Xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện hepatitis a virus (hav) trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật reverse transcription pcr

Đánh giá hiệu lực sơ cấp tại phòng kiểm nghiệm để xác định các thông số kỹ thuật của quy trình đã xây dựng, tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế để xác định khả năng tương đồng của quy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

ĐOÀN MINH QUÂN

XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN HEPATITIS A VIRUS (HAV) TRONG NHUYỄN THỂ BẰNG KỸ THUẬT REVERSE TRANSCRIPTION PCR

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 1 năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG - HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN TIẾN DŨNG

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS PHAN NGỌC HÒA

2 Thư ký hội đồng: TS PHAN THỊ HUYỀN

3 Ủy viên Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

4 Ủy viên Phản biện 2: TS HOÀNG MỸ DUNG

5 Ủy viên hội đồng: TS HOÀNG ANH HOÀNG

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: ĐOÀN MINH QUÂN MSHV: 7140292

Ngày, tháng, năm sinh: 16/09/1991 Nơi sinh: TPHCM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số : 60420201

I TÊN ĐỀ TÀI:

Xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện hepatitis A virus (HAV) trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật Reverse Transcription PCR

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xây dựng quy trình phát hiện HAV trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật Reverse Transcription PCR Đánh giá hiệu lực sơ cấp tại phòng kiểm nghiệm để xác định các thông số kỹ thuật của quy trình đã xây dựng, tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế để xác định khả năng tương đồng của quy trình này so với các phương pháp đang áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm khác trên thế giới Đồng thời khảo sát mức độ hiện diện của HAV trong các mẫu nhuyễn thể tại các vùng nuôi và trong các lô hàng nhuyễn thể 2 mảnh vỏ xuất khẩu

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/1/2016

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 08/11/2016

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN TIẾN DŨNG

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

 Em xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy TS NGUYỄN TIẾN DŨNG Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian em làm đề tài, tạo mọi điều kiện thuận lợi về tinh thần và cơ sở vật chất trong quá trình nghiên cứu, chỉnh sửa chu đáo nội dung và hình thức luận văn Đặc biệt, những chia sẻ về chuyên môn của Thầy giúp em có thêm động lực lớn để hoàn thành luận văn này

 Em xin chân thành cảm ơn Quí Thầy Cô của bộ môn Công Nghệ Sinh Học –

Đại học Bách Khoa TPHCM đã cung cấp những kiến thức quý báu, bổ ích trong suốt thời gian em học tập, quan tâm động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành và bảo vệ luận văn

 Em xin cảm ơn chú Nguyễn Đức Hùng, Ban Giám đốc, cùng các phòng ban

thuộc Trung tâm chất lượng Nông Lâm Thủy Sản vùng 4 – TPHCM đã tạo cho em điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu luận văn này

 Em xin cảm ơn tập thể phòng kiểm nghiệm Sinh học – Trung tâm chất lượng

Nông Lâm Thủy sản vùng 4 (anh Tiến Dũng, cô Vân Ánh, anh Hiểu, anh Việt Dũng, chị Yến Phương, chị Ngọc Thúy, chị Lan Phương, anh Viễn Phương, chị Hiền, chị Kiều, anh Lộc, anh Đô, bạn Phong, bạn Thiện, bạn Hòa, bạn

Vũ, bạn Sang, bạn Toàn, cô Thủy, chị Mai, chị Minh, chị Hương, chị Hoa) Cám ơn các anh chị, các bạn đã luôn giúp đỡ, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho việc học tập và hoàn thành luận văn của em

 Xin cảm ơn bạn Anh Tùng và bạn Hoàng Ngân Hai bạn đã luôn bên cạnh tôi, giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình tôi làm luận văn này

 Và, con xin gửi lời biết ơn đặc biệt đến Ba Mẹ Ba Mẹ đã luôn lo lắng, chăm

lo sức khỏe, cho con những lời động viên, cổ vũ tinh thần giúp con vượt qua những lúc con gặp khó khăn nhất Ba Mẹ là nguồn động lực lớn nhất để con bước tiếp hành trang của mình

(HAV) trong thực phẩm, xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp nhằm đánh giá khả năng áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm; áp dụng phương pháp đã xây dựng để giám sát sự ô nhiễm HAV trong nhuyễn thể thu hoạch tại các vùng nuôi thuộc chương trình giám sát quốc gia và các lô hàng thực phẩm từ nhuyễn thể 2 mảnh vỏ xuất khẩu HAV là loài virus gây bệnh viêm gan A ở người Virus này thường hiện diện trong môi trường nước bị ô nhiễm hữu cơ, chúng có khả năng tích tụ với số lượng lớn trong các loài nhuyễn thể, và gây ra các đợt bùng phát dịch bệnh khi con người ăn phải HAV là 1 trong 2 loài virus được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất trong các tác nhân gây bệnh cho người từ nhuyễn thể 2 mảnh vỏ Hiện nay, tại Việt Nam, nhuyễn thể 2 mảnh vỏ có nhiều tiềm năng

để phát triển Tuy nhiên, việc xuất khẩu các nguồn lợi thủy sản này vào các thị trường lớn như EU, Nhật Bản, Mỹ…còn gặp rất nhiều khó khăn Một trong những khó khăn đó là sự ô nhiễm HAV trong nhuyễn thể Với mục đích xây dựng phương pháp phát hiện HAV trên thực phẩm có thể áp dụng để phát hiện sự hiện diện HAV trong nhuyễn thể, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng và đánh giá phương pháp phát hiện HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR”

 Về phạm vi phòng thí nghiệm, chúng tôi đã:

- Nghiên cứu tính chuyên biệt của cặp mồi khuếch đại vùng gen VP3-VP1 trên

HAV Cặp mồi có độ chuyên biệt cao, được kiểm chứng in silico và intro

- Sử dụng kỹ thuật Reverse Transcription PCR (RT-PCR) để xây dựng phương pháp phát hiện HAV trên đối tượng là nhuyễn thể 2 mảnh vỏ với các điều kiện đã nghiên cứu tối ưu

- Đánh giá hiệu lực quy trình đã xây dựng thông qua việc xác định các thông số kỹ thuật Các thông số đã xác định được như sau: LOD50 là 5 PFU/g nội tạng; độ chính xác là 99,2%; độ nhạy là 100%; độ đặc hiệu là 98,4%; tỉ lệ dương tính giả 1,6%; âm tính giả là 0%

- Bước đầu thử nghiệm kỹ thuật RT-PCR một bước, đã tối ưu hóa được nồng độ buffer cho phản ứng RT và buffer cho phản ứng PCR

- Quy định đã được xác nhận hiệu lực thứ cấp thông qua việc tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về HAV và đạt kết quả loại A, kết quả các mẫu phân tích phù hợp với công bố của phòng thì nghiệm tổ chức quốc tế và các phòng thí nghiệm khác trên thế giới

- Phương pháp này cũng đã được áp dụng để khảo sát mức độ nhiễm HAV trong nghêu tại 2 vùng nuôi ờ Cần Giờ và Bến Tre và trong các lô hàng xuất khẩu Kết quả khảo sát cho thấy mức độ hiện diện HAV trong các mẫu nghêu tại vùng nuôi là 5-15%, tại các lô hàng xuất khẩu là 12,5%

Our study aims to develop the method for detection Hepatitis A virus (HAV) in food, determine the parameters of the method that applicable laboratory This method was developed so that control HAV in aquaculture areas of national surveillance programs and Vietnam’s bivalve mollusk export products HAV is a liver disease virus in human HAV

is often present in the polluted environment, they are able to accumulate large quantities of shellfish, and cause disease outbreaks when people consume them HAV known as one of two agent of the most interesting studied pathogens for for human by bivalve mollusk Currently, in Vietnam, bivalve mollusk have great potential for development However, the export of aquatic resources into EU, Japan, USA …has many difficulties One of the difficulties that HAV contaminated in bivalve mollusk This research is method of detection HAV in food can be applied to detect the presence of HAV in mollusk samples The name of research is: "Development and evaluation method of detecting HAV on bivalve mollusks by RT-PCR technique"

 The scope of the laboratory:

- Research and specificity of primers that amplificate VP3-VP1 gene region in HAV genome Primers had high specificity, verified in silico and in vivo

- Using Reveser Trancription PCR technique (RT-PCR) to study the method for detection HAV on bivalve mollusks with the reaction parameters optimal research

- Evaluating the effective method through the identification of technical parameters The parameters have been identified as follows: LOD50 is 5 PFU/g digestive; accuracy of 99.2%; sensitivity of 100%; specificity of 98.4%; 1.6% of false-positive rate; 0% of false negative rate

- Approaching research One-step RT-PCR, have been optimized for the concentrations RT reaction buffer and PCR reaction buffer

- This method was confirmed through appreciated proficiency test of HAV and achieve Class A, results of sample analysis matched with the announcement of reference labolatories and another laboratories around the world

- This method has also been applied to examine the HAV infection in clams in 2 clam farming areas (Ben Tre, Can Gio) and in export products The result of survey showed that the HAV infection in Ben Tre and Can Gio (5-15%) and HAV infection in clams export products (12,5%)

 The scope of practice:

- Method has developed are being applied to detection HAV in food at Biology Laboratory - the National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department Branch

4 (NAFIQAD 4)

- This method is recommended to control the HAV infection in clams at the farming areas, harvested areas under the national surveillance programs for bivalve mollusks in Can Gio and Ben Tre

Lời cam đoan của tác giả luận văn

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả mà tôi đưa ra trong luận văn này là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Đoàn Minh Quân

MỤC LỤC

Danh mục Bảng……….i

Danh mục Hình ảnh, Sơ đồ……… iii

Danh mục chữ viết tắt………v

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN 5

1.1/ Tổng quan về virus viêm gan A 6

1.1.1/ Lịch sử phát hiện HAV 6

1.1.2/ Đặc điểm sinh học của HAV 7

1.1.2.1/ Phân loại 7

1.1.2.2/ Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV 7

1.1.2.3/ Vị trí kháng nguyên HAV 10

1.1.2.4/ Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy 10

1.1.2.5/ Khả năng tồn tại của HAV 12

1.1.3/ Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm gan siêu vi A 13

1.1.3.1/ Bệnh mẫu và bệnh sinh 13

1.1.3.2/ Dịch tễ học 14

1.1.4/ Tình hình nhiễm virus HAV trên thế giới và Việt Nam 16

1.1.4.1/ Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.1.4.2/ Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 18

1.1.5/ Ngăn ngừa HAV 19

1.2/ Các phương pháp phát hiện HAV 21

1.2.1/ Phương pháp nuôi cấy tế bào và phát hiện kháng nguyên 21

Trang

1.2.2/ Phương pháp phát hiện bằng khuếch đại nucleic acid 23

1.3/ Xác nhận hiệu lực phương pháp 23

1.3.1/ Sơ lược về xác nhận hiệu lực phương pháp 23

1.3.1.1/ Khái niệm 23

1.3.1.2/ Các bước xác nhận hiệu lực phương pháp 24

1.3.2/ Các thông số kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp định tính 25

1.3.2.1/ Độ chính xác (Accuracy) 25

1.3.2.2/ Độ nhạy (Sensitivity) 25

1.3.2.3/ Độ đặc hiệu (Specificity) 25

1.3.2.4/ Âm tính giả (False negative) 25

1.3.2.5/ Dương tính giả (False positive) 25

1.3.3/ Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp 26

2 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 27

2.1/ Vật Liệu 28

2.1.1/ Thiết bị chính 28

2.1.2/ Hoá chất, môi trường 28

2.1.2.1/ Hóa chất dùng cho tách chiết RNA virus 28

2.1.2.2/ Hóa chất dùng cho phản ứng Reverse Transcription (RT) 29

2.1.2.3/ Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 29

2.1.2.4/ Hóa chất khác 29

2.1.3/ Vật liệu thí nghiệm 30

2.1.3.1/ Trình tự các cặp mồi phát hiện HAV 30

2.1.3.2/ Thang DNA 30

2.1.3.3/ Nền mẫu NT2MV sử dụng cho nghiên cứu 31

2.1.3.4/ Chủng virus, vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 31

2.2/ Phương pháp 33

2.2.1/ Công cụ tin sinh học 33

2.2.1.1/ Cơ sở dữ liệu NCBI 33

2.2.1.2/ Chương trình BLAST 34

2.2.2/ Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật sinh học phân tử 35

2.2.2.1/ Phương pháp chiết tách và tinh sạch RNA virus 35

2.2.2.2/ Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 41

2.2.2.4/ Điện di và phân tích sản phẩm khuếch đại 46

2.2.3/ Xác nhận hiệu lực phương pháp phân tích HAV trong NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR 48

2.2.3.1/ Xác định giới hạn phát hiện (LOD 50 ) 48

2.2.3.2/ Độ chính xác 49

2.2.3.3/ Độ nhạy 51

2.2.3.4/ Độ đặc hiệu 51

2.2.3.5/ Tỷ lệ Âm tính giả (False negative – FN)và tỷ lệ Dương tính giả (False positive - FP) 51

2.2.5/ Khảo sát sơ bộ phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 1 bước (One-Step RT-PCR) 52

2.2.4/ Khảo sát tỷ lệ lưu hành HAV trong mẫu NT2MV tại Cần Giờ và Bến Tre55 2.2.5/ Tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về HAV 56

2.2.6/ Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 57

3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 58

3.1/ Kiểm tra tính chuyên biệt và đặc hiệu của cặp mồi đã chọn bằng công cụ BLAST 59

3.1.1/ Kiểm tra tính chuyên biệt của cặp mồi khuếch đại gen VP3-VP1 của

HAV bằng công cụ BLAST 59

3.1.2/ Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại đoạn gen VP3-VP1 với các vi sinh vật khác bằng công cụ BLAST 61

3.1.3/ Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi phát hiện HAV đã chọn 62

3.2/ Xây dựng quy trình phân tích HAV bằng phương pháp RT-PCR 64

3.2.1/ Khảo sát thời gian ủ mẫu với dung dịch làm việc (working solution) 64

3.2.2/ Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 đến phản ứng RT 65

3.2.3/ Khảo sát đồng thởi ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi đến phản ứng PCR 67

3.2.4/ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA trong phản ứng PCR 69

3.3/ Đề xuất quy trình phát hiện HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR70 3.3.1/ Xử lý nền mẫu nhuyễn thể và tách chiết, tinh sạch RNA virus 70

3.3.2/ Phản ứng RT 71

3.3.2.1/ Ủ mẫu với mồi ngẫu nhiên (Random primer) 71

3.3.2.2/ Phản ứng RT 71

3.3.3/ Phản ứng PCR 72

3.3.4/ Phân tích sản phẩm PCR 73

3.3.5/ Diễn giải kết quả 73

3.4/ Đánh giá hiệu lực sơ cấp của quy trình phát hiện HAV trên mẫu NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR đã đề xuất 75

3.4.1/ Xác định giới hạn phát hiện (LOD 50 ) 75

3.4.2/ Xác định các thông số kỹ thuật khác của phương pháp RT-PCR đã được thiết lập 76

3.4.2.1/ Độ chính xác (Accuracy) 77

3.4.2.2/ Độ nhạy (Sensitivity) 77

3.4.2.3/ Độ đặc hiệu (Specificity) 77

3.4.2.4/ Tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả 77

3.5/ Đánh giá hiệu lực thứ cấp của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR thông qua tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế 78

3.6/ Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR 83

3.7/ Khảo sát tỷ lệ lưu hành HAV trong mẫu NT2MV tại Cần Giờ và Bến Tre 85 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 87

4.1/ Kết luận 88

4.2/ Kiến nghị 89

TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

TÀI LIỆU WEB 97

PHỤ LỤC

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Danh mục Bảng

Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn được sử dụng trong nghiên cứu 30

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật dùng trong thí nghiệm 32

Bảng 2.3 Thao tác thực hiện và thành phần phản ứng RT 41

Bảng 2.4 Chương trình phản ứng RT đã được tối ưu hóa 43

Bảng 2.5 Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 44

Bảng 2.6 Khảo sát đồng thời nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi tối ưu trong thành phần phản ứng PCR 45

Bảng 2.7 Chương trình chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 46

Bảng 2.8 Cách diễn giải kết quả khuếch đại dựa trên hình chụp bảng gel điện di 47

Bảng 2.9 So sánh kết quả thử khẳng định 50

Bảng 2.10 Khảo sát đồng thời 2 nồng độ thành phần trong phản ứng One-Step RT-PCR 53

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng One-Step RT-PCR 54

Bảng 2.12 Chương trình phản ứng One-Step RT-PCR 55

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi phát hiện HAV khi khuếch đại với các chủng vi sinh vật khác 63

Bảng 3.2 Kết quả sự ảnh hưởng thời gian ủ mẫu với Working solution 64

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nồng độ mồi và MgCl 2 lên phản ứng PCR 68

Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp phản ứng RT đề xuất 71

Bảng 3.5 Chương trình phản ứng RT đề xuất 72

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR đề xuất 72

Bảng 3.7 Chương trình phản ứng PCR 72

Bảng 3.8 Kết quả LOD 50 của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 75

Bảng 3.9 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 77

Bảng 3.10 So sánh các thông số đánh giá phương pháp với các tiêu chuẩn công bố 77

Trang

Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của phương pháp phát hiện HAV

bằng kỹ thuật RT-PCR giữa phòng kiểm nghiệm Sinh học và CEFAS 80

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của các phòng thí nghiệm trên thế

giới đối với mẫu SF1, SF2, SF3, SF4 81

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của các phòng thí nghiệm trên thế

giới đối với mẫu L1, L2 82

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát 2 thành phần buffer trong phản ứng One-step RT-PCR 83 Bảng 3.15 Kết quả khảo sát mẫu nghêu thực tế bằng phương pháp phát hiện HAV trên

nhuyễn thể áp dụng kỹ thuật RT-PCR đã xây dựng 85

Danh mục Hình ảnh, Sơ đồ

Hình 1.1 HAV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử (x 400.000)……….7

Hình 1.2 Hình dạng hạt virus và cấu trúc các tiểu đơn vị tạo nên vỏ capsid HAV 8

Hình 1.3 Tổ chức bộ gen của HAV 8

Hình 1.4 Sự nhân bản HAV trong tế bào chủ……… 9

Hình 1.5 Mối tương quan giữa HAV và các yếu tố đáp ứng miễn dịch 14

Hình 1.6 Biểu đồ tỷ lệ kháng HAV trên toàn thế giới Error! Bookmark not defined Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus 31

Hình 2.2 Vị trí lấy mẫu nội tạng nghêu (A) và mẫu nội tạng sau khi đã tách rời (B) 35 Hình 2.3 Nội tạng NT2MV sau khi tách được đặt trong ống falcon 36

Hình 2.4 Mẫu nội tạng tách sạch (A), mẫu nội tạng tách chưa sạch (B) sau khi ly tâm 3000xg/5 phút 36

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt các bước tách chiết, tinh sạch RNA virus bằng High Pure RNA Viral kit 38

Hình 2.6 Sơ đồ quy trình khảo sát ảnh hưởng MgCl 2 đến phản ứng RT 43

Hình 2.7 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát đề tài 57

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra bằng BLAST trình tự gen VP3-VP1 với trình tự bộ gen của các chủng HAV trên ngân hàng gen của NCBI 60

Hình 3.2 Kết quả so sánh bằng công cụ BLAST trình tự đoạn DNA khuếch đại của gen VP3-VP1 với bộ gen các loài vi sinh vật khác 61

Hình 3.3 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện HAV với các chủng vi sinh vật khác 62

Hình 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 lên phản ứng RT 66

Hình 3.5 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ mồi và nồng độ MgCl 2 lên phản ứng RT-PCR phát hiện HAV (A và B) 67

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn DNA lên phản ứng PCR 69

Hình 3.7 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR 74

Trang

Hình 3.8 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế về phát hiện HAV trong các mẫu thử

nghiệm 80

Hình 3.9 Kết quả gel điện di khảo sát 2 thành phần buffer trong phương pháp phát

hiện HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR 84

Danh mục chữ viết tắt

CEFAS Center for Environment Fisheries and Aquaculture Science

CDC Center for Disease Control and Prevention

NCBI National Center for Biotechnology Information

RT-PCR Reverse Trancription - Polymerase Chains Reaction

TCID50 Tissue culture infective dose 50

ssRNA single strain ribonucleic acid

LỜI MỞ ĐẦU

Hepatitis A virus (HAV) là virus gây bệnh viêm gan A, một trong 5 dòng virus gây viêm gan trên người hiện nay Tuy chúng không gây nguy hiểm cho người như virus viêm gan B hay virus viêm gan C, nhưng HAV lại có khả năng bùng phát thành

dịch lớn và lây lan trên mọi đối tượng Cùng với Norovirus, HAV là loài virus được

quan tâm nghiên cứu nhiều nhất trong các tác nhân gây bệnh cho người khi tiêu thụ các loài nhuyễn thể 2 mảnh vỏ HAV được quan tâm bởi các nhà nghiên cứu về bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường và an toàn vệ sinh thực phẩm Về bệnh học, HAV được quan tâm nhiều đến đặc điểm, cách thức, liều lượng gây bệnh, đặc điểm phân loại, kháng nguyên, biểu hiện lâm sàng, phương pháp chẩn đoán và phương pháp điều trị

Về khía cạnh dịch tễ học và vệ sinh môi trường, HAV được quan tâm nghiên cứu các đặc điểm phân bố trong môi trường, đặc điểm lây truyền và gây dịch…Về an toàn vệ sinh thực phẩm, HAV là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NT2MV) vì chúng có khả năng được tích tụ trong các loài động vật này với liều lượng rất cao và có khả năng gây bệnh viêm gan cấp tính trên người nếu tiêu thụ thực phẩm

bị nhiễm nhưng không được nấu chín kỹ Khi đó chúng gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm khi hiện diện với mức độ cao Tại các nước phát triển, mức độ lưu hành HAV là rất thấp Ngược lại, tại các nước đang phát triển thì mức độ lưu hành HAV ở mức độ cao Điều này được giải thích là do cơ sở hạ tầng về vệ sinh công cộng còn ở mức độ thấp, vấn đề an toàn thực phẩm chưa được nâng cao và quản lý chặt chẻ, quản lý nguồn nước chưa tốt Do đó, các khu vực như EU, Bắc Mỹ, Nhật Bản rất e ngại trong việc nhập khẩu các sản phẩm NT2MV từ các vùng nuôi bị ô nhiễm, nếu không được chú ý

và kiểm soát nghiêm ngặt HAV tồn tại trong NT2MV có thể lây lan và dễ đang bùng phát dịch trên người tại các nước phát triển với mức độ nhanh chóng

Ở Việt Nam, nguồn nước thải có chứa nhiều yếu tố có nguy cơ gây bệnh đang trực tiếp xả vào môi trường mà không qua bước xử lý hoặc xử lý chưa đạt yêu cầu Một

số nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các virus có trong phân nhiễm vào trong nước

thải không thể bị bất hoạt hoàn toàn thông qua quá trình xử lý nước thải [47,55] Động vật thân mềm hai mảnh vỏ như hàu, sò, hến, nghêu là loài ăn lọc, do đó, các tác nhân gây bệnh như virus đường ruột, có khả năng hiện diện với số lượng lớn trong nội tạng,

bộ phận tiêu hóa của các loài động vật ăn lọc này [17,47,61], và có thể gây bùng phát dịch bệnh do tiêu thụ các loài này khi chưa qua nấu chín Một trong các tác nhân virus gây bệnh dịch đó là HAV

Hiện nay, rất ít các phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm tại Việt Nam có khả năng phát hiện HAV trong thực phẩm nói chung và trong nhuyễn thể nói riêng Các công trình nghiên cứu về HAV có số lượng rất ít và cũng chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát Nguồn lợi về nhuyễn thể nước ta vô cùng lớn, thị trường xuất khẩu các mặt hàng này ngày càng rộng mở Tuy nhiên, hàng rào kỹ thuật về kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm tại các thị trường nhập khẩu càng ngày càng chặt chẽ và khó khăn, nhất là việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh, trong đó có tác nhân virus lây truyền qua đường thực phẩm

Trước yêu cầu thực tiễn như trên, với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện HAV trong NT2MV, được sự đồng ý của Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM và cán

bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ

QUY TRÌNH PHÁT HIỆN HEPATITIS A VIRUS (HAV) TRONG NHUYỄN THỂ BẰNG KỸ THUẬT REVERSE TRANSCRIPTION PCR”

Mục tiêu của đề tài:

- Thiết lập quy trình và đánh giá khả năng áp dụng để phát hiện HAV trong thực phẩm bằng kỹ thuật RT–PCR Áp dụng quy trình đã xây dựng vào việc phân tích HAV trong thực phẩm, đặc biệt là mẫu NT2MV xuất khẩu

- Đồng thời áp dụng quy trình này vào việc giám sát vùng nuôi NT2MV tại vùng Cần Giờ và Bến Tre, qua đó đánh giá mức độ ô nhiễm HAV ở 2 vùng này, làm cơ

sở đề xuất đưa chỉ tiêu này vào chương trình giám sát quốc gia các vùng nuôi và thu hoạch NT2MV có kiểm soát

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

- Phương pháp phân tích HAV đã được xác nhận hiệu lực là công cụ cho các phòng kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm áp dụng để kiểm soát chất lượng cho sản phẩm có giá trị kinh tế cao này

- Đề tài góp phần đảo đảm an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, phòng tránh được tác nhân gây bệnh HAV

- Tránh thiệt hại về kinh tế cho tổ chức, cá nhân sản xuất kinh doanh do thu hoạch NT2MV tại những vùng không đảm bảo vệ sinh an toàn Ngăn ngừa sự lẫn lộn của NT2MV được thu hoạch từ vùng chưa được kiểm soát và vùng đã được kiểm soát

- Thúc đẩy xuất khẩu NT2MV, nâng cao uy tín và duy trì sự phát triển bền vững của thủy sản Việt Nam

- Xây dựng quy trình hoàn chỉnh, bước đầu kiểm soát mối nguy HAV trong các

lô hàng NT2MV xuất khẩu

Nội dung nghiên cứu:

- Xác định tính chuyên biệt của cặp mồi dùng cho quy trình phát hiện HAV trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR

- Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ưu trong các bước tách chiết và tinh sạch RNA virus, thực hiện phản ứng RT, thực hiện phản ứng khuếch đại gen mục tiêu của HAV bằng kỹ thuật RT-PCR

- Đề xuất quy trình phân tích phát hiện HAV trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR

- Đánh giá hiệu lực sơ cấp quy trình phát hiện HAV trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR đã đề xuất

- Bước đầu khảo sát phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR 1 bước (One-step RT-PCR)

- Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để khảo sát mức độ hiện diện HAV trong các mẫu vùng nuôi và mẫu lô hàng của 2 vùng thu hoạch NT2MV đƣợc kiểm soát

- Áp dụng quy trình phát hiện HAV đã xây dựng để tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế về Norovirus và HAV

1 TỔNG QUAN

1.1/ Tổng quan về virus viêm gan A

1.1.1/ Lịch sử phát hiện HAV

Dựa theo lịch sử y khoa, bắt đầu từ thế kỷ thứ 5 trước Công Nguyên loài người

có những miêu tả về những trận dịch vàng da (jaundice outbreaks) xảy ra tại nhiều nơi khác nhau trên thế giới, nhất là ở những thành phố lớn đông dân cư hoặc ở những trại lính chật chội Người bệnh đang sống rất khỏe mạnh, bỗng dưng bị đau bụng, tiêu chảy

và biểu hiện vàng da [7]

Trong Thế Chiến thứ 2, một cơn dịch cảm cúm đã lây lan nhanh chóng với khoảng 200.000 người Mỹ và hơn 5 triệu người dân địa phương bỗng dưng ngã bệnh Lúc bấy giờ người ta chưa hiểu rõ nguyên nhân một cách chính xác, họ cho rằng bệnh nhân bị ngộ nước hoặc trúng độc Vào những năm 1930, với sự phẫu thuật lấy tế bào gan – sinh thiết gan (liver biopsy) để khám nghiệm dưới kính hiển vi, y khoa đã tiến một bước rất dài trong việc xác định bệnh viêm gan

Nhưng tới năm 1973 người ta mới nhận ra được sự có mặt của virus viêm gan A trong cơ thể của người bệnh thông qua việc nuôi cấy tế bào Một trong những nguyên nhân phổ biến của bệnh viêm gan cấp tính là do virus viêm gan A (HAV), được nghiên cứu bởi Purcell vào năm 1973.Năm 1980, các nhà khoa học khẳng định sự hiện diện của virus này bằng các phản ứng ngưng kết huyết thanh Từ đó dịch tễ học, lâm sàng,

sự phát hiện trong tự nhiên của virus viêm gan A đã trở nên rõ ràng hơn Kết quả nghiên cứu này dẫn đến sự phát triển một phương thức tiếp cận cho những cách phát hiện, kiểm soát, ngăn ngừa sự lây lan cũng như sự bùng phát thành dịch của virus viêm gan A này [7]

1.1.2/ Đặc điểm sinh học của HAV

HAV là cá thể duy nhất trong chi Hepatovirus [26,52] Có bảy kiểu gen khác

nhau, đánh số từ I đến VII Bốn kiểu gen trong số này là I, II, III, và VII gây bệnh trên người, trong các kiểu gen gây bệnh trên người được phân thành 6 phân nhóm là IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB [17], 80% chủng HAV gây bệnh cho người có kiểu gen I [26] Các kiểu gen IV, V, VI gây bệnh trên các động vật linh trưởng như khỉ, tinh tinh Những phát hiện đầu tiên của HAV là trên loài khỉ cú (owl monkey) [43]

1.1.2.2/ Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV

Virus chỉ chứa những gì cần thiết để chúng thực hiện sự xâm nhiễm vào tế bào chủ HAV cũng không ngoại lệ, chúng chỉ tồn tại ở dạng nucleocapsid, không có vỏ bao ngoài Capsid là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và được cấu thành từ các đơn vị hình thái Capsomere là các đơn vị hình thái quan sát được trên bề mặt của các hạt virus tương ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc Promoter là các đơn vị cấu trúc nhỏ nhất Capsid của HAV được tạo thành từ các tiểu đơn vị hình thái gọi là capsomer Mỗi capsomere bao gồm năm protomers Mỗi protomer của HAV được làm bằng ba protein là VP1, VP2 và VP3 [37]

Hình 1.2 Hình dạng hạt virus và cấu trúc các tiểu đơn vị tạo nên vỏ capsid HAV [67]

b) Đặc điểm cấu trúc bộ gen HAV

Hình 1.3 Tổ chức bộ gen của HAV [13,29]

3D: enzyme polymerase

Bộ gen HAV gồm khoảng 7500 nucleotide Có ba khu vực chính trong bộ gen:

- Vùng 5’ không dịch mã dài 742 nucleotide Vùng này gắn với VPg được mã hóa từ vùng gen 3B VPg là một protein của virus có điểm đẳng điện thấp hơn các picornavirus khác VPg hỗ trợ cho quá trình bắt đầu sao chép của RNA virus [64]

- Vùng ORF dài 6681 nucleotide, gồm:

+ Vùng ORF gồm 3 phần chính là P1-2A, 2BC, P3 Vùng gen P1-2A được dịch mã và đồng thời xử lý bởi một protease của virus để tạo bốn loại protein có cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4; và bảy protein không có cấu trúc 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D Bốn protein cấu trúc mã hóa cho các protein tạo vỏ capsid polypeptid và kháng nguyên của HAV Các kháng nguyên của HAV chủ yếu nằm tại vùng VP1, VP3 [26] Vùng gen 2BC và P3 mã hóa tạo 7 protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D Trong đó, vùng 3C mã hóa tạo protease và vùng gen 3D mã hóa tạo RNA polymerase Các yếu tố này giúp RNA virus thực hiện quá trình dịch mã tạo các thành phần cho quá trình lắp ráp và nhân lên trong tế bào chủ [26,58]

+ Vỏ capsid của HAV gồm ba protein: VP1 là cấu trúc chính khoảng 33kDa, VP2 khoảng 27kDa và VP3 khoảng 29kDa [65] Dựa trên trình tự nucleotide, một protein capsid thứ tư – VP4, khoảng 2,5 kDa được mã hóa nhưng chưa được xác định trong cấu trúc của virion trưởng thành [65]

- Vùng 3' không mã hoá dài 63 nucleotide, gắn với đuôi poly A, đuôi poly A có chức năng bảo vệ sợi RNA virus tránh sự phân hủy của các RNase

- HAV xuất hiện trong vật chủ, cũng giống như các loài picornavirus khác Locarniniet và cộng sự [36] đã phát hiện có khoảng 11 protein của virus trong các tế bào chủng HM175 bị nhiễm HAV Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác cho thấy chỉ có các protein cấu trúc của HAV trưởng thành mới được phát hiện trong các tế bào bị nhiễm bệnh [19,53] Điều này được giải thích có thể là do sự ổn định của VPg hoặc tốc

độ tăng trưởng chậm và không đồng đều của HAV

1.1.2.3/ Vị trí kháng nguyên HAV

Các loài trong họ picornavirus đƣợc phân biệt là do sự xuất hiện của các kháng nguyên khác nhau [9] Những khác biệt này dựa trên hình dạng, độ lớn phân tử trên bề mặt của vỏ capsid virus [9,49] Nghiên cứu bằng tia X trên bề mặt lớp vỏ capsid virus

đã xác định protein VP1 là protein tiếp xúc lớn [20] Sự sắp xếp trình tự acid amin trong vùng gen VP1 của HAV đã xác định đƣợc ba peptide tạo kháng nguyên [48]

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, HAV bị đột biến chủ yếu là do quá trình tiếp xúc với kháng thể hoặc bị kháng thể trung hòa Vùng gen VP1, VP3 chứa các acid amin có thể thay đổi trình tự để tạo các epitope hạn chế quá trình nhận diện kháng nguyên của các kháng thể [60] Các nghiên cứu về bộ gen của HAV cho rằng chỉ có 6 trong số 11 axit amin nằm ở vùng gen VP1 và VP3 là tạo các protein kết hợp đƣợc với kháng thể Quá trình tiếp xúc này sẽ làm thay đổi các axit amin có thể giúp HAV tạo ra các biến thể, tránh đƣợc sự trung hòa kháng nguyên Các locus VP1 và VP3 mã hóa các kháng nguyên đƣợc đặt khá xa nhau, nhƣng chúng cũng đã kết hợp lại với nhau để tạo thành một yếu tố quyết định tính kháng nguyên duy nhất [20]

1.1.2.4/ Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy

Hình 1.4 Sự nhân bản HAV trong tế bào chủ [67]

Ở mức độ tế bào, HAV đi vào tế bào chủ thông qua sự ẩm bào Tiếp đó, lyzosome của tế bào chủ sẽ ly giải hạt virus, để giải phóng RNA vào bên trong tế bào chất Quá trình phiên mã ngược sẽ diễn ra để tạo cDNA của HAV Tiếp đó, cDNA thực hiện tiếp 2 quá trình:

- Dịch mã tạo polyprotein, các polyprotein này sẽ tạo ra các capsomer của vỏ capsid virus sau này

- Phiên mã tạo ra mRNA, mRNA sẽ sử dụng các thành phần có sẵn của tế bào chủ như polymerase, ribosome… để tạo các yếu tố còn lại của virus mRNA sẽ là vật liệu di truyền cho thế hệ HAV tiếp theo sau khi được giải phóng khỏi tế bào chủ

- Các capsomer sẽ liên kết với nhau và bao lấy mRNA bên trong Hạt virus HAV hoàn chỉnh được hình thành và giải phóng khỏi tế bào chủ ban đầu

Ở mức độ cơ thể, HAV đi vào máu thông qua các biểu mô của hầu họng hoặc ruột Máu mang virus này tới gan, nơi mà virus sẽ nhân bản bên trong tế bào gan và các

tế bào Kupffer (đại thực bào gan) Việc gắn vào tế bào chủ được thực hiện bằng tương tác giữa kháng nguyên của HAV và các thụ thể đính trên tế bào chủ Sau khi thực hiện quá trình nhân bản, virus ra khỏi các tế bào chủ bằng cách ly giải Lúc này virus tồn tại dưới dạng virion Các virion được tiết vào mật và đào thải trong phân Theo các nghiên cứu cho thấy, HAV được đào thải với số lượng lớn khoảng 11 ngày trước khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc xuất hiện kháng thể IgM trong máu Các giai đoạn ủ bệnh là 15-50 ngày [20]

Trong các tế bào gan, bộ gen RNA được giải phóng từ lớp vỏ protein capsid của virus, sau đó sử dụng ribosome của tế bào chủ cho việc dịch mã Không giống như các picornavirus khác, virus này đòi hỏi tế bào chủ phải có tiểu phần eIF4G cho việc khởi đầu sao chép [52]

Các nghiên cứu gần đây cũng cho rằng các đoạn gen tại đầu 5’ của HAV không tiếp xúc hiệu quả với ribosome của tế bào chủ, vì thế quá trình khởi sự dịch mã thường

gặp nhiều vấn đề [21] Hơn nữa, HAV không có tác động mạnh mẽ đến sự trao đổi chất vùng tế bào chất của tế bào chủ nên không có quá trình phá hủy tế bào (cytopathic effect - CPE) [54] Các đột biến của HAV chủ yếu xảy ra tại vùng gen 2B và 2C Các vùng gen này mã hóa cho các protein phi cấu trúc [54] Trong vùng gen P2 chứa các gen 2B, 2C, 2A Nhiệm vụ của các gen này là tạo ra các polyprotein không cấu trúc, chúng sẽ giúp thúc đẩy quá trình apoptosis ở tế bào đã được gây nhiễm HAV [41] Nghiên cứu trong quá trình xâm nhiễm và gây bệnh cho thấy sự gắn kết của virus vào

tế bào chủ đã được chứng minh có sự phụ thuộc vào pH và nồng độ ion canxi Chúng

bị ức chế bởi huyết thanh nhau thai bê [59] Nghiên cứu sâu hơn đã chỉ ra rằng thụ thể

có bản chất là glycoprotein có trong một số mô của người, bao gồm cả mô gan có khả năng tiếp nhận các protein trên vỏ capsid của HAV

1.1.2.5/ Khả năng tồn tại của HAV

Các loại virus, bao gồm cả HAV, không thể nhân bản khi không có tế bào vật chủ, nhưng chúng có thể tồn tại ngoài môi trường trong những khoảng thời gian xác định

Khi bài tiết theo phân người, virus có thể tồn tại trong nước hoặc đất ít nhất 12 tuần ở 25°C Virus này có khả năng đề kháng cao với nhiều loại hóa chất và dung môi khác nhau, có khả năng chịu nhiệt và chịu môi trường khô cao hơn so với các loài virus đường ruột khác HAV có thể kháng với nồng độ clo thấp (0,5-1mg clo) trong 30 phút Chúng cũng có khả năng kháng lại axit perchloroacetic nồng độ 300mg và chloramines nồng độ 1g trong 15 phút ở 20°C Đồng thời, HAV có thể bị bất hoạt trên các bề mặt với dung dịch natri hypoclorit, hoặc thuốc tẩy gia dụng [59]

HAV có khả năng chịu nhiệt tương đối cao Chúng có khả năng sống sót ở 70°C trong 10 phút nhưng bị bất hoạt ở nhiệt độ 85°C trong 1 phút Tại Anh, đối với các thực phẩm là nhuyễn thể có vỏ được khuyến cáo cần phải đun nóng 85-90°C trong 90 giây để làm bất hoạt HAV Dữ liệu từ Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cho thấy rằng các

loài NT2MV nằm trong vùng có mức độ hiện diện HAV cao phải được đun nóng đến 90°C từ 90 giây đến 4 phút [66]

1.1.3/ Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm gan siêu vi A

1.1.3.1/ Bệnh mẫu và bệnh sinh

HAV gây bệnh cho mọi người, đặc biệt rất nhạy cảm với trẻ em

Virus này xâm nhập vào máu, sau đó ủ bệnh đến 30 ngày, lúc đầu có triệu chứng giống như cảm cúm, sau đó một vài ngày có hiện tượng đau cơ, đau đầu chán

ăn, mất tính ngon miệng, sốt, khó chịu Triệu chứng kế tiếp là vàng da do mật không bài thải ra được nên vào máu và ra da, nước tiểu sậm màu Cơ thể sau đó trở lại bình thường sau thời gian biểu hiện bệnh kéo dài 2 tháng, nhưng có 10-15% người nhiễm bị tái phát sau 6 tháng [32] Có khoảng 2/1000 người có các triệu chứng nặng hơn có thể dẫn đến tử vong khi nhiễm HAV Bệnh lâm sàng thường kéo dài 2-6 tuần Tuy nhiên,

có khoảng 3-20% các bệnh nhân viêm gan A tái phát của các triệu chứng như tăng men gan, vàng da… xảy ra từ 1-3 tháng từ lúc không còn biểu hiện triệu chứng, chứng tỏ HAV đã được tái hoạt hóa [22,34]

Với biểu hiện bệnh vàng da do nhiễm HAV, các nghiên cứu cũng cho thấy sự phân bố tỉ lệ ở các nhóm tuổi như sau: < 6 tuổi (10%); 6-14 tuổi (40%-50%); > 14 tuổi (70%-80%) Biến chứng hiếm thấy của bệnh là: viêm gan cấp; viêm xơ gan; viêm gan tái phát Thời gian ủ bệnh: trung bình 30 ngày; dao động khoảng 15-50 ngày, không có thể bệnh mãn tính [3,32] Tỷ lệ tử vong ước tính là 0,1% cho trẻ em dưới 15 tuổi, 0,3% cho người lớn tuổi từ 15 đến 39, và 2,1% cho người lớn tuổi từ 40 trở lên [27,28]

Hình 1.5 Mối tương quan giữa HAV và các yếu tố đáp ứng miễn dịch

Chẩn đoán sự nhiễm HAV cấp tính thông qua thử nghiệm huyết thanh Kháng thể IgM kháng HAV (anti-HAV IgM) được phát hiện từ 7-10 ngày sau khi bị nhiễm bệnh và thường tồn tại cùng thời điểm với các triệu chứng lâm sàng Ở người, thời gian thải loại virus có thể liên quan đến độ tuổi Với người trưởng thành, 22-50% trường hợp có kháng nguyên HAV trong mẫu phân trong vòng một tuần sau khi khởi phát bệnh vàng da Trẻ em và trẻ sơ sinh thải loại virus chậm hơn so với người trưởng thành [5,32] Các kỹ thuật xét nghiệm cho thấy HAV trong mẫu phân từ các ổ dịch thải loại

ra ngoài sau 2-3 tháng kể từ khi khởi phát các triệu chứng ban đầu [28]

1.1.3.2/ Dịch tễ học

a) Sự lây truyền của HAV

HAV thường lây truyền qua đường ruột (phân-miệng), qua tiếp xúc giữa người với người và ăn phải thực phẩm bị ô nhiễm hoặc nguồn nước có nhiễm HAV [33,63] Ngoài ra, những người trong cùng gia đình cũng bị lây lan qua đường ruột với tỉ lệ 20-50% [43]

Nghiên cứu dịch tễ học cũng đã xác nhận các phương thức lây nhiễm HAV khác, bao gồm những người làm việc với các loài linh trưởng [62], lây nhiễm giữa các

quân nhân hoạt động quân sự tại vùng có mức độ lưu hành HAV cao [2,44], một số ít trường hợp lây nhiễm cho truyền máu [2,7], và tỷ lệ lây nhiễm cao do quan hệ đồng tính

b) Vùng lưu hành của HAV

Hình 1.6 Biểu đồ tỷ lệ kháng HAV trên toàn thế giới [7]

Tỉ lệ lưu hành HAV ở các nước châu Úc, Bắc Mỹ, Nhật và đặc biệt là châu Âu

là rất thấp Vì vậy, các nước này thường tăng cường kiểm soát sự xâm nhập HAV qua con đường nhập khẩu thực phẩm Khi nhập khẩu các mặt hàng thủy hải sản, đặc biệt là NT2MV qua các thị trường khó tính như EU, Nhật Bản, Úc thì đều gặp phải sự kiểm tra nghiêm ngặt vì các rào cản về vệ sinh an toàn thực phẩm Trong đó, thị trường lớn nhất chiếm gần 70% tổng giá trị xuất khẩu nhuyễn thể của nước ta là EU [22] Vì vậy, muốn tăng về mặt số lượng và chất lượng cho NT2MV, phù hợp với các tiêu chuẩn của nước nhập khẩu thì cần phải có sự quản lý, giám sát về vùng nuôi và vùng thu hoạch

cũng như các nơi chế biến NT2MV

Tỉ lệ Anti-HAV Cao Trung bình Thấp Rất thấp

Ở nhiều nước phát triển, tiêu chuẩn vệ sinh được cải thiện và điều kiện kinh tế

xã hội nâng cao đã dẫn đến việc giảm tiếp xúc với HAV ở trẻ em và người lớn Tại các nước đang phát triển, tỷ lệ mắc bệnh ở người lớn là tương đối thấp do tiếp xúc với virus này từ bé, cơ thể đã tự sản sinh kháng thể kháng lại virus này Hầu hết người lớn

ở các khu vực này có kháng thể chống lại bệnh viêm gan A Sự phân bố độ tuổi bệnh nhân viêm gan A ở các nước phát triển và đang phát triển khác nhau là hệ quả của các tiêu chuẩn về vệ sinh công cộng và môi trường

Tại các nước đang phát triển, thực phẩm là nguồn gốc chính của việc lây nhiễm HAV Các đợt bùng phát dịch là do ô nhiễm từ chính những người lao động, họ dùng tay không được vệ sinh cẩn thận, thu hoạch các loại thực phẩm, nhất là các thực phẩm tươi sống sau đó chỉ được đông lạnh hay đóng gói mà chưa qua bước xử lý nhiệt hay tẩy rửa, do đó mà nguồn HAV có thể tồn tại và lây truyền nhanh Trong các loại thực phẩm đó thì các sản phẩm thu hoạch có nguồn gốc là động vật có vỏ, NT2MV là những đối tượng có nguy cơ tiềm ẩn cao về mức độ hiện diện của HAV

1.1.4/ Tình hình nhiễm virus HAV trên thế giới và Việt Nam

1.1.4.1/ Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bởi vì tính chất lây lan nhanh, dễ bùng phát dịch và là tác nhân chỉ điểm cho sự

ô nhiễm môi trường nên các nghiên cứu về HAV trên thế giới đã được tiến hành từ lâu

và vẫn đang tiếp tục nghiên cứu Virus viêm gan A được EU xếp vào tác nhân sinh học

có nguy cơ thuộc nhóm 2, Viện sức khỏe Quốc Gia Hoa Kỳ cũng xếp virus này vào nhóm nguy cơ gây bệnh cho con người số 2 [30] Theo thống kê, mỗi năm có khoảng 30.000 trường hợp nhiễm HAV tại Hoa Kỳ [7,33]

Theo Lees và các cộng sự, bệnh viêm gan A là bệnh nhiễm virus nghiêm trọng nhất trong số các bệnh liên quan đến virus trên nhuyễn thể [44] Hơn thế nữa, HAV có thể xâm nhiễm và lây lan với nhiều loại thực phẩm khác nhau, như trai [11], hàu [5,12], nghêu [3,11], hành lá [1], dâu tây đông lạnh [39,51] , quả việt quất [39] và thịt bò sống,

tôm nước ngọt [27] Từ đó cho thấy khả năng xâm nhiễm HAVvào thực phẩm là đa dạng, gây nên những tổn thất kinh tế đối với những nước đang phát triển [43] Virus này hiếm thấy ở những nước có hệ thống vệ sinh công cộng tốt như Mỹ, Nhật, EU Tuy vậy hàng năm ước tính có khoảng 100 người chết do viêm gan có liên quan tới HAV (theo tài liệu CDC) trong số 30.000-50.000 ca bệnh, hao tốn trên 300 triệu USD [70]

Từ năm 1980 đến 2012, trên thế giới đã thống kê có 359 đợt bùng phát virus trên nhuyễn thể Hầu hết tác nhân phổ biến trong các đợt bùng phát dịch là Norovirus

(83,7%) và HAV (12,8%) [10]

Tại Mỹ, viêm gan A cũng là một căn bệnh truyền nhiễm đáng ngại, với khoảng 10% đến 20% bệnh nhân viêm gan A phải nhập viện chữa trị, gây tổn hại hơn 200 triệu USD trong năm 1989, và 300 triệu USD trong năm 1997 Năm 2003, một đợt bùng phát dịch HAV xảy ra do tiêu thụ hành tây, đợt dịch này đã gây ra cho 601 trường hợp với 3 trường hợp tử vong tại Mỹ Năm 2007 ước tính có khoảng 25.000 bệnh nhân viêm gan A mới ở Mỹ Từ năm 2013 đến năm 2016, đã có 4 đợt bùng phát HAV mà tác nhân truyền bệnh là các mặt hàng quả mọng nước đông lạnh nhập khẩu vào thị trường Mỹ [33] Tỉ lệ bệnh viêm gan A cao nhất xảy ra ở phía tây nước Mỹ, nơi dân số chủ yếu là người Mỹ gốc Tây Ban Nha hoặc người bản địa [10]

Gần đây nhất, 5/11/2016, Mỹ đã cảnh báo các sản phẩm dâu tây nhập khẩu từ Ai Cập có sự hiện diện HAV, gây ra 60 ca nhập viện trên 10 tiểu bang khắp nước Mỹ Nguyên nhân là do tay công nhân thu hái dâu tây nhiễm HAV và quá trình thu hoạch không đảm bảo vệ sinh nên HAV đã bị lây nhiễm vào [68]

Tại Châu Á, năm 1988, một dịch viêm gan A rất lớn xảy ra tại thành phố Thượng Hải (Trung Quốc) trong vài tháng với hơn 300.000 trường hợp nhiễm bệnh, nguyên nhân là do người dân ăn nghêu chưa được nấu chín kỹ, nguồn nghêu này được thu hoạch từ các khu vực có nước thải chưa qua xử lý [3,11] Năm 2008, vùng phía Nam Hàn Quốc thống kê có 30.240 trường hợp nhiễm HAV [31]

Các loài nhuyễn thể ăn qua lọc có thể tập trung lượng virus lên đến 100 lần so với mật độ virus trong nước [14,40], do đó cho phép sự tích tụ của HAV từ nguồn nước bị ô nhiễm Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở Ý viêm gan A chủ yếu là do tiêu thụ thực phẩm và động vật nhuyễn thể có vỏ [38] Các thực phẩm ô nhiễm khác bao gồm các loại trái cây và rau quả có thể ăn sống hoặc đông lạnh Các sản phẩm nông nghiệp

có nhiều khả năng bị ô nhiễm do quá trình tiếp xúc của công nhân Nước thải khi được

sử dụng cho mục đích tưới tiêu cũng được xem như là một nguy cơ gây nhiễm bệnh nếu phun lên cây hoặc nếu đất bị ô nhiễm Một số quy trình xử lí như đông lạnh không qua rửa hay xử lý cũng không làm bất hoạt HAV và không loại bỏ các yếu tố gây bệnh

từ sản phẩm Một số tác giả đã cho rằng sự bùng phát ngộ độc thực phẩm có thể lan truyền từ các quần thể có khả năng miễn dịch thấp, nơi mà có sự gia tăng sử dụng các thực phẩm tươi nhập khẩu từ các quốc gia có mức độ lưu hành cao về HAV [27]

Thống kê của EU trong năm 2008 đã có hơn 17.000 trường hợp mắc bệnh viêm gan A.Đứng trước việc thế giới ngày càng có nhiều đợt dịch bệnh mới Ngày 29 tháng

4 năm 2004 Nghị viện và Hội đồng Châu Âu đã ban hành Chỉ thị (EC) số 854/2004 qui định cụ thể việc tổ chức kiểm soát chính thức các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật dùng làm thực phẩm cho người [56] Theo đó, mặt hàng NT2MV phải được kiểm soát

và phân loại vùng nuôi, vùng thu hoạch phục vụ cho việc xuất khẩu sang thị trường

EU Vì vậy, rất cần việc giám sát và đánh giá mức độ ô nhiễm HAV để góp phần củng

cố và tạo sự tin cậy về chất lượng cho mặt hàng NT2MV từ Việt Nam

1.1.4.2/ Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Năm 2010, Ho Thanh Ba và các cộng sự đã nghiên cứu việc “Phát hiện virus viêm gan A trên nhuyễn thể 2 mảnh vỏ tại miền Nam Việt Nam” Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã phát hiện có gần 77% mẫu nhuyễn thể đến tay người tiêu dùng bị nhiễm HAV và riêng khu vực vùng nuôi và thu hoạch nhuyễn thể tại Cần Giờ thì có 57,1% số mẫu phân tích có kết quả dương tính với HAV [25] Trước đó, năm 1999, Hậu và cộng sự đã “Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm virus viêm gan A và E ở khu vực Đồng

bằng sông Cửu Long của Việt Nam”, kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng thể IgG kháng HAV ở người tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long là 97% [24] Điều đó chứng tỏ mức độ hiện diện HAV trong cộng đồng là rất cao

1.1.5/ Ngăn ngừa HAV

Có nhiều chiến lược khác nhau được sử dụng để ngăn ngừa, giảm thiểu nguy cơ nhiễm HAV từ thực phẩm có thể kể đến 3 chiến lược thường dùng gồm:

- Ngăn ngừa hoặc phát hiện các mối nguy gây nhiễm ngay tại nơi nuôi trồng, thu hoạch và dây chuyền sản xuất chế biến thực phẩm

- Loại nhiễm hoàn toàn hoặc bất hoạt virus hiện diện trong những loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm cao bằng các công nghệ chế biến thực phẩm, ví dụ như khâu gia nhiệt trong chế biến NT2MV

- Tiêm chủng để làm giảm nguy cơ lây nhiễm HAV trong cộng đồng, tuyên truyền không sử dụng, tiêu thụ nhuyễn thể tươi sống chưa qua chế biến

a) Ngăn ngừa và phát hiện thực phẩm nhiễm HAV

Các biện pháp ngăn ngừa có thể kể đến như:

- Nỗ lực khuyến cáo người tiêu dùng không tiêu thụ nhuyễn thể chưa qua chế biến

- Yêu cầu kết quả phân tích định lượng vi sinh vật chỉ thị ô nhiễm hữu cơ trong thịt nghêu nguyên liệu và mẫu nước vùng nuôi Kết quả phân tích không được vượt quá

70 Coliforms và 14 Fecal coliforms

- Quy hoạch những vùng nuôi để kiểm soát việc nuôi trồng, thu hoạch nhuyễn thể, và ngăn cấm thu hoạch nhuyễn thể ngoài vùng nuôi

- Triển khai thực hiện và tuân thủ GMP, SSOP, HACCP trong chế biến thực phẩm

- Vị trí thu hoạch NT2MV phải được mã hóa, xác định trên từng lô nghêu thành phẩm cho phép dễ dàng truy suất nguồn gốc khi cần thiết [6,14]

Có hai nhóm chiến lược phân tích để phát hiện sự nhiễm HAV trong thực phẩm:

- Phát hiện sự ô nhiễm HAV gián tiếp thông qua các vi sinh vật chỉ thị an toàn

vệ sinh thực phẩm, các vi sinh vật này có cùng trú quán hay xuất phát từ cùng nguồn gây nhiễm Nếu phát hiện có vi sinh vật chỉ thị vượt mức cho phép thì xác suất có mặt HAV là rất lớn Các vi sinh vật chỉ thị có thể kể đến như các vi khuẩn chỉ thị Coliforms, Fecal coliforms, các virus chỉ thị như rotavirus, enterovirus, adenovirus… Tuy nhiên phương pháp phát hiện gián tiếp này không phải lúc nào cũng phản ánh đúng tình trạng mẫu, trong một số trường hợp có vi sinh vật chỉ thị mà không có HAV

và ngược lại Do đó giải pháp tối ưu nhất để phát hiện HAV vẫn là phân tích trực tiếp

chỉ tiêu này trên nền mẫu có nguy cơ cao như NT2MV [6,14]

- Phát hiện trực tiếp HAV trong thực phẩm bằng hai phương pháp sàng lọc nhanh với độ nhạy cao Phương pháp thường được sử dụng nhất là kỹ thuật RT-PCR

và phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ

b) Loại nhiễm bằng công nghệ chế biến thực phẩm

Để loại bỏ hòan toàn nguồn HAV trong trong quá trình chế biến thực phẩm một

số biện pháp để thực phẩm có nguy cơ cao trở nên an toàn hơn cho người tiêu dùng

Ngay từ khâu nguyên liệu NT2MV sẽ được nuôi lưu và làm sạch trong môi trường nuôi sạch như nước biển đã qua xử lý lọc, sục ozone, chiếu UV…trước khi cấp vào bể nuôi thời gian nuôi đủ để NT2MV có thể loại bỏ, đào thải các tác nhân ô nhiễm nhằm đáp ứng được nhu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm trước khi đưa vào qui trình chế biến tiêu thụ được ở dạng tươi sống Thời gian mỗi đợt làm sạch tối thiểu là 42 giờ [56] Tuy nhiên, HAV vẫn có thể tồn tại trong hàu nuôi 96 giờ trong nước đã được xử

lý ozone

Trong qui trình chế biến, công đoạn luộc chín sản phẩm có thể bất họat HAV, khi tâm sản phẩm đạt đến nhiệt độ 85-95oC trong 1 phút, một vài trường hợp thực nghiệm cho thấy phương pháp này cũng không hoàn toàn đem lại hiệu quả tối ưu khi NT2MV hấp ở 90 oC vẫn không loại bỏ hoàn toàn được HAV

HAV dễ dàng lan nhiễm ra môi trường từ thực phẩm nhiễm, có thể tồn tại được

ở những điều kiện môi trường cực đoan như có thể sống vài năm ở điều kiện đông lạnh, kháng được điều kiện pH 1,0 ở 38oC trong 90 phút, không bị tiêu diệt hoàn toàn bằng phương pháp thanh trùng Pasteur, thực nghiệm cho thấy đun sữa có huyền phù HAV ở 62,8oC trong 30 phút vẫn còn 0,1% HAV không bị tiêu diệt HAV còn có thể tồn tại môt thời gian dài ngoài môi trường trên các bề mặt tiếp xúc, trên mẫu sinh phẩm như phân [50]

Với những mặt hạn chế của các biện pháp loại bỏ HAV trong thực phẩm nêu trên, cùng với đặc điểm có sức đề kháng cao, dễ lan truyền và lây nhiềm của HAV từ môi trường vào thực phẩm, một cách tiếp cận khác để loại bỏ sự nhiễm HAV trong thực phẩm là tuân thủ các qui phạm vệ sinh trong quá trình sản xuất Người xử lý thực phẩm nên rửa tay thường xuyên và đeo găng tay, đặc biệt là tại các khâu trong chuỗi chế biến thức ăn mà phía sau đó không có công đoạn nào khác được xử lý để loại bỏ HAV.Những người bị các triệu chứng của bệnh viêm gan A cần được cách ly từ các khu vực sản xuất thực phẩm cho đến khi được điều trị khỏi bệnh hoàn toàn

1.2/ Các phương pháp phát hiện HAV

1.2.1/ Phương pháp nuôi cấy tế bào và phát hiện kháng nguyên

Phương pháp nuôi cấy tế bào đã được ứng dụng trong việc nghiên cứu virus gây bệnh trên người và động vật HAV cũng đã được nuôi cấy trong các dòng tế bào người

và tế bào động vật, bao gồm:

- Tế bào ở người: tế bào gan Alexander (Alexander hepatoma cells); nguyên bào sợi (Human fibroblasts); tế bào nguyên bào sợi phổi (Human lung fibroblasts- MCR5);

tế bào nguyên bào phôi thai (Human embryo fibroblasts - HFS); tế bào thận thai nhi (Fetal rhesus kidney - FRhK-4; FRhK-6) [15,16]

- Tế bào động vật: tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney cells-BSC-1) [15,16]

Tuy nhiên, hầu hết các dòng tế bào được nuôi cấy luôn gặp khó khăn trong nghiên cứu là do chủng HAV thường không có dấu hiệu phá hủy tế bào (cytopathic effect – CPE) và rất ổn định trong môi trường [16] Để giải quyết vấn đề không có CPE, các nghiên cứu về miễn dịch và phát hiện kháng nguyên HAV đã được áp dụng Một số kỹ thuật được tiến hành trong các nghiên cứu này là: phát hiện tế bào nhiểm HAV bằng cách nhuộm miễn dịch huỳnh quang và phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang [44,45]; ELISA [44]; đồng vị phóng xạ - RIA [45]; đồng vị phóng xạ kết hợp lai huỳnh quang – RIFA; phát hiện HAV bằng kỹ thuật lai tại chỗ – insitu hybridization [44]

Tuy nhiên, các kỹ thuật nuôi cấy virus này tiêu tốn thời gian dài Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang chỉ phát hiện được HAV trong tế bào nuôi cấy sau khi tế bào được lây nhiễm 7 ngày Phương pháp RIFA có thời gian phân tích từ 3 đến 4 tuần mới cho kết quả Mặc khác, các phương pháp này đều yêu cầu các thiết bị phân tích hiện đại, đắt tiền và không có khả năng phân lập HAV trực tiếp từ các mẫu lâm sàng hay mẫu môi trường

Hiện tại, kỹ thuật xét nghiệm bắt kháng thể IgM đã được thương mại hóa để phát hiện anti-HAV IgM [28] Mặc dù kháng thể IgM kháng HAV tồn tại trong thời gian dài, nhưng xét nghiệm chẩn đoán này thường không đạt được kết quả dương tính nếu thời gian nhiễm sau 4 – 6 tháng Sự có mặt của IgM thường có sự xuất hiện kèm theo của kháng thể IgG, cả 2 đều là anti-HAV, loại kháng thể này thường tồn tại suốt đời Tuy nhiên, phương pháp phát hiện HAV dựa trên xét nghiệm bắt kháng thể này yêu cầu một lượng HAV đủ để bắt với kháng thể IgM, như vậy virus viêm gan A này