Nghiên cứu sản xuất phb từ chủng vi khuẩn e coli tái tổ hợp

PHA là một họ polymer lớn, bao hàmhơn 150 đơn phân khác nhau và hơn 100 cấu trúc polymer đã được mô tả, trong đó PHBchính là thành viên đầu tiên của họ PHA được khám phá và là loại polye

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-VÕ HOÀNG THẮNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PHB TỪ

CHỦNG VI KHUẨN E.Coli TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN HOÀNG DŨNG

TP Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG - HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học 1: ………… ……… Cán bộ hướng dẫn khoa học 2: ………

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)Cán bộ chấm nhận xét 2:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM

ngày 03 tháng 01 năm 2017

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 Chủ tịch hội đồng: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

2 Thư ký hội đồng: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

3 Ủy viên phản biện 1: TS TRẦN TRUNG HIẾU

4 Ủy viên phản biện 2: TS NGUYỄN TẤN TRUNG

5 Ủy viên hội đồng: PGS.TS LÊ PHI NGA

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA…………

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: VÕ HOÀNG THẮNG MSHV: 7140297

Ngày, tháng, năm sinh: 20/06/1988 Nơi sinh: Bình Dương

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 604280

I.TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu sản xuất PHB từ chủng vi khuẩn E Coli tái tổ hợp DH5α

mang operon phbCAB

II.NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nghiên cứu sản xuất PHB (Poly-β-hydroxybutyrate)

từ chủng vi khuẩn E Coli tái tổ hợp DH5α mang operon phbCAB Quy hoạch thực nghiệm tối ưu môi trường tăng sinh chủng vi khuẩn E Coli tái tổ hợp DH5α mang

operon phbCAB có khả năng sản xuất PHB Thiết lập quy trình sản xuất PHB ở quy

mô phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất công nghiệp

III.NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 05/07/2016

IV.NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 05/12/2016

V.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : Cán bộ 1: TS TRẦN HOÀNG DŨNG

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

ĐÀO TẠO

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến hai Thầy TS Trần Hoàng Dũng và anh HuỳnhVăn Hiếu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ nhiều kiến thức thực tiễn quýbáu để Tôi hoàn thành cuốn luận văn này Cảm ơn Phòng Vi sinh, bạn Trần Lê ThiênKim và các bạn trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học – Viện Bảo Tồn NguồnGen trường đại học Nguyễn Tất Thành đã nhiệt tình hỗ trợ Tôi trong suốt thời gianthực hiện luận văn Trên tất cả, con xin cảm ơn Cha Mẹ đã luôn bên con, ủng hộ con

để con có được thành công như ngày hôm này

Trân trọng,

Võ Hoàng Thắng

Vi khuẩn Escherichia coli DH5α mang operon phbCAB đã được tối ưu hóa quá trình nuôi cấy nhằm thu được sản lượng PHB cực đại Escherichia coli DH5α mang

operon phbCAB có khả năng sinh tổng hợp PHB ở pH tối ưu 7,0; điều này có thể đượcứng dụng để sản xuất PHB trong công nghiệp vì vi khuẩn có thể sinh trưởng và pháttriển ở môi trường từ trung tính đến kiềm (pH ≥7) Chúng tôi đã sử dụng thiết kế thínghiệm Plackett Burman để kiểm tra mức độ ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa khác nhaulên sản lượng PHB Trong đó mật rỉ đường, thời gian nuôi và khoảng pH là ba yếu tố cótác động mạnh nhất Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)-Central Composite Design (CCD) đã được thực hiện và tìm ra giá trị tối ưu của ba yếu

tố mật rỉ đường (120g/l), thời gian nuôi (48h) và pH (7.0) cho khối lượng khô tế bào(CDW) cực đại 3,36gram/lit và sản lượng PHB cực đại theo mô hình 0,87gram/ lit26,0% Mô hình đã được áp dụng vào thực tế với mô hình 150ml nuôi sục khí là3,3gram/lit (CDW) và 0,86gram/lit 26,06% (PHB), trong nồi lên men tự động 1,5l là6,2gram/lit (CDW) và 1,63gram/lit 26,29% (PHB)

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quảnêu trong luận văn là trung thực Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Võ Hoàng Thắng

Danh mục chữ viết tắt: i

DANH MỤC BẢNG i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Công nghệ lên men 7

1.1.1 Khái quát về quá trình lên men 7

1.1.2 Phương pháp lên men .7

1.1.2.1 Lên men theo mẻ .7

1.1.2.2 Lên men theo mẻ có bổ sung (lên men fed-batch) .9

1.1.2.3 Lên men liên tục 9

1.2 Nhựa phân huỷ sinh học 9

1.2.1 Sơ lược về nhựa phân huỷ sinh học .9

1.2.1.1 Nhựa phân huỷ sinh học tổng hợp .10

1.2.1.2 Nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên .10

1.2.2 Tổng quan về PHB 11

1.2.2.1 Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB .11

1.2.2.2 Con đường chuyển hoá tổng hợp PHB .13

1.2.2.3 Vi sinh vật sản xuất PHB 15

1.2.3 Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB .26

1.2.4 Phương hướng cải thiện sản xuất PHB .26

1.2.4.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn sản xuất PHB thích hợp 26

1.2.4.2 Tối ưu hóa các điều kiện môi trường lên men sản xuất PHB 27

1.2.4.3 Thay thế nguồn cơ chất trong sản xuất PHB vi sinh 27

1.2.5 Tách và thu hồi PHB .29

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .32

2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện: 32

2.2 Vật liệu E coli tái tổ hợp DH5α mang operon phbCAB 4985 .32

2.3 Hóa chất và dụng cụ sử dụng .32

2.3.1 Môi trường nuôi cấy .32

2.3.2 Hóa chất .33

2.3.3 Thiết bị .34

2.4 Phương pháp nghiên cứu .37

2.4.1 Kiểm tra một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn 37

2.4.1.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn .38

2.4.1.2 Kiểm tra hoạt tính tạo PHB của E coli tái tổ hợp bằng phương pháp nhuộm SBB .38

2.4.1.3 Xác định khối lượng khô tế bào .38

2.4.1.4 Xác định PHB trong tế bào bằng phương pháp nhuộm huỳng quang .38

2.4.2 Xử lý mật rỉ đường 39

2.4.3 Tối ưu hóa các thông số dinh dưỡng cho sản xuất PHB bởi cho E coli DH5α mang operon phbCAB 39

2.4.3.1 Khảo sát nguồn carbon thích hợp .40

2.4.3.2 Khảo sát nguồn nitrogen thích hợp .40

2.4.3.3 Khảo sát nguồn phosphate thích hợp .40

2.4.4 Tối ưu hóa môi trường PHB theo ma trận Plackett – Burman và phương pháp RSM – CCD 40

2.4.4.1 Phương pháp xác định điều kiện hóa lý thích hợp để chủng E coli tái tổ hợp lên tạo PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường quy mô 150 ml bằng phương pháp ma trận thực nghiệm .41

2.4.4.2 Chọn phương án sản xuất tối ưu và kiểm tra bằng thực nghiệm 44

2.4.5 Tách chiết PHB bằng sodium hypochlorite và chloroform 46

2.4.6 Làm tinh sạch PHB bằng Acetone, methanol và chloroform 47

2.4.7 Định lượng PHB bằng phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại .48

2.4.7.1 Xây dựng đường chuẩn .48

2.4.7.2 Định lượng PHB 48

2.5 Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu 48

2.6 Xử lý và phân tích số liệu 49

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 50

3.1 Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống vi khuẩn 50

3.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn PHB 50

3.3 Nghiên cứu điều kiện hóa lý thích hợp để chủng E coli tái tổ hợp lên tạo PHB tối ưu

từ cơ chất mật rỉ đường quy mô 150 ml và quy mô 1,5 lít 52

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện hóa lý thích hợp để chủng E coli tái tổ hợp lên men tạo PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường bằng phương pháp đơn yếu tố 52

3.3.1.1 Nguồn carbon 52

3.3.1.2 Nguồn nitơ 53

3.3.1.3 Nguồn muối phosphate và tỉ lệ giữa chúng 54

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện hóa lý thích hợp để chủng E coli tái tổ hợp sản xuất PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường bằng phương pháp ma trận Plackett - Burman và phương pháp đáp ứng bề mặt 55

3.3.2.1 Sàng lọc yếu tố thí nghiệm có ảnh hưởng nhiều nhất đến sinh khối tế bào (CDW) của vi khuẩn E coli tái tổ hợp 55

3.3.2.2 Sàng lọc yếu tố thí nghiệm ảnh hưởng đến sự tích luỹ PHB của vi khuẩn E coli tái tổ hợp .57

3.3.2.3 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa môi trường thu sinh khối và sự tích luỹ PHB bằng RSM – CCD 60

3.3.2.4 Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng quan trong đến sinh khối tế bào và PHB của E coli tái tổ hợp DH5α mang operon phbCAB 62

3.3.2.5 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố cho CDW và lượng PHB cực đại 62

3.3.2.6 Thử nghiệm, đánh giá hiệu suất và chi phí quá trình lên men sản xuất PHB bởi cho E coli DH5α mang operon phbCAB quy mô 1,5 l 64

3.4 Kết quả tinh sạch và xác định tính chất hóa, lý của polymer sinh học PHB 68

3.4.1 Tinh sạch bằng NaClO và chloroform 68

3.4.2 Nghiên cứu tính chất hóa lý của PHB thu được 68

3.4.2.1 Kết quả xác định khối lượng phân tử PHB thu được 68

3.4.2.2 Các tính chất hóa lý khác 70

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 78

Danh mục chữ viết tắt:

PHB Poly hydroxy butyrate

PHA Poly hydroxy acid

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét FTIR Fourier transform infrared spectroscopy Fourier Transform hồng

ngoại

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính hóa lí của PHB và PP (Nguồn: Brown, 1991) 12

Bảng 1.2 Một số chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHB trong tự nhiên 16

Bảng 1.3 Một số phương pháp thu hồi PHB 30

Bảng 2.1 Các hóa chất dung trong nghiên cứu 33

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 36

Bảng 2.3: Danh mục các hóa chất phân tích 37

Bảng 2.4: Bảng yếu tố được chọn và khoảng giá trị khảo sát cùa vi khuẩn E coli tái tổ hợp 42

Bảng 2.5: Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman đối với vi khuẩn E coli tái tổ hợp 42

Bảng 2.6: Nồng độ 3 yếu tố trong RSM – CCD ảnh hưởng đến sinh khối và PHB 44

Bảng 2.7: Kế hoạch thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hoá sinh khối tế bào và PHB44 Bảng 3.1: Tương quan giữa hàm lượng PHB chuẩn và giá trị OD235 51

Bảng 3.2: Kết quả sàng lọc thí nghiệm theo Plackett–Burman cho vi khuẩn E coli tái tổ

hợp 55

Bảng 3.3: Mức ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đối với chỉ tiêu theo dõi sinh khối E coli tái tổ hợp 56

Bảng 3.4: Kết quả sàng lọc thí nghiệm theo Plackett–Burman ảnh hưởng đến sự tích luỹ PHB của vi khuẩn E coli DH5α mang operon phbCAB 58

Bảng 3.5: Mức ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đối với chỉ tiêu theo dõi lượng PHB E coli DH5α mang operon phbCAB 59

Bảng 3.6: Kết quả thực nghiệm theo RSM – CCD đối với chỉ tiêu sinh khối E coli DH5α mang operon phbCAB 60

Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA của các yếu tố trong thí nghiệm RSM– CCD tối ưu lượng sinh khối vi khuần E coli DH5α mang operon phbCAB 61

Bảng 3.8: Sinh sinh tổng hợp PHB từ E coli tái tổ hợp DH5α mang operon phbCAB 65

Bảng 3.9: Độ tinh sạch PHB được xử lý bằng sodium hypochlorite và chloroform 68

Bảng 3.10: Hàm lương kim loại năng ở PHB tách chiết từ E coli 70

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1.Công thức cấu trúc tổng quát của PHA 10

Hình 1.2.Công thức cấu trúc tổng quát của PHB 11

Hình 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp PHB 13

Hình 1.4: Plasmid p4A 21

Hình 1.5: Hình minh họa phương pháp CIChE 22

Hình 1.6: Hình các operon dùng trong thực nghiệm của Kelwick 23

Hình 2 1: Mô hình lên men BioFlo 110 35

Hình 2 2: Mô hình lên men 150ml có sục khí 35

Hình 2 3: Mô hình hệ thống lên men 150ml lắc 35

Hình 2 4: Hệ thống lên men 1,8l có sục khí 36

Hình 2.5 Sơ đồ phương pháp xử lí mật rỉ đường 39

Hình 2.6 Sơ đồ phương pháp tách PHB bằng NaClO và chloroform 47

Hình 2.7 Sơ đồ phương pháp định lượng PHB 48

Hình 3.1 Khuẩn lạc E coli tái tổ hợp (A) và hình dạng tế bào E coli tái tổ hợp (B) 50

Hình 3.2 Kết quả nhuộm Sudan Black B 50

Hình 3.3: Bột khan PHB thu được từ nuôi cấy vi khuẩn E.coli DH5α mang operon

phbCAB-4985 trên môi trường rỉ đường 52Hình 3.4: Mặt đáp ứng 2 chiều và 3 chiều của CDW và PHB theo pH và mật rỉ đường 63Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của PHB chuẩn Sigma 69

Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của PHB thu được từ E coli tái tổ hợp 69

Biểu đồ 3.5: Sự tăng trưởng của chủng E coli DH5α và sự tạo thành PHB trong hệ

thống lên men 1,5 lít - Hệ thống lên men BioFlo 110 (New Brunswick Scientific, Mỹ) 64

Biểu đồ 3.6: Sự tăng trưởng của chủng E coli DH5α và sự tạo thành PHB trong hệ

thống lên men 1,5 lít 67

PHẦN MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Nhựa tổng hợp có nguồn gốc từ dầu mỏ đang được sử dụng rộng rãi trong việcsản xuất các sản phẩm nhựa phục vụ con người Khi thải ra môi trường, các sản phẩmnày cần đến hàng ngàn năm mới phân hủy được, không những vậy, quá trình phân hủychúng còn tạo ra các sản phẩm thứ cấp độc hại Bên cạnh đó, sự khai thác quá mức củacon người cũng đang khiến nguồn tài nguyên dầu mỏ cạn kiệt dần Trước tình hình trên,việc cần thiết là phải tìm ra các nguồn vật liệu mới thân thiện với môi trường để thaythế Hiện đang có những nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất nhựa phân hủy sinh học

từ các vật liệu có nguồn gốc thiên nhiên Đáng chú ý là việc sản xuất poly–β–hydroxybutyrate (PHB) từ các vi sinh vật

PHB là tên gọi của polymer thuộc họ polyhydroxyalkanoate (PHA), chúng là cácpolymer thuộc lớp polyester với các đơn phân là nhiều loại (R)-hydroxyalkanoate.Chúng được tổng hợp trong tự nhiên như là một chất dự trữ bởi quá trình lên men cácđường hay chất béo, diễn ra khi các tế bào bị giới hạn bởi một hoặc nhiều nhân tố cầnthiết của môi trường nhưng lại dư thừa nguồn C PHA là một họ polymer lớn, bao hàmhơn 150 đơn phân khác nhau và hơn 100 cấu trúc polymer đã được mô tả, trong đó PHBchính là thành viên đầu tiên của họ PHA được khám phá và là loại polyester phổ biếnnhất, được biết đến nhiều nhất và chiếm vai trò nổi bật trong sản xuất và ứng dụng [47].Với đặc tính dẻo, đàn hồi, chịu nhiệt, tự hủy sinh học thành các sản phẩm không độc vàtương thích cao với cơ thể sống, PHB và các họ hàng có nhiều tiềm năng ứng dụng lớntrong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là lĩnh vực y học như chỉ phẫu thuật, màng nuôi tế bàodùng trong cấy ghép mô

Hiện nay, có khoảng hơn 300 loài vi sinh vật được biết là có khả năng sinh tổnghợp PHA (PHB nói riêng) Một số loài đang được giới khoa học nghiên cứu ví dụ như

các vi khuẩn Pseudomonas (P aeruginosa, P putida, P oleovorans…), Azotobacter

vinelandii, một số vi khuẩn quang hợp như: Spirulina platensis, Nostoc muscorum, Synechocystis sp., đặc biệt là vi khuẩn Alcaligenes eutrophus (còn gọi là Ralstonia eutropha hay Cupriavidus necator hay Wausteria eutropha) và Alcaligenes latus là hai

chủng vi khuẩn có năng suất sinh tổng hợp PHB cao và được giới nghiên cứu dành

nhiều sự chú ý Có điều, các sản phẩm từ PHB vẫn chưa được sản xuất và sử dụng rộngrãi do chi phí sản xuất cao[47] Đồng thời, việc sử dụng các sinh vật tổng hợp PHAtrong tự nhiên cũng có những hạn chế nhất định Ví dụ chúng có các cơ chế nội tại nhằmphân giải sản phẩm PHA, và thường chúng rất khó bị phân giải, gây khó khăn cho thu

hồi sản phẩm PHA (Chee và cs, 2010) Sử dụng vi khuẩn tái tổ hợp như vi khuẩn E coli

tỏ ra hữu dụng hơn, nó có thể tổng hợp và tích lũy PHB đến 80 – 90% trọng lượng khô

tế bào – cao hơn rất nhiều so với chủng tự nhiên, các tế bào tái tổ hợp có thể đạt mật độ

sinh khối tối đa sau thời gian ngắn (24 – 48h), có thể sử dụng các nguồn carbon rẻ tiền

và không chứa các enzyme phân hủy mất thành phẩm PHB Bộ gene của chúng cũng cóthể được cải biến để có khả năng tăng sinh nhanh, sử dụng các nguồn dinh dưỡng rẻ

tiền Từ rất lâu người ta đã dòng hóa operon phbABC của A eutrophus (chứa các gene chịu trách nhiệm sinh tổng hợp PHB đó là phbA, phbB và phbC) vào E coli [35].

Một trong những nguyên nhân khiến chi phí sản xuất PHB cao là do nguồnnguyên liệu cho môi trường lên men vi khuẩn tạo PHB khá đắt tiền Nhằm hạ thấp chiphí và tăng hiệu quả sản xuất PHB, đã có nhiều nghiên cứu tập trung cải tiến các chủng

vi khuẩn tạo PHB cũng như tìm ra phương thức lên men và thu hồi PHB hiệu quả Vớimong muốn tìm ra một phương pháp sản xuất PHB hiệu quả nhờ vi sinh vật, sử dụngcác nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhằm làm giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành các sản

phẩm từ PHB, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sản xuất PHB từ vi khuẩn E coli tái tổ

hợp” Với chủng vi khuẩn E coli DH5α mang operon phbCAB 4985 được cung cấp bởi

Phòng Công Nghệ Sinh Học thuộc Viện Khoa Học – Kỹ Thuật công nghệ cao trườngĐại Học Nguyễn Tất Thành

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1994, Lee và cộng sự bổ sung các amino acid (nồng độ 50mg/l) và oleic acid

(với các nồng độ khác nhau) vào môi trường nuôi cấy E coli tái tổ hợp, đây là các chất

trung gian trong những quá trình biến dưỡng liên quan đến việc tiêu thụ acetyl-coA vàNADPH Tác giả dự đoán việc bổ sung các acid này sẽ giảm mức độ tiêu thụ hai chấttrên cho các quá trình biến dưỡng khác thay vì sinh tổng hợp PHB Kết quả thực nghiệmcho thấy bổ sung cysteine, isoleucine, methionine, proline làm gia tăng năng suất PHB

đến hai lần (2,54 – 3,10g/l so với 1,27g/l ở điều kiện đối chứng) và bổ sung oleic acidnồng độ 20mM gia tăng năng suất lên ba lần (3,79g/l) Khi nuôi cấy mẻ bổ sung 4 amino

acid kể trên với lượng nhỏ, E coli sinh tổng hợp PHB đến 70,2g/l và đạt tỉ lệ 60,5% sinh

khối khô, gấp nhiều lần so với môi trường đối chứng (16,3g/l và 22,8%) [21]

Năm 1995, Hahn và cộng sự công bố kết quả nghiên một số phương pháp thu hồi

PHB được tổng hợp từ R eutropha và E coli tái tổ hợp Theo đó, phương pháp xử lí với NaClO và chloroform đạt hiệu quả cao hơn những phương pháp khác đối với R.

eutropha [37].

Năm 1987, Wang và Lee khảo sát về nồng độ oxygen khác nhau trong từng giai

đoạn sinh trưởng khác nhau của E coli tái tổ hợp Kết quả cho thấy sử dụng môi trường

nghèo oxygen (nồng độ 1-3%) trong giai đoạn sinh tổng hợp PHB, thì không ảnh hưởng

gì đến mức độ sinh trưởng cũng như năng suất tổng hợp PHB, nhưng làm như vậy trong

giai đoạn sinh trưởng, gia tăng sinh khối tế bào thì hậu quả rất tiêu cực Ahn et al (2000) kế thừa ý tưởng đó trong thực nghiệm nuôi cấy mẻ E coli dùng cơ chất là nước

sữa, duy trì nồng độ 40% trong giai đoạn sinh trưởng, sau đó giảm dần từng bước (30%rồi 10%), thì cho ra năng suất tổng hợp PHB cao hơn hẳn [43]

Năm 2005, P.S Chandrashekharaialh tiến hành phân lập và sàng lọc một số chủng

vi khuẩn sản xuất PHB, tối ưu hóa một số môi trường có khả năng nâng cao sản lượngPHB và sử dụng các chất rẻ hơn để sản xuất PHB nhằm giảm chi phí sản xuất [30].Năm 2014,Gomaa thử nghiệm các điều kiện dinh dưỡng và môi trường đối với

chủng E Coli sử dụng cơ chất là mật rỉ đường Tác giả kết luận tương tự như Liu et al.

(2004), rằng nồng độ mật rỉ đường thấp thì kích thích tăng sinh khối nhanh, còn nồng độcao thì ức chế sinh trưởng nhưng tăng tốc độ tổng hợp PHB Điều kiện nghèo nitrogen

và phosphorus kích thích sinh tổng hợp PHB, với nồng độ phosphorus tối ưu là 2g/l

KH2PO4 và NaHPO4.2H2, còn nguồn nitrogen vô cơ như các muối ammonium sẽ có tácdụng hơn là nguồn nitrogen hữu cơ Trong đó ammonium nitrate cho phần trăm PHBtrên sinh khối khô là cao nhất và tổng khối lượng trên lít PHB cũng cao nhất Các nguồnnitrogen hữu cơ khác như bã đậu nành, mạch nha, chiết xuất từ thịt bò và nấm men cũngcho kết quả tương đối cao, và nồng độ ammonium sulphate vào 1g/l là tối ưu Môi

trường trung tính (pH = 7) là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn và vì vậy cótác động tích cực đến sinh tổng hợp PHB [16].

Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2006, Lê Lý Thùy Trâm và cộng sự công bố kết quả nghiên cứu “Thu nhận

Poly-β-hydroxybutyrate, một loại nhựa sinh học dễ phân hủy, từ vi khuẩn Methylobacterium sp phân lập tại Việt Nam” trên tạp chí khoa học và công nghệ- Đại

học Đà Nẵng Nhóm nghiên cứu đã phân lập, tách chiết được PHB từ chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp., tạo tiền đề cho việc nghiên cứu các vật liệu thay thế polymer

truyền thống từ nguồn phân lập vi khuẩn [2, 3]

Năm 2008, Phạm Thanh Hà, Trần Đình Mấn, Yutaka Tokiwa công bố kết quả

nghiên cứu “Tạo đột biến nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp Poly-β-hydroxybutyrate của

vi khuẩn Alcaligenes latus VN1” trên tạp chí Công nghệ Sinh học Nhóm nghiên cứu đã

thành công khi dùng tác nhân vật lí tia UV để tăng năng suất sinh tổng hợp PHB của

Alcaligen latus ở Việt Nam [6].

Năm 2008-2009, TS Phạm Thanh Hà, Viện Công nghệ Sinh học, thực hiện đề tài

“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất PHB bằng nguyên liệu rẻ tiền nhằm giảm giáthành sản xuất vật liệu polymer sinh học, góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môitrường do chất thải plastic gây ra” Đề tài này hướng đến phân lập tuyển chọn dòng visinh vật lên men tinh bột tạo ra PHB Đây là đề tài ứng dụng công nghệ sinh học để giảibài toán màng bao sinh học Tuy đã đạt được một số thành tựu nhất định, nhưng đề tàichỉ dừng lại ở quy mô nhỏ (dưới 0,5 lít môi trường) và không có hướng kết hợp vớicông nghệ hóa để cho ra sản phẩm cuối cùng

Năm 2010, Kiều Phương Nam và cộng sự nghiên cứu điều kiện lên men thích

hợp để chủng Methylobacterium radiotolerans H2T tích lũy tạo PHB, sử dụng nguồn

carbon methanol có thể kích thích tích lũy lượng PHB 50,55% khối lượng khô tế bào[1]

Từ năm 2012 đến 2015, nhóm của Đoàn Văn Thược đã có những nghiên cứu về

sự tạo thành PHB từ vi khuẩn hoang dại chịu nhiệt hoặc ngập mặn Các chủng vi khuẩn

được nhóm Đoàn Văn Thược chú ý là Yangia sp NĐ199, Yangia sp ND218,

Halomonas boliviensis, Bacillus sp ND153 Nhóm tác giả này không chú ý đến nhóm

sinh PHB truyền thống như Alcaligene và cũng như vi khuẩn E coli tái tổ hợp có khả

năng sản xuất PHB Nhóm tác giả này cũng đã cho lên men tạo PHB từ các chủng visinh vật được phân lập nói trên với cơ chất sử dụng là đường glucose, glycesrol và mật

rỉ làm cơ chất lên men và thay đổi đổi một số chỉ tiêu dinh dưỡng phù hợp với sinhtrưởng và tổng hợp PHB của chủng vi khuẩn như MgSO4, KH2PO4, cao nấm men, Cácquy mô ở mức thí nghiệm nhỏ 150 ml cho thấy hiệu suất sản xuất PHB khá cao với hàmlượng PHB khoảng 77,5% sau 48 h nuôi cấy, với khối lượng khô khoảng 5g/l, các hạt to

đồng nhất nên chủng vi khuẩn Yangia sp NDD199 có nhiều tiềm năng để phát triển trên

quy mô công nghiệp

Mục tiêu nghiên cứu.

Tìm ra các điều kiện hoá lý thích hợp để chủng E coli DH5α mang operon

phbCAB 4985 lên men tạo PHB tối ưu trên cơ chất mật rỉ đường và nghiên cứu phương

pháp tách chiết PHB tối ưu ở quy mô 150ml và 1.5l Đồng thời tìm ra phương pháp táchchiết thu hồi PHB hiệu quả nhất

Nội dung nghiên cứu.

- Nghiên cứu điều kiện hoá lý thich hợp để chủng E coli DH5α mang operon phbCAB

4985 tạo PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường quy mô 150ml và 1.5l.

a) Nghiên cứu nồng độ mật rỉ đường bổ sung ban đầu

b) Nghiên cứu dạng muối nitrogen bổ sung ban đầu

c) Nghiên cứu nồng độ muối nitrogen bổ sung ban đầu

d) Nghiên cứu nồng độ KH2PO4và K2HPO4bổ sung ban đầu

e) Nghiên cứu nồng độ khoáng vi lượng bổ sung ban đầu

f) Nghiên cứu tỉ lệ tiếp giống ban đầu

g) Nghiên cứu pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng

h) Nghiên cứu thời gian nuôi cấy tối ưu

- Nghiên cứu phương pháp tách chiết PHB tối ưu và xác định tính chất hoá lý củapolymer sinh học PHB

a) Xác định khối lượng khô tế bào

b) Tách chiết PHB

c) Xác định PHB trong tế bào.

d) Định lượng PHB

Tính mới của đề tài

Có 2 điểm mới

- Trong đề tài này chúng tôi xác định được các yếu tố dinh dưỡng và điều kiện môi

trường thích hợp để chủng E coli DH5α mang operon phbCAB 4985 để tạo PHB

tối ưu bằng thiết kế thực nghiệm Plackett Burman và hàm đáp ứng bề mặt

RSM-CCD, bên cạnh đó giúp tiếp cận được một số công nghệ sản xuất PHB.

- Sản xuất PHB từ chủng E coli DH5α mang operon phbCAB 4985 trên cơ chất

mật rỉ đường, một nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhằm giảm chi phí sản xuất, hạ giáthành sản phẩm PHB

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Công nghệ lên men.

1.1.1 Khái quát về quá trình lên men.

“Lên men” có nguồn gốc từ từ Latinh “fervere”, nghĩa là sự sôi do hoạt động củanấm men trong dịch chiết quả hoặc malt nghiền Trong hóa sinh, lên men có nghĩa là sựtạo thành năng lượng nhờ quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ Trong công nghệ sinhhọc, lên men được sử dụng để chỉ việc nuôi cấy các vi sinh vật kị khí và hiếu khí để sinhtổng hợp nên các sản phẩm mong muốn[4,31]

Quá trình lên men là quá trình phân giải carbohydrate trong điều kiện kị khí Bắtđầu quá trình lên men, các hợp chất chứa carbohydrate được phân giải thành glucose,trải qua quá trình chuyển hóa, sản phẩm cuối cùng được tạo thành là CO2 và một số hợpchất carbon chưa được oxy hóa hoàn toàn như ethanol, acid acetic, ketone, …Người tathường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy trong từng loại lên men để gọi quá trình lênmen ấy Chẳng hạn như quá trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic được gọi là quátrình lên men lactic[5]

Một số vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa cơ chất trong điều kiện hiếu khí,nhưng lại tạo ra những sản phẩm chưa được oxy hóa hoàn toàn giống quá trình trình lênmen kị khí như acid acetic, keto acid, … Quá trình này dù cũng được gọi là lên mennhưng thực chất là quá trình oxy hóa hiếu khí Rất nhiều quá trình oxy hóa không hoàntoàn có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp lên men vì tạo ra những sản phẩm có giátrị[5]

1.1.2 Phương pháp lên men.

1.1.2.1 Lên men theo mẻ.

Lên men theo mẻ là phương pháp mà trong suốt quá trình lên men, ta không bổsung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường, cũng không loại bỏ các sản phẩm cuối củaquá trình trao đổi chất Trong lên men theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua các giai đoạnsinh trưởng: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong [29]

Pha lag là giai đoạn đầu, khi vi sinh vật mới được đưa vào môi trường nuôi cấymới, sự tăng sinh tế bào xảy ra không đáng kể Lúc này, vi sinh vật bắt đầu thích ứngvới môi trường mới và bắt đầu tổng hợp các chất cần cho sự sinh trưởng Các loài visinh vật khác nhau có độ dài pha lag khác nhau Pha lag cũng có thể kéo dài nếu giốngcấy ban đầu quá lâu hoặc đã được đông lạnh Trong sản xuất, để hệ thống lên mennhanh chóng bước vào pha tăng trường và tổng hợp sản phẩm, cần rút ngắn thời gianpha lag càng ngắn càng tốt [29].

Pha log là pha vi sinh vật sinh trưởng và phân chia mạnh Tốc độ sinh trưởng phụthuộc vào nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và sản phẩm tạo ra từ quá trìnhtrao đổi chất của vi sinh vật [29]

Trong pha cân bằng, sự tăng sinh tế bào bắt đầu chậm lại, số lượng tế bào duy trì

ở mức ổn định do số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi, hoặc do tế bào ngừng phânchia dù vẫn còn hoạt động trao đổi chất Một trong những nguyên nhân khiến vi sinh vậtbắt đầu chuyển sang pha cân bằng là do sự giới hạn một yếu tố dinh dưỡng nào đó trong

môi trường Đây chính là giai đoạn mà sự sinh tổng hợp PHB ở Ralstonia eutropha diễn

ra mạnh Các sản phẩm thừa tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh vật cũng có thể

làm sự tăng trưởng giảm Chẳng hạn như R eutropha có thể sản sinh nhiều butyric và

các acid hữu cơ khác trong pha tăng trưởng, điều này khiến pH môi trường giảm, làm ứcchế sự sinh trưởng của tế bào [29]

Pha suy vong, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa do sự cạnkiệt dinh dưỡng và tích lũy một số sản phẩm độc hại cho vi sinh vật, một số enzyme

phân giải tế bào Ở Ralstonia eutropha, tốc độ suy vong có thể giảm trong trường hợp vi

khuẩn sử dụng nguồn năng lượng dự trữ là PHB tích lũy trong tế bào [29]

Phương pháp này có một số ưu điểm là đơn giản, dễ tiến hành do không phải bổsung thêm bất kỳ thành phần nào trong quá trình vận hành, giảm khả năng bị nhiễm, thuhồi sản phẩm đạt mức tối ưu, giảm chi phí sản xuất Tuy nhiên, phương pháp này chosản lượng thấp do vi sinh vật không được cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanhchóng bước vào pha suy vong khi nguồn cơ chất cạn kiệt, giữa các mẻ nuôi phải ngắtquãng thời gian [4]

1.1.2.2 Lên men theo mẻ có bổ sung (lên men fed-batch).

Trong hệ thống lên men này, môi trường mới được bổ sung liên tục theo giaiđoạn vào bình nuôi nhưng không loại bỏ dịch nuôi khỏi bình cho đến khi kết thúc quátrình lên men Phương pháp này có ưu điểm là giữ được các điều kiện trong quá trìnhnuôi cấy, tránh được việc cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và hạn chế ảnh hưởng của các sảnphẩm độc trong môi trường [4]

1.1.2.3 Lên men liên tục.

Môi trường được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lấy ra dịch lênmen để thu nhận sản phẩm theo từng giai đoạn đã định trước Lên men liên tục có ưuđiểm là làm cho tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật cao, thu được lượng sinh khốicao, tiết kiệm do không có thời gian chết và tối ưu dễ dàng điều kiện nuôi cấy bằng cáchthêm chất dự trữ hoặc thay đổi các thông số Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một

số nhược điểm như dễ bị tạp nhiễm, dễ xảy ra hiện tượng đột biến, … [4] Đối với quá

trình lên men gồm hai giai đoạn là tăng trưởng và sinh tổng hợp PHB như ở R.

eutropha, lên men liên tục có thể đạt năng suất không cao bằng lên men theo mẻ hay lên

men theo mẻ có bổ sung do tế bào luôn ở trạng thái pha log [29]

1.2 Nhựa phân huỷ sinh học.

1.2.1 Sơ lược về nhựa phân huỷ sinh học.

Nhựa phân huỷ sinh học là những polymer có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp,

có đặc tính dễ bị phân huỷ hoàn toàn bởi các tác nhân sinh học như vi khuẩn, nấm Qúatrình phân huỷ xảy ra trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí, phân cắt polymer thành cácđơn phân, sau đó tiếp tục chuyển hoá bởi hệ emzim của vi sinh vật tạo sản phẩm cuốicùng là CO2 và H2O Có thể phân loại thành 2 nhóm lớn sau:

 Nhựa phân huỷ sinh học tổng hợp: điển hình là các polymer thuộc nhóm poly –

α-hydroxyalkanoic acid như poly lactic-glycolic acid (PLA), poly glycolic acid(PGA), dạng đồng trung hợp poly lactic-glycolic acid (PLGA)…Đây là nhữngpolymer được tổng hợp hoá học từ các đơn phân là vật liệu sinh học như lacticacid, glycolic acid.[9]

 Nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên: điển hình là các polymer thuộc nhóm

poly-β-hydroxyalkanoic acid như poly-β-hydroxybutyrate (PHB),

poly-β-hydroxyvalerate (PHV) hay dạng trùng hợp poly-β-hydroxybutyrate-valerate(PHBV) Đây là các polymer có nguồn gốc tự nhiên được tổng hợp trong tế bàocủa nhiều loại vi khuẩn.[9]

1.2.1.1 Nhựa phân huỷ sinh học tổng hợp.

 Poly glycolic acid (PGA).

PGA là một polyester mạch thẳng đơn giản nhất từ các đơn phân glycolic acidPGA có độ bền cao, nhiệt độ nóng chảy 220-2250C và khó hoà tan trong các dung môihữu cơ ngoại trừ hexafluoroisopropanol PGA được hình thành do phản ứng trung hợp

mở vòng glycolide, một dạng nhị phân của glycolic acid, nên PGA còn được gọi với tênthông thường là polu glycolide [9]

 Poly lactic acid (PLA).

PLA là một loại polyester phân huỷ sinh học được sử dụng rất phổ biến đặc biệttrong y học Do có độ mềm dẻo hơn PGA, PLA rất thích hợp để sử dụng làm vỏ bọc chocác loại thuốc sử dụng dần trong cơ thể Ngoài ra, PLA còn được sử dụng làm mô cấythay thế trong cơ thể người cũng như thay thế nhựa truyền thống trong nhiều ứng dụngkhác PLA được hình thành từ phản ứng trung hợp mở vòng lactide, một dạng nhị phâncủa lactic nên PLA còn được gọi với tên thông thường là poly lactide[9]

1.2.1.2 Nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên.

Đa số các loại nhựa phân huỷ sinh học tự nhiên thuộc nhóm hydroxyalkanoic acid (PHA) hay còn gọi với một tên khác là poly-β-hydroxyalkanoate.Đây là những polyester của các đơn phân hydroxyalkanoic acid, với công thức tổng quátlà:

poly-β-Hình 1.1.Công thức cấu trúc tổng quát của PHA [9]

PHA được tổng hợp ở nhiều loài vi khuẩn Gram dương và Gram âm như nguồn

dự trữ carbon dưới dạng các vi thể trong tế bào chất khi điều kiện dinh dưỡng (nguồnnitơ, phosphate và các loại khoáng khác) bị hạn chế Với các đặc tính tương tự nhựa

truyền thống và ưu thế dễ phân huỷ sinh học, PHA được ứng dụng rất nhiều trong y học

và công nghiệp Có khoảng 150 loại PHA khác nhau được ghi nhận, trong đó chú ý nhất

là poly-β-hydroxybutyrate (PHB) và dạng đồng trung hợp poly-β- valerate (PHBV).[24]

hydroxybutyrate-1.2.2 Tổng quan về PHB.

Poly –β-hydroxybutyrate (PHB) là loại polymer sinh học thuộc nhóm PHA Nó

được phát hiện trong Bacillus megaterium vào năm 1926 bởi nhà khoa học người Pháp

Lemoige [25]

1.2.2.1 Cấu trúc và đặc tính lí hóa của PHB.

PHB là polyester được tế bào tích lũy dưới dạng thể vùi lipid Thành phần thể vùiPHB gồm khoảng 97 – 98% PHB, 2% protein và 0,5% lipid [33]

Với công thức hóa học (C4H6O2)n , cấu trúc phân tử PHB được thể hiện trong hình 1.2

Hình 1.2.Công thức cấu trúc tổng quát của PHB[17]

PHB có một số đặc tính lí hóa sau:

- Khối lượng phân tử 100 000 – 800 000 Da

- PHB không tan trong nước và có sức chống chịu tương đối với các phản ứngthủy phân Đây chính là điểm khác biệt của PHB so với các loại nhựa phân hủysinh học khác, hầu hết tan trong nước hoặc nhạy độ ẩm

- PHB không bị phá vỡ cấu trúc bởi tia UV nhưng rất dễ bị hủy bởi acid hoặcbase và dễ tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, methylene chloride,

…

- Khả năng khuếch tán oxygen tương đối kém Nhờ tính chất này mà các sảnphẩm bao bì đựng thực phẩm làm từ PHB có thể hạn chế sự oxygen hóa gâyhỏng thực phẩm

- Tính tương thích sinh học cao nên rất thích hợp để ứng dụng trong y học

- Không độc.

- Có khả năng chịu lực căng khoảng 40Mpa, tương đương với polypropylene

- Nhanh chóng bị phân hủy trong tự nhiên và thân thiện với môi trường, PHBđang được quan tâm như một loại vật liệu mới thay thế cho các loại nhựa từ dầu

mỏ như polyetylene (PE), polypropylene (PP),… bởi PHB mang những đặc tínhtương tự như các loại nhựa truyền thống Bảng 1.1 cho thấy PHB dù cứng và dễgãy hơn nhưng trong hầu hết các đặc tính khác thì loại polymer này tốt hơnhoặc tương đương với PP [3]

Bảng 1.1 So sánh các đặc tính hóa lí của PHB và PP (Nguồn: Brown, 1991)

Polymer Đặc tính

Nhiệt độ nóng chảy (oC)

Tinh thể hóa (%)

Trọng lượng phân tử (Daltons) (x105)

Nhiệt độ thủy tinh hóa (0C)

6 – 8MạnhYếuCó

171 – 186

65 –702.2 – 7-150.905 – 0.9401.739400YếuMạnhKhông

Mặc dù mang nhiều đặc tính tốt, PHB vẫn chưa được sử dụng rộng rãi do giáthành sản phẩm từ PHB cao gấp 15 lần các sản phẩm nhựa tổng hợp Để việc sử dụngPHB trở nên phổ biến, cần phải có những giải pháp làm giảm giá thành sản phẩm nhưtối ưu hóa quá trình lên mên tạo PHB, sử dụng môi trường rẻ tiền và tìm ra phương pháp

thu hồi sau lên men PHB hiệu quả Trong quá trình sản xuất PHB, chi phí nguyên liệucho môi trường lên men chiếm đến khoảng 40% tổng chi phí sản xuất Do đó, sử dụngnhững nguồn carbon rẻ tiền làm nguyên liệu cho lên men là rất cần thiết nhằm làm giảmgiá thành sản xuất PHB [9].

1.2.2.2 Con đường chuyển hoá tổng hợp PHB.

Ở Ralstonia eutropha, sự tổng hợp PHB nội bào diễn ra trong điều kiện môi trường

dinh dưỡng có nồng độ carbon thích hợp và bị hạn chế một yếu tố dinh dưỡng khác nhưnitrogen, phosphate, oxygen hòa tan hay một số yếu tố khoáng như magnesium, sắt,

 Tổng hợp PHB ở Ralstonia eutropha.

Con đường chuyển hoá tổng hợp PHB ở Ralstonia eutropha được xem là điển

hình ở hầu hết các loài vi sinh vật PHB được tổng hợp từ acetyl-CoA qua một chuỗiphản ứng với sự xúc tác của 3 enzyme:

- β- ketothiolase xúc tác chuyển hoá 2 phân tử acetyl-CoA thành

acetoacetyl-CoA Enzyme này được mã hoá bởi gen phaA

- Acetoacetyl-CoA reductase xúc tác chuyển hoá acetoacetyl-CoA thành hydroxybutyryl-CoA Qúa trình này đi kèm với sự oxy hoá NADPH Enzyme

D-3-này được mã hoá bởi gen phaB

- Bước cuối cùng, PHB synthase xúc tác cho phản ứng liên kết các đơn phân 3-hydroxybutyryl-CoA thành PHB qua các cầu nối ester Enzyme này do gen

D-phaC mã hoá.

Sơ đồ chuyển hoá như sau

1.2.2.3 Vi sinh vật sản xuất PHB.

1.2.2.3.1 Vi sinh vật trong tự nhiên.

Trong tự nhiên, có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tạo ra một lượng PHB chiếm

30 – 80 % khối lượng khô tế bào Mặc dù PHB có thể được tổng hợp hóa học sử dụng butyrate hoặc β-hydroxybutyric acid làm monomer, nhưng qui trình điều khiển khó khăn

β-và giá thành sản xuất cao đã khiến việc sản xuất PHB theo con đường tổng hợp hóa họctrở nên không thể thực hiện được Trong khi đó, sinh tổng hợp PHB nhờ các vi sinh vậtlại mang nhiều thuận lợi bởi qui trình sản xuất đòi hỏi điều kiện đơn giản hơn Lên mensản xuất PHB sử dụng vi sinh vật đang là hướng đi đáng chú ý [9]

Dựa trên yêu cầu về điều kiện nuôi cấy để tạo PHB, có thể phân các vi khuẩn thành

hai nhóm Nhóm thứ nhất gồm những loài vi khuẩn như R.eutropha, Pseudomonas

olevorans, cần điều kiện sinh trưởng mất cân bằng để tổng hợp PHB Chúng sẽ tổng

hợp và tích lũy PHB khi môi trường giàu carbon và giới hạn một yếu dinh dưỡng thiếtyếu khác (nitrogen, oxygen, ) Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn sản xuất PHB mà

không đòi hỏi phải giới hạn dinh dưỡng Điển hình trong nhóm này là Alcaligenes

latus[24].

Trong số các chủng vi sinh vật có khả năng tạo PHB, hai chủng vi khuẩn phổ biến

là Ralstonia eutropha và Alcaligenes latus.

a) Ralstonia eutropha

R.eutropha (trước đây là Alcaligene eutrophus) là vi khuẩn Gram âm, dạng hình

que,không hình thành bào tử, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ tối

ưu 30C [9]

R.eutropha được xem là chủng vi khuẩn sản xuất PHB hiệu quả nhất nhờ khả năng

sử dụng được nhiều nguồn carbon khác nhau như glucose, fructose, acetic acid, thực vật,dầu thực vật, … để tích lũy PHB với hàm lượng có thể lên đến 80%w/w [13].Vi khuẩn

có thể sản sinh PHB trong điều kiện môi trường có mặt nguồn carbon song song với sựthiếu hụt một nhân tố sinh trưởng thiết yếu khác Do đó, qui trình sản xuất PHB thườngtrải qua hai bước, mở đầu là sự tăng nhanh sinh khối tế bào, theo sau là bước sản xuấtPHB [9]

b) Alcaligenes latus

Alcaligenes latus là vi khuẩn Gram âm, sống hiếu khí bắt buộc, sinh trưởng trong

nhiệt độ tối ưu khoảng 350C A.latus có thể tích lũy PHB trong tế bào sử dụng nguồn

carbon là sucrose và không cần sự giới hạn của bất kì yếu tố dinh dưỡng nào [9]

c) Một số chủng vi khuẩn khác

Pseudogenes oleovorans có thể sản xuất lượng PHB khá cao (149 g/L) khi được

nuôi cấy theo mẻ có bổ sung hoàn toàn tự động Tuy nhiên, để đạt được nồng độ PHBtrên, cần phải trải qua 170 giờ nuôi cấy Điều đó đã làm giảm hiệu suất sản xuất PHB(0.88g/giờ) [9]

Kim và cộng sự đã nghiên cứu sự sản xuất PHB ở Escherichia coli tái tổ hợp mang gen quy định tổng hợp PHB của R eutropha (1992) Nghiên cứu cho thấy E.coli tái tổ

hợp có thể tích lũy lượng PHB đến 80 – 90% khối lượng khô tế bào

Bảng 1.2 Một số chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHB trong tự nhiên [34][40]

Chủng vi sinh vật Nguồn

Carbon

%PHB Tài liệu tham khảo

50 – 68%

1.1 – 5%

Liebergessel et al 1994

1.2.2.3.2 Vi sinh vật tái tổ hợp.

Đa số các chủng hoang dại trong tự nhiên có chu trình sống kéo dài nên thời giannuôi cấy để thu nhận sản phẩm PHB lâu Một số loài rất khó ly giải tế bào để tách chiếtPHB Bên cạnh đó, các chủng hoang dại thường có quá trình phân huỷ PHB tự nhiênxảy ra đồng thời do chính phức hệ enzyme của tế bào thực hiện làm giảm hiệu suất tổnghợp PHB Tất cả các yếu tố trên làm cho việc thu nhận PHB từ các chủng hoang dạikém hiệu quả Do đó sử dụng các chủng vi khuẩn tái tổ hợp mang gen tổng hợp PHBvới tỉ lệ cao đồng thời không có quá trình phân huỷ PHB tự nhiên trong tế bào là mộtgiải pháp để gia tăng hiệu suất thu nhận PHB

Chủng Ralstonia eutropha tái tổ hợp mang operon biểu hiện vượt mức gen phaC,

phaA, phaB có thể tăng hiệu suất tổng hợp PHB lên đến 33-40% sinh khối khô tế bào

[Park, (1995)] Mặc dù hiệu suất tăng không đáng kể so với chủng hoang dại nhưng

chủng tái tổ hợp này vẫn có ý nghĩa do thời gian lên men được rút ngắn khoảng 20%.

Chủng Alcaligenes latus được chuyển gen phaC cho thấy có sự gia tăng đáng kể lượng

PHB được tổng hợp, khoảng 50-65% sinh khối khô tế bào

Chủng Pseudomonas hoang dại không có khả năng tổng hợp PHB, nhưng khi được chuyển operon mang 3 gen phaC, phaA, phaB từ Ralstonia eutropha thì cho hiệu suất tổng hợp PHB lên tới 25% Chủng Ralstonia eutropha mang gen phaC từ

Clostridium violaceum có thể tích luỹ 85% PHB khi sử dụng gluconate làm nguồn

carbon trong khi chủng Pseudomonas putida cũng mang gen phaC từ Clostridium

violaceum thì lại không có khả năng này (Kolibachuk, 1999) [45].

Chủng E coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp PHB.

Mặc dù chủng Ralstonia eutropha hoang dại có hiệu suất tổng hợp PHB cao

nhưng chủng này cũng có một số hạn chế nhất định như chúng phát triển rất chậm, rấtkhó ly giải tế bào để thu nhận sản phẩm Để khắc phục vấn đề này, người ta tạo các

chủng E coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp PHB từ Ralstonia eutropha, đồng thời

chủng tái tổ hợp cũng không có gen phân huỷ PHB nên sẽ hạn chế được quá trình phângiải PHB tự nhiên làm giảm năng suất tổng hợp PHB

- Ưu điểm của E coli tái tổ hợp.

Khi di truyền học ngày càng phát triển và hiểu biết của con người về bộ gene củasinh vật ngày càng sâu rộng, người ta đã bắt đầu tiếp cận với khả năng can thiệp vào bộmáy di truyền của các sinh vật Các nhà nghiên cứu ngày càng chú ý nhiều hơn đến việckiến tạo các sinh vật biến đổi gene mang các đặc tính hữu ích cho sản xuất mà các chủng

tự nhiên không thể có Lĩnh vực sinh tổng hợp PHB không ngoại lệ, nhiều chủng vikhuẩn, nấm, thực vật biến đổi gene mang khả năng sinh tổng hợp PHB đã được giớinghiên cứu tìm hiểu và phát triển

Trong đó, việc kiến tạo các chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp nhận gene sản xuất

PHB từ sinh vật tự nhiên được chú ý nhiều vì các ưu điểm như: bộ gene quá “quenthuộc” với giới nghiên cứu, khả năng sử dụng nhiều loại nguồn carbon, mật độ tích trữ

PHB có thể đạt mức rất cao (cao nhất có thể là 95% so với 80% ở R eutropha) (Dennis

và Slater, 1994), dễ dàng thu hồi PHB từ sinh khối, không có enzyme phân giải PHB,

khả năng sinh sản nhanh, mật độ vi khuẩn rất dầy (trong điều kiện lý tưởng) và môi

trường nuôi cấy không đắt [Park et al., (2005)]; [Rosano và Ceccarelli, (2014)] Ở đây, đặc tính không có enzyme phân giải PHB rất có ý nghĩa vì E coli sẽ không tiêu thụ mất

số PHB đã dày công tổng hợp được, gây hao phí nguyên liệu và giảm hiệu suất, đây điều

mà các chủng tự nhiên có thể làm nếu như người nuôi cấy bất cẩn trong việc theo dõiquá trình sinh trưởng và điều kiện nuôi cấy [13], [28], [41]

Kim (2000) làm thực nghiệm so sánh năng suất sinh tổng hợp của E coli tái tổ hợp với Azotobacter chrococcum và liệt kê các nghiên cứu trước đó sử dụng các vi khuẩn khác nhau trong điều kiện khác nhau E coli trong thực nghiệm (cơ chất nước sữa) và R eutropha (cơ chất bột năng) trong nghiên cứu của Kim và Chang (1995) có năng suất và tỉ lệ PHB trên sinh khối khô cao nhất; trong đó E coli cho năng suất thấp

hơn (0,48 – 0,90g/l/giờ so với 1,03g/l/giờ) nhưng tỉ lệ PHB cao hơn (57-80% so với58%) [19]

Yutaka và Ugwu (2007) so sánh năng suất sinh tổng hợp và nguồn carbon làm cơ

chất của các chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp và các chủng tự nhiên (R eutropha, A.

latus, A chrococcum) Chủng E coli XL1-Blue cho ra năng suất khá cao, trong thí

nghiệm của [Kahar et al (2005)] cho ra năng suất 2,98g/l/giờ và tỉ lệ PHB lên đến 80% sinh khối khô, còn Choi et al (1998) cho ra năng suất 4,63g/l/giờ, tỉ lệ 73% Cả hai đều

sử dụng cơ chất là glucose và nuôi cấy mẻ [Ahn et al (1998)] với chủng CGSC4401

dùng cơ chất nước sữa cũng cho ra năng suất 2,57g/l/giờ và tỉ lệ 81% Trong các chủng

tự nhiên, R eutropha NCIMB 11599 của Kim et al., (1994) cho năng suất 2,42g/l/giờ và

tỉ lệ 76%, trong khi các chủng A latus DSM 1123 của [Yamane et al (1996)], [Wang và

Lee (1997)] cho năng suất 3,97 và 4,94g/l/giờ, và tỉ lệ là 50% và 88% Cả ba đều dùng

nuôi cấy mẻ, R eutropha dùng cơ chất glucose còn A latus dùng sucrose [11], [43],

[44]

Các thông số này cho thấy, vi khuẩn E coli tái tổ hợp hoàn toàn có thể được xây

dựng và cải tiến để đạt năng suất tổng hợp PHB ngang bằng hoặc vượt hơn với các

chủng tự nhiên Trong các chủng tự nhiên, R eutropha và A latus cho năng suất sinh

tổng hợp rất cao, và vì vậy gene tổng hợp PHB của chúng đây là ứng cử viên sáng giá

cho việc kiến tạo chủng E coli tái tổ hợp theo yêu cầu.

-Chuyển các gene trực tiếp tham gia sinh tổng hợp PHB vào vi khuẩn E.coli.

Thực nghiệm đầu tiên nhằm chuyển các gene sinh tổng hợp PHB vào E coli được cho là triển khai bởi [Schubert et al (1988)], với các operon lấy từ vi khuẩn R.

eutropha Các thí nghiệm sau đó tiếp tục đào sâu nghiên cứu hoạt động chức năng và

ảnh hưởng của các gene này trên vi khuẩn E coli cũng như chuyển vào E.coli những

gene liên quan đến sinh tổng hợp PHB phát hiện trong nhiều vi khuẩn khác [35]

Như đã nêu, nhìn chung có ba gene phbA, phbB, phbC quy định các enzyme tham gia sinh tổng hợp PHB, chúng cùng nằm trên một operon phbCAB Như vậy, vi khuẩn

E coli tái tổ hợp cần có đầy đủ các gene này trong trạng thái hoạt động được Như đã

nêu, operon của R eutropha và A latus là hai đối tượng thường xuyên được lựa chọn để kiến tạo E coli tái tổ hợp cần thiết [Choi et al (1997)] đã chuyển các gene của A.latus vào E coli và so sánh chúng với các chủng E coli sử dụng gene của R eutropha đã được nghiên cứu trước đó Kết quả cho thấy hai trong bốn chủng sử dụng gene A latus cho năng suất sinh tổng hợp PHB cao hơn các chủng dùng gene của R eutropha, trong

đó chủng dùng gene A latus cho năng suất cao nhất là 4,63 g/lít/giờ với nồng độ PHB là 141,6 g/l (so với 3,4 g/l/giờ của chủng dùng R eutropha) – tác giả kết luận rằng E coli

sử dụng gene của A latus có thể là một hướng đi có triển vọng trong việc nâng cao năng

suất sinh tổng hợp PHB [11]

Có nhiều cách chuyển gene cần thiết vào tế bào vi khuẩn E coli Gene cần biểu

hiện có thể được gắn trực tiếp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn, nhưng thường là được gắnvào plasmid – một đoạn DNA vòng có khả năng sao chép – rồi chuyển plasmid vào tếbào vi khuẩn Sử dụng plasmid là phương pháp phổ biến, dễ kiểm soát, nhưng có một sốnhược điểm như sự thiếu ổn định về di truyền và cấu trúc của plasmid, hay plasmid quálớn không thể chuyển vào vi khuẩn Vì vậy hướng chuyển trực tiếp gene vào nhiễm sắc

thể vi khuẩn chủ cũng giành được nhiều mối quan tâm (Li et al., 2012) [22].

Hình 1.4: Plasmid p4A (Dennis, 1996) [12].

Việc gia tăng mức độ biểu hiện của gene cũng là điều quan trọng vì trong nhiềutrường hợp các gene tự nhiên không có mức độ biểu hiện như mong muốn – ví dụ như

các gene của R eutropha thường có mức biểu hiện rất thấp trong cơ thể E coli

[Andersen và Wilke-Douglas, (1984)] Một phương pháp thường gặp để gia tăng mức

độ biểu hiện gene là nâng cao số lượng phiên bản của gene (còn gọi là liều lượng gene)

[Li et al., (2012)] làm tăng mức độ biểu hiện và tương xứng là năng suất tổng hợp PHB.

Do thể truyền gene chủ yếu là plasmid nên liều lượng gene tương quan với hàm lượng

cũng như khả năng sao chép của plasmid, tỉ như [Janes et al (1990)] cho thấy chủng E.

coli được thiết kế để ở 30oC mỗi tế bào chỉ mang một plasmid có năng suất tổng hợp

PHB chỉ bằng 1/40 so với chủng đối chứng Hay [Lee et al (1994)] nhận thấy chủng E.

coli mang plasmid pSYL101 (trung bình 280 phiên bản/tế bào) tích trữ nhiều PHB hơn

chủng pSYL102 (21 phiên bản/tế bào) Như vậy, các plasmid có khả năng sao chépthành rất nhiều phiên bản là ứng cử viên sáng giá cho vai trò thể truyền, ví dụ như

plasmid p4A áp dụng trên một số chủng E coli cho ra mức độ tích lũy PHB đến 70-95%

sinh khối [Dennis và Slater, (1994)] Ngoài ra, các plasmid cũng có thể được thiết kế để

có khả năng “sao chép bỏ chạy” (runaway replication), tức là ở điều kiện nhất định nhưkích thích do nhiệt, cơ chế kiểm soát sự sao chép của thể truyền bị vô hiệu hóa, thểtruyền tự sao chép liên tục cho đến khi cạn kiệt nguyên liệu [Dennis (1996)] cho biếttrong môi trường LB thì mỗi tế bào có thể có đến 500-1000 phiên bản plasmid như vậy,

và mức độ tích lũy PHB có thể đạt tới gần 90% sinh khối trong môi trường LB +glucose Do sinh tổng hợp PHB tạo ra gánh nặng đối với sự sinh trưởng, kích thích sao

chép bỏ chạy chỉ được thực hiện sau khi quá trình tăng trưởng tế bào đã thực hiện đủyêu cầu [12], [13], [21], [22].

Hình 1.5: Minh họa phương pháp CIChE (Tyo et al., 2009) [42]

Đối với hướng chuyển gene trực tiếp vào nhiễm sắc thể, Tyo et al (2009) đã giới

thiệu phương pháp tăng liều lượng gene bằng tiến hóa nhiễm sắc thể kích thích bởi biệnpháp hóa học (Chemically Inducible Chromosomal Evolution – CIChE) Vi khuẩn chủ

sẽ mang một đoạn gene đặc biệt là recA có tác dụng làm thay đổi số phiên bản gene cần

dùng trong nhiễm sắc thế trong quá trình nhân đôi tế bào, và các hóa chất (như khángsinh hay chloramphenicol) sẽ được tùy nghi thêm vào môi trường để tiêu diệt các cá thể

có liều lượng gene không đủ, mô phỏng cơ chế của chọn lọc tự nhiên Sau khi vi khuẩn

đã “tiến hóa” đạt yêu cầu thì recA sẽ bị xóa để đảm bảo sự ổn định của bộ gene Tác giả

đã áp dụng phương pháp này lên vi khuẩn E.coli tái tổ hợp sinh tổng hợp PHB, kết quả cho thấy chủng E coli “tiến hóa” dưới nồng độ 1.360 µg/ml chloramphenicol có tỉ lệ tích trữ PHB xấp xỉ bằng chủng E coli dùng plasmid, nhưng có bộ máy di truyền với độ

ổn định vượt trội: E coli dùng plasmid mất hẳn khả năng sinh tổng hợp PHB sau 35-40

thế hệ, trong khi các tính trạng của chủng “tiến hóa” vẫn ổn định ở mức cao sau 70 thế

thiết [Li et al (2012)] xây dựng vùng gene khởi động bao hàm nhiều promoter core-tac

(CPtac) nằm kế tiếp nhau, kết quả cho thấy tăng số lượng CPtac lên tới mức tối đa là 5thì có tác dụng tăng mức độ biểu hiện của gene Promoter có 5CPtac được cho là tối ưu

nhất, và chủng E coli mang 5CPtac có khả năng tổng hợp PHB lên đến 23,7% sinh khối

khô (gấp 5,6 lần chủng đối chứng), mức độ biểu hiện gene cũng tăng 6 lần so với chủng

đối chứng Ngay cả chủng E coli mang 20 bản sao chép của phbCAB cũng chỉ sản sinh PHB đạt 18% sinh khối khô mà thôi (Li et al., 2012; Tyo et al., 2009) [22], [42].

Hình 1.6: các operon dùng trong thực nghiệm của Kelwick et al (2015) [18].

Còn [Kelwick et al (2015)] xây dựng một operon phbCAB hỗn hợp với nền tảng

từ operon hoang dại của R eutropha Operon hỗn hợp mang hai vùng gene khởi động,

một trong đó là promoter hoang dại, còn lại là promoter nhân tạo J23104 kèm với vùngbám ribosome (RBS) B0034 Nhóm nghiên cứu so sánh mức độ biểu hiện trong vi

khuẩn E coli của operon hỗn hợp với operon hoang dại và operon nhân tạo chỉ bao hàm J23104 và B0034 (xem hình 1.5) Kết quả cho thấy các điều: 1) chủng E coli mang

operon hoang dại cho năng suất và tỉ lệ PHB/sinh khối khô thấp hơn nhiều lần so với hai

chủng còn lại và 2) sau 24 giờ chủng E coli mang operon hỗn hợp sản sinh nồng độ

PHB cũng như tỉ lệ PHB/sinh khối khô cao vượt trội so với 2 chủng còn lại, nhưng sau

48 giờ thì sụt giảm đến bằng hay thấp hơn chủng E coli mang operon nhân tạo không

hỗn hợp Kết quả ngụ ý rằng operon hỗn hợp làm tăng mức độ sản sinh RNA thông tin

và mức biểu hiện các enzyme của phbCAB, và sự kết hợp hai promoter tạo ra kết quả

nhân bội hơn là cộng gộp Sự suy giảm của chủng hỗn hợp được cho là kết quả của quátrình tranh giành nguồn cơ chất giữa nhiệm vụ tăng trưởng tế bào với nhiệm vụ sinhtổng hợp PHB [18]

Độ ổn định của plasmid cũng là một tiêu chuẩn cần xem xét Đặc tính này phụthuộc vào một số yếu tố như số lượng sao chép và điều kiện nuôi cấy Người ta có thể

dùng kháng sinh như ampicillin [Friehs, (2004)] để gia tăng độ ổn định cho plasmid,nhưng do giá thành đắt nên không thích hợp ứng dụng trong sản xuất quy mô côngnghiệp Một hướng đi khác là tác động vào cấu trúc di truyền của plasmid để tạo ra cácplasmid có tính ổn định cao, như [Gerdes (1988)] khai thác khả năng điều tiết sự ổn định

của locus parB (hok/sok) của plasmid R1 Trong khi đó [Lee et al (1994)] nhân dòng locus parB này vào trong các plasmid pSYL102 và pSYL101 (mang gene tổng hợp PHB của R eutropha) để tạo thành các plasmid pSYL104 và pSYL103, hai plasmid mới

có mức độ ổn định 100% trong suốt quá trình tổng hợp PHB của mẻ nuôi cấy [15], [21]

Ngoài ra, việc lựa chọn dòng vi khuẩn E coli thích hợp cũng rất hệ trọng, vì các

dòng vi khuẩn khác nhau sẽ mang lại năng suất, hiệu suất, tốc độ sinh trưởng, sản phẩmphụ, nguyên liệu làm cơ chất… không hề giống nhau [Lee và Chang, (1995)]; [Luli và

Strohl, (1990)] [Lee et al (1994)] đã tiến hành so sánh 7 chủng E coli (trong đó có 3

chủng hoang dại là B, W, K12) với plasmid pSYL105 mang gene sinh tổng hợp PHB

của R eutropha, sử dụng môi trường LB với nồng độ glucose 20g/lít Trong đó chủng

XLI-Blue (pSYL105) và B (pSYL105) có năng suất sinh tổng hợp cao nhất (0,2g PHB/gsinh khối thật/giờ và 6-7g PHB/lít), còn chủng JM109 (pSYL105) tích trữ PHB ở tỉ lệcao nhất (85,6%) với sinh khối thật là 0,77g/lít Trừ hai chủng K12 và W, còn lại đềuhình thành sợi (filamentation), nguyên nhân có thể là sự biểu hiện quá mức của enzymePHB synthase hoặc mức độ tích lũy cao của PHB [21]

Bên cạnh vấn đề năng suất sinh tổng hợp, cải thiện chất lượng và cấu trúc của sảnphẩm PHB cũng được chú ý Ví dụ, PHB có khối lượng phân tử lớn và rất lớn (khốilượng mol trên 3 x 106 g) sẽ có độ bền cơ học cao Hiroe et al (2012) thực hiện theo hướng thay đổi vị trí các gene phb (lấy từ vi khuẩn R eutropha) trong một operon, dựa

theo nguyên lý gene nào càng gần vùng khởi động (promoter) thì mức độ biểu hiện càngcao Các thử nghiệm đã xác nhận có mối quan hệ ngược chiều giữa năng suất sinh tổnghợp PHB với khối lượng PHB, cụ thể là enzyme PHB synthase hoạt động càng mạnh thìnăng suất càng cao nhưng khối lượng phân tử càng thấp Kết quả thử nghiệm cũng tìm

thấy thứ tự promoter – phbB – phbA – phbC tạo ra mức độ cân bằng tối ưu nhất về khối

lượng phân tử và năng suất sinh tổng hợp PHB Đối với các PHA mạch ngắn “họ hàng”với PHB như poly(3-Hydroxypropionate-co-3-Hydroxybutyrate) [P(3HP-co-3HB) hayPHPB] hay poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) [P(3HB-co-3HV) hay

PHBV], vi khuẩn cần các cơ chất thích hợp để sản xuất ra các hydroxyacyl-CoAthioester cần thiết như 3HV-coA và 3HP-coA, ví dụ như propionic acid, valeric acid,levulinic acid, valine, threonine, 3-hydroxypropionic acid…Ví dụ, cơ chất propionicacid sẽ được enzyme acetyl-coA synthetase của vi khuẩn chuyển đổi thành propionyl-coA, chúng sẽ được enzyme ketothiolase tùy nghi gắn kết vào các acetyl-coA, thànhphần propionyl sẽ được khử thành valeryl, hình thành nên các loại PHBV (Dennis vàSlater, 1996) Thông thường, các cơ chất cần thiết này bắt buộc phải được bổ sung vàomôi trường nuôi cấy, điều này dẫn đến vấn đề về chi phí đắt cũng như độc tính của các

cơ chất; vì vậy đã có những nỗ lực tạo dựng các chủng sinh vật có khả năng tự tổng hợp

các chất cần thiết từ những nguồn carbon rẻ và phổ biến Tseng et al (2010) đã thử nghiệm chủng E coli tái tổ hợp có khả năng tổng hợp propionyl-coA từ glucose thông

qua con đường sinh tổng hợp threonine, và propionyl-coA cùng với acetyl-coA sẽ lànguyên liệu để tổng hợp các 3HV-coA; kết quả khả năng tổng hợp 3HV từ nguồn

carbon không propionate đã được xác thực Chen et al (2011) cũng xây dựng các chủng

E coli sử dụng con đường tương tự, với chủng đạt tỉ lệ 3HV cao nhất là 17,5 mol% với

năng suất 3,04 g/l và tỉ lệ PHBV là 11,1% sinh khối khô[8], [13]

[Slater et al (1992)] thử nghiệm khả năng kết hợp gene sinh tổng hợp PHBV với trong chủng E coli bị đột biến ở gene atoC(Con) và fadR khiến nó mất đi sự ức chế quá

trình biến dưỡng acid béo và propionic acid, kết quả chứng thực khả năng tổng hợpPHBV của chủng này, và tìm được khoảng nồng độ tối ưu của glucose (2%), propionicacid (~50mM), cho thấy việc trì hoãn bổ sung các cơ chất này cho đến pha log của quá

trình sinh trưởng sẽ có tác dụng làm tăng tỉ lệ 3HV Valentin et al (2000) so sánh các chủng E.coli tái tổ hợp chứa gene prpE, orfZ và acoE quy định các enzyme xúc tác tổng hợp 3HP-coA, kết quả cho thấy prpE và orfZ sinh tổng hợp các PHPB có tỉ lệ 3HP cao hơn nhiều lần so với acoE, nhưng tỉ lệ PHPB trên sinh khối khô của prpE nhỉnh hơn Nguyên do được giải thích là, enzyme synthetase quy định bởi prpE có một lợi thế là có

thể chủ động đẩy phản ứng tổng hợp về phía 3HP-coA nhờ sử dụng năng lượng tự do từ

ATP, trong khi enzyme transferase quy định bởi orfZ phụ thuộc hoàn toàn vào nồng độ

acetyl-coA và đưa nồng độ acetyl-CoA, acetate, 3HP, 3HP-CoA về trạng thái cân bằngphản ứng [35], [45]

1.2.3 Lược sử ngành công nghiệp sản xuất PHB.

PHB đã được đưa vào sản xuất từ cuối những năm 1950 Khi đó, Baptist vàWerber thuộc công ty W.R Grace (Mỹ) là những người tiên phong mở đường cho việcsản xuất PHB thương mại Tuy nhiên, do không thể thu hút được sự quan tâm chú ýcộng với hiệu suất sản xuất thấp, việc sản xuất PHB đã phải ngừng lại Một thời gian dàingười ta đã không còn quan tâm đến việc sản xuất PHB thương mại cho đến giữa nhữngnăm bảy mươi, khủng hoảng dầu đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các loại nhựa thay thế.Trong những năm 1980, một công ty của Úc là Chemie Linz AG hợp tác với

Petrochemia Dnubia (PCD) sản xuất PHB từ A latus trên cơ chất sucrose Năm 1993,

tiến sĩ Hangii được PCD trao lại công nghệ sản xuất PHB và chủng vi khuẩn Một nămsau, ông bắt đầu sản xuất PHB dưới tên thương mại là Biomer [25]

Hầu hết các loại nhựa phân hủy sinh học không thể cạnh tranh giá cả với nhựa cónguồn gốc từ dầu mỏ Jaquel và cộng sự đã biên soạn một bài viết về giá thành củanhiều loại PHA thương mại khác nhau Năm 2003, các sản phẩm Biomer, Biocycle,Biogreen, Biopol và Nodax có giá từ 10 đến 20 € một kilogam Đến năm 2010, giáthành các sản phẩm này giảm còn 2.20 – 5.0 € một kilogam Giá thành sản phẩm cao là

do giá nguyên liệu thô cao, chi phí thực hiện qui trình sản xuất cao và sản lượng thuđược thấp Vì vậy điều cần thiết lúc này là phải tìm ra những giải pháp giúp hạ giá thànhsản xuất PHB [25]

1.2.4 Phương hướng cải thiện sản xuất PHB.

Hiện nay, các nghiên cứu đang chủ yếu tập trung vào việc hạ giá thành sản xuấtPHB bằng một số phương pháp như sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền, sử dụng nhữngchủng vi khuẩn có hiệu suất sản xuất PHB cao, áp dụng qui trình lên men tốt hơn và cóphương pháp thu hồi PHB hiệu quả hơn

1.2.4.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn sản xuất PHB thích hợp.

Lựa chọn chủng vi khuẩn tổng hợp PHB lý tưởng là công việc mang tính quyếtđịnh trong qui trình sản xuất PHB Để xác định một vi khuẩn là phù hợp với sản xuấtPHB quy mô lớn, có thể dựa vào một số yếu tố như khả năng tế bào sử dụng nguồncarbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũytrong tế bào Trong đó, các yếu tố có ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất tạo PHB, bao

gồm tốc độ sinh trưởng, tốc độ tổng hợp PHB và lượng PHB tối đa tích lũy trong tế bào,cần phải càng cao càng tốt Không nên chọn những vi sinh vật mà bên cạnh việc sảnxuất PHB còn tạo polysaccharide ngoại bào bởi nguồn carbon không được chúng tậndụng hết cho quá trình sinh tổng hợp PHB Mặt khác, như đã trình bày ở trên, vi khuẩntổng hợp PHB gồm hai nhóm nên khi lựa chọn chủng vi khuẩn, cần chú ý điểm này để

có kế hoạch lên men phù hợp [25]

Hiện đang có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật mới, cải thiệnnăng suất tạo PHB Gây đột biến tạo chủng vi sinh vật đã được thực hiện nghiên cứu ởnhiều nơi trên thế giới Tại Việt Nam, Phạm Thanh Hà và cộng sự (2008) đã gây đột

biến A lactus VN1 bằng tia UV, năng suất tạo PHBở chủng đột biến cải thiện được 40%

so với chủng dại [7].Các vi sinh vật chuyển gen cũng được sử dụng trong sản xuất PHB.Người ta đã đưa được gen qui định sinh tổng hợp PHB của một số chủng vi khuẩn vào

tế bào vi khuẩn tái tổ hợp, làm tăng năng suất tạo PHB Phổ biến nhất là E.coli tái tổ hợp mang gen qui định sinh tổng hợp PHB của R eutropha [20].

1.2.4.2 Tối ưu hóa các điều kiện môi trường lên men sản xuất PHB.

Sự thay đổi các điều kiện môi trường khi lên men sản xuất PHB có thể có ảnhhưởng rất lớn đến hiệu quả sản xuất PHB Do đó, cần tìm được những thông số về thànhphần dinh dưỡng, điều kiện lí, hóa thích hợp để quá trình lên men tạo PHB đạt hiệu quảcao nhất

1.2.4.3 Thay thế nguồn cơ chất trong sản xuất PHB vi sinh.

Trong quá trình sản xuất, chi phí nguyên liệu thô mà đặc biệt là nguồn carbon cóảnh hưởng rất lớn đến tổng chi phí thành phẩm PHB được tích lũy trong điều kiện hiếukhí, do đó vi khuẩn sử dụng một lượng lớn carbon cho hô hấp tế bào Kết quả là chỉchưa tới 50% lượng carbon được dùng để tạo PHB Bên cạnh đó, việc sử dụng nguồncarbon đắt tiền như glucose càng khiến chi phí sản xuất PHB thêm đắt đỏ Hiện naynhững nguyên liệu thô rẻ tiền, dễ tìm như rác thải nông nghiệp và công nghiệp đangđược xem là nguồn cơ chất carbon tiềm năng Sử dụng các sản phẩm thải này không chỉ

là giải pháp làm giảm giá thành sản xuất PHB mà còn giúp giảm bớt gánh nặng loại bỏrác thải [3, 25]

 Sản xuất PHB sử dụng rác thải nông nghiệp và xác thực vật.

Rác thải nông nghiệp đang xem là một nguồn nguyên liệu cung cấp cho quá trình

sản xuất PHB ở một số loài vi sinh vật Chẳng hạn như Cupriavidus necator có thể tích

lũy PHB khi được bổ sung nguồn carbon và nitrogen là sản phẩm thủy phân lúa mì vàcao nấm men Trong môi trường có cám lúa mì được thủy phân nhờ enzyme của

Aspergillus oryzae NM1, Halomonas boliviensis LC1 có khả năng tích lũy lượng PHB

khoảng 34% khối lượng khô tế bào [25]

60% xác thực vật chứa lignocellulose Nguồn tài nguyên này vô cùng dồi dào trêntrái đất Tuy nhiên, nguồn vật liệu này cần phải được xử lí trước khi cung cấp cho quátrình lên men vi sinh [25]

 Sản xuất PHB sử dụng chất thải công nghiệp.

Nhiều loại chất thải công nghiệp như mật rỉ rất giàu carbon Chúng đã được sửdụng để sản xuất các sản phẩm như acid lactid, ethanol, enzyme, Một số loại chất hiệnđang được nghiên cứu và sử dụng để sản xuất PHB

a Mật rỉ

Mật rỉ là chất thải phổ biến của ngành công nghiệp đường Trong mật rỉ có chứanguồn carbon chính là sucrose, vài loại đường khác và một số nhân tố kích thích sinhtrưởng như vitamin và biotin Thành phần hóa học trong mật rỉ rất khó dự đoán Nó phụthuộc vào các điều kiện như thổ nhưỡng, thời tiết, giống mía, giai đoạn thu hoạch cũngnhư qui trình sản xuất tại mỗi nhà máy [24]

Hiện nay, hai loại mật rỉ được sử dụng phổ biến trong sản xuất PHB là mật rỉ mía

Người ta đã thực hiện sản xuất PHB trong môi trường có chứa nước sữa, sử dụng

E coli tái tổ hợp mang gen tổng hợp PHB của R eutropha Khi được nuôi cấy theo mẻ