Đánh giá khả năng ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng salmonella spp để phát hiện salmonella trong thực phẩm

và đánh giá khả năng sử dụng phức hợp hạt từ- kháng thể phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng các phương pháp kết hợp phân tách miễn dịch từ IMS và nuôi cấy.. Sự kết hợp giữa kỹ thu

VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 1: TS NGUYỄN TẤN TRUNG

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Cán bộ chấm nhận xét 2: TS HOÀNG KIM ANH

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký) Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 08 tháng 08 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2 Phản biện 1: TS NGUYỄN TẤN TRUNG

3 Phản biện 2: TS HOÀNG KIM ANH

4 Ủy viên: PGS.TS LÊ THỊ THỦY TIÊN

5 Thư ký: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: ĐỖ THỊ KIM YẾN MSHV:13310325

Ngày, tháng, năm sinh: 30/01/1987 Nơi sinh: Nha Trang

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá khả năng ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp để phát hiện Salmonella trong thực phẩm

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Cộng hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp và đánh giá khả năng sử dụng phức hợp hạt từ- kháng thể phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng các phương pháp kết hợp phân tách miễn dịch từ (IMS) và nuôi cấy

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 19/01/2015

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 14/07/15

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KTHH

(Họ tên và chữ ký)

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Trưởng phòng Hóa Miễn dịch Viện Pasteur

TP.HCM, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận văn

Ban Giám đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành

luận văn đúng thời gian quy định

Các anh chị Viện Y tế Công cộng đã cung cấp các mẫu thực phẩm để tôi

thực hiện đề tài

Các thầy, cô giáo và các bạn cao học khóa 2013 Trường Đại học Bách

khoa TP.HCM đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Các chị phòng Hóa Miễn Dịch - Viện Pasteur TP.HCM đã động viên, chia

sẻ những khó khăn với tôi trong công việc

Và cuối cùng, con xin cảm ơn gia đình đã luôn ở bên và ủng hộ con để

con có được thành công như ngày hôm nay

Đỗ Thị Kim Yến

Salmonella spp là tác nhân vi sinh gây ngộ độc thực phẩm xếp thứ hai trên thế giới Để phát hiện Salmonella trong thực phẩm, phương pháp dựa trên nuôi cấy được

xem là tiêu chuẩn vàng do có tính chọn lọc và độ nhạy cao Phương pháp này cần nhiều thời gian (từ 5-7 ngày) Ngoài nhược điểm trên nó cũng có thể cho kết quả âm tính giả do sự hiện diện của một số thành phần trong thực phẩm và vi sinh vật nền Để tách và cô đặc các vi khuẩn đích trong mẫu thực phẩm, phương pháp hiệu quả và thành công nhất là phương pháp phân tách miễn dịch từ (Immunomagnetic Separation-IMS)

Để tăng khả năng phát hiện vi khuẩn đích, môi trường thạch chọn lọc cũng liên tục được cải tiến Một cải tiến quan trọng đó là bổ sung thêm các cơ chất tạo màu giúp

nó có độ đặc hiệu cao hơn, nhằm dễ dàng phát hiện Salmonella với các vi sinh vật nền

khác

Sự kết hợp giữa kỹ thuật IMS và nuôi cấy sẽ tăng khả năng phát hiện vi khuẩn

Salmonella hiện diện trong các mẫu thực phẩm

Mục tiêu của nghiên cứu này là so sánh và đánh giá các phương pháp kết hợp

nuôi cấy và IMS với phương pháp nuôi cấy chuẩn ISO 6579:2002 để phát hiện

Salmonella trong thực phẩm Kết quả nghiên cứu đã rút ra 1 số kết luận sau:

 Phương pháp IMS cấy trực tiếp lên XLD (IMS-XLD) cho độ đặc hiệu và khả

năng phát hiện Salmonella thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

 Phương pháp IMS-RV và IMS- SCA cho độ đặc hiệu cao hơn phương pháp nuôi cấy chuẩn Trên những nền mẫu có độ tạp nhiễm vi sinh vật nền cao khả

năng phát hiện Salmonella của phương pháp IMS-RV và IMS- SCA cao hơn

phương pháp nuôi cấy chuẩn

 Phương pháp IMS-SCA giúp giảm thời gian thử nghiệm xuống 1 ngày so với phương pháp nuôi cấy chuẩn

mẫu chứa hàm lượng chất béo cao

Theo đó, phương pháp IMS-SCA là phù hợp với yêu cầu phân tích nhanh và

chính xác Salmonella trong thực phẩm

Salmonella spp is the second major cause of foodborne disease in the world

Due to the high selectivity and sensitivity, standard culture method remains the gold

standard to detect Salmonella However, this method requires long time, 5-7 days to

perform In addition, the food samples containing the high density of micro flora and ingredients can led to the results of false negative Immunomagnetic separation (IMS) should be considered the most effective and successful method to separate and concentrate given bacteria from food samples

To improve the detection of the Salmonella strains, selective media have been

modified or new media developed Importantly, chromogenic substrates are added

to detect specific enzyme of Salmonella, helped increase the specificity of media

The combination of IMS and culture will improve the detection ability of

Salmonella in food samples

The purpose of this study is to compare and validate methods of combination

culture and IMS with standard culture method ISO 6579:2002 for the detection

Salmonella from food samples Following the IMS process the bead-bacteria complexes are plated directly onto selective agar XLD (IMS-XLD), Salmonella

chromogenic agar SCA), or enriched in selective enrichment broth RV RV) Results showed that:

(IMS- IMS-XLD method had specificity and detection ability lower than standard culture method

 Both IMS-RV and IMS-SCA methods had the specificity higher than standard culture method On the food samples containing high background microflora, IMS-RV and IMS-SCA methods had the ability to

detect Salmonella spp higher than standard culture method

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Đỗ Thị Kim Yến

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂN ii

ABSTRACT iv

LỜI CAM ĐOAN vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH MỤC CÁC BẢNG xiv

DANH MỤC CÁC HÌNH xvi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.VI KHUẨN SALMONELLA 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Đặc điểm kháng nguyên 3

1.1.3 Vị trí phân loại và danh pháp 5

1.1.4 Đặc điểm sinh hóa 6

1.1.5 Salmonella gây bệnh ở người và động vật bậc cao 7

1.1.5.1 Đặc điểm gây bệnh 7

1.1.5.2 Cơ chế gây bệnh 8

1.2 TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO SALMONELLA 10

1.2.1 Trên thế giới 10

1.2.2 Tại Việt Nam 11

1.4 PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY THEO

ISO 6579:2002 11

1.4.1 Tiền tăng sinh 12

1.4.2 Tăng sinh chọn lọc 14

1.4.3 Phân lập trên môi trường thạch chọn lọc 15

1.4.5 Khẳng định bằng phản ứng sinh hóa và huyết thanh học 16

1.5 MÔI TRƯỜNG THẠCH MÀU DÙNG PHÂN LẬP SALMONELLA 17

1.5.1 Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme galactosidase 18

1.5.2 Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme esterase 19

1.5.3 Môi trường thạch màu kết hợp cả hai đặc tính tạo enzyme galactosidase và enzyme esterase 19

1.6 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH MIỄN DỊCH TỪ (IMS) 21

1.6.1 Hạt từ 22

1.6.2 Kháng thể 24

1.6.3 Nguyên tắc hoạt động 25

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28

2.2 VẬT LlỆU 28

2.2.1 Thiết bị, máy móc 28

2.2.2 Các loại môi trường và hóa chất 29

2.2.3 Vật liệu thí nghiệm 30

2.2.3.2 Chủng vi khuẩn 30

2.2.3.3 Mẫu thí nghiệm 31

2.3 PHƯƠNG PHÁP 32

2.3.1 Sơ đồ nội dung thực hiện đề tài 32

2.3.2 Phương pháp ngưng kết kháng thể với vi khuẩn 33

2.3.3 Phương pháp tinh chế kháng thể đặc hiệu kháng Salmonella bằng sắc ký ái lực qua cột Hitrap-Protein A 34

2.3.4 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%-SDS 35

2.3.5 Phương pháp Bradford (xác định nồng độ kháng thể) 36

2.3.6 Phương pháp gắn kháng thể vào hạt từ nhờ carbodiimide 37

2.3.7 Phương pháp xác định hiệu suất cộng hợp kháng thể vào hạt từ 38

2.3.8 Phương pháp ngưng kết phức hợp hạt từ kháng thể với vi khuẩn 38

2.3.9 Phương pháp đếm khuẩn lạc (xác định mật độ vi khuẩn) 39

2.3.10 Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS) 40

2.3.11 Phương pháp nuôi cấy chuẩn phát hiện Salmonella trong thực phẩm ISO 6579:2002 41

2.3.12 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD hoặc HE 42

2.3.13 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS tăng sinh trong môi trường chọn lọc RV 43

2.3.14 Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng IMS cấy trực tiếp trên thạch màu SCA 44

pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trong thực phẩm 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 46

3.1 CỘNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG SALMONELLA SPP 46

3.1.1 Tinh chế kháng thể 47

3.1.2 Kiểm tra kháng thể sau tinh chế 48

3.1.3 Cộng hợp kháng thể sau tinh chế lên hạt từ 50

3.1.4 Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp lên hạt từ 50

3.1.5 Đánh giá phức hợp hạt từ gắn kháng thể sau cộng hợp 51

3.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HẠT TỪ GẮN KHÁNG THỂ ĐỂ PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM 52

3.2.1 So sánh và đánh giá phương pháp IMS cấy trực tiếp trên thạch chọn lọc XLD và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm 54

3.2.2 So sánh và đánh giá phương pháp IMS qua tăng sinh chọn lọc trong RV và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm 56

3.2.3 So sánh và đánh giá phương pháp IMS cấy trực tiếp trên thạch màu SCA và phương pháp nuôi cấy chuẩn để phát hiện Salmonella trên thực phẩm 61

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

4.1 KẾT LUẬN 67

4.2 ĐỀ NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 74

AOAC The Association of Analytical Communities

ATCC American Type Culture Collection

c-AMP Cyclic Adenosine monophosphate

CDC Centers for Desease Control and Prevention

cDNA complementary DNA

CFU Colony Forming Unit

c-GMP Cyclic Guanosine monophosphate

DNA Deoxyribonucleic acid

DPF Delayed Permeability Factor

ELISA Enzym-linked Immunosorbent assay

JICA Japan International Cooperation Agency

LPS Lipopolysaccharide

MEA 2-Mercaptoethylamin

MES 4-Morpholinoethanesulfonic acid

Mr Remanent magnetization (độ từ kháng)

Ms Saturation magnetization (độ bão hòa từ)

OMA Salmonella O Antiserum Poly A

OMB Salmonella O Antiserum Poly B

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PCR Polymerase Chain Reaction

PKA Protein kinase A

TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam

Tp.HCM Thành phố Hồ Chí Minh

TSA Tryticase Soya Agar

WHO World Health Organization

X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside XLD Xylose Lysine Deoxycholate

YTCC Y tế Công cộng

xiv

Bảng 1.1: Số lượng các loài phụ của loài S Enterica và S Bongori 5

Bảng 1.2: Các đặc tính sinh hóa của các loài phụ Salmonella 6

Bảng 1.3: 5 tác nhân hàng đầu gây tử vong do ngộ độc thực phẩm ở Mỹ, 2011 10

Bảng 1.4: Các môi trường tiền tăng sinh cải tiến cho một số dạng mẫu thực phẩm phức tạp 13

Bảng 2.1: Tên và nguồn gốc các chủng Salmonella được sử dụng 30

Bảng 2.2: Chủng gốc sử dụng ngưng kết và công thức kháng nguyên 33

Bảng 3.1: Kết quả tinh chế kháng huyết thanh OMA và OMB 48

Bảng 3.2: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau tinh chế 50

Bảng 3.3: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp lên hạt từ 51

Bảng 3.4: Khả năng tóm bắt các chủng Salmonella của hạt từ-kháng thể 52

Bảng 3.5: Số lượng mẫu bị nhiễu nền của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 55

Bảng 3.6: Kết quả phát hiện Salmonella của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 56

Bảng 3.7: Số lượng mẫu nhiễu nền của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 59

Bảng 3.8: Kết quả phát hiện Salmonella trên nền mẫu thực phẩm của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 60

Bảng 3.9: Số lượng mẫu nhiễu nền của của phương pháp IMS-SCA so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 64

xv IMS-SCA so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 64

Hình 1.1: Vi khuẩn Salmonella 3

Hình 1.2: Các dạng cấu trúc kháng nguyên Salmonella 4

Hình 1.3: Các biểu hiện bệnh thường gặp gây ra bởi các kiểu huyết thanh Salmonella 7 Hình 1.4: Nội độc tố Lipid A hiện diện trong cấu trúc LPS của vách tế bào Salmonella 8

Hình 1.5: Cơ chế gây tiêu chảy bởi sự điều hòa Guanyl cylase 9

Hình 1.6: Quy trình phân lập Samonella theo ISO 6579:2002 12

Hình 1.7: Các thử nghiệm trên strip Api 20 17

Hình 1.8: Cơ chế hiện màu của vi khuẩn đường ruột trên môi trường có bổ sung cơ chất X-Gal 18

Hình 1.9: Cơ chế hiện màu của Salmonella trên môi trường có bổ sung Magenta-caprylate 20

Hình 1.10: Cơ chế tác động của Inhibigen lên E.coli 21

Hình 1.11: Sự phân bố của hạt từ 23

Hình 1.12: Cấu trúc hạt từ mang kháng thể 23

Hình 1.13: Cấu tạo của phân tử kháng thể 24

Hình 1.14: Các dạng liên kết giữa phân tử kháng nguyên và kháng thể 25

Hình 1.15: Kỹ thuật phân tách miễn dịch từ 26

Hình 1.16: Vi ảnh điện tử cho thấy hạt từ gắn vi khuẩn 27

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32

Hình 2.2: Vị trí liên kết của kháng thể vào protein A, G, L và lectin 34

Hình 2.4: Phản ứng cố định kháng thể vào hạt từ mang nhóm carboxyl 37

Hình 2.5: Sơ đồ pha loãng 40

Hình 2.6: Các thiết bị sử dụng trong phương pháp IMS 40

Hình 2.7: Kỹ thuật ria trên thạch 44

Hình 3.1: Các giai đoạn tạo hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella 46

Hình 3.2: Phản ứng ngưng kết kiểm tra kháng huyết thanh thương mại 47

Hình 3.3: Tinh chế kháng thể kháng OMA qua cột Hitrap-protein A (lần 1) 48

Hình 3.4: Điện di SDS-PAGE 12% kiểm tra kháng thể trước và sau tinh chế 49

Hình 3.5: Kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp 51

Hình 3.6: Sơ đồ mô tả các bước thực hiện nuôi cấy 53

Hình 3.7: Sự khác biệt nền mẫu của phương pháp IMS-XLD so với phương pháp 55

Hình 3.8: Sự khác biệt nền mẫu của phương pháp IMS-RV so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 58

Hình 3.9: Sự khác biệt nền mẫu của phương pháp IMS-SCA so với phương pháp nuôi cấy chuẩn 63

Hình 3.10: Mẫu cá hồi âm tính với Salmonella nhưng lại cho khuẩn lạc màu hồng tím đặc trưng cho Salmonella trên SCA 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn Salmonella là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng thứ hai trong số các tác nhân vi khuẩn [7] Vi khuẩn này hiện diện khắp nơi trong môi trường

sống và lây nhiễm vào người qua đường tiêu hóa Theo ước tính mỗi năm trên thế giới

có đến 10 triệu trường hợp bị bệnh và 100.000 ca tử vong do ăn phải thực phẩm bị

nhiễm vi khuẩn Salmonella [57] Các triệu chứng gặp phải ở người bị nhiễm khuẩn Salmonella gồm có: sốt, đau bụng quặn thắt, nôn mửa, nhức đầu, tiêu chảy, trường hợp

mất nước nghiêm trọng có thể gây tử vong Đối với những người dễ mắc bệnh như trẻ

em, người cao tuổi, phụ nữ có thai và người suy giảm miễn dịch, chỉ với 1-10 tế bào vi khuẩn cũng có khả năng gây bệnh [36] Do Salmonella gây hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người nên nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam không cho phép

Salmonella hiện diện trong thực phẩm [5],[1],[20]

Để phát hiện Salmonella trong thực phẩm, phương pháp dựa trên nuôi cấy được

xem là tiêu chuẩn vàng do có tính chọn lọc và độ nhạy cao [4],[20] Phương pháp này cần nhiều thời gian (từ 5-7 ngày) Ngoài nhược điểm trên nó cũng có thể cho kết quả

âm tính giả do sự hiện diện của một số thành phần trong thực phẩm và vi sinh vật nền

Để tách và cô đặc các vi khuẩn đích trong mẫu thực phẩm, phương pháp hiệu quả và thành công nhất là phương pháp phân tách miễn dịch từ (Immunomagnetic Separation-IMS) Phương pháp này sử dụng các hạt từ mang kháng thể đặc hiệu kháng

Salmonella Vi khuẩn Salmonella sau khi liên kết với kháng thể trên bề mặt bề mặt vi

hạt sẽ được tách dễ dàng khỏi các thành phần khác trong mẫu nhờ thanh nam châm mang từ tính mạnh đặt bên ngoài ống nghiệm Vi khuẩn này vẫn giữ khả năng nhân lên trong môi trường dinh dưỡng Vì vậy, người ta có thể sử dụng phức hợp hạt từ-vi khuẩn để tăng độ nhạy của phương pháp phát hiện và có thể giảm thời gian phân tích tổng từ 1-2 ngày [14],[31],[39],[44]

Để tăng khả năng phát hiện vi khuẩn đích, môi trường thạch chọn lọc cũng liên tục được cải tiến Một cải tiến quan trọng là bổ sung thêm các cơ chất tạo màu giúp nó

có độ đặc hiệu cao hơn [23], nhằm dễ dàng phát hiện Salmonella với các vi sinh vật

nền khác [38]

Sự kết hợp giữa kỹ thuật IMS và nuôi cấy sẽ tăng khả năng phát hiện vi khuẩn

Salmonella hiện diện trong các mẫu thực phẩm

Tại Việt Nam, nghiên cứu phát triển và sử dụng hạt từ mang kháng thể để phát hiện vi sinh vật vẫn chưa được quan tâm nhiều Đến nay, chỉ có một nghiên cứu sử

dụng hạt từ gắn kháng thể kháng E.coli O157 thương mại để phân lập đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 [3] Hiện tại, bước đầu chúng tôi đã chế tạo được hạt từ mang kháng thể kháng Salmonella có khả năng phát hiện Salmonella thuộc các nhóm B, D1,

E1, E4 ở nồng độ 102 cfu/ml và Salmonella thuộc nhóm A, C ở nồng độ 103 cfu/ml [2]

Hạt từ này phù hợp với mục tiêu phân lập Salmonella từ nền mẫu thực phẩm Tuy nhiên, để có thể ứng dụng phân tích Salmonella trong thực phẩm thì phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella cần phải được đánh giá về khả năng ứng dụng

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và yêu cầu thực tiễn nêu trên, tôi xin đề xuất

đề tài: “Đánh giá khả năng ứng dụng hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella spp

để phát hiện Salmonella trong thực phẩm”

Đề tài gồm các nội dung nghiên cứu sau:

 Cộng hợp và đánh giá hạt từ gắn kháng thể kháng Salmonella

 So sánh và đánh giá các phương pháp sử dụng phức hợp hạt từ kết hợp nuôi cấy với phương pháp nuôi cấy chuẩn trên các mẫu thực phẩm, từ đó xác định hiệu quả sử dụng của phức hợp hạt từ gắn kháng thể kháng

Salmonella spp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.VI KHUẨN SALMONELLA

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Salmonella là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước nhỏ (0,4-0,6µm x

2-3µm), kị khí tùy ý, không có khả năng hình thành bào tử, có khả năng di động nhờ lông roi (Hình 1.1)

1.1.2 Đặc điểm kháng nguyên

Dựa trên tính chất khác biệt về các thành phần cấu tạo nên bề mặt tế bào

Salmonella, người ta phân thành 3 loại: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng

nguyên vỏ Vi [34], [36] (Hình 1.2.):

 Kháng nguyên O: có bản chất là lipopolysaccharide (LPS) Đây là thành phần của màng ngoài tế bào vi khuẩn, ổn nhiệt, có khả năng kháng cồn và axit loãng

 Kháng nguyên H: là các protein tiểu phần tạo thành cấu trúc sợi lông roi, không

bền với nhiệt Salmonella là vi khuẩn duy nhất của họ vi khuẩn đường ruột có

thể biểu hiện 2 kháng nguyên H khác nhau trong giai đoạn sinh trưởng Hai kháng nguyên này được mã hóa bởi 2 gen khác nhau H1 và H2

 Kháng nguyên vỏ Vi: là các polysaccharide nhạy với nhiệt và tạo thành nang gắn ở bề mặt vi khuẩn, có tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ Khi phát triển nhiều, nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O Kháng nguyên này chỉ hiện

diện ở 1 số kiểu huyết thanh: Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi C

Hình 1.2: Các dạng cấu trúc kháng nguyên Salmonella [59]

Sự kết hợp của các kháng nguyên cho ra một công thức kháng nguyên duy nhất

cho mỗi kiểu huyết thanh Salmonella Hệ thống phân loại Kauffmann-White dựa trên

ba nhóm kháng nguyên chính để phân nhóm và định danh Salmonella [34]

1.1.3 Vị trí phân loại và danh pháp

Chi Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Số lượng kiểu huyết thanh gia tăng liên tục qua các năm Hiện nay có 2673 kiểu huyết thanh Salmonella và được phân thành 2 loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori Loài Salmonella enterica gồm 6 loài phụ và được chỉ định bởi chữ số La Mã: Salmonella enterica I, II, IIIa, IIIb, IV, VI Loài Salmonella bongori chỉ có 1 loài phụ và được chỉ định là V

Loài phụ Kháng nguyên O: kháng nguyên H pha 1: kháng nguyên H pha 2

Ví dụ: Salmonella II 47:b:1,5

(Sự thiếu hụt một kháng nguyên H sẽ được diễn tả bằng dấu “-”)

1.1.4 Đặc điểm sinh hóa

Một số đặc điểm sinh hóa chính của Salmonella bao gồm: lên men glucose và

mannitol sinh acid, không lên men saccharose và lactose (trừ 1 số chủng), không có khả năng chuyển trytophan thành indole, không phân giải urea, và hầu hết các chủng đều sinh H2S

Bảng 1.2: Các đặc tính sinh hóa của các loài phụ Salmonella [34]

Loài phụ I II IIIa IIIb IV VI V Đặc tính

- : ≥ 90% có phản ứng âm tính

d: phản ứng khác nhau tuỳ thuộc kiểu huyết thanh

(*): Typhimurium d, Dublin -

1.1.5 Salmonella gây bệnh ở người và động vật bậc cao

1.1.5.1 Đặc điểm gây bệnh

Có đến 59% trong tổng số kiểu huyết thanh Salmonella thuộc về Salmonella enterica loài phụ enterica Các kiểu huyết thanh được phân lập từ thực phẩm với tần suất cao nhất mỗi năm gồm có: Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Heidelberg, Salmonella Hadar đều thuộc về loài phụ enterica Trong đó, Salmonella Typhimurium và Salmonella Enteritidis là hai kiểu huyết thanh chủ yếu

gây ngộ độc thực phẩm cho người [7]

Các bệnh do Salmonella gây ra cho người có thể chia vào 4 nhóm: sốt thương

hàn bao gồm bệnh thương hàn và phó thương hàn, viêm dạ dày ruột và nhiễm trùng máu [36] Tùy thuộc vào các kiểu huyết thanh và hiệu quả bảo vệ của thể chủ chống lại

kiểu huyết thanh đó, Salmonella có thể lây nhiễm gan, lá lách, túi mật, xương, màng

não hay các cơ quan khác

Hình 1.3: Các biểu hiện bệnh thường gặp gây ra bởi các kiểu huyết thanh

Salmonella [36]

Ở người khỏe mạnh, số lượng vi khuẩn Salmonella cần thiết để gây bệnh từ 105

-109 với thời gian ủ bệnh là 4-14 ngày Các vi khuẩn sống sót đến ruột xâm nhập qua

niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột Trong quá trình sống, Salmonella gây bệnh

do sản sinh ra các nội độc tố và ngoại độc tố tác động lên tế bào vật chủ [24],[42],[46]

1.1.5.2 Cơ chế gây bệnh

Nội độc tố do thành phần lipid A có LPS được phóng thích khi vi khuẩn

Salmonella bị phân huỷ (Hình 1.4) Nội độc tố giữ vai trò chính trong việc gây bệnh

với độc lực cao và khả năng chịu nhiệt độ cao (ở 100°C sau 2 giờ vẫn còn độc lực) [46] Để thể hiện độc tính, nội độc tố phải liên kết với tế bào thông qua các thụ thể bề mặt Nhiều cơ quan trong cơ thể chịu tác động của nội độc tố như gan, thận, cơ, tim gây nên hiện tượng rối loạn tiêu hóa, tắc mạch máu Nội độc tố còn tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch kích thích hình thành kháng thể [46]

Hình 1.4: Nội độc tố Lipid A hiện diện trong cấu trúc LPS của vách tế bào

Salmonella [59]

Ngoại độc tố đóng vai trò là độc tố đường ruột và độc tố tế bào Độc tố đường ruột gồm có độc tố thẩm xuất chậm (DPF-Delayed Permeability Factor) không bền với

nhiệt, gây đáp ứng sau 18 giờ và độc tố thẩm xuất nhanh (RPF-Rapid Permeability Factor) bền với nhiệt, gây đáp ứng sau 2 giờ [24],[42] Độc tố DPF sẽ hoạt hóa men adenylcylase trong tế bào giúp tăng tiết c-AMP, khiến cho protein kinase A (PKA) được hoạt hóa Điều này làm cho sự phosphoryl hóa kênh Cl- vượt quá mức bình thường Kết quả là kích thích tế bào tăng tiết Cl-, HCO3- ra khỏi tế bào ruột đồng thời

ức chế Na+ vào trong tế bào ruột gây tiêu chảy, mất nước Độc tố RPF sẽ hoạt hóa men guanylcylase trong tế bào giúp tăng tiết c-GMP, khiến cho protein kinase G (PKG) được hoạt hóa và gây tiêu chảy với cơ chế tương tự [45] (Hình 1.5) Khi người và động vật tiêu chảy thì kèm theo là hiện tượng hàng loạt tế bào biểu mô ruột bị tổn thương hoặc bị phá hủy do các độc tố tế bào gây ra Cơ chế chung của độc tố tế bào là ức chế tổng hợp protein và làm trương tế bào [38]

Hình 1.5: Cơ chế gây tiêu chảy bởi sự điều hòa Guanyl cylase [45]

năm trên thế giới có đến 10 triệu trường hợp bị bệnh và 100.000 ca tử vong do ăn phải

thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn Salmonella [57] Theo số liệu thống kê 2011 của trung

tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh CDC (Centers for Desease Control and Prevention), tại Mỹ, số ca tử vong do ngộ độc thực phẩm bởi vi khuẩn chiếm trên 80%,

trong đó do Salmonella gây ra chiếm tỉ lệ cao nhất với 28% [53]

Bảng 1.3: 5 tác nhân hàng đầu gây tử vong do ngộ độc thực phẩm ở Mỹ, 2011 [53]

Tác nhân Ước lượng số ca tử vong hằng năm Tỉ lệ (%)

1.2.2 Tại Việt Nam

Mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 10.000 người bị mắc bệnh và 100-200 ca tử vong Ngộ độc thực phẩm do bị nhiễm vi

7.000-sinh vật chiếm 33-49%, chủ yếu do tác nhân Salmonella chiếm tới 70% số vụ ngộ độc

[54] Theo báo cáo kết quả giám sát từ tháng 5/2013 - 4/2014 tại Tp.HCM được thực hiện bởi Cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản phối hợp với JICA cho thấy

số mẫu nhiễm Salmonella trên thịt heo là 71/231 mẫu kiểm tra (30,74%), thịt gà là

105/231 mẫu kiểm tra (45,45%) [49] Nhiễm khuẩn thực phẩm cũng gây nên tổn thất kinh tế lớn cho các doanh nghiệp Việt Nam Đối với hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu sang Mỹ, trong quý 1 năm 2012, mỗi tháng có 1 lô hàng bị FDA cảnh báo về việc

nhiễm khuẩn Salmonella, và riêng trong tháng 4 năm 2012, 19/20 lô hàng bị FDA cảnh báo nhiễm khuẩn Salmonella Các lô hàng thường nhiễm khuẩn là cá nục (55%), cá

cơm (15%) [56] Tại thị trường EU, theo số liệu thống kê năm 2013 cho thấy tình hình

các lô hàng thủy sản Việt Nam bị cảnh báo nhiễm Salmonella tăng lên đáng kể so với

năm 2012, tập trung vào mặt hàng nghêu luộc đông lạnh Điều này đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng hàng thủy sản Việt Nam

1.3 CÁC QUY ĐỊNH VỀ SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

Do Salmonella có khả năng gây hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người nên

Việt Nam và nhiều nước trên thế giới đã quy định không cho phép sự hiện diện của

Salmonella trong thực phẩm [1],[5],[20]

1.4 PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY THEO

ISO 6579:2002

Phương pháp nuôi cấy được xem là phương pháp chuẩn đang được áp dụng ở tất

cả các phòng kiểm nghiệm vi sinh để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm cũng như bệnh phẩm [4],[20] Phương pháp nuôi cấy chuẩn cho phép phát hiện Salmonella ở

ngưỡng 1 tế bào trong 25 g mẫu thực phẩm, thời gian cho kết quả là 5-7 ngày Qui

trình bao gồm các bước: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định (Hình 1.6)

Hình 1.6: Quy trình phân lập Samonella theo ISO 6579:2002

1.4.1 Tiền tăng sinh

Ủ trực tiếp mẫu thực phẩm cần phân tích vào môi trường tăng sinh chọn lọc thường khó phục hồi các vi sinh vật mong muốn do:

 Một số tế bào khỏe mạnh thường bị chết trong môi trường tăng sinh chọn lọc [8] Khi chúng có số lượng thấp, chúng có thể bị giết chết toàn bộ Nuôi cấy tiền tăng sinh cho phép số lượng vi khuẩn tăng lên vì thế giúp

làm giảm tác động này

 Tế bào tổn thương nhạy cảm hơn tế bào khỏe mạnh khi tiếp xúc với các tác nhân chọn lọc Phần lớn kỹ thuật làm giàu khi nghiên cứu thường dùng các

tế bào khỏe mạnh nên tế bào bị tổn thương có thể khó hồi phục tại nồng độ của các tác nhân chọn lọc sử dụng trong môi trường tăng sinh Trong trường hợp này, giai đoạn tiền tăng sinh cho phép các tế bào đích sửa chữa tổn thương và giúp chúng lấy lại khả năng đề kháng với các tác nhân chọn lọc trước khi tiếp xúc với chúng trong môi trường tăng sinh [8]

Theo ISO 6579, đệm peptone là môi trường được lựa chọn sử dụng cho các loại

mẫu thực phẩm Để tăng khả năng phát hiện Salmonella trên các nền mẫu thực phẩm

phức tạp, môi trường tiền tăng sinh có thể được bổ sung thêm một số thành phần nhưsữa gầy, tergitol 7, hay các chất kháng khuẩn (xanh malachie, xanh brilliant, tím crystal)

Bảng 1.4: Môi trường tiền tăng sinh cải tiến cho một số dạng mẫu phức tạp [9] Dạng thực phẩm Môi trường tiền tăng sinh Tác dụng

hoặc kiềm cao

Chỉnh pH môi trường tiền tăng sinh về 6,6-7,0 trước khi ủ

Trung hòa axit hoặc kiềm

thảo dược, gia vị (quế,

đinh hương…) và mật ong

Pha loãng mẫu 100 lần với nước đệm pepton, ví dụ:

25g+2475ml

Giảm sự ức chế

Salmonella

1.4.2 Tăng sinh chọn lọc

Giai đoạn tăng sinh chọn lọc có mục đích ức chế sự phát triển của các sinh vật

khác và tạo điều kiện để Salmonella tăng sinh

Các môi trường tăng sinh chọn lọc thường dùng để phát hiện Salmonella trên

nền mẫu thực phẩm là môi trường Tetrathionate Mueler Kauffmanm (TT) và môi trường Rappaport Vassiliadis (RV)

- Môi trường tetrathionate (TT): Môi trường này chỉ tác động đến các tế bào đang tăng trưởng khi có sự hiện diện của thiosulfate và tetrathionate ở một tỉ

lệ nhất định [32] Tuy nhiên, cơ chế thực sự của tác động gây chết này không được biết rõ Một số nghiên cứu cho rằng tetrathionate và thiosulfate phản ứng với nhóm sulfhydryl tự do nên chúng sẽ can thiệp vào quá trình tổng hợp và hoạt động của các enzyme có chứa lưu huỳnh cũng như các thành

phần vách và màng tế bào [33],[35] Một số vi sinh vật như Salmonella, Proteus, Entrobacter và Pseudomonas aeruginosa có thể mang enzyme khử

tetrathionate làm thay đổi tỉ lệ hỗn hợp thiosulfate-tetrathionate nên ít bị tác động bởi môi trường này Nhằm chọn lọc Salmonella tốt hơn, Kauffmann đã

thêm dung dịch xanh brilliant và muối mật để ức chế vi khuẩn Gram dương

và một số vi khuẩn Gram âm khác, trong đó có Proteus spp Môi trường này

tiếp tục được cải tiến thành môi trường MKTT (thêm dịch nấm men) và

MKTTn (thêm dịch nấm men và novobiocin) để tăng sự ức chế Proteus spp Tuy nhiên, các biến đổi môi trường nhằm loại trừ Proteus có thể gia tăng các

nguy cơ khác Khi chất dinh dưỡng trong môi trường tăng sẽ làm tăng sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh Khi thêm kháng sinh hay xanh

brilliant sẽ làm ức chế sự phát triển của 1 vài chủng Salmonella như S Typhi, S Paratyphi, S Typhimurium và S Dublin Do vậy , BAM khuyến

cáo nên ủ môi trường ở 43oC khi phân tích các mẫu thực phẩm tươi chứa hệ

vi sinh vật cao để tăng tính chọn lọc [6]

- Môi trường Rappaport Vassiliadis (RV):

Môi trường Rappaport tăng sinh chọn lọc Salmonella dựa trên khả năng tồn

tại ở áp suất thẩm thấu tương đối cao, tăng trưởng ở pH thấp, đề kháng tương đối với xanh malachite và nhu cầu dinh dưỡng thấp hơn các vi sinh vật khác Magiê clorua dùng tăng áp suất thẩm thấu của môi trường và pH của môi trường là 5,5 [41] Do độc tính của xanh malachite, Vassiliadis đã cải tiến môi trường này bằng cách giảm nồng độ xanh malachite và tăng nhiệt độ ủ lên 43oC thay vì 37oC như môi trường Rappaport Môi trường mới có tên

Rappaport-Vassiliadis Sau đó, để tăng khả năng phát hiện Salmonella,

Peterz đã ủ môi trường ở nhiệt độ 41,5  0,5C trong 24 giờ Môi trường này tiếp tục được biến đổi thành Rappaport Vassiliadis soya peptone bằng cách

thay tryptone bằng soya peptone để tăng khả năng phát hiện Salmonella [23]

1.4.3 Phân lập trên môi trường thạch chọn lọc

Phân lập trên môi trường thạch chọn lọc có mục đích ức chế sự phát triển của

các vi khuẩn khác, giúp phân biệt dễ dàng vi khuẩn Salmonella cần phân lập với các vi

khuẩn khác cũng có khả năng hình thành khóm

Thạch chọn lọc dựa vào các tác nhân chọn lọc, hệ thống chỉ thị khác nhau để có

thể phân biệt dễ dàng vi khuẩn Salmonella cần phân lập với các vi khuẩn khác cũng có

khả năng hình thành khóm Sự khác biệt về hình thái không chỉ làm tăng khả năng phân lập mà còn làm giảm số lượng các khóm cần sàng lọc bằng các phản ứng sinh hóa Hai đặc tính thường được sử dụng là khả năng lên men carbohydrate và sự tạo thành hydrogen sulfide Hiện nay, thạch XLD và HE là hai loại môi trường phổ biến

nhất dùng phân lập Salmonella Quy trình nuôi cấy chuẩn ISO 6579:2002 khuyến cáo

sử dụng thạch chọn lọc XLD Môi trường này chứa dịch chiết nấm men để cung cấp nguồn nitơ và vitamin cho quá trình tăng trưởng và Sodium deoxycholate là tác nhân chọn lọc, ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram dương Lactose, sucrose và xylose

là nguồn carbohydrate cho vi sinh vật sử dụng cho quá trình lên men Sự phân hủy

xylose, lactose và sucrose tạo ra axit khiến môi trường chuyển từ đỏ phenol sang màu

vàng Shigella không có khả năng lên men xylose, lactose và sucrose nên sẽ cho các khuẩn lạc màu đỏ Trong khi đó, Salmonella chỉ sử dụng được nguồn xylose Khi nguồn xylose cạn kiệt, Salmonella spp có mang ensym lysine-decarbocylase sẽ

decarboxyl hóa lysine khiến pH môi trường kiềm trở lại và hình thành các khuẩn lạc

màu đỏ tương tự Shigella Để ngăn chăn sự kiềm hóa trở lại gây ra bởi các vi sinh vật

khác cũng mang enzyme này, môi trường đã được bổ sung một lượng dư lactose và

sucrose Để phân biệt Salmonella với Shigella, môi trường có thêm hệ thống chỉ thị

hydrogen sulfite (H2S) cho Salmonella bằng cách bổ sung Sodium thiosulfate và ferric ammonium citrate Salmonella khử Sodium thiosulfate tạo thành H2S, khí này tác dụng

với sắt cho tủa màu đen Kết quả Salmonella sẽ cho các khuẩn lạc màu đỏ tâm đen trên môi trường này Riêng các S Paratyphi A, S Choleraesuis, S Pullorum and S

Gallinarum không có khả năng tạo H2S, sẽ cho các khuẩn lạc đỏ giống như Shigella

Như vậy,môi trường này có thể phân lập hầu hết các chủng Salmonella Tuy nhiên một

số chủng dương tính với lactose (cho khuẩn lạc màu vàng) hay âm tính với H2S (khuẩn

lạc không có tâm đen) có thể bị bỏ qua Do đó, để không bỏ sót các chủng Salmonella,

nên sử dụng 2 thậm chí đến 3 môi trường phân lập khác nhau [6]

Để tăng khả năng phát hiện Salmonella, thạch XLT-4, được cải tiến từ thạch

XLD bằng cách bổ sung Tergitol 4 (7-ethyl-2methyl-4-undecanol hydrogensulfate

sodium salt) đóng vai trò là chất ức chế chọn lọc của các loài Proteus (cũng có khả

năng sinh H2S và cho hình thái khuẩn lạc giống Salmonella) và các loài không phải Salmonella Trên thạch XLT-4, Salmonella cho khuẩn lạc tâm đen, dễ dàng phân biệt với các Citrobacter spp., cho khuẩn lạc màu vàng có kích thước nhỏ hơn [23]

1.4.4 Khẳng định bằng phản ứng sinh hóa và huyết thanh học

Mục đích khẳng định là để xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella

trên môi trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh học đặc trưng

Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol

(+), lysine decarboxylase (+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+) Các thử nghiệm sinh hóa nuôi cấy chuẩn trong ống nghiệm cho kết quả sau 3 ngày Hiện nay, các phương pháp này đã được thay thế bằng bảng phản ứng thu nhỏ như Api 20 (Hình 1.7), hay các hệ thống bán tự động với thời gian xác định chỉ còn 18-21 giờ hay hệ thống tự động dựa vào các phản ứng huỳnh quang cho kết quả rất nhanh từ 2-4 giờ như hệ thống Micro Scan Walkaway, Vitek, Phoenix [27]

Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá

Hình 1.7: Các thử nghiệm trên strip Api 20

1.5 MÔI TRƯỜNG THẠCH MÀU DÙNG PHÂN LẬP SALMONELLA

Việc phân lập và phát hiện Salmonella trên các môi trường chọn lọc cổ điển có một số hạn chế như thiếu màu sắc riêng cho Salmonella nên khó phân biệt nó với các

vi sinh vật khác khi chúng có hình thái khuẩn lạc tương tự nhau Do đó, người ta thường thêm vào môi trường phân lập cổ điển như XLD một số cơ chất màu đặc hiệu cho các enzyme đặc trưng của một số loại vi khuẩn đã trở thành hệ thống chỉ thị quan

trọng giúp dễ dàng phân biệt Salmonella với các vi sinh vật tạp nhiễm

1.5.1 Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme galactosidase [23]

Người ta đã phát triển các môi trường thạch màu dựa trên đặc điểm Salmonella

không sản xuất enzyme β-D-galactosidase trong khi các coliform khác có khả năng sản

xuất enzyme này Ngoài ra, Salmonella có khả năng sản xuất enzyme

-D-galactosidase trong khi các coliform khác không sản xuất enzyme này

Môi trường thạch màu được phát triển đầu tiên là thạch Rambach Trên môi

trường này, các khuẩn lạc Salmonella có khả năng tạo acid từ propylene glycol Trong

sự hiện diện của một chỉ thị pH, các khuẩn lạc Salmonella sẽ có màu đỏ đặc trưng

Các coliform có enzyme β-D-galactosidase mà xúc tác phản ứng cắt cơ chất tạo màu X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β-D-galactopyranoside) cho khuẩn lạc màu xanh

(Hình 1.8) Proteus cho khuẩn lạc không màu Hạn chế của môi trường này là các chủng Salmonella enterica subspecies arizonae, Salmonella enterica subspecies diarizonae và S bongori có enzym β-D-galactosidase, vì thế vẫn hình thành khuẩn lạc màu xanh Hơn nữa một số kiểu huyết thanh Salmonella như S Typhi, S Paratyphi A

và S Paratyphi B không thể tạo acid từ propylene glycol do đó tạo ra các khuẩn lạc

3,4-cyclohexenoaesculetin-β-D-Gal) Cơ chất CHE-GAL phản ứng với enzyme β-galactosidase tạo ra từ các coliform khi có sự hiện diện của sắt sẽ hình thành khuẩn lạc màu đen Cơ chất X--Gal bị các

chủng Salmonella thủy phân tạo khuẩn lạc màu xanh lá.

1.5.2 Môi trường thạch màu dựa trên khả năng tạo enzyme esterase

Vào đầu những năm 1990 , một số tác giả đã chứng minh rằng phần lớn các

chủng Salmonella của tất cả các loài và các týp huyết thanh có khả năng cắt các ester

của axit béo chứa 7 đến 10 nguyên tử carbon Rất ít vi khuẩn đường ruột sản xuất enzyme này

Thạch CSE (Chromogenic Esterase) chứa dimethoxyphenyl) vinyl]quinolinium-1-(propan-3-yl-carboxylic acid) bromide (còn

4-[2-(4-octanoyloxy-3,5-được gọi là SLPA octanoate ở dạng bromide) Trên môi trường này, Salmonella thủy phân ester trên tạo ra các khuẩn lạc màu đỏ, các chủng không phải Salmonella cho

khuẩn lạc màu trắng, vàng đến trong suốt Độ nhạy và độ đặc hiệu của CSE cho kết

quả cao hơn thạch Rambach, XLD, HE và SMID (Salmonella Detection and

Identification) [13]

1.5.3 Môi trường thạch màu kết hợp cả hai đặc tính tạo enzyme galactosidase và enzyme esterase

Thạch Compass Salmonella, CHROMagar Salmonella, Salmonella chromogenic

agar (SCA) đều chứa 2 cơ chất: X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D galactopyranoside) và magenta-caprylate (5-bromo-6-chloro-3-indolyl-caprylate)

Enzyme esterase của Salmonella thủy phân cơ chất magenta-caprylate tạo khuẩn lạc

màu hồng tím X-gal là cơ chất kết hợp với enzyme β-D-galactosidase của vi sinh vật

thuộc họ Enterobacteriaceae tạo khuẩn lạc xanh Các vi sinh vật khác không phản ứng

với các cơ chất màu cho khuẩn lạc không màu

Hình 1.9: Cơ chế hiện màu của Salmonella trên môi trường có bổ sung

Magenta-caprylate [51]

Thạch SMID chứa 2 cơ chất màu: X-gal để phát hiện hoạt tính β-galactosidase

và glucuronate (X-Glu) để phát hiện hoạt tính β-glucosidase Salmonella không sản

xuất hai enzyme này vì thế nó sẽ cho các khuẩn lạc màu hồng trong khi các vi khuẩn

thuộc họ Enterobacteriaceae sẽ cho các khuẩn lạc có màu từ xanh đến tím Để cải

thiện khả năng ứng dụng của thạch SMID, BioMerieux đã bổ sung vào thạch cơ chất

màu thứ 3, để có thể phát hiện hoạt tính esterase của Salmonella spp Môi trường mới này được gọi là SMID2 (hoặc CHROMID Salmonella) và có thể cho phép phân biệt tốt hơn Salmonella và các khuẩn lạc cạnh tranh

Môi trường thạch màu Brilliance Salmonella agar (BSA): Chứa hai cơ chất màu

của enzyme esterase và β-glucosidase Một số vi khuẩn đường ruột bao gồm

Klebsiella, Enterobacter có enzyme β-glucosidase Khi những vi khuẩn này tăng

trưởng, chúng sẽ tạo thành khuẩn lạc màu xanh cả trong trường hợp chúng có enzyme

eterase giúp phân biệt dễ dàng với khuẩn lạc Salmonella có màu tím BSA còn chứa 1 hợp chất Inhibigen để ức chế sự tăng trưởng của E coli Inhibigen là một hợp chất

không độc do đó có thể tồn tại trong môi trường và không làm tổn hại đến các vi sinh vật Khi hợp chất này vào tế bào, enzyme đặc hiệu sẽ ly giải chúng tạo thành một chất gây độc Chất này sẽ ức chế các chức năng quan trọng của tế bào gây ra cái chết của vi