nhiễm các vi rút trong quần thể dân số, chính sách phát triển, tài lực mà mỗi quốc gia có quy định về các dấu ấn phải được xét nghiệm sàng lọc trước khi truyền máu

Tại các cơ sở truyền máu ở nước ta hiện nay, các phương pháp được nêu dưới đây đang được áp dụng trong xét nghiệm sàng lọc máu:

− Phương pháp huyết thanh học

 Xét nghiệm nhanh

 Kỹ thuật ngưng kết hạt

 Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)

 Kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (CMIA)

− Phương pháp sinh học phân tử

 Kỹ thuật xét nghiệm NAT

2.3.1 Phương pháp huyết thanh học

2.3.1.1 Xét nghiệm nhanh

Thông thường xét nghiệm nhanh được thực hiện bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

Kỹ thuật này được thực hiện dựa trên nguyên tắc là kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng với tác nhân cần tìm được cố định trên que thử chuyên dụng Nếu trong huyết thanh hoặc huyết tương có kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng, sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể Phức hợp này được nhận biết và cho phản ứng bằng hai vạch có màu đỏ (một ở ô kiểm chứng và một ở ô kết quả) Hiện tượng

âm tính được nhận biết bằng việc chỉ xuất hiện duy nhất một vạch màu đỏ ở ô kiểm chứng

Xét nghiệm nhanh có ưu điểm là dễ thực hiện bởi kỹ thuật đơn giản, cho kết quả trong vòng 15 phút và thích hợp ở các phòng xét nghiệm hoặc các trung tâm y tế chưa

có điều kiện trang bị các trang thiết bị hiện đại Tuy nhiên, xét nghiệm nhanh có điểm hạn chế là độ nhạy không cao và phải được kiểm chứng bởi một kỹ thuật khác [1][36]

Hình 7 Xét nghiệm nhanh HBV (Nguồn: TTTM Chợ Rẫy) 2.3.1.2 Kỹ thuật ngưng kết hạt

Kỹ thuật ngưng kết hạt là kỹ thuật gián tiếp phát hiện sự hiện diện của vi rút dựa trên nguyên lý là kháng nguyên hoặc kháng thể kháng vi rút được gắn lên bề mặt của những hạt trơ như latex hoặc gelatin Nếu trong huyết thanh hoặc huyết tương có kháng thể kháng vi rút hoặc kháng nguyên tương ứng thì sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết mà mắt thường nhìn thấy được Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả nhanh, dễ thực hiện, sinh phẩm dễ bảo quản, không cần trang thiết bị, máy móc hiện đại Tuy nhiên, điểm hạn chế chính là phụ thuộc vào tay nghề và kinh nghiệm của kỹ thuật viên

do phải đánh giá kết quả bằng mắt thường [8][36]

Hình 8 Kỹ thuật ngưng kết hạt trong xét nghiệm HIV [39]

2.3.1.3 Kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA)

Đây là kỹ thuật được dùng rất phổ biến trong chẩn đoán và sàng lọc các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kỹ thuật này được áp dụng để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên hay kháng thể kháng vi rút Để biết được trong mẫu thử có yếu tố cần xác định thì người ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (các yếu tố đó có thể là kháng thể kháng vi rút hoặc kháng nguyên) để tạo ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần xác định Phức hợp kháng nguyên-kháng thể được phát hiện bằng phản ứng sinh màu khi cho một chất cộng hợp là kháng nguyên của vi rút có gắn enzyme đánh dấu vào phản ứng (chất cộng hợp cũng có thể là kháng thể kháng immunoglobulin người có gắn chất đánh dấu) Kỹ thuật này khá đơn giản và có thể được thực hiện ở các phòng xét nghiệm tại các tuyến cơ sở với kỹ thuật viên đã qua đào tạo [1][8][36] Hiện nay, trong quá trình áp dụng, người ta dần cải thiện kỹ thuật này cho phù hợp với nhiều mục đích sử dụng khác nhau

Hình 9 Kỹ thuật ELISA [40]

Đối với HIV:

Hiện nay, để góp phần thực hiện An toàn trong truyền máu, các sinh phẩm sử dụng

kỹ thuật ELISA trong sàng lọc HIV có thể phát hiện đồng thời kháng nguyên vi rút và

cả kháng thể kháng HIV với mục đích là giúp nhận biết sớm nhiễm HIV Theo nguyên

lý của kỹ thuật này thì kháng thể chống kháng nguyên vi rút (P24) và các kháng nguyên vi rút được cố định trên giếng nhựa sẽ kết gắn đặc hiệu với kháng nguyên của

vi rút hoặc là các kháng thể kháng HIV có trong mẫu máu Sự gắn kết này được nhận biết bằng phản ứng hiện màu sau khi cho cộng hợp gắn men và cơ chất [1][5][8] Kháng thể kháng HIV-1 bao gồm nhóm O và M, kháng thể kháng HIV-2 và kháng nguyên HIV p24 (p24 Ag)

Đối với HBV:

Trong xét nghiệm sàng lọc máu với HBV, người ta thường sử dụng các loại sinh phẩm có độ nhạy cao để phát hiện kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) vì đây được xem là dấu ấn quan trọng để chẩn đoán nhiễm HBV Thông thường khoảng 3 tuần sau khi HBV-DNA đầu tiên xuất hiện thì HBsAg hiện diện trong máu [8][36]

2.3.1.4 Kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (CMIA)

Kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay - CMIA) được áp dụng với khuyến nghị là tăng cường thêm độ nhạy trong xét nghiệm Kỹ thuật này sử dụng hoạt chất hóa phát quang làm chất đánh dấu Hoạt chất hóa phát quang không có tính chất như chất phóng xạ, chất huỳnh quang hoặc enzyme Khi kết hợp với một thuốc thử kích hoạt, chất đánh dấu hóa phát quang

sẽ tạo ra ánh sáng [36] Hoạt chất hóa phát quang sử dụng để xét nghiệm là hoạt chất dẫn xuất của Acridinium với hai nhóm chức đặc biệt đã đăng ký độc quyền là nhóm sulfopropyl và nhóm sulfonamide

Nguyên lý kỹ thuật: Kháng nguyên + Kháng thể + Chất đánh dấu huỳnh quang + Nguồn sáng huỳnh quang

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

Kỹ thuật xét nghiệm Nucleic acid (NAT)

NAT là một trong các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện các tác nhân gây bệnh Đây là kỹ thuật mới nhất hiện nay được áp dụng cho sàng lọc máu nhằm phát hiện sự hiện diện của vi rút (DNA hay RNA)trong các mẫu máu từ người hiến máu Với kỹ thuật này, một đoạn RNA/DNA đặc hiệu của vi rút được nhận biết và khuếch đại Bước khuếch đại giúp phát hiện nồng độ vi rút thấp trong mẫu nguyên thủy bởi tăng số lượng của đoạn gen đích đặc hiệu hiện diện đến một nồng độ giúp dễ dàng phát hiện Sự hiện diện của nucleic acid đặc hiệu chỉ ra sự hiện diện của chính vi rút và người hiến máu đó bị nhiễm bệnh

Kỹ thuật xét nghiệm NAT multiplex được sử dụng trong sàng lọc máu để phát hiện đồng thời DNA hay RNA từ nhiều vi rút như viêm gan B, viêm gan C, HIV-1 và 2 Với sự tiến bộ của công nghệ mới như real time PCR nhuộm đa màu, điều này không

chỉ có khả năng phát hiện đồng thời mà còn xác định ngay lập tức một hay nhiều dấu

ấn vi rút trong một mẫu thử

Kỹ thuật xét nghiệm NAT được thực hiện trên hệ thống Cobas s 201 của Roche với phản ứng phiên mã ngược - khuếch đại chuỗi (RT-Real time PCR) sẽ phát hiện đồng thời RNA của HIV-1 (nhóm M và O), HIV-2 RNA, HCV RNA, và HBV DNA Đây là một hệ thống gồm các mô-đun tự động được sử dụng trong sàng lọc máu Đầu tiên là pipettor Hamilton Microlab® STAR IVD, có vai trò hút mẫu và phối trộn mẫu tự động Tiếp theo mẫu sẽ được tách chiết acid nucleic trên Cobas Ampliprep (CAP) Sau cùng Cobas® TaqMan® (CTM) thực hiện khuếch đại và phát hiện DNA hoặc RNA của vi rút có trong mẫu Cả quá trình xét nghiệm được kiểm soát bởi hệ thống quản lý mẫu thử và sử dụng phần mềm quản lý dữ liệu để phân tích và biện luận kết quả [21][45]

Kỹ thuật xét nghiệm NAT đối với HBV, HCV và HIV được áp dụng trong xét nghiệm sàng lọc máu hay còn gọi là xét nghiệm trước truyền máu với khuyến nghị là rút ngắn giai đoạn cửa sổ do phát hiện chất liệu di truyền của vi rút (RNA hay DNA)

vì vậy đã sớm phát hiện sự hiện diện của vi rút khi mới xâm nhập vào cơ thể Đây chính là tính ưu việt của xét nghiệm này so với phương pháp huyết thanh học Phương pháp huyết thanh học nêu trên cũng có các ưu điểm như dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, không quá đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, chi phí xét nghiệm thấp…Tuy nhiên, một trong những hạn chế quan trọng của phương pháp huyết thanh học là giai đoạn cửa sổ vẫn còn dài, vì phương pháp này chủ yếu phát hiện kháng thể và/hoặc kháng nguyên của vi rút nên khi vi rút mới nhiễm vào cơ thể thì sẽ tấn công và xâm nhập vào

tế bào vật chủ, sau đó phải mất một thời gian thì các yếu tố này mới bắt đầu hiện diện trong huyết thanh với một nồng độ nhất định thì lúc đó phương pháp huyết thanh học mới phát hiện được ví dụ như thời gian cửa sổ để phát hiện HIV bằng phương pháp huyết thanh học là 22 ngày, nhưng nếu tiến hành xét nghiệm NAT thì chỉ mất 11 ngày; hoặc rút ngắn giai đoạn cửa sổ 31 ngày đối với HBV và 7 ngày với HCV khi thực hiện xét nghiệm NAT Như vậy, xét nghiệm NAT đã giúp rút ngắn đáng kể thời gian giai đoạn cửa sổ, góp phần đảm bảo an toàn cho bệnh nhân khi truyền máu so với phương pháp huyết thanh học

2.4 Tình hình xét nghiệm NAT trên thế giới và tại Việt Nam

Kỹ thuật xét nghiệm NAT đã được FDA cho phép thực hiện vào năm 1999 để phát hiện HIV-RNA và HCV-RNA tại Mỹ và hiện nay cũng đã được áp dụng tại các nước Châu Âu như Đức, Pháp, Anh… Chính nhờ áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT trong sàng lọc máu mà nguy cơ lây nhiễm HIV và HCV tại một số nước Châu Âu đã giảm xuống đáng kể [11][28][31][34]

Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả tại Viện Quốc gia về tim mạch, phổi và máu cùng nhóm nghiên cứu về NAT của Mỹ được thực hiện từ giữa năm 1999 đến

2001 trên 37.164.054 đơn vị máu đã có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học Người ta ghi nhận có 12 mẫu dương tính HIV với kỹ thuật xét nghiệm NAT (chiếm tỷ lệ 1/3.000.000 đơn vị máu) Đối với HCV, tỷ lệ dương tính với kỹ thuật xét nghiệm NAT là 1/230.000 đơn vị máu Bên cạnh đó, người ta còn thống kê được tỷ lệ dương tính của người hiến máu lần đầu cao hơn người hiến máu nhắc lại từ 3,3 đến 4,1 lần [34]

Theo dữ liệu thống kê của Viện Robert Koch- Viện thống kê và phân tích các dữ liệu dịch tể học của Đức, được đăng trên tạp chí vào ngày 01/02/2005 về nguy cơ lây nhiễm các bệnh lây qua đường truyền máu là HIV, HBV và HCV trong số những người hiến máu từ năm 2000 đến 2002, nếu như không thực hiện xét nghiệm NAT thì

tỷ lệ nhiễm HIV là 1-2/770.000; HBV là 1/230.000 và HCV là 1/670.000 đơn vị máu Ngược lại, nếu được xét nghiệm NAT thì tỷ lệ nguy cơ nhiễm các vi rút trên giảm xuống đáng kể: đối với HIV là 1/5.540.000; HBV là 1/620.000 và HCV là 1/4.400.000 Điều này có thể thấy rằng nếu áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT vào trong xét nghiệm sàng lọc máu sẽ làm giảm nguy cơ bị lây nhiễm các bệnh lây qua đường truyền máu [28]

Theo một nghiên cứu được thực hiện tại bệnh viện đa khoa Almana ở Saudi Arabia trên đối tượng là người hiến máu từ năm 2008-2012 Qua đó, ghi nhận được 13.435 mẫu thử âm tính với các xét nghiệm huyết thanh học Sau khi được thực hiện bằng kỹ thuật xét nghiệm NAT, phát hiện có 7 mẫu dương tính: 4 mẫu dương tính với HBV, 2 mẫu dương tính với HCV và 01 mẫu dương tính với HIV Sau khoảng từ 3 đến 6 tháng, người ta kiểm lại bằng phương pháp huyết thanh học với 7 người hiến máu đã cho kết quả dương tính với xét nghiệm NAT ở trên thì thấy rằng cả 7 mẫu này đều

dương tính Như vậy, kỹ thuật xét nghiệm NAT đã giúp phát hiện sớm các bệnh lây nhiễm qua đường truyền máu ở giai đoạn cửa sổ [24]

Tại các nước Châu Á như Nhật, Singapore, Malaysia, Đài Loan, Thái Lan [23][26][30][32] cũng đã áp dụng kỹ thuật này vào trong sàng lọc máu Tuy nhiên, do

tỷ lệ nhiễm viêm gan B ở khu vực Châu Á khá cao nên hầu hết các nước đều chọn hình thức là làm riêng rẽ từng mẫu chứ không gộp mẫu như các nước Châu Âu

Theo nghiên cứu của tác giả H Ohnuma và cộng sự được thực hiện tại hội Chữ thập đỏ và dịch vụ truyền máu Nhật Bản từ tháng 02 năm 2001, với hơn 6.000.000 đơn

vị máu đã có kết quả âm tính với HIV, HBV và HCV bằng phương pháp huyết thanh học, sau khi kiểm tra bằng kỹ thuật xét nghiệm NAT thì phát hiện thêm 112 mẫu dương tính với HBV, 25 mẫu dương tính với HCV và 4 mẫu dương tính với HIV [23] Thái Lan bắt đầu triển khai kỹ thuật xét nghiệm NAT trên 100% các đơn vị máu từ năm 2006 Theo một nghiên cứu của Ngân hàng máu Thái Lan được thực hiện vào năm 2007 với 242.363 mẫu thử đã có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học, sau khi xét nghiệm NAT thì phát hiện thêm 108 mẫu dương tính, trong đó 03 mẫu dương tính với HIV, 01 mẫu dương tính với HCV và 104 mẫu dương tính với HBV Như vậy qua nghiên cứu này có thể kết luận được kỹ thuật xét nghiệm NAT có thể rút ngắn giai đoạn cửa số nhiễm HIV, HBV, HCV [32]

Theo một nghiên cứu của Ngân hàng máu Malaysia được thực hiện từ năm 2008 -

2010 với tổng số mẫu thử lấy ngẫu nhiên từ người cho máu là 1.388 mẫu Các mẫu thử này chưa thực hiện xét nghiệm sàng lọc Sau khi được tiến hành xét nghiệm đồng thời bằng phương pháp huyết thanh học và kỹ thuật xét nghiệm NAT, người ta ghi nhận có

360 mẫu cho kết quả âm tính và 4 mẫu cho kết quả dương tính với cả hai phương pháp

và kỹ thuật nêu trên Riêng 24 mẫu có sự khác biệt, trong đó 05 mẫu dương tính với kỹ thuật xét nghiệm NAT và 19 mẫu dương tính với phương pháp huyết thanh học Tuy nhiên, khi tái kiểm tra khẳng định bằng phương pháp huyết thanh học thì 19 mẫu này lại cho kết quả âm tính Như vậy, qua nghiên cứu này có thể kết luận được kỹ thuật xét nghiệm NAT có thể hạn chế các trường hợp dương tính giả [30]

Tại Việt Nam, chúng ta cũng chỉ mới bắt đầu áp dụng kỹ thuật này vào trong xét nghiệm sàng lọc máu vào tháng 01/2015 tại ba trung tâm truyền máu lớn ở Hà Nội và

máu-Huyết học TP.HCM năm 2015, trong 10.349 mẫu thử có kết quả âm tính với HBV, HCV và HIV bằng phương pháp huyết thanh học, sau khi được xét nghiệm NAT thì phát hiện thêm 10 trường hợp dương tính với HBV (chiếm tỷ lệ 0,0966%) và chưa phát hiện trường hợp nào dương tính với HCV và HIV Qua đó, bước đầu có thể kết luận áp dụng kỹ thuật xét nghiệm NAT trong sàng lọc máu sẽ góp phần đảm bảo

an toàn trong truyền máu [17]

Chương 3

ĐỐI TƯỢNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

27.270 mẫu máu của người hiến máu tại Trung tâm truyền máu Chợ Rẫy từ 18/06/2015 đến 18/09/2015

3.2 Mẫu thử, thuốc thử và trang thiết bị

*Mẫu thử:

5 ml máu đông và 4ml máu chống đông EDTA của người hiến máu

*Thuốc thử và trang thiết bị

Phương pháp huyết thanh học: để phát hiện kháng nguyên, kháng thể của vi rút

HIV, HBV và HCV với hai kỹ thuật là miễn dịch gắn men (ELISA) và miễn dịch vi hạt hóa phát quang (CMIA)

 Sinh phẩm xét nghiệm HIV, HBV và HCV bằng kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA) trên hệ thống xét nghiệm miễn dịch tự động ETIMAX với các sinh phẩm đi kèm: Murex HIV Ag/Ab combination; Murex HBsAg Qualitative; Murex HCV Ag/Ab combination

 Sinh phẩm xét nghiệm HIV, HBV và HCV bằng kỹ thuật miễn dịch vi hạt hóa phát quang (CMIA) trên hệ thống xét nghiệm tự động Architect I2000SR của Abbott: Architect HIV Ag/Ab Combo; Architect HBsAg Qualitative; Architect anti-HCV

Phương pháp sinh học phân tử: để phát hiện chất liệu di truyền của vi rút (NAT):

− Bộ sinh phẩm xét nghiệm NAT multiplex phát hiện đồng thời DNA của HBV, RNA của HCV và HIV-1, HIV-2 và hệ thống phân tích tự động cobas® TaqScreen MPX, phiên bản 2.0 của Roche

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Mô tả cắt ngang, tiến cứu

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Thực hiện xét nghiệm sàng lọc kháng nguyên-kháng thể HIV, kháng nguyên bề mặt HBsAg, kháng nguyên-kháng thể HCV bằng phương pháp huyết thanh học cho mẫu máu hiến Từ đó, thống kê các trường hợp dương tính với HIV, HBV và HCV ở người cho máu khi xét nghiệm bằng phương pháp huyết thanh học

Những mẫu thử có kết quả âm tính với phương pháp huyết thanh học sẽ được xét nghiệm bằng kỹ thuật xét nghiệm NAT phát hiện đồng thời DNA của HBV, RNA của HCV và HIV-1, HIV-2