Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray

Nhiệm vụ và nội dung:  Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của một số vùng siêu biến đổi phù hợp nhất để phát hiện các vi sinh vật gậy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng – Chủ tịch

2 TS Huỳnh Ngọc Oanh – Thư ký

3 PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Ủy viên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do- Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Bùi Khắc Hoàng Vũ MSHV: 13310322

Ngày, tháng, năm sinh: 21/01/1990 Nơi sinh: Lâm Đồng

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 420 201

I Tên đề tài:

“Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp in silico microarray”

II Nhiệm vụ và nội dung:

 Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ sự kết hợp của một

số vùng siêu biến đổi phù hợp nhất để phát hiện các vi sinh vật gậy bệnh phổ biến trong thực phẩm

 Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng biến đổi đã lựa chọn và đánh giá tác động của các vùng biến đổi này đến đồng phát hiện các vi sinh vật gây phổ biến trong thực phẩm bằng phương pháp microarray

 Thiết kế cặp mồi chung phù hợp với các vùng siêu biến đổi lựa chọn được

III Ngày giao nhiệm vụ: 07/07/2014

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 10/05/2015

V Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Tp HCM, ngày … tháng … năm 2015

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thầy của tôi – PGS

TS Nguyễn Thúy Hương, người đã không quản mọi khó khăn để hướng dẫn, giúp đỡ

và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn cũng như chương trình cao học Tôi đã học được ở cô sự yêu nghề, nhiệt huyết, tinh thần trách nhiệm cũng như sự bao dung và lòng vị tha

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học, bộ môn Công nghệ thực phẩm- Trường Đại học Bách Khoa đã động viên va giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn anh Lê Thành Điền, chị Đỗ Thị Bích Phượng, bạn Nguyễn Minh Trí – học viên cao học ngành Công nghệ sinh học khóa 2013 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẽ trong suốt quá trình học tập và làm luận văn tại trường

Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh Võ Văn Giàu – Đại học Công nghiệp thực phẩm, anh Hà Minh Luân – Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, chị Trần Thị Như Hoa – Đại học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và chia sẽ không chỉ về mặt chuyên môn mà còn về các khía cạnh khác của cuộc sống

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã luôn khích lệ, động viên tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu

và đi theo con đường mình đã chọn

loài (Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Campylobater jejuni,

Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus và Yersinia enterocolitica) Các tác nhân gây bệnh có thể phân

biệt đến mức độ dưới chi nhưng chưa đến loài bao gồm nhóm Bacillus cereus, nhóm

Campylobacter jejuni/Campylobacter coli và nhóm Yersinia pestis/Yersinia pseudotuberculosis Các tác nhân khác hoàn toàn không thể phát hiện được do mức độ

tương đồng cao giữa chúng với các vi sinh vật cùng chi và loài bao gồm các loài thuộc

Salmonella spp., Shigella spp và Vibrio parahaemolyticus Nghiên cứu này cũng xác

nhận sự kết hợp giữa các vùng biến đổi V1-V2-V3 và các vùng biến đổi V6-V7-V8 là tốt nhất trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Có 35 mẫu dò đặc hiệu được lựa chọn và 2 cặp mồi chung được thiết kế nhằm sử dụng các vùng biến đổi này vào phát hiện vi sinh vật gây chủ yếu trong thực phẩm bằng kỹ thuật microarray trên thực nghiệm

SUMMARY

To ensure food safety, detection by microarray method is one of the most trending approaches in recent years 16S ribosomal RNA gene is one of the most common genes using in identification bacteria and detection major foodborne pathogens In this research, we analyzed the effect of variable regions of 16S rRNA gene and the combination between them on simultaneous detect foodbone pathogens Specific probes and design primers were selected and designed from the suitable regions for the goal of study In the output, we confirmed that 16S ribosomal RNA could distinguish 9

pathogens to species level (including Clostridium perfringens, Clostridium botulinum,

Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Yersinia enterocolitica) The groups of

pathogens which could be differentiated to below genus level but still upper species

level were Bacillus cereus group, Campylobacter jejuni/Campylobacter coli group and

Yersinia enterolitica/ Yersinia pseudotuberculosis group Other pathogens which could

not be distinguished to genus level or species level due to high similarities with their

related organisms are Salmonella spp., Shigella spp and Vibrio parahaemolyticus This

study also shown that the combination between V1, V2 and V3 regions and between V6, V7 and V8 regions were the best options for foodborne pathogens detection Finally, 35 specific probes were chosen and 2 pairs of primers were designed for

detection and identificarion of foodborne pathogens in practical situations

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện

Các số liệu, hình ảnh và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Bùi Khắc Hoàng Vũ

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm 3

1.2 Các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm 4

1.2 4

1.2.1 Esherichia coli 4

1.2.2 Salmonella 6

1.2.3 Shigella 8

1.2.4 Campylobacter 10

1.2.5 Listeria monocytogenes 12

1.2.6 Staphylococcus aureus 13

1.2.7 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus 15

1.2.8 Clostridium botulinum và Clostridium perfringens 19

1.2.9 Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia pestis 21

1.2.10 Bacillus cereus 24

1.3 Các phương pháp chủ yếu trong kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm 26

1.3.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống 26

1.3.2 Phương pháp ELISA 26

1.3.3 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) 27

1.3.4 Phương pháp microarray 28

1.4 Tổng quan về 16S Ribosomal RNA 30

1.5 Tổng quan về các nghiên cứu liên quan 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Vật liệu 36

2.1.1 Trình tự gene 16S ribosomal RNA của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu

36

2.1.2 Các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA 36

2.1.3 Các cơ sở dữ liệu dùng trong nghiên cứu 37

2.1.4 Các phần mềm và công cụ tin sinh học sử dụng trong nghiên cứu 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.1 Sơ đồ tổng quát 41

2.2.2 Bố trí thí nghiệm 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 Trình tự 16S ribosomal RNA được sử dụng trong nghiên cứu 49

3.2 Kết quả sắp gióng cột đa trình tự và xác nhận các vùng bảo tồn, vùng biến đổi của 16S ribosomal RNA 50

3.3 Kết quả xây dựng cây sinh loài từ các vùng biến đổi và so sánh với cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA của tất cả các vi sinh vật mục tiêu 53

3.4 Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu và ảnh hưởng của các vùng biến đổi đến phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm 58

3.5 Kết quả thiết kế mồi chung 64

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Escherichia coli O157:H7 6

Hình 1.2: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Salmonella enterica 8

Hình 1.3: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Shigella flexneri 10

Hình 1.4: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Campylobacter jejuni 11

Hình 1.5: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Listeria monocytogenes 13

Hình 1.6: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Staphylococcus aureus 15

Hình 1.7: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus 18

Hình 1.8: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Clostridium botulinum và Clostridium perfringens 20

Hình 1.9: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia pestis 24

Hình 1.10: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Bacillus cereus 25

Hình 1.11: Trình tự các bước thực hiện căn bản của phương pháp microarray 29

Hình 1.12: Cây sinh loài xây dựng dựa trên so sánh trình tự 16S, thể hiện mối quan hệ giữa ba nhánh chính trong tự nhiên bao gồm Archaea, Bacteria và Eucaya 30

Hình 3.1: Vị trí các vùng biến đổi từ V1 đến V8 của 16S ribosomal RNA 53

Hình 3.2: Cây sinh loài xây dựng từ toàn bộ trình tự gene 16S rRNA của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu 55

Hình 3.3: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V1 đến V3 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu 56

Hình 3.4: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V4 đến V5 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu 57

Hình 3.5: Cây sinh loài xây dựng từ vùng V6 đến V8 của các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu 58

Hình 3.6: Vị trí SNP phân biệt Campylobacter jejuni với C.coli, C curvus và C fetus

và vị trí SNP phân biệt Vibrio vulnificus với V cholera và V parahaemolyticus 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 đến 2012 4

Bảng 2.1: Vị trí các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA dựa trên Escherichia coli O157:H7 36

Bảng 3.1: Danh sách các trình tự được tài từ GenBank được sử dụng trong nghiên cứu 49

Bảng 3.2: Vị trí các vùng bảo tồn cao của gene 16S ribosomal RNA 50

Bảng 3.3: Vị trí các vùng biến đổi của gene 16S ribosomal RNA 50

Bảng 3.3: Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V1-V3 60

Bảng 3.4: Kết quả lựa chọn mẫu dò đặc hiệu cho vùng biến đổi V6-V8 61

Bảng 3.5: Tác động của một số vùng biến đổi đến phân biệt vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng microarray 63

Bảng 3.6: Kết quả thiết kế mồi chung 65

DANH MỤC VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦU

Ô nhiễm thực phẩm hiện hiện diễn biến hết sức nghiêm trọng, đặt ra nhu cầu phải

có phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh cùng lúc nhanh, chính xác và có độ tin cậy cao

Trong những năm gần đây, sự phát triển của kỹ thuật microarray ngày càng dược quan tâm do có thể đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao với hai bước chính: (1) thực hiện phản ứng PCR với mồi chung, mồi riêng, hoặc kết hợp mồi chung với mồi riêng; (2) lai sản phẩm PCR với mẫu dò đặc hiệu cho từng chủng vi sinh vật cụ thể Điều này giúp cho

về mặt lý thuyết, có thể phát hiện cùng lúc hàng chục các vi sinh vật khác nhau Do đó

mà phương pháp này hiện nay là một trong những hướng tiếp cận chủ yếu hiện nay trong đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Một trong những yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến thành công của kỹ thuật microarray trong đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm là chọn ra trình tự phù hợp để thiết kế mồi và lựa chọn mẫu

dò đặc hiệu Trong đó, gene mã hóa cho 16S ribosomal RNA hiện nay được xem là tiêu chuẩn mới trong định danh vi sinh vật nói chung và vi sinh vật gây bệnh nói riêng

Lý do là cơ sở dữ liệu về trình tự này tương đối đầy đủ, trong khi các ứng viên khác như vùng trung gian 16S-23S tuy có mức độ biến đổi cao tuy nhiên lại quá ngắn Vùng 23S được cho là có độ đa dạng cao nhất thì thông tin về trình tự này trên các cơ sở dữ liệu vẫn chưa được đầy đù Do đó gene 16S ribosomal RNA hiện vẫn là lựa chọn tốt nhất trong việc định danh và phát hiện vi sinh vật

Tuy nhiên, các nghiên cứu liên quan hiện vẫn chưa thống nhất được về khả năng và

số lượng vi sinh vật có thể phân biệt bằng phương pháp microarray sử dụng trình tự 16S ribosomal RNA Ngoài ra, do quá trình cập nhật, thay đổi, điều chỉnh các cơ sở dữ liệu, hệ mẫu dò đặc hiệu của một số nghiên cứu trước đây không còn phù hợp nữa, và

có khả năng dẫn đến các kết quả sai nếu áp dụng vào thực tế Điều này đặt ra vần đề

cần thiết phải đánh giá lại về mặt lý thuyết khả năng của gene 16S cũng như các vùng biến đồi tiêu biểu của chúng đến đồng phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm theo FDA bằng phương pháp microarray nhằm ứng dụng vào thực

tế đạt hiệu quả cao nhất

Từ mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu :

“Đồng phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp

in silico microarray”

Nghiên cứu được tiến hành cùng với những nội dung chính sau:

 Xây dựng cây sinh loài từ toàn bộ trình tự 16S ribosomal RNA cũng như từ

sự kết hợp của một số vùng siêu biến đổi phù hợp nhất và so sánh chúng với nhau nhằm tìm ra vùng siêu biến đổi phù hợp nhất để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh mục tiêu

 Lựa chọn hệ mẫu dò đặc hiệu cho các vùng siêu biến đổi đã lựa chọn và đánh giá tác động của các vùng siêu biến đổi này đến đồng phát hiện các vi sinh vật gây bệnh thường gặp trong thực phẩm bằng phương pháp microarray

 Thiết kế cặp mồi chung phù hợp với các vùng siêu biến đổi lựa chọn được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan tình hình ngộ độc thực phẩm

Theo Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration – FDA), các tác nhân vi sinh vật gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm bao

gồm: Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., Yersinia

enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio chloerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens và Clostridium botulinum [1]

Ở Mỹ, theo thống kê của Elain Scallan et al (2011) ở Mỹ thực hiện tại Trung tâm

kiểm soát và phòng chống dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention), Aurora, Colorado thì hàng năm 31 chủng gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm gây ra 9,4 triệu ca ngộ độc, trong đó có 55,961 ca phải nhập viện và 1,351 trường hợp tử vong

Trong đó khoảng 58% ca ngộ độc gây ra bởi virus, tiếp đó là Salmonella spp (11%),

Clostridium perfringens (10%) và Campylobacter spp (9%) Trong số các ca phải

nhập viện, nguyên nhân dẫn đầu là do nhiễm Salmonella spp (35%),tiếp đến là virus (26%), Campylobacter spp (15%) và Toxoplasma gondii (8%) Trong số các ca tử vong, dẫn đầu vẫn là Salmonella spp (28%), tiếp đến là T.gondii (24%), Listerichia

monocytogenes (19%) và các loại virus (11%) [2] Trong khi đó, tại Châu Âu, theo báo

cáo của Cơ quan An toàn thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority EFSA) và Trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Châu Âu (European Centre for Disease Prevention and Control - ECDC) trong năm 2011, ghi nhận 5,648 ca ngộ

-độc gây ra chủ yếu bởi Salmonella spp., các -độc tố vi khuẩn, Campylobacter spp và

các loại virus, thực phẩm chủ yếu gây ngộ độc bao gồm trứng, thức ăn hỗn hợp và hải sản [3]

Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê đến năm 2012 của Cục An toàn thực phẩm, Bộ

Y tế, năm 2007 xảy ra nhiều nhất với tổng số 247 vụ với tổng số ca ngộ độc là 7,329;

số nhập viện là 5,584; gây tử vong 55 ca Năm 2008 giảm xuống còn 205 vụ nhưng số

ca ngộ độc, số nhập viện và số tử vong gia tăng lần lượt là 7,829; 6,526 và 62 ca, cao nhất trong cả giai đoạn Từ năm 2009 đến năm 2012, chỉ trừ năm 2010, xu hướng ngộ độc thực phẩm nhìn chung có xu hướng giảm ở cả ba khía cạnh là tổng số vụ, số ca, số nhập viện và số tử vong, điều này cho thấy nổ lực của các cơ quan có thẩm quyền cũng như ý thức của người dân ngày một tốt hơn trong những năm gần đây Tuy nhiên tình hình ngộ độc ở Việt Nam vẫn hết sức nghiêm trọng, do đó vấn đề cần đặc biệt lưu tâm

là phải đề ra được chiến lược tốt nhất để đảm bảo nguồn cung thực phẩm có chất lượng cao và đảm bảo đủ an toàn trước khi đưa ra thị trường Bên cạnh đó, khi ngộ độc thực phẩm xảy ra, cần phải có phương pháp nhanh chóng xác định chính xác tác nhân gây ngộ độc nhằm đưa ra phác đồ điều trị riêng cho từng bệnh nhận, tránh các biến chứng nghiêm trọng do ngộ độc gây ra [4]

Bảng 1.1: Tình hình ngộ độc tại Việt Nam từ năm 2007 đến năm 2012 [4]

1.2.1.1 Đặc điểm phân loại

Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, hình que (1-2µ chiều dài), hiếu khí và có

khả năng di động Một số chủng gây bệnh có khả năng chịu acid Đa phần các chủng E

coli không gây độc và nguy hiểm cho con người và động vật E coli là đối tượng vi

sinh vật chủ yếu trong nghiên cứu sinh lý học, trao đổi chất, quy luật di truyền, truyền

tín hiệu và cấu trúc chức năng của vách tế bào Triệu chứng nhiễm các chủng E.coli

gây bệnh bao gồm viêm dạ dày, viêm ruột, lỵ, hội chứng nhiễm độc urê (hemolytic uremic syndorome - HUS), hội chứng nhiễm trùng đường tiết niệu (urinary tract infection - UTI), nhiễm trùng máu, viêm phổi và viêm màng não Các ca ngộ độc gia

tăng trong các năm gần đây chủ yếu liên quan đến các chủng enterohemorrhagic E coli

chủ yếu do tiêu thụ thịt, rau quả thối

E coli thuộc họ Enterobacteriacea, thường gặp trong nhóm vi sinh vật đường ruột

của động vật máu nóng Chúng được thải vào trong môi trường thông qua phân và gây

ô nhiễm đất và nước, có thể ảnh hưởng đến rau quả nếu phân sử dụng cho tưới tiếu

không được xử lý cẩn thận Thịt cũng có thể bị nhiễm E coli do quá trình giết mổ có

tiếp xúc với phân

Lớp kháng nguyên O quyết định nhóm huyết thanh của E coli Kháng nguyên O có

chứa lipopolysaccharide (LPS), có tất cả 174 kháng nguyên O, được đánh số từ 1-181,

bỏ qua các số 31, 47, 67, 72, 93, 94 và 122 Ngoài ra còn có 53 kháng nguyên kiểu H hay kháng nguyên tiêm mao (flagellar antigens) (H1-H53) và 80 kháng nguyên kiểu K hay kháng nguyên vỏ (capsular antigen) Chủng không có tiêm mao và không có khả

năng di động E coli có thể có nhiều kiểu kết hợp kháng nguyên khác nhau, trong đó

kháng nguyên “O” giúp xác định nhóm kháng nguyên trong khi “H” giúp xác định kháng nguyên

Tuýp gây độc (virotype) hay tuýp gây bệnh (pathotype) được xác định dựa trên sự hiện diện của các yếu tố gây độc và tác động của chúng đối với tế bào hoặc mô động

vật như bám dính, xâm nhiễm và sản sinh độc tố Các chủng E coli gây độc chia làm 6 tuýp gây độc bao gồm: enterotoxigenic E coli (ETEC), enteropathogenic E coli

(EPEC), enterohemorrhagic E coli (EHEC), enteroinvasive E coli (EIEC), enteroaggregative E coli (EAEC) và diffusely adhering E coli (DAEC) [5]

1.2.1.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Perna et al (2001), genome của Escherichia coli O157:H7 dài 5,527,445bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Escherichia coli

O157:H7 dài 1,554bp., nằm ở vị trí từ 227,103 đến 228,644 [6]

Hình 1.1: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Escherichia coli O157:H7

1.2.2 Salmonella

1.2.2.1 Đặc điểm phân loại

Daniel E Salmon lần đầu tiên phân lập Salmonella từ lợn năm 1885 và đặt tên là Bacterium choleraesuis (nay là Salmonella enterica serovar Choleraesuis) Salmonella

gây ra viêm dạ dày và ruột, bệnh thương hàn và là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở cả các nước đang phát triển lẫn đã phát triển Thống kê toàn cầu đã ghi nhận

16 triệu ca nhiễm thương hàn, 1.3 tỉ ca viêm dạ dày và ruột và 3 triệu ca tử vong liên

quan đến Salmonella Riêng ở Mỹ hằng năm Salmonella gây ra 2-4 triệu ca, số tử vong

lên đến 500-1000 và gây tổn thất kinh tế vào khoảng 3 tỉ đô la

Chi Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, không sinh bào tử Salmonellae di động (trừ Salmonella Pullorum và S Gallinarum) và

có tiêm mao Salmonella là vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc, có thể phát triển trong

khoảng nhiệt độ từ 5-45oC, nhiệt độ tối thích từ 35-37oC Chúng có thể phát triển trong điều kiện pH thấp và nhạy cảm với sự gia tăng nồng độ muối trong môi trường nuôi

cấy Salmonella có dạng nhiều sợi tiêm mao trong điều kiện khắc nghiệt từ 4-8oC hoặc

từ 44oC và khi phát triển ở pH 4.4 hoặc 9.4

Salmonella có mặt trong đường ruột của chim, bò sát, rùa, côn trùng, gia súc và con

người Gia cầm là một trong những nguồn gây nhiễm Salmonella chủ yếu Khả năng nhiểm Salmonella có nguy cơ gia tăng do quá trình giết mổ không hợp vệ sinh Trứng cũng là một trong những nguốn chứa Salmonella, đặc biệt là serovar Enteritidis do vi

sinh vật này có thể xâm nhập vào buồng trứng của gà mái Sự xâm nhiễm này khiến

cho trứng bị nhiễm Salmonella trước cả khi vỏ trừng được hình thành Kết quả là, trứng được bảo quản ở nhiệt độ phòng có thể chứa nồng độ Salmonella rất cao, có thể

lên đến 1011 tế bào/ quả

Các ca ngộ độc do nhiễm Salmonella chủ yếu do tiêu thụ các sản phẩm từ động vật

như thịt, sữa, thịt gia cầm và trứng Các sản phẩm sử dụng hàng ngày như phô mai và kem cũng là một trong những nguồn gây ngộ độc Trong những năm trở lại đây, rau quả như rau diếp, cà chua, rau mầm, quả hạnh nhân cũng được ghi nhận như là một

trong những nguồn lan truyền Salmonella Quá trình canh tác cơ hữu cũng làm gia tăng nguy cơ gây nhiễm các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, trong đó có Salmonella

Salmonella được xếp nhóm dựa trên kháng nguyên O, kháng nguyên tiêm mao (H)

và kháng nguyên vỏ (Vi) Có tất cả 2,463 kiểu kháng nguyên Salmonella thuộc 2 loài:

Salmonella enterica và Salmonella bongori, trong đó S enterica chứa 2,443 kiểu

kháng nguyên và S bongori chứ 20 kiểu kháng nguyên S enterica có 6 dưới loài,

được đánh số La mã từ I đến VI bao gồm: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica) [5]

1.2.2.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Deng et al (2003), genome của Salmonella enterica

subs Enterica serovar Typhy dài 4,791,96bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của

Salmonella enterica dài 1,534bp., nằm ở vị trí từ 287,477đến 289,010 [7]

Hình 1.2: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Salmonella enterica

1.2.3 Shigella

1.2.3.1 Đặc điểm phân loại

Shigella lần đầu được phát hiện bởi nhà vi sinh học người Nhật Kiyoshi Shiga vào

năm 1896 Độc tố sinh ra bởi vi sinh vật này được gọi là Shiga toxin Shigella thuộc họ

Enterobacteriaceae, thường gặp ở nguồn nước bị nhiễm phân người, và lan truyền

sang người thông qua con đường ăn uống Các ca ngộ độc do nhiễm Shigella thường

gặp ở các nước đang phát triển Uống phải nước hoặc ăn phải thực phẩm có nhiễm

phân người được cho là nguyên nhân chính gây nhiễm Shigella.Cho đến nay ước tính

có khoảng 1.1 ca tử vong và 165 triệu ca bệnh lỵ hàng năm trên toàn thế giới, trong đó trẻ em dưới 5 tuối có nguy cơ mắc bệnh lỵ cao Trẻ em bị suy dinh dưỡng dễ nhiễm

Shigella và Shigella khi nhiễm vào tiếp tục thúc đẩy quá trình suy dinh dưỡng, gây

nhiễm trùng định kỳ và làm chậm phát triển

Shigella là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi và không di động Đặc điểm sinh

hóa chung của Shigella là catalase (+), oxidase (-) và lactose (-) Shigella lên men đường và không sinh khí Ngưỡng nhiệt độ tồn tại của Shigella là từ 7 đến 46o

dòng cũng gây ra bệnh tiêu chảy và kiết lỵ

Họ Shigella gồm có 4 loài: Shigella dysenteriae, S flexneri, S boydii và S sonnei, mỗi loài lại chứa nhiều kiểu huyết thanh khác nhau Trong 4 loài Shigella, S

dysenteriae và S flexneri thường gây ra ngộ độc ở các quốc gia phát triển, S sonni gây

ra các ca ngộ độc rãi rác ở các quốc gia công nghiệp, do bị nhiễm vào trong nước hoặc

thực phẩm chưa qua chế biến Tại Mỹ, S sooni chịu trách nhiệm cho 2/3 số ca nghi nhiễm Shigella [5]

1.2.3.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Wei et al (2003), genome của Shigella flexneri dài 4,599,354bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Shigella flexneri dài 1,541bp.,

nằm ở vị trí từ 214,156 đến 215,696 [8]

Hình 1.3: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Shigella flexneri

1.2.4 Campylobacter

1.2.4.1 Đặc điểm phân loại

Theo như báo cáo của CDC, từ năm 1998 đến năm 2002, Campylobacter gây ra 61

ca trong tổng số 1,440 ca ngộ độc tại Mỹ Tuy nhiên số các ca nhiễm thực sự liên quan

đến Campylobacter được cho là vào khoảng 1.9 triệu ca hằng năm, nhiều nhất trong số

các vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm, và các ca nhiễm thường liên quan đến tiêu thụ và sử dụng thịt gà

Các loài thuộc Campylobacter là vi khuẩn Gram âm, uốn cong hình chữ S hay dạng que xoắn ốc dài khoảng 0.5-5.0µm Campylobacter có roi ở một hoặc cả hai đầu

Campylobacter là vi khuẩn vi hiếu khí, sống ở môi trường có nồng độ O2 từ 3-5% và

CO2 từ 3-10% Trong số các loài vi khuẩn thuộc họ Campylobacter, C coli, C jejuni,

C upsaliensis và C lari là vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 42oC và không phát triển ở ngưỡng dưới 30oC Hầu hết các loài thuộc Campylobater sinh

trưởng kém ở môi trường có nồng độ muối cao (2% NaCl), khô và có độ pH thấp hơn 4.9 Chúng sử dụng amino acid là nguồn dự trữ năng lượng thay cho đường

Trong số 16 loài thuộc họ Campylobacter, 12 loài được xem là vi khuẩn gây bệnh, bao gồm C fetus, C coli, C jejuni, C upsaliensis, C consisus, C curvus và C lari Việc nhiễm những vi sinh vật này dẫn đến tiêu chảy C.jejuni là vi khuẩn thuộc họ

Campylobacter phổ biến nhất, có mặt trong 95% số vụ ngộ độc

Động vật là nguồn chứa đựng Campylobacter và có thể tìm thấy ở thỏ, chim, cừu,

ngựa, bò, heo, gia cầm và cả ở vật nuôi gia đình Vi sinh vật này cũng xuất hiện ở rau, động vật có vỏ và nước Tuy nhiên, nếu chỉ xét trên khía cạnh an toàn vệ sinh thực phẩm, gia cầm được cho là nguồn gây bệnh chủ yếu bên cạnh việc sử dụng sữa chưa

qua thanh tiệt trùng hay lây nhiễm do quá trình chế biến thực phẩm Campylobacter

spp tồn tại ở manh tràng gà với nồng độ trung bình là từ 106-107 cfu.g-1, trong đó

chiếm chủ yếu là C jejuni và C coli [5]

1.2.4.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Parkhill et al (2000), genome của Campylobacter

jejuni dài 1,641,481bp Trình tự gene 16S ribosomal RNA của Campylobacter jejuni

dài 1,513bp., nằm ở vị trí từ 39,249 đến 40,761 [9]

Hình 1.4: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Campylobacter jejuni

1.2.5 Listeria monocytogenes

1.2.5.1 Đặc điểm phân loại

Listeria là nhóm vi khuẩn gram dương, hình que, không sinh bào tử Chúng có

chiều dài từ 1-2µm, tồn tại ở dạng đơn hoặc đôi tế bào Trong một số điều kiện nhất

định về điều kiện sinh trưởng và phát triển, Listeria có thể tồn tại ở dạng chuỗi

Listeria phổ biến trong tự nhiên và có thể sống sót trong những điều kiện môi trường

khắc nghiệt, bao gồm khoảng pH rộng (4.1-9.6), nồng độ muối cao (10%) và sự có mặt của các yếu tố kháng sinh Chúng là vi sinh vật ưa lạnh và có thể sống ở khoảng nhiệt

độ rộng (từ 1-45o

C)

Các loài thuộc Listeria có thể được tìm thấy ở trong đất, nước, nước thải, thực vật

và trong đường ruột của gia súc Một phần năm số người khỏe mạnh được cho là có

mang Listeria Thịt, rau, cá và các thực phẩm hàng ngày là các nguồn gây bệnh tiềm

tàng Thực phẩm được chế biến sẵn như hotdog, pate, cá xông khói, phô mai mềm và phô mai được làm từ sữa chưa qua thanh tiệt trùng cũng là nguyên nhân gây ra nhiều ca ngộ độc thực phẩm

Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh nội bào và ảnh hưởng đến sức khỏe

cũng như làm suy giảm hệ miễn dịch của con người Tỷ lệ tử vong do nhiễm Listeria

monocytogenes có thể lên đến 20-30% Nồng độ ô nhiễm Listeria monocytogenes có

thể gây tử vong vào khoảng từ 100 đến 106 tế bào phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của vật chủ Trong thử nghiệm ở chuột, chỉ cần một vài cho đến 10 tế bào vi khuẩn là

đã có thể gây tử vong Quá trình ủ bệnh của Listeria monocytogenes là từ 3 ngày đến 3

tháng phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch và số tế bào vi sinh vật bị nhiễm [5]

1.2.5.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Epie et al (2015), genome của Listeria

monocytogenes dài 2,904,662bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Listeria monocytogenes dài 1,561bp., nằm ở vị trí từ 242,730 đến 244,290 [10]

Hình 1.5: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Listeria monocytogenes

1.2.6 Staphylococcus aureus

1.2.6.1 Đặc điểm phân loại

Staphylococcus aureus là tụ cầu khuẩn gram dương (đường kính 1µm), quan sát

dưới kính hiển vi thường tụ thành đám giống chùm nho Chúng không thể di động và

có màu vàng Vách tế bào của S aureus bao gồm 3 thành phần chính: lớp peptidolycan

bao gồm lặp đi lặp lại các đơn vị N-acetyl glucosamine β-1,4 liên kết với N-acetyl muramic acid, ribitol teichoic acid liên kết với muramyl-6-phosphate thông qua N-acetyl mannosaminyl-β-1, 3- N-acetyl glucosamine và Protein A liên kết cộng há trị với peptidoglycan và có khả năng liên kết với thành phần Fc của immunoglobulin trong huyết tương gây hiện tượng tụ huyết Những loài khác thuộc staphylococci không chứa protein A trong vách tế bào

Staphylococcus aureus là vi khuẩn yếm khí tùy nghi, dương tính với catalase, phát

triển tốt dưới điều kiện hiếu khí Sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi glucose dưới điều kiện hiếu khí sẽ là acetoin Chúng có thể lên men manitol và gây ra hiện

tượng tụ huyết S aureus có thể chịu được muối ở nồng độ cao (10-15%) và chịu được

các điều kiện khắc nghiệt như khô và nóng

Staphylococcal nói chung và Staphylococcus nói riêng là một trong những vi sinh

vật gây bệnh trong thực phẩm phổ biến nhất Trong những năm 1970 và 1980, một phần ba số ca ngộ độc thực phẩm được ghi nhận tại Mỹ có liên quan đến staphylococci

Hiện nay, chủ yếu các ca ngộ độc S aureus được ghi nhận tại Brazil, Ai Cập, Đài Loan

và Nhật Bản và các quốc gia đang phát triển Nguyên nhân gây bệnh thường là do nhiễm phải độc tố Staphylococcal enterotoxin (SEs) có mặt trong thực phẩm Nhiễm Staphylococcal thường liên quan dến các thực phẩm như sữa, salad, thịt, jambon, cá, động vật có vỏ và các sản phẩm có liên quan đến sữa Staphylococci có thể lây nhiễm thông qua dụng cụ chế biến thực phẩm như dao hoặc tay của người chế biến Độc tố

của S aureus được sản xuất ở nhiệt độ từ 10 đến 40oC, do đó thực phẩm để ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn có thể gây ra ngộ độc SEs [5]

1.2.6.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Holden et al (2004), genome của Staphylococcus

aureus dài 2,902,619bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Staphylococcus aureus

dài 1,555bp., nằm ở vị trí từ 514,251 đến 515,805 [11]

Hình 1.6: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Staphylococcus aureus

1.2.7 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus

1.2.7.1 Đặc điểm phân loại

Các loài thuộc chi Vibrio là các vi khuẩn Gram âm, hình que tròn, kích thước chiều

dài khoảng từ 1.4 đến 2.6µm và chiều rộng từ 0.5 đến 0.8µm Chúng di dộng và sở hữu tiêm mao ở một cực của tế bào, là các vi sinh vật yếm khí tùy nghi, hầu hết dương tính

với oxidase và sử dụng D-glucose là nguồn carbon chính Vibrio sản xuất nhiều

enzyme ngoại bào như amylase, gelatinase, chitinase và DNase Một số loài thuộc

Vibrio là vi sinh vật ưa mặn (chịu được nồng độ NaCL 10%) Vibrio phát triển tốt

trong khoảng pH từ trung tính đến 9.0 và nhạy cảm với môi trường acid Khoảng pH tối thích là từ 8 đến 8.8 và nhiệt độ phát triển là từ 20 đến 37oC Vibrio có thể được phân lập từ nước ngọt, nước mặn cũng như nước lợ Vibrio được tìm thấy ở dạng tự do hoặc liên kết với các bề mặt vô tri hoặc trên các động thực vật thủy sản Vibrio ở dạng

liên kết với các sinh vật phù di hoặc động vật có vỏ có thể tồn tại lâu hơn so với dạng

tự do [5]

a Vibrio cholerae

Vibrio cholerae là một trong những vi sinh vật phổ biến nhất thuộc chi Vibrio với

hai chủng gây bệnh chủ yếu thuộc hai kiểu huyết thanh O:1 và O:139 Vibrio cholera là

một trong những tác nhân chính gây bệnh tả, theo tổ chức Sức khỏe thế giới World Health Organization (WHO), chỉ tính trong năm 2005, có khoảng 131,943 ca nhiễm cholera trong đó có 2,272 ca tử vong ở 52 quốc gia khác nhau

Vibrio cholerae là vi sinh vật Gram âm, dạng que hoặc que tròn (0.7-1.0 x

1.5-3.0µm) Chúng là các vi sinh vật yếm khí tùy nghi, khuẩn lạc màu vàng nhạt, trong suốt, có đường kính từ 2-3mm trên môi trường thạch thiosulfate citrate bile salts

sucrose (TCBS) V cholerae có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-45oC, khoảng pH từ 6-10 và nồng độ muối khoảng 6% [5]

b Vibrio parahaemolyticus

Vibrio paprahaemolyticus là vi sinh vật gây bệnh ưa mặn, sống ở khoảng nhiệt độ

từ 15oC đến 44oC và có tiêm mao hai bên hoặc ở đầu Các chủng V parahaemolyticus

được xác định dựa trên kháng nguyên soma (O) hoặc kháng nguyên vỏ (K), kiểu huyết thanh gây bệnh phổ biến nhất là O3:K6

V parahaemolyticus phân bố nhiều ở vùng nước mặn ven biển khắp thế giới Mức

độ xâm nhiễm của V parahaemolyticus phụ thuộc vào nhiệt độ nước, vi sinh vật phù

du và nồng độ oxy hòa tan Các quốc gia có khí hậu ôn đới có số ca mắc bệnh nhiều hơn các quốc gia nhiệt đới vào mùa hè, còn ở các quốc gia nhiệt đới, do nhiệt độ ấm áp quanh năm, các ca mắc bệnh cũng rãi rác quanh năm chứ không tập trung theo mùa

Các ca ngộ độc do nhiễm V parahaemolyticus thường liên quan đến việc tiêu thụ hải

sản đặc biệt là là hầu và các động vật có vỏ [5]

c Vibrio vulnificus

Trong số các si sinh vật gây bệnh thuộc chi Vibrio, Vibrio vulnificus là loài gây

bệnh nguy hiểm nhất đối với con người và dẫn đầu số ca tử vong liên quan đến hải sản tại Mỹ với trung bình 40 ca hằng năm Số ca ngộ độc cũng rất cao ở Nhật Bản do bờ

biển ấm áp và thói quen tiêu thụ hải sản tươi sống V vulnificus gây ra hội chứng

nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn vết thương và viêm nhiễm đường tiêu hóa ở người Hội chứng nhiễm khuẩn máu và nhiễm khuẩn vết thương diễn tiến rất nhanh chóng và

có thể khiến người bệnh tử vong trong vòng 24h do sốc nội độc tố [5]

1.2.7.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Folster et al (2015), genome của Vibrio cholerae dài 3,043,139bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Vibrio cholerae dài 1,550bp., nằm

ở vị trí từ 235,186 đến 236,735 [12]

Theo kết quả giải trình tự của Mariko et al (2003), genome của Vibrio

parahaemolyticus dài 3,288,558bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Vibrio parahaemolyticus dài 1,471bp., nằm ở vị trí từ 33,633 đến 35,103 [13]

Theo kết quả giải trình tự của Lo et al (2014), genome của Vibrio vulnificus dài 3,315,989bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Vibrio vulnificus dài 1,554bp.,

nằm ở vị trí từ 25,292 đến 26,845 [14]

(A)

(B)

(C)

Hình 1.7: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Vibrio cholerae (A),

Vibrio parahaemolyticus (B) và Vibrio vulnificus (C)

1.2.8 Clostridium botulinum và Clostridium perfringens

1.2.8.1 Đặc điểm phân loại

a Clostridium botulinum

Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí bắt buộc và có dạng hình

que tròn Chúng sinh sản trong ruột và bảo tử có thể tìm thấy trong đất và thực vật

Neurotoxin (chất độc thần kinh) ở C botulinum được sản xuất ở nhiệt độ thấp từ 3oC đến 15oC C botulinum không thể phát triển ở khoảng pH dưới 4.6, bào tử của chúng nhạy cảm cao với nhiệt độ C.botulinum thông thường là vi sinh vật gây bệnh yếu do

khả năng tồn tại trong cơ thể người là không cao Tuy nhiên, bào tử tồn tại trong thực phẩm nếu chịu được nhiệt độ cao có thể chuyển sang dạng tế bào sinh dưỡng Ở dạng

tế bào sinh dưỡng, chúng phát triển dưới điều kiện kỵ khí và sản sinh độc tố botulinum gây nguy hiểm cho con người [5]

b Clostridium perfringens

Clostridium perfringens là vi khuẩn Gram dương, dạng hình que tròn, phần lớn

sống kỵ khí tuy nhiên một số chủng là hiếu khí Chúng không di động và sản sinh vòng phân giải đôi huyết tương khi nuôi trên môi trường thạch máu Vùng phân giải rõ là do perfringolysin O (theta-toxin) và vùng không rõ ràng là do phospholipase C (alpha-

toxin) Nhiệt độ tối tích của C perfringens là từ 43-45oC, chúng không thể phát triển dưới 15o

C, pH tối thích là từ 5-9.0 C perfringens có thể tồn tại và phát triển trong môi

trường có nồng độ muối cao (chứa 330ppm sodium nitrate và 4-6% NaCl)

C.perfringens cần đến 12 amino acid và vitamin khác nhau để có thể phát triển bình

thường, do đó mà chúng thường được tìm thấy ở thực phẩm liên quan đến thịt

Từ năm 1992 đến năm 1997, có tổng cộng 248,520 số ca nhiễm C perfringens được ghi nhận bởi CDC Riêng trong năm 1993, có đến 10,000 ca nhiễm C

perfringens với 100 ca tử vong được ghi nhận [5]

1.2.8.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Sabaihia et al (2015), genome của Clostridium

botulinum dài 3,886,916bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Clostridium botulinum dài 1,442bp., nằm ở vị trí từ 9,294 đến 10,735 [15]

Theo kết quả giải trình tự của Shimizu et al (2002), genome của Clostridium

perfringens dài 3,031,430bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Clostridium perfringens dài 1508bp, nằm ở vị trí từ 10,173 đến 11,680 [16]

(A)

(B)

Hình 1.8: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Clostridium botulinum

(A), Clostridium perfringens (B)

1.2.9 Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis và Yersinia pestis

1.2.9.1 Đặc điểm phân loại

a Yersinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica là vi khuẩn Gram âm, dạng que ngắn, sống yếm khí tùy nghi

Y enterocolitica phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 44oC, nhiệt độ tối ưu là từ 25 đến 29o

C Chúng có thể phát triển trong sữa hoặc thịt sống ở ngưỡng 1oC với tốc độ

chậm Y enterocolitica có thể phát triển ở 5% NaCl và pH dưới 4.6, khoảng pH tồn tại của chúng là từ 4-10 Yersinia phát triển chậm, khuẩn lạc thường xuất hiện sau 24h

nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu, thạch MacConkey và thạch Hektoen-Enteric Chúng lên men đường sucrose nhưng không lên men được lactose

Yersinia enterocolitica tồn tại phổ biến trong tự nhiên, bao gồm nước, nước thải,

thực phẩm và động vật Trong đó, heo là nguồn mang chủ yếu các chủng gây bệnh có thể lây nhiễm cho con người Có đến 35-70% số đàn heo chứa cá thể mang chủng gây

bệnh thuộc Yersinia enterocolitica Các chủng phân lập từ tự nhiên thì hầu hết không gây bệnh và thuộc nhóm 1A Dịch bệnh đầu tiên gây ra bởi Y enterocolitica phát hiện

ở Mỹ ảnh hưởng đến 222 trẻ em do sử dụng sữa sô cô la nhiễm bẩn, kiểu kháng nguyên phát hiện chịu trách nhiệm là O:8 [5]

b Yersinia pestis

Yersinia pestis là vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Bệnh dịch hạch lần đầu tiên ghi

nhận vào khoảng năm 430 trước công nguyên tại Athens, bệnh dịch hạch cũng là

nguyên nhân gây ra “cái chết đen” thời trung cổ tại châu Âu Y pestis chịu trách nhiệm

cho ba ca đại dịch lớn nhất trong lịch sử nhân loại, với hơn 200 triệu ca tử vong trong

vòng 1,500 năm Y pestis lây sang người chủ yếu do nguyên nhân tiếp xúc với động vật gặm nhắm và bọ chét được coi là vật chủ trung gian Y.pestis tấn công các tế bào

lympho và gây viêm, nhiễm, áp xe và hình thành nên các hạch nổi

Yersinia pestis không di động, không sinh bào tử Nhiệt độ tối thích của chúng là

28oC, khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển là từ 4-40oC Yersinia pestis là vi

khuẩn tùy nghi và tồn tại ở 3 dạng: antiqua, medievalis và orientalis Các dạng tồn tại của chúng được phân biệt dựa trên khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau Antiqua dương tính với glycerol, arabinose và nitrate; medievalis cũng dương tính với glycerol, arabinose nhưng âm tính với nitrate trong khi orientalis âm tính với glycerol, arabinose

nhưng dương tinh với nitrate Các dạng tồn tại khác của Y pestis được xếp vào dạng

microtus, dạng này thường có đặc điểm dương tính với glycerol nhưng âm tính với arabinose và nitrate [5]

c Yersinia pseudotuberculosis

Yersinia pseudotuberculosis là vi khuẩn Gram âm gây ra bệnh sốt Viễn Đông ở

người, lây nhiễm chủ yếu qua con đường thực phẩm

Ở người, triệu chứng sốt Viễn Đông tương tự với triệu chứng nhiễm Yersinia

enterocolitica là sốt và đau bụng phía bên phải, trừ triệu chứng tiêu chảy thường không

xuất hiện Việc nhiễm Yersinia pseudotuberculosis có thể gây nên những triệu chứng

giống với triệu chứng viêm ruột thừa, đặc biệt là trẻ em và trẻ vị thành niên Trong một

số trường hợp đặc biệt, việc nhiễm tác nhân gây bệnh này có thể gây ra tình trạng viêm

da, cứng, đau khớp hoặc nhiễm trùng máu

Các triệu chứng của bệnh sốt Viễn Đông thường xuất hiện sau 5 đến 10 ngày ủ bệnh, và thường kéo dài từ 1 đến 3 tuần nếu không chữa trị Đối với những bệnh nhân

bị suy giảm hệ miễn dịch, phải được chữa trị bằng các kháng sinh amplicillin, aminoglycosides, tetracycline, chloramphenicol hoặc cephalosporin mới có hiệu quả

Về mặt di truyền, Yersinia pseudotuberculosis rất tương đồng với Yersinia pestis

Yersinia pestis được cho là phát triển từ Yersinia pseudotuberculosis khoảng 1,500 đến

2,000 năm trước [17, 18]

1.2.9.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Thomson et al (2006), genome của Yersinia

enterocolitica dài 4,615,899bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia enterocolitica dài 1,489bp, nằm ở vị trí từ 17,506 đến 18,994 [19]

Theo kết quả giải trình tự của Johnson et al (2015), genome của Yersinia

pseudotuberculosis dài 4,728,337bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia pseudotuberculosis dài 1,531bp., nằm ở vị trí từ 429,951 đến 431,481 [20]

Theo kết quả giải trình tự của Song et al (2004), genome của Yersinia pestis dài 4,695,065bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia pestis dài 1,439bp., nằm

ở vị trí từ 12,057 đến 13,545 [21]

(A)

(B)

(C)

Hình 1.9: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Yersinia enterocolitica

(A), Yersinia pseudotuberculosis (B) và Yersinia pestis (C)

1.2.10 Bacillus cereus

1.2.10.1 Đặc điểm phân loại

Baciluus cereus là vi khuẩn Gram dương, dương tính với thử nghiệm phân giải urea

và nhạy với penicillin Bacillus cereus là vi sinh vật phổ biến trong tự nhiên, là vi sinh

vật cơ hội và gây ngộ độc cho cơ thể người qua con đường ăn uống với các triệu chứng tiêu chảy và đầy hơi hoặc nôn và buồn nôn Ở cơ thể người khỏe mạnh nhưng hầu hết

là ở những người bị suy giảm hệ miễn dịch hoặc bệnh nhân sau phẫu thuật, B cereus

gây nên các triệu chứng nhiễm trùng máu, viêm nội mạc, nhiễm trùng da, viêm phổi và

viêm màng não B cereus tuy được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm, chúng cũng là thành phần quan trọng trong hệ sinh thái đất B cereus cũng được tìm thấy trong hệ

đường ruột của động vật không xương sống, không chỉ ở dạng bào tử mà còn ở dạng tế

bào sinh dưỡng B cereus cũng mang gene Cry giống với B thuringiensis Không có yếu tố gây độc nào được tìm thấy đặc trưng cho B cereus, một số protein vốn được cho

là đặc trưng cho B cereus cũng được tìm thấy ở B thuringiensis

Các ca nhiễm Bacillus cereus liên quan đến việc sử dụng ngũ cốc hay soup Triệu

chứng nôn và buồn nôn thường liên quan có liên quan đến pasta, gạo, thịt bò, thịt gia cầm, sốt vanilla và hay bắt gặp ở trẻ sơ sinh Trong khi triệu chứng tiêu chảy thường chủ yếu liên quan đến sử dụng thịt, cá, soup, các loại rau như ngô, bột ngô, khoai tây

nghiền cũng như các thực phẩm từ sữa B cereus có thể tạo nên lớp kem ở sữa do hoạt động của lecithinase B cereus có thể kết tụ lại ở sữa có pH thấp Sữa tươi có thể bị nhiễm B cereus từ trang trại nếu vú sữa của bò không được vệ sinh sạch sẽ Bên cạnh

đó, bào tử chịu nhiệt của B cereus có thể sống sót qua thanh trùng Pasteur [5]

1.2.10.2 Thông tin di truyền

Theo kết quả giải trình tự của Takeno et al (2012), genome của Bacillus cereus dài khoáng 5,221,581bp., trình tự gene 16S ribosomal RNA của Bacillus cereus dài

1,451bp., nằm ở vị trí từ 9,185 đến 10,635 [22]

Hình 1.10: Vị trí trình tự gene 16S ribosomal RNA của Bacillus cereus