Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu nhận các chế phẩm từ trichoderma sp

Nấm Trichoderma là đối tượng được quan tâm vì khả năng đối kháng mạnh, phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh trên cây trồng và khả năng kích thích sự phát triển bộ rễ.. Hệ en

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SVTH: Nguyễn Hoàng Anh MSHV: 13310293

GVHD: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TP HỒ CHÍ MINH - 1/2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày … tháng … năm ……

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KTHH

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Hoàng Anh MSHV: 13310293

Ngày, tháng, năm sinh: 03/07/1989 Nơi sinh: Sóc Trăng

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60.42.80

I TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu nhận các chế phẩm từ

Trichoderma sp

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

1 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu bào tử và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm

bào tử nấm Trichoderma viride dưới dạng bột

2 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu enzyme cellulase thô từ chủng Trichoderma

harzianum

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/2014

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2014

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GS TS Ng yễn Thúy Hương

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi và các bạn của tôi hoàn thành tốt luận văn cao học

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thúy Hương – Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Đại Học Bách Khoa TpHCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo sát tiến trình thí nghiệm Tôi đã học được nhiều điều hay ở

cô về lòng nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm trong công việc, và cả tình yêu thương đối với mọi người

Tôi xin gởi lời cảm ơn đế các thầy cô và các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thí nghiệm tại trường

Tôi xin gởi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến mẹ và các anh trong gia đình tôi vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật chất, giúp tôi có thể an tâm thực hiện tốt các thí nghiệm trong thời gian vừa qua

Ngoài ra tôi cũng xin gởi lời cám ơn đến các anh chị lớp CH12 và 13 và các bạn sinh viên khóa 2010 đã hỗ trợ nhiệt tình, cũng như phụ giúp làm thí nghiệm, trao đổi các kinh nghiệm trong tiến trình thí nghiệm để tôi có thể hoàn thành tốt bài luận văn này

Trichoderma sp.”

- Học viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Anh

- Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

- Thời gian thực hiện: từ 20/1/2014 - 20/7/2014

Nội d ng đề tài:

Ứng dụng 1:

1 Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng T viride

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử

3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu bào tử

4 Thử nghiệm tạo chế phẩm Trichoderma dưới dạng bột

Ứng dụng 2:

1 Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng T harzianum

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu enzyme cellulase

Kết quả đề tài:

Ứng dụng 1:

1 Thời gian tối ưu để thu bào tử T viride là 3 ngày

2 Thí nghiệm đơn yếu tố để thu bào tử: saccharose 3%, NaNO3 0.36%, nhiệt độ

1 Thời gian tối ưu để thu enzyme cellulase từ T harzianum là 4 ngày

2 Thí nghiệm đơn yếu tố để thu enzyme cellulase: lactose 1.2%, D-glucose 0.4%, peptone 1.2%, (NH4)2SO4 1.0%, nhiệt độ 290C, tỷ lệ giống 0.7%, pH 5.0, độ ẩm 60%

3 Điều kiện nuôi cấy tối ưu là pH 5.25, độ ẩm 60.68%, tỷ lệ giống 0.55%, glucose 0.44%, (NH4)2SO4 0.9% Khi đó hoạt tính enzyme cực đại là 5.47 UI/g

D-FROM TRICHODERMA SP

Content subjects

Application 1:

1 Survey physiology and morphology of the fungus Trichoderma viride

2 Survey the ability to produce spores by the factors affecting

3 Optimization of culture condition for maximal number of spores

4 Production testing of Trichoderma spores in powder form

Application 2:

1 Survey physiology and morphology of the fungus Trichoderma harzianum

2 Survey the ability to produce cellulase enzyme by the factors affecting

3 Optimization of culture condition to obtain cellulase enzyme

Results

Application 1:

1 The optimal time to producing spores from T viride is 3 days

2 Single factor experiments to produce spores: saccharose 3%, NaNO3 0.36%, temperature 330C, inoculum’s size 1.0%, pH 5.0, water activity 60%, culture media thickness 1.5 cm

3 Maximum number of spores of 7.53.108cfu/g was obtained at the optimum levels

of process variables (pH 5.1, water activity 59.15%, inoculum’s size 0.98%, saccharose 3.15%)

Application 2:

1 The optimal time to producing cellulase enzyme from T harzianum is 4 days

2 Single factor experiments to produce cellulase: lactose 1.2%, D-glucose 0.4%, peptone 1.2%, (NH4)2SO4 1.0%, temperature 290C, inoculum’s size 0.7%, pH 5.0, water activity 60%

3 Maximum specific enzyme activity of 5.47 UI/g was obtained at the optimum levels of process variables (pH 5.25, water activity 60.68%, inoculum’s size 0.55%, D-glucose 0.44%, (NH4)2SO4 0.9%)

Mục lục

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC ĐỒ THỊ viii

DANH MỤC BẢNG ix

Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu chung về nấm Trichoderma 3

2.1.1 Phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm nấm Trichoderma 7

2.2. Vai trò của nấm Trichoderma trong bảo vệ thực vật 12

2.2.1 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng 12

2.2.2 Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật 15

2.3 Enzyme cellulase 26

2.3.1 Phân loại 26

2.3.2 Cấu trúc của enzyme cellulase 27

2.3.3 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 28

2.3.4 Ứng dụng của enzyme cellulase 28

2.4. Các nghiên cứu của nấm Trichoderma trong và ngoài nước 29

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ HƯƠNG HÁ 3.1 Vật liệu 33

3.2 Nội dung nghiên cứu 35

3.2.1 Sơ đồ tiến hành 35

3.2.2 Giải thích quy trình 36

3.3 Khảo sát đặc điểm sinh học 36

3.4 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng

đến khả năng sinh bào tử nhằm định hướng tạo chế phẩm bào từ Trichoderma 41

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng 41

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 42

3.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống 42

3.4.4 Ảnh hưởng của pH 42

3.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm 43

3.4.6 Ảnh hưởng của bề dày môi trường 43

3.4.7 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thu bào tử 43

3.4.8 Kiểm tra và bước đầu tạo chế phẩm bột bào tử Trichoderma 47

3.5 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase nhằm định hướng tạo chế phẩm enzyme thô 48 3.5.1 Kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô 48

3.5.2 Ảnh hưởng thời gian 48

3.5.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 48

3.5.4 Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

3.5.5 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

3.5.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

3.5.7 Ảnh hưởng pepton, (NH4)2SO4 đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

3.5.8 Ảnh hưởng D-glucose và Lactose đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 49

3.5.9 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm thu enzyme cellulase thô 49

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1.Tối ư hóa điều kiện nuôi cấy thu bào tử Trichoderma 55

4.1.1 Khảo sát một số đặc điểm của chủng giống Trichoderma viride nhằm thu bào tử 55

4.1.2 Kết quả lập đường cong sinh trưởng 56

4.1.3 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố dinh dưỡng 58

4.1.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng NaNO3 58

4.1.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng Saccharose 59

4.1.4 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, độ ẩm, pH, bề dày và tỷ lệ giống 61

4.1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 61

4.1.4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 63

4.1.4.3 Ảnh hưởng của pH 64

4.1.4.4 Ảnh hưởng của độ ẩm 65

4.1.4.5 Ảnh hưởng của bề dày môi trường 66

4.1.5 Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử 68

4.1.6 Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử 69

4.1.7 Kiểm tra và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm bột Trichoderma 74

4.2.Tối ư hóa điều kiện nuôi cấy thu enzyme cellulase 76

4.2.1 Khảo sát một số đặc điểm của chủng giống Trichoderma harzianum nhằm thu enzyme cellulase 76

4.2.2 Kết quả kiểm tra sơ bộ khả năng thủy phân CMC của enzyme thô 77

4.2.3 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố thời gian, nhiệt độ, độ ẩm, pH và tỷ lệ giống 77

4.2.3.1 Ảnh hưởng thời gian 77

4.2.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống 79

4.2.3.3 Ảnh hưởng của pH 80

4.2.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm 82

4.2.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 83

4.2.4 Khảo sát thí nghiệm tại tâm của các yếu tố dinh dưỡng 85

4.2.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng Peptone và (NH4)2SO4) 85

4.2.4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng D-glucose và Lactose 88

4.2.5 Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 91

4.2.6 Kết quả tối ưu hóa các yếu tố ảnh hướng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 92

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1.Kết luận 100 5.2.Kiến nghị 100 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 101

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

T viride: Trichoderma viride

T harzianum: Trichoderma harzianum

CCD – Central Composite Design – Mô hình cấu trúc có tâm

RSM – Response Surface Methodology – Phương pháp đáp ứng bề mặt PDA: Potato D-glucose Agar

CMC: Carboxyl Methyl Cellulose

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Nấm Trichoderma phát triển trên đĩa Petri 3

Hình 2.2: Cấu tạo nấm Trichoderma 4

Hình 2.3: Cơ chế chuyển protein mục tiêu đến mạng lưới nội chất 10

Hình 2.4: Sự tổng hợp một protein tiết và tạo các bóng vận chuyển 10

Hình 2.5: Sự chế biến qua các túi màng chứa dịch của thể Golgi 11

Hình 2.6: Con đường tiết protein ở Trichoderma 12

Hình 2.7: Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng của Trichoderma hazianum lên cây cà chua 14

Hình 2.8: Chức năng của Trichoderma và Azotobacter trong đất 15

Hình 2.9: Tổng quát các giai đoạn của quá trình ký sinh và tiêu diệt của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm bệnh Rhizoctonia 18

Hình 2.10: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus 20

Hình 2.11: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào 20

Hình 2.12: Hình ảnh của Rhizotonia solani dưới kính hiển vi sau khi Trichoderma mycoparasitic được gỡ bỏ Enzyme do Trichoderma mycoparasitic tiết ra làm thủng tế bào nấm bệnh 21

Hình 2.13: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh 21

Hình 2.14: Cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp được tiết ra từ Trichoderma 23

Hình 2.15: Ức chế sự phát triển của Pythium ultimum bởi chất kháng sinh 6PP được tiết ra từ Trichoderma hazianum 24

Hình 2.16: Nấm Trichoderma cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống với các nấm bệnh khác 26

Hình 2.17: Cấu trúc 3D của endoglucanase từ Trichoderma harzianum 27

Hình 2.18: Cơ chế hoạt động của enzyme cellulose 28

Hình 3.1: Quy trình chọn lọc giống 37

Hình 3.2: Quy trình quan sát đại thể và vi thể 38

Hình 3.3: Quy trình nhân giống cấp 1 39

Hình 3.4: Sơ đồ lên men bán rắn tạo chế phẩm bào tử Trichoderma 47

Hình 4.1: Bề dày môi trường nuôi cấy 67

Hình 4.2: Chế phẩm Trichoderma dạng bột 75

Hình 4.3: Vòng thủy phân CMC bởi enzyme thô 77

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của nấm TH1 57

Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của NaNO3 đến khả năng sinh bào tử 58

Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của Saccharose đến khả năng sinh bào tử 60

Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bào tử 61

Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh bào tử 63

Đồ thị 4.6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh bào tử 64

Đồ thị 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh bào tử 65

Đồ thị 4.8: Ảnh hưởng của bề dày môi trường đến khả năng sinh bào tử 66

Đồ thị 4.9: Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh bào tử 69

Đồ thị 4.10: Mặt đáp ứng của số lượng bào tử theo pH và độ ẩm 73

Đồ thị 4.11: Khảo sát thời gian thu enzyme 78

Đồ thị 4.12: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống 79

Đồ thị 4.13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase 81

Đồ thị 4.14: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính enzyme cellulase 82

Đồ thị 4.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 84

Đồ thị 4.16: Ảnh hưởng của hàm lượng Peptone đến hoạt tính enzyme cellulase 85

Đồ thị 4.17: Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến hoạt tính enzyme cellulase 86

Đồ thị 4.18: Ảnh hưởng của hàm lượng Lactose đến hoạt tính enzyme cellulase 88

Đồ thị 4.19: Ảnh hưởng của hàm lượng D-glucose đến hoạt tính enzyme cellulase 89

Đồ thị 4.20: Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzyme 92

Đồ thị 4.21: Mặt đáp ứng của số lượng bào tử theo tỷ lệ giống và độ ẩm 97

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma 5

Bảng 3.1: Mức khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH, độ ẩm, tỷ lệ giống, saccharose, và NaNO3 44

Bảng 3.2: Ma trận sàng lọc các yếu tố trên môi trường bán rắn thu bào tử 45

Bảng 3.3: Các mức của ma trận thực nghiệm trên môi trường bán rắn thu bào tử 45

Bảng 3.4: Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa lượng bào tử sinh ra 46

Bảng 3.5: Mức khảo sát các yếu tố nhiệt độ, thời gian, pH, tỷ lệ giống, độ ẩm, hàm lượng D-glucose, Lactose, Pepton và (NH4)2SO4 50

Bảng 3.6: Ma trận sàng lọc các yếu tố trên môi trường bán rắn thu enzyme 51

Bảng 3.7: Các mức của ma trận thực nghiệm trên môi trường bán rắn thu enzyme 51

Bảng 3.8: Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hóa thu enzyme 52

Bảng 4.1: Kết quả đường cong sinh trưởng 56

Bảng 4.2: Ảnh hưởng hàm lượng NaNO3 đến khả năng sinh bào tử 58

Bảng 4.3: Ảnh hưởng hàm lượng Saccharose đến khả năng sinh bào tử 59

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bào tử 61

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ban đầu đến khả năng sinh bào tử 63

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh bào tử 64

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh bào tử 65

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của bề dày môi trường đến khả năng sinh bào tử 66

Bảng 4.9: Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng 68

Bảng 4.10: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố 68

Bảng 4.11: Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố 70

Bảng 4.12: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ưu 71

Bảng 4.13: Tọa độ điểm tối ưu 74

Bảng 4.14: Theo dõi số lượng bào tử trước và sau khi sấy 75

Bảng 4.15: Khảo sát thời gian thu enzyme cellulase 77

Bảng 4.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hoạt tính enzyme cellulase 79

Bảng 4.17: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase 80

Bảng 4.18: Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt tính enzyme cellulase 82

Bảng 4.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 83

Bảng 4.20: Ảnh hưởng của Peptone đến hoạt tính enzyme cellulase 85

Bảng 4.21: Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hoạt tính enzyme cellulase 86

Bảng 4.22: Ảnh hưởng của Lactose đến hoạt tính enzyme cellulase 88

Bảng 4.23: Ảnh hưởng của D-glucose đến hoạt tính enzyme cellulase 88

Bảng 4.24: Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng 91

Bảng 4.25: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố 91

Bảng 4.26: Kết quả tối ưu hóa giá trị các yếu tố 93

Bảng 4.27: Mức độ ảnh hưởng và độ tin cậy của các yếu tố tối ưu 94

Bảng 4.28: Tọa độ điểm tối ưu 98

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm Trichoderma hiện diện khắp nơi trên toàn thế giới Tiềm năng của chúng được

biết đến như là một tác nhân điều khiển sinh học trên đối tượng bệnh hại cây trồng, đã

được nghiên cứu từ những năm 1930 Nấm Trichoderma là đối tượng được quan tâm vì

khả năng đối kháng mạnh, phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh trên cây trồng và khả năng kích thích sự phát triển bộ rễ Một trong những vũ khí mạnh của chúng phải kể đến khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào rất hiệu quả, tham gia trực tiếp vào quá trình phá hủy vách tế bào nấm bệnh Hệ enzyme mà chúng có khả năng sản sinh ra là chitinase, β-glucanase, cellulase có tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của nấm bệnh [25]

Những nhóm enzyme này được ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp để phòng trừ nấm bệnh và kích thích sự phát triển bộ rễ thông qua việc phân giải các hợp chất khó tan cho cây dễ hấp thu Hiện nay chúng đã và đang được nghiên cứu để tạo chế phẩm sinh

học phòng trừ các loại nấm bệnh như: Rhzoctonia, Fusarium, Pythium và Phytophthora…

Việc sử dụng chế phẩm này đạt hiệu quả cao hơn thuốc diệt nấm và duy trì lâu hơn Ngoài ra còn làm giảm rủi ro về sức khỏe, chi phí và thiệt hại từ môi trường do tập quán

sử dụng thuốc hóa học gây ra Hiện nay, đã có những nỗ lực để mở rộng sản phẩm

thương mại Trichoderma và đã được phát triển bởi các trường đại học, các viện nghiên

cứu và các công ty phân bón.v.v…

Trên thế giới và Việt Nam đã có rất nhiều những nghiên cứu về thu sinh khối và

enzyme cellulase có nguồn gốc từ Trichoderma Tuy nhiên, việc tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu và phương pháp thực hiện để thu nhận các chế phẩm từ Trichoderma thì vẫn

đang trong quá trình nghiên cứu và cần được hệ thống hóa nhằm tìm ra một quy trình chuẩn để đi vào hoạt động sản xuất trong tương lai

Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài luận văn Tối ư hóa

điều kiện nuôi cấy để thu nhận các chế phẩm từ Trichoderma sp

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện nhằm 2 mục tiêu chính:

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu bào tử và bước đầu thử nghiệm tạo chế phẩm

bào tử nấm Trichoderma viride dưới dạng bột

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu enzyme cellulase thô từ chủng Trichoderma

harzianum.

1.3 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được mục tiêu của đề tài đặt ra nội dung nghiên cứu như sau:

 Hướng ứng dụng 1:

1 Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng nấm Trichoderma viride

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh bào tử

3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm thu bào tử

4 Thử nghiệm tạo chế phẩm bào tử nấm Trichoderma dưới dạng bột

 Hướng ứng dụng 2:

1 Khảo sát đặc điểm sinh lý và hình thái của chủng nấm Trichoderma harzianum

2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

3 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm thu enzyme cellulase

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma

Trichoderma là loại nấm có mặt nhiều trong đất, các rễ cây, chúng có khả năng

phân hủy gỗ, các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật [29] Các chủng Trichoderma là

thành phần chính trong hệ vi sinh vật của đất, đó có thể là do khả năng trao đổi chất

phong phú và cạnh tranh tích cực của chúng Trichoderma được cho là ít liên quan đến dịch bệnh ở thực vật sống, mặc dù một nhóm của Trichoderma harzianum gây bệnh trên

nấm thương mại Năm 1996 thì Samuels đã đưa ra đánh giá toàn diện về đặc tính sinh

học của Trichoderma, kỹ thuật thu nhận được enzyme tiết ra từ Trichoderma và khả

năng kiểm soát sinh học của chúng [2]

Nấm Trichoderma sp thuộc ngành nấm Mycota, lớp nấm bất toàn (imperfect fungi) Deuteromycetes, bộ nấm bông Moniliales, học Moniliaceae, chi Trichoderma [17] Nấm

Trichoderma phát triển nhanh và sinh nhiều bào tử màu xanh lá cây

Hình 2.1: Nấm Trichoderma phát triển trên đĩa Petri [2]

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra Trichoderma có thể ký sinh trên các loại nấm

bệnh và khả năng tiết kháng sinh Năm 1932 Weinding và các cộng sự đã mô tả chi tiết

quá trình ký sinh lên nấm bệnh Rhizoctonia solani của Trichoderma, từ việc cuộn xung

quanh các sợi nấm bệnh, thâm nhập và sau đó phá hủy tế bào của nấm chủ Ông cũng đã

mô tả khả năng tiết kháng sinh để tiêu diệt hai chủng Rhizotonia và Sclerotinia và đặt

tên nó là gliotoxin Trong những năm nghiên cứu này, nhiều kết quả tương tự khác cũng

đã được báo cáo bởi các nhà bệnh lý học thực vật Ví dụ: chất kháng sinh được tiết ra từ

Trichoderma virens thể hiện sự ức chế mạnh đối với Pythium ultinum và Phytothora

[30]

Sử dụng chế phẩm Trichoderma để kiểm soát hiệu quả các bệnh gây ra trên cây

trồng đã và đang được quan tâm rất lớn, một số sản phẩm thương mại của nấm

Trichoderma được sản xuất ở các thị trường Châu Á, Châu Âu, và Hoa Kỳ để sử dụng

trên một loạt các loại cây trồng Các dạng được sử dụng hiệu quả như bào tử, sợi nấm

và bào tử vách dày (bào tử hậu) được sản xuất dưới một trong hai trạng thái rắn hoặc chất lỏng lên men [2, 27]

Năm 1998, Kubicek và Harman đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho

rằng tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau [25]

Hình 2.2: Cấu tạo nấm Trichoderma [48]

Trichoderma

atroviride

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh, đạt 8-9cm sau 14 ngày

nuôi cấy ở 20 0C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 14µm Bào tử màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục đường kính từ 4-12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt

2-hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa [6].

Trichoderma

harzianum

Đại thể: Môi trường có nhiệt độ từ 15-350C, pH: 4.7-5.7 rất thích hợp cho sự phát triển của nấm Khuẩn lạc phát triển nhanh, đường kính khoảng 9cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 200

C

Bào tử đính có hình cầu méo đến bầu dục ngắn, màu xanh lục, vách trơn láng, kích thước (2.7-3.2)x(2.5-2.8)µm

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến trong đất, nảy mầm tốt

nhất trong môi trường mùn cưa có độ ẩm khoảng 30% [3]

Trichoderma

koningii

Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính 3-5cm sau 5 ngày nuôi

cấy ở nhiệt độ 200C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3.0-4.8)x(1.9-2.8)µm

Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất mặt, nhưng ở độ sâu

120cm vẫn có sự hiện diện của loài nấm này Nấm phát triển tốt

ở nhiệt độ từ 260

C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH: 6.0 [6]

Sinh hóa: Nhiệt độ 240C và pH: 3.7-4.7 là những điều kiện

rất thuận lợi cho sự phát triển của Trichoderma hamatum và

Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai nguồn nitrogen đơn giản

và phức tạp Khi Trichoderma tăng trưởng trên nguồn

cacbonhydrate như là nguồn cacbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate [15]

2.1.2 Đặc điểm nấm Trichoderma

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma

Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất

nhằm phân tích, xác định mật độ và khu vực phân bố của chúng [3]

Nấm Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất,

trên vỏ cây mục nát Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Khi quan sát hạch nấm hay chồi

mầm của nhiều loại nấm khác cũng có thể tìm thấy các loài Trichoderma Sự phân bố và điều kiện môi trường sống của các loài Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau Nhìn chung các loài Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm [6] Đặc điểm

hình thái của nấm này là cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài Bào tử đính ở đỉnh của cành [3]

Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm

sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, mùn cưa, cám trấu hoặc trên các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%)

Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm dựa vào độ pH của đất và khả năng này mất dần đi Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của

Trichoderma làm thay đổi pH của đất, ảnh hướng đến khả năng kháng nấm sẵn có của

đất Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến

hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất do đặc tính làm thay đổi pH Độ nhạy của đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acid Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh

Thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: vi sinh vật trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau

trường đất Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9-36 tuần sau khi cấy nấm vào đất) Điều này cũng phụ thuộc vào loại nấm và thành phần thức ăn trong đất, từ đó hình thành quần thể sợi nấm Quần thể sợi nấm này có thể thiết lập và duy trì trong thời gian dài và tác động trực tiếp đến khu vực mà chúng đã phân bổ

Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây: Trichoderma được phân lập tại vùng rễ cây chính

vì thế chúng có thể dùng vào việc phòng trừ sinh học đối với bệnh ở vùng rễ cây Hiệu

quả của Trichoderma không chỉ dùng để xử lý hạt, mà còn tiếp tục thiết lập quần thể dưới vùng rễ cây sau khi xử lý hạt Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh

hệ rễ tạo các bào tử ngăn cản bệnh xâm nhiễm cây trồng Nếu Trichoderma được cấy

vào trong đất để ngăn bệnh cho cây trồng thì thường phải cấy dọc theo bề mặt rễ cây,

nhưng cách xa lá mầm Trichoderma có khả năng trong việc phòng chống bệnh thối rễ

cây, thối hạt và bệnh cây chết non

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy rằng:

 Trichoderma harzianum không thiết lập quần thể xung quanh hệ rễ cây họ đậu và

đậu Hòa Lan con Quan sát bào tử trên vùng rễ cây gồm: rễ, vỏ, hạt bị thối và lá mầm, thì số lượng bào tử trên mỗi gram đất xung quanh hệ rễ luôn luôn ít Vài bào tử được tìm thấy cách xung quanh hệ rễ cây 10cm, trên cây được xử lý hạt Ngược lại, số lượng bào tử tìm thấy nhiều trên lá nầm đậu Hòa Lan bị thối và vỏ hạt giống kể cả mẫu bệnh xung quanh rễ

 Năm 2004, G.E.Harman và cộng sự cho rằng bào tử của Trichoderma ít thiết lập

quần thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây [27]

Để giải thích cho điều này có nhiều lý do đã được đưa ra bao gồm: thiếu dinh dưỡng, sự hiện diện chất độc trong rễ cây hay sự hiện diện của chất kháng hoặc sự hiện

diện của vi sinh vật đối lập với Trichoderma [27] Ví dụ: Pseudomonas cũng là một tác

nhân phòng trừ sinh học, nhưng khi có sự hiện diện của chất sắt trong vùng rễ của cây

hay Pseudomonas sản xuất ra chất độc chuyển đổi gây ảnh hưởng đến bào tử của

Trichoderma [3].

2.1.2.2 Sự tiết protein của nấm Trichoderma

Trong tế bào nấm men và động vật, protein được tổng hợp ở ribosome do các mRNA chương trình hóa [11], các ribosome này bám trên mạng lưới nội chất nhờ các protein riboforin [8] Các polysome ở đây tổng hợp lên các protein với mục đích bài tiết

ra ngoài hoặc tham gia vào thành phần enzyme [11] Các protein này được đưa đến mạng lưới nội chất nhám bởi các hạt nhận tín hiệu và peptide tín hiệu [25]

Trình tự các bước xảy ra trong tổng hợp bài tiết như sau [11]:

1 Dịch mã mRNA bắt đầu trên ribosome tự do theo con đường thông thường

2 Khi nối dài, thứ tự tín hiệu xuất hiện từ ribosome, trước hết nó liên kết với phức ribonucleoprotein trong tế bào chất gọi là hạt nhận tín hiệu (signal recognition particle-SPR) Phức hệ này chứa 6 protein và một phân tử đơn RNA làm ngừng

sự nối dài tiếp theo cho đến khi việc gắn vào màng xảy ra

3 Phức hệ SRP-ribosome liên kết với bề mặt mạng lưới nội chất, gắn với phức hệ protein nội tại, một trong số đó gọi là protein bến đậu (protein docking-DP) SPR bị thay thế và protein mới sinh ra gắn xen vào màng, có thể xuyên qua lỗ

do protein màng khác tạo nên

4 Việc nối dài ra vẫn tiếp diễn, protein mới tổng hợp đi vào trong mạng lưới nội chất Ở giai đoạn này xảy ra việc glycosyl hóa nhờ các sợi glycosyl chuyển từ dolichol đến protein mới sinh ra trong lúc nối dài sợi

5 Trong hầu hết các trường hợp thứ tự bị tách bỏ theo con đường thủy phân protein, trước khi việc dịch mã hoàn tất

6 Khi kết thúc dịch mã các tiểu phần ribosome tách ra khỏi màng, protein hoàn chỉnh dời vào phía trong mạng lưới nội chất (hình 2.3)

Hình 2.3: Cơ chế chuyển protein mục tiêu đến mạng lưới nội chất [49]

Tại đây sự tổng hợp và tiết protein trải qua 4 bước: (1) Tổng hợp polypeptide ở ribosome và đưa polypeptide vào khoảng trong mạng lưới nội chất nhám (2) Gắn các chuỗi đường ngắn lên lên chuỗi polypeptide, tạo các glycoprotein (3) Bao bọc glycoprotein trong túi màng nhỏ, gọi là bóng vận chuyển (4) Tách rời bóng vận chuyển khỏi mạng lưới nội chất nhám và đưa bóng ra ngoại vi tế bào [1]

Bóng vận chuyển

Ch uỗi

Glycopotein được gói trong bóng vận chuyển và được đưa ra ngoài tế bào

Mạng lưới nội chất nhám

Hình 2.4: Sự tổng hợp một protein tiết và tạo các bóng vận chuyển [52]

Sau đó chúng được đưa vào túi mang và được mạng lưới chuyên chở đến phức hệ Golgi và từ đây được đóng gói và tiết ra ngoài [1]

Thể Golgi được xem như kho chứa các phân tử và là nhà máy chế biến sau cùng, cso vai trò nhận và tiếp tục chế biến các chất có nguồn gốc từ mạng lưới nội chất Hoạt động này qua các bước sau:

1 Các túi ở mặt cis (mặt nhận) dung hợp với các bóng vận chuyển từ mạng lưới nội chất

2 Các phân tử từ mạng lưới nội chất (glycoprotein) được chuyển lần lượt qua các túi màng kế tiếp nhau (nhờ sự tạo các bóng mới và sự dung hợp của bóng này với túi kế tiếp)

3 Sản phẩm sau cùng, từ sự chế biến lần lượt qua các túi màng, được bao bọc trong các bóng vận chuyển (của thể Golgi)

4 Các bóng vận chuyển chứa sản phấm hoàn thành được phóng thích từ mặt trans (mặt xuất) các sản phẩm từ bộ máy Golgi có thể xen vào màng của chính bộ máy này, hay trở thành thành phần của một bào quan khác như lysosome, hay được chuyển tới màng nguyên sinh chất để phóng thích ra khỏi tế bào (nhờ hiện tượng dung hợp)

Hình 2.6: Con đường tiết protein ở Trichoderma [25]

2.2 Vai trò của nấm Trichoderma trong bảo vệ thực vật

2.2.1 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Trichoderma có thể kết hợp với các vi khuẩn vùng rễ gây kích thích sự phát triển

của rễ Những vi sinh vật có thể hình thành trong mô liên kết và tương tác với các vi khuẩn khác trong vùng rễ, tác động và bảo vệ vùng rễ, ảnh hưởng đến sự phát triển và năng suất cây trồng [19]

Dựa vào cơ chế hoạt động của nấm Trichoderma là tiết ra enzyme làm tan vách tế

bào của các loài nấm hại, sau đó tấn công vào bên trong và tiêu diệt chúng bảo vệ cây

trồng Vì thế khi sử dụng các chế phẩm có chứa nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo

điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng

và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải các chất xơ, chitin, ligin, pectin…trong các phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng [16]

Một vài nghiên cứu gần đây cho thấy nấm Trichoderma còn có khả năng sản sinh

các chất thuộc nhóm kích thích tăng trưởng cho cây như phytohormone (indol axetic

acid (IAA), ethylene) có con đường trao đổi chất đã được xác định Chủng Trichoderma

sản sinh những phân tử giống cytokinin, zeatyl, và gibberellin GA3 hay liên quan đến GA3 gần đây cũng đã được nghiên cứu [19]

Sự tương tác giữa Trichoderma và cây chủ làm tăng sức kháng bệnh và tăng khả

năng chống chịu của cây trước môi trường xung quanh Những nghiên cứu của Harman

năm 2004, đã chỉ ra rằng xử lí cây với Trichoderma có tác dụng làm tăng sinh trưởng

của thân, rễ chống lại những điều kiện bất lợi trong quá trình sống và những thay đổi trong điều kiện dinh dưỡng của cây Ông đã chỉ ra rằng, các loại ngũ cốc như ngô trồng

trong đất có hàm lượng nitơ thấp được bổ sung với T harzianum đã đem lại kết quả tốt

với cây, làm cây xanh hơn và to hơn nhận rõ trong thời kì đầu sinh trưởng Trong giai

đoạn trưởng thành và chín, những cây đã xử lí với Trichoderma có đường kính thân lớn

hơn và tăng sản lượng hạt Trong những vùng sản xuất nơi có hàm lượng nitơ được

cung cấp đủ và không xử lí cây với T harzianum thì không có kết quả trong tăng sản

lượng hạt và hàm lượng chất xơ Tuy nhiên, lượng đạm đòi hỏi để có sản lượng cao nhất

đối với những cây xử lý với Trichoderma là thấp hơn so với những cây không được xử

lý [16]

Năm 2007, Mariola R Chacón đã thực hiện một thí nghiệm phân tích sự phát triển

và tác động của Trichoderma hazianum lên thân, lá và rễ của cây cà chua Từ đó ông cũng nghiên cứu khả năng kích thích tăng trưởng của Trichoderma hazianum lên cây cà

chua thông qua việc xác định: chiều dài rễ, số lá trên một cây, trọng lượng tươi của cây,

và diện tích lá Nhằm mục đích chứng minh Trichoderma kích thích tăng trưởng cho

cây cà chua [19] Kết quả được xác định thông qua hình sau:

Hình 2.7: Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng của Trichoderma hazianum lên cây

cà chua [19]

Từ kết quả trên ông đã đưa ra nhận xét: chủng Trichoderma hazianum có tác dụng

kích thích tăng trưởng tốt Các thí nghiệm với cây cà chua có tiêm phòng Trichoderma

hazianum thì hạt cà chua nảy mầm tốt và đồng đều, kích thước cây lớn hơn và đồng

nhất hơn, hệ thống rễ phát triển tốt hơn và dài hơn, lá phát triển tốt hơn

Điều này khẳng định nấm Trichoderma có khả năng kích thích sự phát triển và tăng

trưởng của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn

của bộ rễ so với thông thường [9]

Đối chứng Đối chứng

Ngoài ra, chúng còn có khả năng kết hợp với các loài vi khuẩn như Azotobacter để

phân cắt các hợp chất khó tan, hay xác bã thực vật và tạo nên nguồn dinh dưỡng cung cấp, bổ sung trực tiếp cho cây

Trichoderma viride có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase để phân giải các

cellulose trong phân xanh và đất, làm tăng độ mùn và chất dinh dưỡng cho đất Các

hãng trên thế giới đã sử dụng Trichoderma để sản xuất cellulase [15]

Hình 2.8: Chức năng của Trichoderma và Azotobacter trong đất [47]

2.2.2 Vai trò tiêu diệt các loài nấm gây bệnh trên thực vật

2.2.2.1 Nguyên tắc chung

Nghiên cứu về cơ chế đối kháng có ý nghĩa quan trọng bởi lẽ muốn sử dụng hiệu quả nhất những tác nhân kiểm soát bệnh thực vật, chúng ta phải hiểu những tác nhân đó làm việc như thế nào và giới hạn của chúng là gì Trên cơ sở đó, tác động có hiệu quả tới các khâu nuôi dưỡng, bảo quản và cuối cùng sử dụng những tác nhân kiểm soát sinh học sao cho có thể khai thác tốt nhất khả năng kiểm soát bệnh của chúng Nhiều nghiên

cứu từ trước tới nay đã chỉ ra rằng, Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế khác nhau trong

phòng trừ và tiêu diệt nấm bệnh như: hiện tượng kí sinh nấm, sự sản sinh kháng sinh, sự tiết những enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh, khả nămg cạnh tranh mạnh chất

Nấm Trichoderma

Azotobacter

dinh dưỡng và không gian sống [16].Những cơ chế này không tách biệt nhau, và để đối kháng với các chủng nấm bệnh thì chúng có thể kết hợp hai hay nhiều cơ chế trong suốt

quá trình ký sinh và tiêu diệt Ví dụ, sự kiểm soát Botrytis trên nho bởi Trichoderma bao

gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự ký sinh lên hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh [5]

Cả cơ chế tạo ra chất kháng nấm và cơ chế ký sinh đều có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các chất kháng sinh

và các enzyme thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng ký sinh [5]

Theo Kredics (2003), quá trình đối kháng của nấm Trichoderma với nấm bệnh chủ

yếu bằng 2 cơ chế:

- Thứ nhất: Nấm Trichoderma bao quanh và cuộn lấy nấm bệnh

- Thứ hai: Nấm Trichoderma tiết ra các loại enzyme thủy phân

Klein và Eveleigh (1998), thì cho rằng nấm Trichoderma tấn công trực tiếp bằng

cách cuộn quanh và tiết ra enzyme phân hủy chitin của nấm gây hại thành những phân

tử nhỏ dễ hấp thu, vừa tiêu diệt nấm bệnh và đồng thời giúp cây trồng tăng trưởng và phát triển tốt [6]

2.2.2.2 Cơ chế đối kháng

Nấm Trichoderma phát triển nhanh trong đất, nên chúng tăng nhanh về số lượng so

với các loài nấm gây bệnh khác [6] Chúng sẽ chiếm chỗ và phát triển nhanh trước khi các loại nấm gây bệnh xâm nhiễm vào mô cây trồng Để hiểu khái quát hơn về các cơ chế ký sinh, đối kháng của các loài nấm đối kháng được thể hiện ở một số hiện tượng sau:

- Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” ở vùng tiếp xúc giữa nấm đối kháng với nấm gây bệnh xuất hiện sự quấn chặt của sợi nấm đối kháng quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó xảy

ra hiện tượng thủy phân thành vách sợi nấm bệnh, nhờ đó mà nấm đối kháng xâm nhập vào bên trong sợi nấm, phá vỡ tế bào sợi nấm và tiêu diệt nấm gây bệnh

- Cơ chế tác động của các loài nấm đối kháng dựa trên cơ sở các loài nấm đối kháng

có khả năng sản sinh ra một số chất kháng sinh (thực chất là chất độc tố do nấm đối kháng sản sinh ra nhưng không làm tổn hại đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng và không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đối kháng ở trong đất và ở vùng rễ cây trồng, cũng như không gây hại cho con người): Gliotoxin, 6PP, Trichodermaviridin, Dermadin, Cyclosporin, Alamethicin, vv… Chất kháng sinh do nấm đối kháng sản sinh

ra có khả năng kìm hãm, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của sợi nấm, đến quá trình xâm nhiễm ký sinh trên nấm gây bệnh và có thể tiêu diệt nấm gây bệnh, bảo vệ cây trồng [12]

Ví dụ điển hình ở nấm Trichoderma hazianum

Bào tử nấm Trichoderma hazianum nảy mầm và phát triển xung quanh rễ cây

Chúng sống nhờ vào chất dinh dưỡng được tiết ra từ rễ cây, nhưng không gây ảnh hưởng ngược lại đối với cây Khi chúng phát triển nhanh, chúng có khả năng cạnh tranh

và chiếm chỗ các tác nhân gây bệnh cho cây trồng Chúng tiết ra các hợp chất (các loại enzyme và chất kháng sinh) gây ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các tác nhân gây bệnh

Bào tử nấm Trichoderma hazianum cuộn xung quanh, thâm nhập vào và giết chết

các loại nấm gây bệnh cây trồng Chúng có thể tiết enzyme phân hủy thành tế bào của nấm bệnh, làm cho vách tế bào nấm bệnh bị vỡ vụn tại những vị trí tiết enzyme và gây chết

Những hình ảnh dưới đây được chụp bằng kính hiển vi điện tử, giải thích rõ ràng

khả năng hoạt động của Trichoderma hazianum giết chết nấm bệnh Rhizoctonia bằng cả

cơ chế vật lý (xâm nhập) và hóa học (hòa tan) [51]

2) Giai đoạn ban đầu của sự phá hủy

Trichoderma hazianum tiết enzyme

5) Trichoderma hazianum sau khi rời

khỏi để lộ bề mặt ngoài một lỗ đã được

xâm nhập và tiếp tục di chuyển đến vị

trí khác

(CB) Vị trí đã bị phá hủy

(TH) Vết lằn của Trichoderma hazianum

để lại (R) Rhizotonia

6) Enzyme hoạt động tiêu diệt nấm bệnh

Rhizoctonia

Hình 2.9: Tổng quát các giai đoạn của quá trình ký sinh và tiêu diệt

của nấm Trichoderma hazianum đối với nấm bệnh Rhizoctonia [51]

a Hiện tượng “giao thoa sợi nấm”

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Năm 1932, Weidling

đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng

đó là “giao thoa sợ nấm” [3]

Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm này lên một nấm khác Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính sau: đầu tiên là

sự nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công, xuyên qua thành tế

bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh Một số chi tiết của cơ chế này ở Trichoderma đã

được nghiên cứu và làm sáng tỏ [16]

Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá trình tấn

công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh

Quan sát (hình 2.10), giai đoạn đầu tấn công chủng nấm bệnh Trong giai đoạn đầu này có thể chia làm 4 bước:

Bước 1: Nấm Trichoderma phát hiện nấm bệnh (hình 2.10.B)

Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ có tính hướng hóa chất, nó ký sinh

phân nhánh hướng về nấm bệnh đã được định trước (do những nấm này tiết ra hóa

chất) Ngoài ra, chúng có thể nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự

nhiên hay hóa học (qua trung gian là pectin trên bề mặt tế bào của nấm bệnh) [15]

Bước 2: Sợi nấm bám sát vào nấm bệnh (hình 2.10.C)

Sau khi phát hiện nấm bệnh, chúng nhanh chóng phát triển về hướng nấm bệnh và phân nhánh để tăng diện tích diện tích tiếp xúc với nấm bệnh [22]

Bước 3: Phát triển cuống bào tử và bào tử đính (hình 2.10 D+E)

Sau khi đã tiếp xúc được với nấm bệnh, chúng bắt đầu tăng sinh cuống bào tử đính

và hình thành các bào tử đính [22]

Bước 4: Tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh (hình 2.10 F+G)

Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma tạo các giác bám trên bề mặt nấm bệnh

và chẩn bị bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme

Hình 2.10: Nấm Trichoderma atroviride đối kháng với nấm gỗ Polyporus [22].

Giai đoạn 2: Giai đoạn tiết enzyme phá hủy vách tế bào

Trichoderma sản sinh ra một số enzyme phá huỷ thành tế bào nấm bệnh và cũng có

thể sinh những kháng sinh peptaibol

Hình 2.11: Trichoderma tiết enzyme chitinase phá hủy vách tế bào [53].

Kết quả của những hoạt động phối hợp nhiều nhân tố này đã tạo thành những lỗ thủng tại vị trí giác bám trên sợi nấm bệnh

Tế bào chủ

Vách tế bào

Hình 2.12: Hình ảnh của Rhizotonia solani dưới kính hiển vi sau khi Trichoderma

mycoparasitic được gỡ bỏ Enzyme do Trichoderma mycoparasitic tiết ra làm thủng tế

bào nấm bệnh [3]

Giai đoạn 3: Tấn công vào tế bào chất và tiêu diệt nấm bệnh

Các sợi nấm Trichoderma xuyên qua lỗ thủng vào khoang trong của nấm bệnh, phá

huỷ chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó [16] Sự phá hủy các chất nguyên sinh của nấm bệnh làm cho chúng bị teo lại và chết đi [3]

Hình 2.13: Nấm Trichoderma sinh trưởng trong nấm bệnh [48]

b Cơ chế tiết kháng sinh

Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký

sinh đã làm cho nấm bệnh chết Tuy nhiên, ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm

Trichoderma mà nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu giải thích là tác động

của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh [3].

Howell (1987), thấy rằng những chủng T virens đột biến mất khả năng ký sinh nhưng vẫn giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh R

solani tương đương với chủng tự nhiên Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh không là cơ

chế chính yếu trong phòng trừ sinh học một bệnh cụ thể Sự sinh kháng sinh cũng là một

trong những đặc tính quen thuộc của chi Trichoderma Nó là một trong những cơ chế

chính đối với điều khiển sinh học Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những vi sinh vật khác Khả năng sinh kháng sinh của các loài, các chủng không giống nhau, chúng gồm: Gliotoxin: chất kháng sinh này được R Weindling và O

Emerson mô tả năm 1936 do nấm T lignorum sinh ra Gần đây được xác định lại là do nấm T virens sinh ra Chất gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…) [16] Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành trong hoạt

động của chúng Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945 Viridin độc hơn rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ,

giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm Được sản xuất từ T virens [15].

Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện được hai chất kháng sinh

Trichodermin và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T koningii và T aureoviride Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên

quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,

isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T virens sinh ra [16].

Các chất trao trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt

các hợp chất hóa học Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể được phân loại như sau: (i) các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl- α –pyrone (6PP), (ii)