Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu lá thuộc chi citrus ở việt nam

Tinh dầu lá chanh và lá cam được trích ly bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và chưng cất có hỗ trợ vi sóng.. Thành phần hóa học của 10 mẫu tinh dầu được xác định bằn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

NGUYỄN PHAN HẢI ÂU

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LÁ

THUỘC CHI Citrus Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành : Công nghệ Hóa học

Mã số: 11050135

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2014

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2 :

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA…………

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN PHAN HẢI ÂU MSHV: 11050135 Ngày, tháng, năm sinh: 09/01/1988 Nơi sinh: Bến Tre Chuyên ngành: Công nghệ Hóa học Mã số : 605275

I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát thành phần hóa học của tinh dầu lá thuộc chi Citrus ở Việt

Nam

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tách tinh dầu bằng hai phương pháp: chưng cất lôi cuốn hơi nước và chưng cất có

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): Tiến sĩ Nguyễn Thị Lan Phi

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy cô phòng thí nghiệm Hóa phân tích, thầy cô Bộ môn Hữu cơ đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình

em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Lan Phi đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ, động viên em rất nhiều trong khoảng thời gian em thực hiện luận văn

Trong khoảng thời gian học tập tại trường, là khoảng thời gian quý báu mà tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức và nhiều điều bổ ích từ thầy cô và bạn bè Hơn thế nữa, khoa Kỹ thuật Hóa Học đã tạo điều kiện cho mỗi sinh viên chúng tôi được thực hiện luận văn tốt nghiệp như một sự đúc kết tất cả các kiến thức để chúng tôi nhìn lại một chặng đường dài học tập

Xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ vì luôn bên con, yêu thương, tin tưởng và ủng hộ con Em cũng muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh, chị, em, bạn bè của em, những người luôn sát cánh bên em trong thời gian qua, những người đã giúp đỡ em rất nhiều

để em hoàn thành tốt luận văn

Xin gửi lời cảm ơn đến lãnh đạo đơn vị, anh chị đồng nghiệp nơi em đang công tác, đã tạo điều kiện, hỗ trợ, san sẻ công việc với em rất nhiều trong những ngày em làm luận văn Cảm ơn các bạn sinh viên trong Đội Sinh viên tình nguyện WinBK vì đã luôn động viên, ủng hộ chị

Một lần nữa, em xin gửi đến mọi người lời cảm ơn chân thành nhất

Trân trọng!

ii

TÓM TẤT LUẬN VĂN

Cây thuộc họ Cam quýt (Citrus) được trồng rất phổ biến ở Việt Nam Tinh dầu

của cây thuộc họ này chủ yếu tập trung ở vỏ quả và lá Đề tài này tiến hành khảo sát tinh dầu lá của một số loại chanh và cam trồng phổ biến ở miền Nam Việt Nam Tinh dầu lá chanh và lá cam được trích ly bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp và chưng cất có hỗ trợ vi sóng Thành phần hóa học của 10 mẫu tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Kết quả cho thấy trong tinh dầu lá chanh hàm lượng limonene cao nhất (19,31% đến 63,98%), ngoài ra còn có β-myrcene (17,57% đến 19,55%), citral (3,58% đến 8,64%), citronellal (2,87% đến 4,09%), β-trans-ocimene (1,89% đến 5,29%), sabinene (0,96% đến 2,74%) Tinh dầu lá cam chứa chủ yếu các cấu phần sabinene (20,25% đến 22,52%), 2,6-octadienal, 3,7-dimethyl-, (Z)- (13,46%), 3-carene (15,82% đến 18,96%), ocimene (7,31% đến 10,35%), linalool (4,18%), citronellol (4,08% đến 8,84%), terpinen-4-ol (4,89% đến 7,87%) Hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu lá cam (IC50 từ 3,667 đến 16,98 mg/ml) cao hơn tinh dầu lá chanh (IC50 từ 4,599 đến 29,69 mg/ml)

iii

ABSTRACT

The essential oils obtained from leaves of orange and lime (Citrus genus) were isolated by using conventional hydrodistillation and microwave – assisted distillation methods The physical and chemical properties of the oils were identified The chemical composition was examined by gas chromatography – mass spectrometry (GC

- MS) analysis The main components of the leaf lime oils are limonene (19,31% to 63,98%), β-myrcene (17,57%, 19,55%), citral (3,58% to 8,64%), citronellal (2,87% to4,09%), β-trans-ocimene (1,89% to 5,29%), sabinene (0,96% to 2,74% ) The main components of the organe leaf oils are sabinene/thujene (19,11% to 23,47%), (+)-3-carene (9,78% to 11,26%), (Z)-β-ocimene (7,31% to 10,35%), limonene (4,89% to 6,52%), citronellol (4,08% to 8,84%), terpinen-4-ol (4,89% to 8,3%) The antioxidant property of these oils was also determined by values of IC50 And the antioxidant of organe leaf oils is stronger than lime leaf oils’

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn khoa học của cô Nguyễn Thị Lan Phi Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa được công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TPHCM không liên quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

Tp Hồ Chí Minh, ngày …… tháng …… năm 2014

Người thực hiện

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẤT LUẬN VĂN ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

Danh mục bảng biểu ix

Danh mục hình x

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu về chi Citrus 1

1.1.1 Cam 1

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật [8, 9, 10, 11, 12] 1

1.1.1.2 Một số loại cam tiêu biểu [8, 10] 1

1.1.1.3 Nguồn gốc và phân bố [6, 10, 13, 15] 3

1.1.2 Chanh [16] 3

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2.2 Một số loại chanh 4

1.1.2.2 Phân bố và sinh thái 5

1.1.2.3 Bộ phận dùng 5

1.1.2.4 Thành phần hóa học 5

1.2 Tinh dầu lá cam, chanh 6

1.2.1 Tinh dầu lá cam [20] 6

1.2.2 Tinh dầu lá chanh 7

1.2.1.1 Tính chất vật lý 7

1.2.1.2 Công dụng 7

1.3 Các phương pháp tách tinh dầu thông dụng 8

vi

1.3.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp 8

1.3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn gián tiếp 8

1.3.3 Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn 9

1.3.4 Phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng 9

1.3.5 Phương pháp cơ học 9

1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu lá thuộc chi Citrus 10

1.4.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh 10

1.4.2 Thành phần hóa học của tinh dầu lá cam 11

1.5 Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu 13

1.5.1 Vai trò chất chống oxy hóa 13

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 13

1.5.2.1 Phương pháp DPPH 14

1.5.2.2 Phương pháp ABTS 15

1.5.2.3 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxydant power) 15

1.6 Đối tượng, mục tiêu, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu 16

1.6.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 16

1.6.1.1 Đối tượng 16

1.6.1.2 Mục tiêu 16

1.6.1.3 Nhiệm vụ 16

1.6.2 Phương pháp nghiên cứu 16

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Hóa chất 18

2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 19

2.2 Tách chiết tinh dầu lá cam và chanh 19

2.2.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp 19

vii

2.2.2 Phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng 19

2.3 Phân tích thành phần tinh dầu 20

2.4 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá cam và chanh 21

2.4.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH cho từng nồng độ 21

2.4.1.1 Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ test Co/30 21

2.4.1.2 Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ test Co/300 21

2.4.1.3 Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng 21

2.4.2 Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu ( IC50) 21

2.4.2.1 Thực hiện với mẫu thử 21

2.4.2.2 Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng 22

2.4.3 Kết quả tính toán 22

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Hiệu suất tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp (CT) và có hỗ trợ vi sóng (VS) 23

3.1.1 Tinh dầu lá cam 23

3.1.2 Tinh dầu lá chanh 24

3.2 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu 25

3.2.1 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá cam 25

3.2.1 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh 29

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 38

3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cam 38

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh 40

3.4 Nhận xét chung 45

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 1 1

viii

PHỤ LỤC 2 3 PHỤ LỤC 3 8 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 1

ix

Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1 Một số thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh [18]

Bảng 2.1 Các loại lá chanh, lá cam được sử dụng trong thí nghiệm

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu (g/kg lá tươi) lá cam và khối lượng riêng

Bảng 3.2 Hàm lượng tinh dầu (g/kg lá tươi) lá chanh và khối lượng riêng

Bảng 3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu lá cam xoàn

Bảng 3.4 Thành phần hóa học của tinh dầu lá cam mật

Bảng 3.5 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh núm

Bảng 3.6 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh giấy

Bảng 3.7 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh không hạt

Bảng 3.8 Tỷ lệ thành phần hóa học của tinh dầu lá cam, lá chanh

Bảng 3.9 Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) của tinh dầu lá cam và chanh

x

Danh mục hình

Hình 1.1 Quả, lá cây cam xoàn

Hình 1.2 Cây chanh không hạt

Hình 1.3 Limonene

Hình 1.4 Pinene

Hình 1.5 Tinh dầu lá chanh trên thị trường

Hình 1.6 Thành phần hóa học tinh dầu lá cam chua [27]

Hình 1.7 Phản ứng trung hòa DPPH

Hình 3.1 Hàm lượng tinh dầu lá cam và chanh (trên cùng khối lượng lá tươi)

Hình 3.2 Thành phần hợp chất chứa oxy, Hydrocarbon trong tinh dầu lá cam và chanh Hình 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cam xoàn được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 3.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cam xoàn được tách bằng phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng

Hình 3.5 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cam mật được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuống hơi nước

Hình 3.6 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá cam mật được tách bằng phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng

Hình 3.7 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh núm được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 3.8 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh núm được tách bằng phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng

Hình 3.9 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh giấy được tách bằng

phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 3.10 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh giấy được tách bằng phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng

Hình 3.11 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá chanh không hạt được tách

bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Hình 1.1 Quả, lá cây cam xoàn

1.1.1.2 Một số loại cam tiêu biểu [8, 10]

Cam nhiều chủng loại, ở nước ta có một số loại chính như sau:

- Cam Sành: là giống lai giữa cam (Citrus sinensis) và quýt (Citrus reticulate),

dân ta quen gọi là cam, tùy vùng trồng lâu đời mà có các tên gọi sau:

2

 Cam Sành Bố Hạ: trồng ở Bố Hạ, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang Cam Sành

Bố Hạ ưa đất phù sa cổ, khí hậu mát ẩm Hiện nay vùng cam này đã bị xóa sổ

do bệnh vàng lá greening

 Cam Sành Hà Giang- Tuyên Quang-Yên Bái: là vùng cam chủ yếu của các tỉnh phía Bắc Cây cao trung bình, thích nghi rộng, năng suất cao Cam Sành thu vào dịp Tết, khối lượng quả trung bình 150-250g, ngon thơm ngọt đậm

- Cam Xã Đoài: nguồn gốc từ vùng Xã Đoài, huyện Nghi Lộc, Nghệ An Đưa

lên vùng núi cao, mã quả đẹp hơn Cây cao trung bình, tán lá hơi xòe, thích nghi rộng Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 200-250g/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 12, tháng 1 hàng năm

- Cam Valencia: nhập vào Việt Nam từ năm 1971, quả to hơn cam Hamlin,

trung bình 250g/quả Khi chin vỏ quả có màu vàng, ruột màu vàng da cam Chín muộn vào dịp tết âm lịch

- Cam Hamlin: là giống của Mỹ, được đưa vào Việt Nam từ năm 1971 thông

qua Cu Ba Hamlin là giống chin sớm vào tháng 9-10, quả mỏng vỏ, khối lượng trung bình 200g/quả, nọt đậm

- Cam Sông Con: nguồn gốc chọn từ cây gieo hạt ở Nông trường Sông Con,

Nghệ An Cây cao trung bình, tán gọn, không có gai trên cành, thích nhi rộng Năng suất trung bình, khối lượng quả trung bình 200-250g/quả, thu hoạch vào tháng 10, tháng 11 hàng năm

- Cam Bù Hà Tĩnh: là giống quý được trồng nhiều ở Nghệ An-Hà Tĩnh Cây cao

trung bình, khối lượng quả 180-220g, ngọt đậm, quả chin vào tháng 12, tháng 1 hàng năm

- Cam Vân Du: được chọn lọc từ những cây gieo hạt của giống cam Sunkit ở trại

nghiên cứu cam Vân Du (Thanh Hóa), trồng nhiều ở các nông trường vùng Thanh-Nghệ-Tĩnh trong những năm 70-80 Cây cao trung bình, tán gọn có gai trên cành, thích nghi rộng Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 180-200g/quả, ngon thơm, thu hoạch khoảng tháng 10, tháng 11

- Cam Canh: là giống quýt đường (Citrus Reticulata Blanco), được trồng nhiều

ở vùng Từ Liêm, Hà Nội và Hoài Đức-Hà Tây Hiện nay đã được trồng ở nhiều

3

nơi như Châu Giang, Hưng Yên, vẫn cho phẩm chất tốt Cây cao trung bình 3.5cm, đường kính tán 3-4m, phân cành thấp, lá không có eo, màu xanh đậm, tán cây có hình dù rộng Ra hoa tháng 2-3 Thu hoạch khoảng tháng 10 đến tháng 11

3 Cam Xòan: Cam Xoàn có nguồn gốc từ Bến Tre, được trồng nhiều và lâu đời ở

một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long Cây cam xoàn rất chắc khoẻ, cho trái sai quanh năm, vỏ mỏng và có những vòng xoáy như đồng tiền Cây sinh trưởng và phát triển mạnh, thích nghi với nhiều vùng đất cao ráo thoát nước tốt, đất không quá nhiễm phèn- mặn Cam xoàn có cơm màu vàng nhạt, vị ngọt đậm, mùi thơm, trọng lượng trung bình 250 – 300gram

1.1.1.3 Nguồn gốc và phân bố [6, 10, 13, 15]

Cam có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á, miền nam Trung Quốc, Đông Ấn, Pakistan và sau này được nhân giống, trồng rộng rãi nhiều nơi trên thế giới như California, Florida, Brazil, Tây Ban Nha, Ai Cập, Nam Phi, Bắc Phi …

Ở Việt Nam, điều kiện khí hậu đất đai rất thuận lợi cho việc phát triển các giống cam Các loại chính yếu được trồng từ Bắc vào Nam trong các vườn cây ăn trái Ở nông thôn thuộc các vùng Bố Hạ (Hà Bắc), Hòa Bình, Hà Tây, Nghệ Tĩnh, Nha Trang, Đồng Nai, các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như Tiền Giang, Bến Tre, Hậu Giang, Trà Vinh …

Cam ưa đất phù sa, nhiều mùn, thoát nước Cam được trồng bằng hạt hay chiết cành Đào hố trồng bầu rộng 60 – 80 cm, sâu 60 cm Mật độ 6 x 5m; 6 x4m hay 5 x4m Chú ý phòng trừ sâu bệnh sâu vẽ bùa, sâu đục than, nhện đỏ, nhện trắng, bệnh vàng lá, bệnh sẹo … Bộ phận dùng: nước quả, tinh dầu từ vỏ quả và hoa

- Chanh núm (Citrus limon): Quả có núm, vỏ dày, chín vàng, thơm, nhiều nước, gốc ở

miền Trung và Tây Bắc ấn Độ, vùng ít mưa khí hậu khô mát không quá lạnh, không quá nóng ẩm Chanh này được trồng nhiều ở vùng ven biển Xixin (ý), Hy Lạp, Tây Ban Nha, Nam Califonia ở các vùng này chanh núm mới có chất lượng cao

- Chanh tứ thời hay chanh không hạt (Citrus latifolia): Ra hoa và quả chanh quanh

năm Quả chanh không hạt có đường kính khoảng 6 cm, so với chanh ta (Citrus

aurantifolia) thì có kích thước lớn hơn, không hạt, cứng hơn, thân cây không có gai,

quả tạo thành chùm, vỏ mỏng, nước quả ít chua hơn và không có vị đắng như chanh ta Cây chanh không hạt trồng ở Việt Nam có thể cho năng suất quả 150–200 kg/năm

- Chanh đào: Vỏ quả vàng đỏ, ruột đỏ, vị thơm

Hình 1.2 Cây chanh không hạt

5

1.1.2.2 Phân bố và sinh thái

Cây chanh, Citrus limona Osbeck, có nguồn gốc ở miền bắc Ấn Độ và vùng tiếp

giáp với Myanma và phía bắc Malaysia Chanh được trồng ở nhiều nơi trên thế giới thuộc khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới

Ở Đông Nam Á, nước sản xuất nhiều nhât là Thái Lan (53.600 tấn/năm), Lào khoảng 8.000 tấn, Malaixia 3.000 tấn, Camphuchia 1.000 tấn và Việt Nam ước tính vài chục ngàn tấn

Cây chanh cũng như hầu hết các loài trong chi Citrus không chịu được điều kiện chịu giá rét Chúng ưa điều kiện nóng ẩm, lượng mưa hay lượng nước tưới đủ lớn mặc

dù có tán lá rộng nhưng chúng là cây thường xanh và không rụng lá theo mùa Chúng

nở hoa vào mùa xuân và tạo quả chỉ một thời gian ngắn sau đó Quả bắt đầu chính vào mùa thu hay đầu mùa đông

1.1.2.3 Bộ phận dùng

Bên cạnh nhiều lợi ích sử dụng trong đời sống hàng ngày, chanh còn được sử dụng rộng rãi trông dân gian để làm thuốc Các bộ phần trong chanh được dung làm thuốc là quả, lá và rễ với rất nhiều công dụng như cầm ho hen, chống nắng nóng …

1.1.2.4 Thành phần hóa học

- Trong quả chanh có các thành phần chính sau:

+ Tinh dầu (ở vỏ quả chiếm 0,5%, ở lá khoảng 0,09 – 0,11%)

+ Acid hữu cơ

+ Vitamin C

+ Các hợp chất flavonoid như: hesperetin, rutinosid, neohesperidin

+ Pectin

+ Tinh dầu (0,5% trong vỏ quả)

Lá có chứa tinh dầu 0,09 – 0,11%

Cụ thể trong 100g thịt quả chanh có 90% nước, protein 0.8g, chất béo 0.5g, carbohydrat 8.2g, chất xơ 0.6g, tro 5.4g, calci 33mg, phosphor 15mg, sắt 0.5mg, natri 3mg, kali 137mg, vitamin A 12mg, B1 0.5mg, B2 0.02mg, B3 0.1mg, C 52 mg

6

Tinh dầu vỏ chanh, Oleum Limettae là chất lỏng màu vàng đỏ, mùi thơm đặc biệt của chanh, vị đắng Tỉ trọng ở 15oC từ 0.857 đến 0.862 Dưới tác dụng của khí trời và ánh sáng, tinh dầu chanh sẽ để lắng một chất đặc và nhầy, tỉ trông cũng tang lên Với tinh dầu chanh Việt Nam có 28 thành phần trong đó có limonene (82%), α- và β- pinen (6%), terpinen (4,5%), alcol toàn phần (3,8%), aldehyde (citral) (0.33%)

1.2 Tinh dầu lá cam, chanh

1.2.1 Tinh dầu lá cam [20]

Tinh dầu lá cam được sản xuất chủ yếu ở Paraguay và Pháp Loại tinh dầu từ lá cây cam đắng (Citrus aurantium var amara) sản xuất ở vùng Địa Trung Hải có giá trị đặc biệt và có mặt trên thị trường với giá trị kinh tế cao nhất

Loại tinh dầu này được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nước hoa và mỹ phẩm cũng như trong thực phẩm và đồ uống như một chất gia vị, do hương thơm đáng chú ý của nó

7

1.2.2 Tinh dầu lá chanh

Tinh dầu lá chanh rất được ưa chuộng Tinh dầu lá chanh có nguồn gốc từ vùng Viễn Đông, hiện nay được sản xuất và phân phối rộng rãi trên khắp thế giới ( Pháp, Paraquay, Haiti và Bắc Phi)

Hình 1.5 Tinh dầu lá chanh trên thị trường

1.2.1.1 Tính chất vật lý

Tinh dầu lá chanh có hương thơm nhẹ, mát, có vị cay, thoảng hương thân gỗ và hoa

Tỷ trọng ở 25o

C: 0,975 – 0,985 Chỉ số khúc xạ ở 25 oC: 1.4650 – 1.4675

Góc quay cực ở 25 oC: từ 8o đến 24o

1.2.1.2 Công dụng

Tinh dầu lá chanh có tác dụng chống viêm, chống nhiễm khuẩn, cân bằng tinh thần, giúp tăng cường hệ thống tiêu hóa và khử mùi tốt

Tinh dầu lá chanh tăng cường hệ hô hấp, chống lo lắng, giảm sự hoảng loạn, lo

sợ và chứng trầm cảm, giúp giảm chứng mất ngủ, khó tiêu, táo bón và các triệu chứng đau bụng

Tinh dầu lá chanh chống khô da và nứt nẻ, tốt trong việc duy trì độ ẩm và cân bằng tuyến nhờn trên da, đặc biệt nó rất tốt trong việc điều trị mụn trứng cá Điều tiết

mồ hôi do căng thẳng gây ra

8

1.3 Các phương pháp tách tinh dầu thông dụng

1.3.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

Nguyên liệu và nước được cho vào trong cùng một thiết bị, đun sôi, hơi nước bay ra sẽ lôi cuốn theo hơi tinh dầu, sau đó làm lạnh nhưng tụ hơi, ta sẽ thu được tinh dầu sau khi phân ly tách nước

Ưu điểm:

 Thiết bị tương đối đơn giản, rẻ tiền, phù hợp với quy mô sản xuất nhỏ

Nhược điểm:

 Chất lượng tinh dầu sản phẩm không cao

 Nguyên liệu dễ bị cháy, khét, do bị thiếu nước, bị dính vào thành thiết bị

 Khó điều chỉnh các thông số kỹ thuật, thời gian chưng cất kéo dài

 Tiêu tốn nhiều năng lượng

1.3.2 Phương pháp chưng cất lôi cuốn gián tiếp

Phương pháp chưng cất gián tiếp sử dụng nồi bốc hơi riêng hoặc sử dụng chung hệ thống hơi nước từ một lò hơi chung cho các thiết bị khác

 Thiết bị gọn nhẹ, dễ chế tạo

 Nâng cao hàm lượng hoặc tách riêng từng cụm cấu tử trong hỗn hợp hơi

 Có thể tiến hành sử dụng đối với các cấu tử có nhiệt độ sôi trên 1000C

Nhược điểm:

 Chỉ dùng khi nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu cao

 Một số cầu tử có thể bị phân hủy trong quá trình chưng cất

 Không thể tách được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu

9

 Lượng tinh dầu hòa tan trong nước khá lớn và rất khó tách riêng

 Tiêu tốn một lượng nước ngưng tụ lớn

1.3.3 Phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn

Phương pháp này lợi dụng tính chất khí CO2 có thể hóa lỏng ở áp suất cao, dùng CO2 tách chiết tinh dầu ra khỏi nguyên liệu

Ưu điểm:

 Dung môi CO2 có tính chọn lựa tốt, nhất là với nhựa có trong nguyên liệu

 CO2 không có tác dụng độc hại đối với con người như loại dung môi khác

 Dễ loại và không để lại vết dung môi

 Khi loại dung môi không cần sử dụng nhiệt, vì vậy giữ được mùi thơm của tinh dầu, không sợ tinh dầu bị phân hủy

1.3.5 Phương pháp cơ học

Phương pháp này đơn giản chủ yếu dùng để tách tinh dầu trong các loại vỏ quả như cam, chanh, quýt…Trong loại nguyên liệu này, tinh dầu nằm trong những lớp tế bào mỏng trong biểu bì Khi dùng lực cơ học tác dụng vào vỏ quả, các tế bào này vỡ ra và giải phóng tinh dầu Tinh dầu khi mới ép được bị đục và dần dẫn sẽ trong trở lại Sau khi ép trong phần bã bao giờ cũng còn chứa khoảng 30-40% tinh dầu, người ta tiếp tục

 Các thành phần trong tinh dầu ít bị biến đổi

 Thiết bị nhỏ gọn và đơn giản

 Phù hợp cho quá trình nghiên cứu trên quy mô nhỏ

Nhược điểm:

 Hiệu suất thấp

 Tinh dầu bị vẫn đục, phải tinh chế lại, thường lẫn vào tinh dầu nhiều chất nhày, những mô và tạp chất khác

1.4 Thành phần hóa học của tinh dầu lá thuộc chi Citrus

1.4.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá chanh

Thành phần chính của tinh dầu chứa terpen 20,5%, alcohol 13,2%, aldehyd 26% ester 23,8%, acid 2% và citropten 2% Lá còn chứa coumarin, isopimpinellin,

bergapten

1.4.2 Thành phần hóa học của tinh dầu lá cam

Thành phần chính trong tinh dầu lá cam bao gồm geraniol, geranyl acetate, linalool, linalyl acetate, myrcene, nerol, neryl acetate, terpineol, trans ocimene

12

Hình 1.6 Thành phần hóa học tinh dầu lá cam chua [27]

13

1.5 Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu

1.5.1 Vai trò chất chống oxy hóa

Nguyên tắc chung của một chất chống oxy hóa là ức chế sự tạo thành các gốc tự

do hoặc đưa vào hệ các chất phản ứng với các gốc tự do khi chúng được tạo thành Chất chống oxy hóa có thể là thành phần tự nhiên trong thực phẩm hoặc cũng có thể thêm vào sản phẩm để làm tăng chất lượng thực phẩm bằng cách trì hoãn quá trình oxy hóa lipid mà đã thực hiện trong nhiều thế kỷ mặc dù nó không xác định về mặt hóa học Do đó, sự tổng hợp các chất chống oxy hóa như BHA, BHT và TBHQ được

sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm như là chất ức chế sự oxy hóa của lipid Tuy nhiên, một số nghiên cứu trước đây đã minh chứng rằng BHA và BHT tích lũy trong cơ thể có thể dẫn đến tổn thương gan và các chất sinh ung thư Chính vì vậy mà các hợp chất chống oxy hóa thiên nhiên chiết xuất từ các loài thảo mộc và gia vị để ứng dụng vào các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm đang thu hút

sự quan tâm trong các nghiên cứu gần đây Trong số các hợp chất tự nhiên này thì nhóm phenolic được xem là có khả năng ức chế sự tạo thành các gốc tự do bằng cách chuyển điện tử [4]

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxy hóa

Hiện nay, việc đánh giá khả năng chống oxy hóa của các chất hay hỗn hợp các chất được thực hiện bằng các phương pháp đo như: tổng hàm lượng phenolic, khả năng chống oxy hóa trong acid linoleic, khả năng khử, khả năng chelat hóa kim loại, khả năng chốngđiện tử sử dụng DPPH hay 2,2’-azino-bis(3-ethyibenzthiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS), khả năng liên hợp điện Việc chọn phương pháp để đánh giá khả năng chống oxy hóa cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Việc đo phải thật sự xảy ra tương ứng trong ứng dụng

- Đơn giản

- Phương pháp được sử dụng với điểm cuối và cơ chế hóa học xác định

- Dụng cụ và hóa chất có sẵn

14

- Có sự lặp lại giữa các lần và các ngày đo

- Thích hợp để đo các chất chống oxy hóa ưa nước và ưa dầu

1.5.2.1 Phương pháp DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-diphenyl-1-picryhydrazine (DPPH-H), có màu vàng cam Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa

Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do Phương pháp này rất hữu hiệu được dung phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định

Hình 1.7 Phản ứng trung hòa DPPH

𝜆𝑚𝑎𝑥 = 517𝑛𝑚

15

1.5.2.2 Phương pháp ABTS

Nguyên tắc: Gốc ABTS•+ có màu xanh trong khi ABTS không có màu Các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong mẫu nghiên cứu sẽ cung cấp electron để khử gốc ABTS•+ thành ABTS

Mức độ giảm độ màu của dung dịch gốc tự do ABTS•+ tỉ lệ thuận với khả năng

ức chế oxy hóa trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ hấp thu

UV – VIS Dựa trên sự giảm độ màu của dung dịch chưa gốc tự do ABTS•+ trong etanol ta có thể suy ra phần trăm ức chế sự oxy hóa Sau đó, ta sẽ dùng đường chuẩn phần trăm ức chế sự oxy hóa theo nồng độ Trolox trong etanol tinh khiết để nội suy hoạt tính chống oxy hóa của mẫu nghiên cứu

Dung dịch gốc tự do ABTS•+ trong etanol có độ hấp thu mạnh nhất ở các bước sóng 645nm, 734nm, 815nm [7]

1.5.2.3 Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxydant power)

Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hóa trong việc khử Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) ở pH thấp Khi đó độ tăng cường độ màu xanh tỉ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là FeSO4 hay BHT (butylate hydroxyl toluene)

Khi cho phức Fe3+

-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ Kết quả tính toán là mmol Fe2+/g chất khô Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện

tử rất cao Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều Fe3+

-TPTZ cùng một lúc Đây là han chế của phương pháp này

16

1.6 Đối tượng, mục tiêu, nhiệm vụ và phương pháp nghiên cứu

1.6.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Từ mục tiêu trên, nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn này là:

- Tách tinh dầu bằng hai phương pháp: chưng cất lôi cuốn hơi nước và chưng cất có hỗ trợ vi sóng

- So sánh một số thành phần chính trong mẫu tinh dầu lá cam và chanh thuộc chi

Citrus

- So sánh khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu lá cam và chanh thuộc chi

Citrus

1.6.2 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện nhiệm vụ trên cùng với việc xem xét các thiết bị hiện có trong phòng thí nghiệm, luận văn đã đề cập đến các phương pháp nghiên cứu sau:

- Phương pháp chưng cất lôi cuốn trực tiếp và chưng cất có hỗ trợ vi sóng để tách tinh

dầu lá cam và lá chanh thuộc chi Citrus

- Phân tích thành phần chính trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), từ đó so sánh thành phần tinh dầu lá các loại cam, chanh thu được từ 2 phương pháp tách chiết và đưa ra nhận xét và kiến nghị

- Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu lá bằng phương pháp DPPH, so sánh khả năng kháng oxy hóa của các mẫu tinh dầu trong cùng phương pháp và khả

17

năng kháng oxy hóa của cùng loại tinh dầu thu được từ 2 phương pháp tách chiết khác nhau, đưa ra nhận xét và kiến nghị

18

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Các loại lá chanh, lá cam được sử dụng trong thí nghiệm

1 Chanh Núm Mỹ Thạnh – Giồng Trôm

4 Cam xoàn Giồng Trôm – Bến Tre CX Citrus sinensis

5 Cam mật Giồng Trôm – Bến Tre CM Citrus sinensis

- ABTS: 2,2’-azino – bis ( 3 - ethylbenzthiazoline) – 6 – sulfonic acid

- DMSO (Dimethyl Sulfoside)

- Diethyl ether 99,8%

- Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp có hồi lưu nước

- Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp có hồi lưu nước có hỗ trợ của vi sóng

- Thiết bị vi sóng Electrolux

- Máy đo quang phổ hấp thu

- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ Agilent 7890A

2.2 Tách chiết tinh dầu lá cam và chanh

2.2.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp

Cân 500g lá , xay nhuyễn cho vào bình chưng, thêm 800ml nước cất , tiến hành trích

ly trong 4 giờ [17]

Khi nước bay hơi sẽ lôi cuốn tinh dầu, ngưng tụ hơi, bộ phận Clavenger được sử dụng

để hồi lưu nước về bình chưng, tinh dầu nhẹ hơn nước sẽ ngưng tụ lại và nằm phía trên

Sau 4 giờ, ta tiến hành tách nước, làm khan tinh dầu sau khi thu được bằng Na2SO4khan, cân và tính hiệu suất tinh dầu thu được

2.2.2 Phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng

Đối với phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng, bộ phận cung cấp nhiệt đun nước là

lò vi sóng

2.3 Phân tích thành phần tinh dầu

Sau khi thu được tinh dầu từ lá, ta tiến hành phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí – khối phổ

- Dùng pipetman hút 01 µl 1-heptanol, 02 µl chất nội chuẩn Metyl myristate cho vào ống bi nâu đồng thời cân khối lượng từng chất

- Dùng pipetman hút 250 µl tinh dầu cho vào ống bi nâu đã có sẵn chất chuẩn vừa lấy

ở trên, cân khối lượng tinh dầu

Tiến hành chạy sắc ký khí – khối phổ các mẫu đã pha nội chuẩn với máy Agilent 7890A có các điều kiện:

- Sử dụng cột mao quản HP – 5MS (5% Phenyl Metyl Siloxan, dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, bề dày lớp pha tĩnh 0,25 µm)

21

2.4 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của tinh dầu lá cam và chanh

2.4.1 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH cho từng nồng độ

2.4.1.1 Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ test Co/30

DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM

Cho 100 l dung dịch DPPH nồng độ 6 mM vào 2800 l methanol, sau đó bổ sung 100 l dung dịch mẫu

Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 517 nm

2.4.1.2 Thực hiện với mẫu thử ở nồng độ test C o /300

Pha loãng 100 l dung dịch mẫu với 900l DMSO được 1ml dung dịch mẫu có nồng độ Co/300

Tiến hành thử hoạt tính tương tự mục 2.4.1.1

2.4.1.3 Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng

Hoà tan ascorbic acid (vitamine C) trong DMSO ở nồng độ ban đầu 3mg/ml

 Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100l dung dịch DPPH nồng độ 6mM

vào 2800l methanol, sau đó bổ sung 100l dung dịch ascorbic acid nồng

độ 3mg/ml

 Mẫu trắng: Cho 100l DMSO vào 2900l methanol

Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 517 nm

2.4.2 Xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu ( IC 50 )

2.4.2.1 Thực hiện với mẫu thử

DPPH hoà tan trong dung môi methanol ở nồng độ 6mM

Hoà tan mẫu trong DMSO ở 5 nồng độ khác nhau

Cho 100l dung dịch DPPH nồng độ 6mM vào 2800l methanol, sau đó bổ sung 100l mẫu thử (thực hiện lần lượt cho từng nồng độ)

22

Dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 517 nm

Mỗi nồng độ mẫu được thử nghiệm lặp 2 lần để tính giá trị trung bình

2.4.2.2 Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng

Hoà tan ascorbic acid (vitamine C) trong DMSO ở 8 nồng độ khác nhau

 Mẫu đối chiếu (ascorbic acid): Cho 100l dung dịch DPPH nồng độ 6mM

vào 2800l methanol, sau đó bổ sung 100l dung dịch ascorbic acid

 Mẫu trắng: Cho 100l DMSO vào 2900l methanol

Cả hai dung dịch được lắc đều, thực hiện phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút, rồi đem mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng  = 517 nm

Mỗi nồng độ chất đối chiếu được thử nghiệm lặp 2 lần để tính giá trị trung bình

(1(%)

A A Q

Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử

A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu

Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu

Giá trị IC 50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần

trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng từ 5 nồng độ khác nhau)